Bab III Metodologi Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap yaitu, tahap isolasi kitin yang terdiri dari penghilangan protein, penghilangan mineral, tahap dua pembuatan kitosan dengan deasetilasi kitin, diteruskan dengan karakterisasi kitosan, kemudian tahap ketiga pengambilan sampel air, karakterisasi awal sampel air, pengolahan sampel air, dan analisis sampel air. III.1 Alat dan Bahan Penelitian
III.1.1 Alat
Peralatan yang dipakai adalah sebagai berikut : Blender, peralatan gelas dan non gelas, seperangkat alat pengaduk magnetik berpemanas, termometer, batang pengaduk, penyaring plastik, oven pengering, spatula, neraca digital, alat jar test, FTIR One Perkin Elmer, viskometer Ostwald, pH meter, Stop watch, Spectronic 20. III.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit udang kering, NaOH, HCl, CH3COOH, indikator universal, aquades, FeSO4.7H2O, tawas, hidrazin sulfat, heksametil tetraamin, sampel air sungai dan kertas saring.
III.2 Prosedur Penelitian
III.2.1 Sampel limbah udang
Sampel limbah udang kering yang terdiri dari bagian kulit badan dihaluskan dengan diremas-remas.
III.2.2 Isolasi kitin dari limbah udang
Isolasi kitin dari limbah udang dilakukan menggunakan metoda yang dikembangkan oleh No dan Meyers23, dengan beberapa modifikasi.
Metoda
isolasi kitin meliputi dua tahap yaitu penghilangan protein dan penghilangan mineral.
III.2.2.1 Penghilangan protein
Pada tahap ini protein dari limbah udang dipisahkan dengan cara memasukkan 50 g bubuk limbah udang ke dalam 500 mL larutan NaOH 3,5% b/v dan dipanaskan pada suhu 65◦C selama 2 jam, sambil terus diaduk dengan pengaduk magnetik. Selanjutnya campuran ini didinginkan, disaring dengan penyaring kain. Residu yang tersaring dicuci dengan air sampai netral kemudian dibilas dengan aquades. Residu netral yang merupakan kitin kasar dikeringkan dalam oven dengan suhu 65◦C selama 24 jam dan ditimbang. III.2.2.2 Penghilangan mineral
Limbah udang yang telah dihilangkan proteinnya dimasukkan ke dalam larutan HCl 1 M pada suhu kamar dengan perbandingan 1:15 (b/v) 23 selama 1 jam. Kitin kasar dimasukkan ke dalam larutan secara perlahan.
Proses pengadukan
dilakukan di atas pengaduk magnetik. Hasil reaksi disaring dengan menggunakan penyaring kain. Residu yang disaring dicuci dengan air sampai netral kemudian dibilas dengan aqua dm. Residu netral yang merupakan kitin kasar, dikeringkan dalam oven dengan suhu 65◦C selama 24 jam dan ditimbang.
III.2.3 Pembuatan Kitosan III.2.3.1 Tahap Deasetilasi Kitin menjadi kitosan
Kitin hasil isolasi dimasukkan ke dalam gelas kimia yang berisi larutan NaOH 50% b/v selama 4 jam pada suhu 100◦C dengan perbandingan 1:10 (b/v).
18
Campuran tersebut diaduk dengan menggunakan pengaduk magnetik, suhu diusahakan konstan. Hasil ekstrak kitin disaring menggunakan penyaring kain. Residunya yang merupakan kitosan, dicuci dengan air sampai netral dan dibilas menggunakan aquades.
Kitosan dikeringkan dalam oven dengan suhu 65◦C
selama 24 jam, kemudian ditimbang. Untuk menguji kelarutan kitosan, diambil sejumlah tertentu kitosan kemudian dilarutkan dalam asam asetat 1% v/v dengan perbandingan 3-4% b/v.
III.2.3.2 Karakterisasi Kitosan dan Penentuan Derajat Deasetilasi
Kitosan yang diperoleh kemudian dikarakterisasi dengan analisa spektrofotometri FTIR untuk penentuan derajat deasetilasi, dan ditentukan juga massa molekul rata-rata viskositas kitosan ( Mv ). Metode yang digunakan untuk karakterisasi menggunakan spektrofotometer FTIR adalah metode pelet KBr 8. Sebanyak 1 mg kitosan yang sudah diblender sampai halus dicampur dengan KBr 1% b/b. Campuran ini kemudian ditekan sehingga berbentuk pelet.
