Bab III Metodologi Penelitian III.1 Alat-alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: alat sentrifugasi 5.000 rpm dan 11.000 rpm; ball pipet; batang pengaduk; botol semprot; botol zat berbagai ukuran; buret 50 mL; cawan penguap; corong saring; corong vakum Buchner; freezer; gelas kimia 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL dan 1000 mL; gelas ukur 10 mL, 50 mL dan 100 mL; glukotester elektrik Life Scan tipe Smart Scan dari Johnson & Johnson®; injector 2 mL; inkubator 37oC Fisher model 503; kaca arloji; kawat kassa; kuvet plastik; labu Erlenmeyer 100 mL dan 250 mL; labu takar 100,00 mL; lemari pendingin 4oC; magnetic stirrer; mikropipet Eppendorf 500 μL dan 1000 μL beserta tip kuning dan tip biru; mortar dan stemper; neraca analitis Ohaus; pembakar Bunsen; penjepit kayu; pipet tetes; pipet ukur 1,00 mL, 10,00 mL dan 25,00 mL; pisau; plat tetes; rak tabung reaksi; spatula; spektrofotometer Spectronic–Genesys 20; tabung reaksi bertutup 15 mL; tabung sentrifugasi 5 mL; tripod; vortex; dan alat-alat gelas dan non gelas lainnya yang umum digunakan di laboratorium biokimia. Glukotester elektrik yang digunakan untuk mengukur kadar GDP hewan uji dalam penelitian ini dapat dilihat pada Gambar III.1.
Gambar III.1. Glukotester Life Scan tipe Smart Scan dari Johnson & Johnson® beserta strip yang digunakan untuk pengukuran kadar GDP hewan uji
26
III.2 Bahan-bahan Penelitian III.2.1 Tanaman Tin dan Hewan Uji Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah tin (Ficus carica L.) segar yang diperoleh dari Kompleks Pesantren Qiro’atus Sab’ah, Limbangan, Garut, Jawa Barat, seperti yang terlihat pada Gambar III.2.
(a)
(b)
Gambar III.2. Buah tin segar sebelum dikeringkan: (a) sebelum dipotong; dan (b) sesudah dipotong Adapun hewan uji yang digunakan adalah tikus putih jantan galur wistar (Rattus norvegicus L.) berumur 2 – 3 bulan, dengan berat masing-masing ± 200 g, sebanyak 35 ekor, seperti yang terlihat pada Gambar III.3. Tikus ini semuanya diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Klinik RSUP Dr. Hasan Sadikin, Bandung, Jawa Barat.
Gambar III.3. Tikus putih jantan galur wistar (Rattus norvegicus L.) yang digunakan sebagai hewan uji dalam penelitian
27
III.2.2 Bahan-bahan Kimia Adapun bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: aloksan monohidrat, C4H4N2O5.H2O (Sigma); amonia, NH3 (Merck); amonium molibdat, (NH4)2MoO4 (Merck); anhidrida asetat, (CH3CO)2O (Merck), asam klorida, HCl (Merck); asam sulfat, H2SO4 (Merck); aquades, H2O; barium hidroksida, Ba(OH)2 (Merck); dietil eter, C4H10O (Merck); etanol, C2H5OH (Merck); glukosa monohidrat, C6H12O6.H2O (Merck); indikator fenolftalein (Merck); kloroform, CHCl3 (Merck); natrium hidrogen arsenat heptahidrat, Na2HAsO4.7H2O (Merck); natrium bikarbonat, NaHCO3 (Merck); natrium kalium tartrat, NaKC4H4O6 (Merck); natrium karbonat, Na2CO3 (Merck); natrium sulfat anhidrat, Na2SO4 (Merck); pereaksi Dragendorff; pereaksi Mayer; tembaga(II) sulfat pentahidrat, CuSO4.5H2O (Merck); dan zink sulfat heksahidrat, ZnSO4.6H2O (Merck). III.2.3 Bahan-bahan Penunjang Adapun bahan-bahan penunjang lainnya yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: air minum distilasi dengan merk dagang Amidis®; kertas saring; tablet metformin dengan merk dagang Diabex®; dan pelet makanan tikus. III.2.4 Penyediaan Bahan-bahan Penelitian III.2.4.1 Larutan Aloksan Monohidrat Sebanyak 1,00 g aloksan monohidrat dilarutkan di dalam 10,00 mL aquades, sehingga diperoleh larutan aloksan monohidrat 100 mg/mL. Larutan yang diperoleh disimpan di dalam botol kaca dan dimasukkan ke dalam lemari pendingin. III.2.4.2 Larutan Arseno Molibdat Sebanyak 5,0 g amonium molibdat dilarutkan dalam 90 mL aquades, kemudian ditambahkan 4,2 mL asam sulfat pekat dan diaduk. Larutan yang diperoleh didinginkan pada suhu ruang. Selanjutnya ke dalam larutan tersebut ditambahkan larutan 0,6 g natrium hidrogen arsenat heptahidrat dalam 5 mL aquades dan diaduk sampai homogen. Larutan kemudian disimpan di dalam botol dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.(46)
