BAB IV METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian Penelitian ini adalah penelitian Eksperimental, dengan rancangan penelitian yang digunakan adalah penelitian Posttest Only Control Design ( Gliner,2000 ) dengan kultur in vitro . Skema rancangan penelitian dapat digambarkan sebagai berikut P0 P1
O1 O22
Populasi
P2
Sampel
O3
P3
Random
O4
Bagan 4.1 Skema Rancangan Penelitian In Vitro Keterangan : P0 : Kelompok Kontrol yang hanya diberi medium DMEM P1 : Kelompok Perlakuan yang diberi medium DMEM + GM-CSF + TGF β1 60
2
P2 : Kelompok Perlakuan yang diberi medium DMEM + GM-CSF + Activin A. P3 : Kelompok Perlakuan yang diberi medium DMEM +GM-CSF + TGF β1 + Activin A
1.2 Lokasi dan Waktu Penelitian a.
Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Institut Tropical Disease , Kampus C Universitas Airlangga Jln Mulyorejo Surabaya. b.
Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama 10 minggu sejak bulan Maret 2011 sampai dengan bulan Mei 2011. 4.3 Penentuan Sumber Data 4.3.1 Kriteria Subjek Pada penelitian ini subjeknya adalah Darah Perifer yang mengandung Hematopoetic Stem cell, yang memenuhi kriteria inklusi dan kriteria eksklusi 4.3.1.1 Kriteria Inklusi •
Hematopoetic Stem cell Dewasa dari darah perifer
3 •
Sehat
•
Tidak sedang flu, atau sakit
4.3.1.2 Kriteria Eksklusi : •
Terjadi apabila Darah Hemolysis
4.3.1.3 Kriteria Drop Out •
Terjadi apabila Sel Mati dalam Kultur.
•
Tidak dapat dinilai sel yang bermakna
4.3.2 Besaran Sampel Pada penelitian in vitro ini sampel diperhitungkan dengan Rumus Federer (1963) (Nathasa, 2007) : ( n - 1) x ( t – 1) ≥ 15 n = jumlah replikasi t = jumlah perlakuan Nilai n yang diperoleh dari rumus ini adalah 5 sampel, dengan jumlah perlakuan 3 perlakuan. 4.3.3 Teknik penentuan sampel
4
Teknik penentuan sampel penelitian in vitro dilakukan dengan cara berikut : 1. Aspirasi sampel dari Darah Perifer Manusia 2. Kultur sel Hematopoetik 3. Pemurnian sel 4. Hasil kultur kemudian di pantau dan di hari ke 5 diberi perlakuan. 4.4 Variabel
Penelitian ini terdiri dari variabel bebas dan tergantung. Selain itu ada variabel yang dikendalikan. Berikut uraian klasifikasi variabel. 4.4.1 Klasifikasi Variabel Variabel dalam penelitian ini adalah : 1. Variabel Bebas ( independent variable ) : dosis mitogen TGF B1, Activin A , dan
GM-CSF 2. Variabel tergantung ( dependent variable ) : tumbuhnya sel langerhans kulit
dengan indikator. Yaitu : a. Jumlah sekresi IL 12 b. Jumlah sekresi Interferon Gamma
3. Variabel kendali : suhu penyimpanan sel 370C, medium biakan, sterilitas, gas CO2 4.4.2 Definisi Operasional 1. Interferon- γ : Interferon-gamma ( IFN-γ ) adalah sebuah dimerized larut sitokin yang satu-satunya anggota kelas II jenis interferon . Interferon ini awalnya disebut makrofag-
5
mengaktifkan faktor , istilah yang sekarang digunakan untuk menggambarkan sebuah keluarga besar protein yang IFN- γ miliki. 2. Sel Langerhans : Sel efektor pembawa antigen imun pada kulit epidermis maupun di dermis. 3. IL-12 ( Interleukin 12 ) adalah suatu sitokin pleitropik interleukin yang secara natural diproduksi oleh dendritic cells, macrophage dan human B-lymphoblastoid cells (NC-37) dalam respon terhadap stimulasi antigen. -
4.5 Hubungan Antar Variabel VARIABEL BEBAS Dosis TGF-β1 Dosis Activin A Dosis GM-CSF
VARIABEL TERGANTUNG Sekresi IL-12 Sekresi IFN-γ
VARIABEL KENDALI Kualitas dari Medium Kultur
Bagan 4.2 Kerangka Hubungan Antar Variabel 4.6 Alat dan Bahan Penelitian
6
4.6.1. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Microscope Inverted 2. Incubator CO2 3. Laminar flow 4. Tabung Erleinmejer 2 buah 5. Beker Glass 6. Pipet Glass 5 – 10cc 7. Sentrifuge 8. Spuit 10 cc untuk ambil darah 9. Petridish 10. Microplate 24 well 11. Conjugated Anti Interferon Gamma atau bisa dengan Cytokin 12. ELISA Reader 13. Tabung centrifuge 15 ml, dan 50 ml 14. Yellow Tip 15. Blue Tip 16. Ficol