Pelet KBr yang
diperoleh dimasukkan ke tempat cuplikan dan direkam spektrum serapan infra merahnya pada bilangan gelombang 4000-650 cm-1. Penentuan derajat deasetilasi ditentukan dengan metode baseline16. Pada metode ini puncak tertinggi diukur dari garis dasar yang telah dipilih. Nilai absorbansi dapat dihitung dengan rumus sesuai persamaan (III.1). A = log (To/T)
(III.1)
Dimana : To = % transmitan pada garis dasar T = % transmitan pada puncak minimum Kemudian menghitung perbandingan nilai absorbansi pada bilangan gelombang 1655 cm-1 (serapan gugus amida) dengan absorbansi pada bilangan gelombang 3450 cm-1 (serapan gugus hidroksil). Nilai A1655 = 1,33 ditentukan sebagai Ndeasetilasi kitin yang sempurna (derajat deasetilasi 100%)15. Maka N-deasetilasi dihitung sesuai persamaan (III.2). % N-deasetilasi = {1 – [(A1655/A3450) x 1 1,33
19
]} x 100%
(III.2)
III.2.3.3 Penentuan Massa Molekul Rata-rata Kitosan
Untuk menentukan massa molekul rata-rata kitosan digunakan metode viskometri dengan menggunakan viskometer Ostwald. Waktu alir fluida sebanding dengan viskositas fluida, yang ditunjukkan pada persamaan berikut : ηsp = t – to
(III.3)
to Dengan: ηsp = viskositas jenis to = waktu alir pelarut (detik) t = waktu alir larutan kitosan (detik) Dengan menentukan waktu alir pelarut asam asetat (to) dan waktu alir larutan kitosan (t) dalam beberapa variasi konsentrasi (C) yaitu 0,0512 g per 100 mL; 0,1010 g per 100 mL; 0,2008 g per 100 mL; 0,3002 g per 100 mL; 0,4002 g per 100 mL dengan pelarut asam asetat maka diperoleh ηsp. Selanjutnya mengalurkan nilai konsentrasi (C) terhadap ηsp/C dan menariknya pada sumbu C = 0, sehingga diperoleh nilai [η]. Kemudian dengan persamaan Mark-Houwink yaitu : [η] = K. Mv a
(III.4)
dengan nilai K = 1,40 x 10-4 dan a = 0,83, maka diperoleh nilai massa molekul relatif rata-rata viskositas kitosan ( Mv ).
III.2.4 Penggunaan Kitosan Untuk Penjernihan Air
III.2.4.1 Pembuatan Sampel Air Keruh
Sebelum kitosan digunakan langsung untuk menjernihan air sungai, terlebih dahulu digunakan untuk menjernihkan sampel air simulasi dengan melarutkan FeSO4.7H2O sebanyak 0,0497 g dalam 1L air, sehingga diperoleh air keruh dengan konsentrasi 10 ppm dan disimpan selama 24 jam.
20
III.2.4.2 Pembuatan Larutan Induk Kitosan
Larutan induk kitosan dibuat dengan konsentrasi 10.000 ppm. Kitosan sebanyak 0,5 g dilarutkan dalam 50 mL asam asetat 1%. Larutan induk ini kemudian disimpan di lemari pendingin untuk prosedur selanjutnya. Dari larutan induk kitosan tersebut dibuat larutan kitosan dengan konsentrasi 500 ppm, untuk setiap pengerjaan. Sebanyak 2,5 mL dari larutan tersebut dilarutkan dalam aquades sampai volume 50 mL dalam labu takar.
III.2.4.3 Pembuatan Larutan Aluminium Sulfat
Larutan induk aluminium sulfat dibuat dengan konsentrasi 500 ppm. Sebanyak 0,025 g aluminium sulfat dilarutkan dalam aquades sampai volume 50 mL dalam labu takar.
III.2.4.4 Pembuatan Larutan Standar Hidrazin Sulfat
Sebagai larutan standar dibuat dua jenis larutan sebagai berikut : A. 0,25 g hidrazin sulfat dilarutkan dalam aquades sampai volume 25 mL dalam labu takar. B.
2,5 g heksametil tetraamin dilarutkan dalam aquades sampai volume 25 mL dalam labu takar.
Kemudian 5 mL larutan A dicampur dengan 5 mL larutan B dan disimpan selama 24 jam dalam gelas kimia terbuka. Campuran larutan A dan larutan B diencerkan sampai volume 100 mL dalam labu takar. Larutan hidrazin sulfat ini mempunyai nilai kekeruhan sebesar 400 NTU. Sebanyak 1,25 mL dari larutan itu dipipet, dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL dan ditambahkan aquades sampai tanda batas sehingga larutan ini mempunyai nilai kekeruhan sebesar 10 NTU. Dengan cara yang sama, dibuat pula larutan standar hidrazin sulfat dengan nilai kekeruhan 20 NTU, 30 NTU, 40 NTU. Kemudian diukur %Transmitan dengan Spectronic 20 pada panjang gelombang 420 nm dan ditentukan nilai absorbansi dari larutan
21
standar tersebut dan ditentukan persamaan regresi linier dengan menggunakan Microsoft Excel.
III.2.5 Karakterisasi Awal Sampel Air
Sampel air yang akan diolah dengan menggunakan koagulan kitosan dan tawas, terlebih dahulu dilakukan analisis terhadap dua parameter yaitu pH dan kekeruhan. pH sampel diuji dengan pH-meter, sedangkan kekeruhannya diuji dengan Spectronic 20.