28
III.2.4.3 Larutan Barium Hidroksida 0,3 N Sebanyak 150 mL aquades dididihkan kemudian didinginkan pada suhu ruang. Ke dalam 100 mL aquades tersebut kemudian ditambahkan 5,15 g barium hidroksida dan diaduk. Larutan yang diperoleh disimpan di dalam botol plastik.(46) III.2.4.4 Larutan Etanol 10% Sebanyak 3,01 mL etanol 99,5% dipipet dan diencerkan dengan aquades hingga 30 mL. III.2.4.5 Larutan Etanol 95% Sebanyak 9,55 mL etanol 99,5% dipipet dan diencerkan dengan aquades hingga 10 mL. III.2.4.6 Larutan Glukosa Standar Sebanyak 0,10 g glukosa monohidrat dilarutkan dengan aquades dalam labu takar 100 mL, kemudian diencerkan hingga tanda batas. Larutan standar glukosa yang diperoleh mempunyai konsentrasi 1 mg/mL. Larutan ini langsung diencerkan menjadi 8 larutan dengan konsentrasi yang berbeda, yaitu: 0,002; 0,003; 0,004; 0,005; 0,010; 0,020; 0,030; dan 0,040 mg/mL. Banyaknya volume larutan standar glukosa 1 mg/mL yang diencerkan dengan aquades hingga 100 mL untuk masingmasing konsentrasi dapat dilihat pada Tabel III.1. Tabel III.1. Volume larutan standar glukosa 1 mg/mL yang digunakan pada pengenceran larutan standar Konsentrasi larutan standar glukosa (mg/mL)
Volume larutan standar glukosa 1 mg/mL
0,002 0,003 0,004 0,005 0,010 0,020 0,030 0,040
0,20 mL 0,30 mL 0,40 mL 0,50 mL 1,00 mL 2,00 mL 3,00 mL 4,00 mL
29
III.2.4.7 Larutan Indikator Fenolftalein 1% Sebanyak 0,10 g fenolftalein dilarutkan di dalam 10 mL etanol 95%. Larutan indikator yang diperoleh kemudian disimpan di dalam botol cokelat. III.2.4.8 Larutan Somogyi–Nelson A Sebanyak 1,5 g natrium kalium tartrat, 3 g natrium karbonat, 2 g natrium bikarbonat dan 18 g natrium sulfat anhidrat dilarutkan dengan aquades, lalu diaduk sampai homogen. Larutan yang dihasilkan kemudian diencerkan dengan aquades dalam labu takar 100 mL hingga tanda batas. Selanjutnya larutan disimpan di dalam botol dan dimasukkan ke dalam lemari pendingin.(46) III.2.4.9 Larutan Somogyi–Nelson B Sebanyak 18 g natrium sulfat anhidrat dan 2 g tembaga(II) sulfat pentahidrat dilarutkan dengan aquades, lalu diaduk sampai homogen. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan H2SO4 pekat sebanyak 2 tetes. Larutan yang dihasilkan kemudian diencerkan dengan aquades dalam labu takar 100 mL hingga tanda batas. Selanjutnya larutan disimpan di dalam botol dan dimasukkan ke dalam lemari pendingin.(46) III.2.4.10 Larutan Somogyi–Nelson C Larutan pereaksi Somogyi–Nelson A dan B dicampurkan dengan perbandingan volume 4 : 1 sehingga diperoleh larutan C. Larutan ini harus segar sehingga proses pencampuran dilakukan beberapa saat sebelum pengukuran absorbansi.(46) III.2.4.11 Larutan Zink Sulfat Heksahidrat 5% Sebanyak 5 g zink sulfat heksahidrat dilarutkan dengan aquades dan diencerkan dalam labu takar 100 mL hingga tanda batas. Sebanyak 5 mL larutan ini kemudian dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer 100 mL, kemudian ke dalamnya ditambahkan 2 tetes indikator fenolftalein dan diencerkan dengan aquades hingga 25 mL. Selanjutnya larutan yang diperoleh dititrasi dengan barium hidroksida 0,3 N hingga mencapai titik akhir titrasi.(46)
30
III.2.4.12 Suspensi Metformin 5 mg/mL Sebanyak 10 butir tablet metformin, dengan berat masing-masing 50 mg, dihaluskan dan disuspensikan dalam 100 mL aquades. Selanjutnya suspensi disimpan di dalam botol dan dimasukkan ke dalam lemari pendingin. III.3 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Desember 2007 hingga bulan April 2008 dan bertempat di: a.