7 17. PBS 18. Eppendorf tube 19. Pipet Single Channel 20. Pipet Multichannel 21. Pipet Automatic untuk Glass Pipet 22. Conjugated Anti IL-12p70
4.6.2 Bahan penelitian 1. Bahan Human TGF Beta 1 ( sediaan stok : 1 µg ) Merk R & D System dengan No Katalog : 100B Perhitungan : Formulasi dalam bentuk beku ( Frezze dry ) dari 0,2µM solution didalam larutan aceton nitrite dan TFA dengan BSA ( Bovine Serum Albumin ) sebagai carrier protein. Cara Pengenceran adalah
dengan membuat larutan 4mM Hcl lalu ditambahkan
dengan 0,1 % BSA. Dosis yang direkomendasikan : 0,04 – 0,2 ng/ml Dosis yang digunakan : 0,05 ng/ml 3. Bahan Activin A ( sediaan stok : 5 µg )
Merk R & D System dengan No 003-ACTIVIN a Perhitungan :
8
Stok 5µg ditambahkan dengan 100 µl air sehingga menjadi konsentrasi 5000ng dalam 100µl dalam 10mM citric acid, pH 3. Pengenceran ini tahan selama 4 bulan dalam suhu 4oC. Jika akan digunakan maka diencerkan dengan PBS yang mengandung 2 mg/ml Albumin dan disimpan di suhu – 80oC. Dosis yang direkomendasikan : 0,2 – 2 ng/ml Dosis Activin A yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 0,2 ng/ml 4. Bahan GM-CSF ( Sediaan 10µg )
Merk R&D system dengan No katalog : DY215 Perhitungan : Terlebih dahulu diencerkan dengan 100µl PBS yang terdiri dari 0,1% Human/BSA Dosis yang direkomendasikan : 6 – 30 pg/ml Dosis yang digunakan adalah : 10 pg/ml 5. DMEM
Merk GIBCO DMEM/F12 dengan no katalog 21331-020 produksi Invitrogen (GIBCO) 4.7 Alur dan Prosedur Penelitian 4.7.1 . Prosedur Penelitian a. Pengambilan sampel penelitian = darah perifer b. Kultur sel Hematopoetic c. Pemurnian sel
9
d. Pengukuran Indikator Peningkatan sel Langerhans setelah diberikan Mitogen e. Alat dan Bahan f. Analisis Hasil perlakuan. Pasase Sel Hematopoetik •
Supernatan diambil dari kultur hematopoetik dan dimasukkan dalam tube 15 cc
•
Dilakukan sentrifugasi 1600 rpm, 5 menit , dalam suhu 28oC.
•
Kemudian supernatannya dibuang, pelletnya di resuspensi dengan medium penumbuh sebanyak 2cc.
•
Lalu kita bagi menjadi 2 petri dish 10 cm, dan kedalam masing masing petri dish ditambahkan 9 cc medium DMEM, kita masukkan inkubator
•
Pasase ini kita lakukan tiap 3 sampai 4 hari , karena bila lebih dari 5 hari maka sel-sel tersebut akan tumbuh terlalu padat sehingga nutrisi untuk sel juga semakin berkurang.
Prosedur Perlakuan •
•
Sampel dibagi dalam microplate 24 well dan dibagi menjadi 4 kelompok yaitu 1. Kelompok Kontrol
: hanya diberi DMEM
2. Kelompok perlakuan 1
: DMEM + TGF-β1 + GM-CSF
3. Kelompok perlakuan 2
: DMEM + GM-CSF + Activin A
4. Kelompok perlakuan 3
: DMEM + GM-CSF + TGF-β + Activin A
Masing-masing kelompok diamati tiap 3 hari dan diambil supernatannya untuk mengetahui kadar sekresi IL-12 dan IFN-γ
10 •
Diambil foto mikroskop dengan pembesaran 200x.
Pengambilan Sampel
4.7.2 Alur Penelitian
Kultur dengan Media yang berbeda
Penelitian
Pengukuran Indikator IL-12,IFN-γ untuk Sel Langerhans
Analisis Data
Bagan 4.3 Skema Alur penelitian 4.8. Analisis Data
Analisa data pada penelitian ini menggunakan : 4.8.1. Analisa deskriptif dengan ELISA 4.8.2. Analisa Normalitas data dengan Shapiro Wilk Test 4.8.3. Analisa Homogenitas Data dengan Levene’s test 4.8.4. Analisa Komparatif yang meliputi :
4.8.4.1 One Way Anova 4.8.4.2 Least Significant Difference- test ( LSD ) 4.8.4.2 Multivariete Test ( Manova )
11
4.8.1 Protokol ELISA Dengan menggunakan merk ebioscience Human IL-12 p70 Platinum ELISA BMS238/BMS238TEN dan ebioscience Human IFN-γ Platinum ELISA BMS228CE.