III.2.5.1 Prosedur Pengukuran Kekeruhan
Tingkat kekeruhan sampel diukur dengan menggunakan alat Spectronic 20, dengan
membaca
transmitan
(%T),
yang
kemudian
ditentukan
nilai
absorbansinya. Sebelum penggunaan, alat dipanaskan terlebih dahulu selama kurang lebih 15 menit. Terlebih dahulu skala pembaca diatur ke posisi nol, dan kuvet yang berisi blanko yang berisi aquades dimasukkan ke dalam cell, dan skala diatur ke posisi 100. Kemudian kuvet yang sudah terisi sampel dimasukkan dan dibaca nilai transmitannya.
Kemudian dibuat spektrum absorpsi air keruh
simulasi untuk menentukan panjang gelombang maksimum, yang diperoleh dengan memilih absorbansi maksimum (puncak serapan maksimum) dengan menggunakan Spectronic 20 pada panjang gelombang 390-480 nm. gelombang maksimum untuk air keruh simulasi sebesar 420 nm.
Panjang Spektrum
terdapat pada Lampiran 3.
III.2.5.2 Prosedur Pengukuran pH
Derajat keasaman sampel diukur dengan menggunakan alat pHmeter.
Tahap
kalibrasi alat pHmeter perlu dilakukan sebelum alat pHmeter digunakan. Pertama, elektroda gelas pHmeter dibilas dengan aquades lalu dikeringkan, kemudian dicelupkan ke dalam larutan buffer pH = 4, lalu tekan tombol On dan
22
angka dibaca menunjukkan 4. Setelah itu dengan cara yang sama, pengkondisian dilakukan dengan menggunakan larutan buffer dengan pH = 8.
Pengukuran
derajat keasaman sampel dilakukan dengan cara mencelupkan elektroda gelas ke dalam sampel yang akan diukur, lalu tekan tombol On. Angka yang ditunjukkan merupakan deajat keasaman sampel tesebut.
III.2.6 Pengolahan sampel
Pada pengolahan sampel air digunakan alat jar test23 pengadukan.
dengan dua tahap
Ke dalam gelas kimia 600 mL dimasukkan sebanyak 200 mL
sampel air keruh buatan, kemudian ditambahkan koagulan kitosan dengan konsentrasi 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, dan 10 ppm. Untuk perbandingan maka ditambahkan pula pada gelas kimia lain koagulan tawas dengan variasi konsentrasi yang sama. Kemudian diaduk dengan alat pengaduk pada alat jar test dengan kecepatan 100 rpm selama 2 menit, selanjutnya dengan kecepatan 50 rpm selama 13 menit .
Larutan didiamkan selama 40 menit lalu dipisahkan
supernatannya dengan disaring dan dilakukan pemeriksaan pH dan kekeruhan. Selanjutnya dilakukan prosedur yang sama untuk penjernihan air sungai.
III.2.7 Analisis Sampel Air
1. Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH meter 2. Pengukuran kekeruhan dilakukan dengan menggunakan Spectronic 20 dengan mengukur nilai transmitannya dan menentukan nilai absorbansinya.
23
III.3 Bagan Alir Penelitian
Proses pembuatan kitosan dari limbah udang digambarkan pada Gambar III.1
Limbah udang kering - Dihaluskan - Dihilangkan protein, dengan dilarutkan dalam 500 mL larutan NaOH 3,5% b/v selama 2 jam sambil dipanaskan pada suhu 65oC dan diaduk - Disaring - Dicuci sampai pH netral dan dikeringkan (65oC, 24 jam) - Dihilangkan mineral, dengan dilarutkan dalam HCl 1 M dengan perbandingan 1:15 (b/v) selama 1 jam pada suhu kamar sambil diaduk - Disaring - Dicuci sampai pH netral dan dikeringkan (65oC, 24 jam)
Kitin
- Dideasetilasi
Kitosan
Gambar III 1 Diagram alir metode isolasi kitin dan kitosan dari limbah udang
24
Pengolahan sampel air dengan koagulan kitosan dan tawas dapat dilihat pada Gambar III.2
200 mL sampel air simulasi dalam gelas kimia 1 dan 2
200 mL sampel air sungai dalam gelas kimia 1 dan 2
- Diukur pH dan kekeruhan - Ditambahkan koagulan kitosan dalam gelas kimia 1 dan tawas dalam gelas kimia 2 dengan konsentrasi yang sudah ditetapkan - Diaduk dengan kecepatan 100 rpm (2 menit) - Diaduk dengan kecepatan 50 rpm (13 menit) - Didiamkan selama 40 menit - Disaring Supernatan
- Diukur pH - Diukur kekeruhan
Data nilai pH dan kekeruhan
Gambar III 2 Diagram alir pengolahan sampel air
25