Laboratorium Penelitian Biokimia, Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung.
b.
Laboratorium Farmakologi Klinik, Fakultas Kedokteran, Universitas Padjadjaran, yang berlokasi di RSUP Dr. Hasan Sadikin, Bandung.
III.4 Metoda Penelitian III.4.1 Desain Penelitian Ruang
lingkup
penelitian
ini
adalah
eksperimental
laboratoris
dengan
menggunakan desain penelitian Rancangan Acak Lengkap (RAL). Pada penelitian ini dilakukan uji pemberian ekstrak air buah tin (Ficus carica L.) pada tikus putih jantan galur wistar (Rattus norvegicus L.) yang telah diinduksi dengan aloksan monohidrat untuk melihat efeknya terhadap kadar GDP hewan uji dan membandingkan efektivitasnya dengan pemberian metformin. III.4.2 Definisi Konsep dan Operasi Variabel III.4.2.1 Definisi Konsep Variabel Konsep variabel dalam penelitian ini terdiri dari variabel tidak bebas, variabel bebas dan variabel terkendali, dengan rincian sebagai berikut: a.
variabel tidak bebas yaitu kadar GDP;
b.
variabel bebas terdiri dari dosis ekstrak air buah tin dan dosis metformin; dan
c.
variabel terkendali terdiri dari galur, jenis kelamin, berat badan, umur, makanan dan minuman.
31
III.4.2.2 Definisi Operasi Variabel a.
Kadar GDP ditentukan dengan dua jenis metoda, yaitu metoda enzimatik dengan glukotester Life Scan tipe Smart Scan dan metoda Somogyi–Nelson yang
berdasarkan
pada
penentuan
absorbansi
dengan
metoda
spektrofotometri sinar tampak pada panjang gelombang 660 nm. b.
Dosis ekstrak air buah tin yang digunakan adalah 25 mg/kgBB, 50 mg/kgBB, 100 mg/kgBB dan 200 mg/kgBB per oral.
c.
Dosis metformin yang digunakan adalah 50 mg/kgBB per oral.
d.
Hewan uji adalah tikus putih jantan galur wistar (Rattus norvegicus L.), berumur 2 – 3 bulan, sebanyak 35 ekor, dengan berat rata-rata ± 200 g.
e.
Makanan hewan uji berupa pelet standar dan minumannya berupa air.
III.4.3 Jumlah Sampel Jumlah sampel atau hewan uji berupa tikus putih jantan galur wistar (Rattus norvegicus L.) untuk setiap kelompok adalah 4 ekor. III.5 Prosedur Penelitian III.5.1 Pembuatan Ekstrak Air Buah Tin (Ficus carica L.) Buah tin segar sebanyak ± 500 gram dibersihkan, dikupas, diiris dan dikeringkan di bawah sinar matahari. Sebanyak 100 gram buah tin yang sudah kering ditambahkan ke dalam 500 mL aquades lalu dididihkan selama satu jam di atas api sedang. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dengan penyaring vakum Buchner. Filtrat yang dihasilkan selanjutnya disentrifugasi pada suhu 4oC dengan kecepatan 11.000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh dipisahkan dari suspensinya. Selanjutnya ke dalam supernatan tersebut ditambahkan 5 tetes larutan etanol 10%, kemudian disimpan di dalam freezer untuk proses selanjutnya. III.5.2 Analisis Fitokimia Analisis fitokimia terhadap simplisia buah tin (Ficus carica L.) yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi penapisan beberapa metabolit sekunder yaitu alkaloid, saponin, steroid dan triterpenoid.
32
III.5.2.1 Uji Alkaloid Sebanyak 2 gram serbuk simplisia buah tin (Ficus carica L.) dalam mortar dibasakan dengan 5 mL amonia encer lalu ditambah 10 mL kloroform sambil digerus kuat-kuat. Lapisan kloroform dipipet sambil disaring, kemudian ke dalamnya ditambahkan 5 mL HCl 2 N. Campuran larutan tersebut dikocok hingga terdapat dua lapisan. Lapisan asam dipisahkan dan dibagi menjadi tiga bagian. Bagian pertama digunakan sebagai blanko. Bagian kedua ditetesi pereaksi Mayer, terbentuknya endapan warna putih menunjukkan adanya alkaloid. Sementara bagian ketiga ditetesi pereaksi Dragendorff, terbentuknya endapan jingga merah menunjukkan adanya alkaloid.(47) III.5.2.2 Uji Saponin Sebanyak 1 gram simplisia buah tin (Ficus carica L.) digerus dengan 10 mL air suling dan dipanaskan beberapa saat, lalu disaring. Setelah dingin, filtrat dalam tabung reaksi dikocok kuat-kuat selama beberapa menit. Pembentukan busa setinggi minimal 1 cm dan bertahan selama 5 – 10 menit serta tidak hilang pada penambahan 1 tetes larutan HCl 0,1 N menunjukkan adanya saponin.(48) III.5.2.3 Uji Steroid dan Triterpenoid Sebanyak 1 gram simplisia buah tin (Ficus carica L.) digerus dengan 20 mL eter, kemudian dipipet sambil disaring. Filtrat yang diperoleh kemudian diuapkan dalam cawan penguap hingga kering. Ke dalam filtrat tersebut ditambahkan pereaksi Liebermann–Burchard yang terdiri dari 2 tetes H2SO4 pekat dan 1 tetes anhidrida asetat. Terbentuknya warna ungu menunjukkan adanya senyawa triterpenoid sedangkan terbentuknya warna hijau–biru menunjukkan adanya senyawa steroid.(47) III.5.3 Perlakuan Terhadap Hewan Uji Sebanyak 35 ekor tikus putih jantan galur wistar (Rattus norvegicus L.) sebagai hewan uji disiapkan, ditimbang berat badannya dan diadaptasikan selama tujuh hari. Sejak hari pertama proses adaptasi tersebut, semua tikus diberi makanan pelet dan minuman secukupnya. Setelah proses adaptasi, masing-masing tikus
33
dipuasakan selama 12 jam lalu diperiksa kadar GDP–nya dengan glukotester elektrik dan dengan metoda Somogyi–Nelson sehingga diperoleh data kadar GDP pra induksi. Dari ke–35 ekor tikus tersebut diambil empat ekor tikus dan dimasukkan ke dalam kelompok satu (K.1). Sisa tikus sebanyak 31 ekor diinduksi dengan larutan aloksan monohidrat secara intravena dengan dosis 125 mg/kgBB, lalu didiamkan selama 60 jam. Selanjutnya GDP–nya diperiksa kembali dengan metoda yang sama setelah dipuasakan terlebih dahulu selama 12 jam sehingga diperoleh data kadar GDP pasca induksi pada T0. Tikus yang mempunyai kadar GDP di atas 126 mg/dL dipilih sebagai tikus diabetes. Semua tikus diabetes dibagi menjadi enam kelompok secara acak, masing-masing terdiri dari empat ekor, sisanya digunakan sebagai cadangan. Dengan demikian, secara keseluruhan terdapat tujuh kelompok tikus dengan perlakuan berbeda sebagai berikut: a.
kelompok 1 (K.1)
: kontrol negatif, tidak diinduksi dengan larutan aloksan monohidrat, diberi makan dan minum;
b.
kelompok 2 (K.2)
: kontrol positif, diinduksi dengan larutan aloksan monohidrat 125 mg/kgBB secara intravena, diberi makan dan minum, diberi Amidis® 1 mL per oral setiap hari
c.
kelompok 3 (K.3)
: kelompok pembanding, diinduksi dengan larutan aloksan
monohidrat
125
mg/kgBB
secara
intravena, diberi makan dan minum, diberi metformin 50 mg/kgBB per oral setiap hari; d.
kelompok 4 (K.4)
: diinduksi dengan larutan aloksan monohidrat 125 mg/kgBB secara intravena, diberi makan dan minum, diberi ekstrak air buah tin 25 mg/kgBB per oral setiap hari;
e.
kelompok 5 (K.5)
: diinduksi dengan larutan aloksan monohidrat 125 mg/kgBB secara intravena, diberi makan dan minum, diberi ekstrak air buah tin 50 mg/kgBB per oral setiap hari;
34
f.
kelompok 6 (K.6)
: diinduksi dengan larutan aloksan monohidrat 125 mg/kgBB secara intravena, diberi makan dan minum, diberi ekstrak air buah tin 100 mg/kgBB per oral setiap hari; dan
g.
kelompok 7 (K.7)
: diinduksi dengan larutan aloksan monohidrat 125 mg/kgBB secara intravena, diberi makan dan minum, diberi ekstrak air buah tin 200 mg/kgBB per oral setiap hari.
Perlakuan mula-mula dilakukan selama tujuh hari. Selanjutnya kadar GDP–nya diperiksa kembali dengan metoda yang sama setelah dipuasakan selama 12 jam sehingga diperoleh data kadar GDP pasca induksi pada T7. Dan dengan cara yang sama pula, dilakukan pemeriksaan kadar GDP pasca induksi pada T14 dan T21. III.5.4 Pemeriksaan Kadar GDP III.5.4.1 Pemeriksaan dengan Glukotester Elektrik Sebelum dilakukan pemeriksaan kadar GDP, tiap tikus dipuasakan terlebih dahulu selama 12 jam. Alat yang digunakan dalam metoda ini yaitu glukotester elektrik Life Scan tipe Smart Scan dari Johnson & Johnson®. Cuplikan darah diambil dari bagian ekor tikus dan diteteskan ke atas strip yang sudah terpasang pada bagian tertentu dari glukotester elektrik, seperti terlihat pada Gambar III.4. Nilai kadar GDP dapat dilihat pada layar setelah 15 detik, seperti terlihat pada Gambar III.5. Nilai kadar GDP yang tertera pada layar adalah nilai dalam mg/dL.
Gambar III.4. Proses penetesan cuplikan darah hewan uji ke atas strip glukostester elektrik Life Scan tipe Smart Scan
35
Gambar III.5. Tampilan nilai kadar GDP yang terbaca pada layar glukotester elektrik Life Scan tipe Smart Scan III.5.4.2 Pemeriksaan dengan Metoda Somogyi–Nelson Sebelum dilakukan pemeriksaan kadar GDP, tiap tikus dipuasakan terlebih dahulu selama 12 jam. Cuplikan darah tikus yang diambil dari ekornya mula-mula diteteskan ke atas plat tetes secukupnya, lalu diambil sebanyak 0,05 mL dengan menggunakan mikropipet Eppendorf 500 μL melalui tip kuning dan ditambahkan ke dalam tabung sentrifugasi 5 mL yang sudah berisi 1,95 mL aquades. Pipet dibilas dengan aquades yang ada di dalam tabung tersebut minimal tiga kali, lalu diaduk. Ke dalam larutan tersebut kemudian ditambahkan 1,50 mL barium hidroksida 0,3 N dan diaduk hingga berwarna cokelat, lalu ditambah 1,50 mL zink sulfat heksahidrat 5% dan diaduk lagi. Selanjutnya campuran didiamkan selama lima menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 20 menit. Filtrat darah bebas protein kemudian didekantasi dan dipindahkan ke dalam wadah yang lain, lalu disimpan di dalam lemari pendingin untuk proses selanjutnya.(46,49,50) Tabung blanko berisi 1,00 mL aquades, tabung larutan standar berisi 1,00 mL larutan glukosa standar dengan beberapa variasi konsentrasi, sedangkan tabung cuplikan berisi 1,00 mL filtrat darah. Ke dalam tabung-tabung tersebut selanjutnya ditambahkan 1,00 mL larutan Somogyi–Nelson C, yang merupakan campuran antara pereaksi Somogyi–Nelson A dan B. Semua tabung lalu ditutup
36
dan dipanaskan di atas penangas air mendidih selama 20 menit. Setelah didinginkan pada suhu ruang, ke dalam semua tabung ditambahkan 1,00 mL pereaksi arsenomolibdat, lalu dikocok dengan vortex hingga semua gelembung gas hilang. Ke dalam semua campuran tersebut kemudian ditambahkan 7,00 mL aquades dan diaduk kembali dengan vortex hingga homogen. Setelah itu, absorbansinya diukur dengan spektrofotometer Spectronic–Genesys 20 pada panjang gelombang 660 nm. Pengukuran absorbansi dilakukan sebanyak tiga kali dan nilai absorbansi yang diambil adalah nilai rata-rata dari ketiga nilai absorbansi tersebut.(46,49,50) Diagram alir pemeriksaan kadar GDP dengan metoda Somogyi–Nelson dapat dilihat pada Gambar III.10. Adapun kadar GDP hewan uji dapat ditentukan melalui persamaan (3.1). (3.1) di mana Cu
= kadar glukosa darah puasa cuplikan (mg/mL)
Au
= absorbansi cuplikan
As
= absorbansi larutan glukosa standar
Cs
= konsentrasi larutan glukosa standar (mg/mL)
Vu
= volume darah hewan uji (mL)
Du
= volume akhir di mana cuplikan diencerkan (mL)
Ds
= volume akhir di mana glukosa standar diencerkan (mL)
III.6 Analisis Data Hasil penelitian dianalisis secara statistik untuk pengujian hipotesis menggunakan analisis varian oneway ANOVA. Jika hasil analisis varian menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan maka dilanjutkan dengan uji jarak berganda DUNCAN dengan derajat kepercayaan 95% (p ≤ 0,05). Analisis dilakukan dengan program SPSS for Windows versi 13.0.
37
III.7 Diagram Alir Penelitian III.7.1 Pembuatan Ekstrak Air Buah Tin (Ficus carica L.)
± 500 g buah tin matang dan segar
dibersihkan dengan air dibuang kulitnya diiris tipis dikeringkan di bawah sinar matahari
Buah tin kering
100 g buah tin kering ditambah 500 mL aquades dididihkan selama 1 jam Suspensi merah kecokelatan disaring dengan corong Buchner Filtrat merah kecokelatan disentrifugasi dengan kecepatan 11.000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit Supernatan ditambah 5 tetes etanol 10% dimasukkan ke dalam botol disimpan di dalam freezer Ekstrak air buah tin siap digunakan diuji aktivitas hipoglikemiknya terhadap hewan uji yang sudah diinduksi dengan aloksan monohidrat Hasil
Gambar III.6. Prosedur pembuatan ekstrak air buah tin (Ficus carica L.)
38
III.7.2 Perlakuan Terhadap Hewan Uji 35 Ekor tikus putih jantan
ditimbang diadaptasikan selama 7 hari dipuasakan selama 12 jam kadar GDP diperiksa dengan glukotester elektrik dan metoda Somogyi–Nelson
Tikus dengan kadar GDP normal
Kelompok non induksi sebanyak 4 ekor
Kelompok induksi sebanyak 31 ekor
diinduksi dengan aloksan 125 mg/kgBB didiamkan 60 jam dipuasakan selama 12 jam GDP diperiksa pada T0 dengan glukotester elektrik dan metoda Somogyi–Nelson
Tikus dengan kadar GDP ≥ 126 mg/dL dibagi menjadi 6 kelompok secara acak, masingmasing terdiri dari 4 ekor sisanya digunakan sebagai cadangan
K.1
K.2
K.3
Kontrol –
Kontrol +
Pembanding
Aquades
Aquades
Metformin 50 mg/kgBB
K.4
K.5
K.6
K.7
Ekstrak buah tin 25 mg/kgBB
Ekstrak buah tin 50 mg/kgBB
Ekstrak buah tin 100 mg/kgBB
Ekstrak buah tin 200 mg/kgBB
diberi perlakuan setiap hari pada jam yang sama dipuasakan 12 jam sebelum pemeriksaan GDP GDP diperiksa pada T7, T14 dan T21 dengan glukotester elektrik dan metoda Somogyi–Nelson data dianalisis
Data GDP pada T7, T14 dan T21 Gambar III.7. Perlakuan terhadap hewan uji tikus putih jantan galur wistar (Rattus norvegicus L.)
39
III.7.3 Pemeriksaan Kadar GDP dengan Metoda Somogyi–Nelson 0,05 mL darah tikus putih jantan galur wistar (Rattus norvegicus L.)
dipipet ke dalam tabung sentrifugasi 5 mL yang berisi 1,95 mL aquades diaduk ditambah 1,50 mL Ba(OH)2 0,3 N diaduk
Warna cokelat
ditambah 1,50 mL ZnSO4.6H2O 5% diaduk dibiarkan 5 menit disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 rpm selama 20 menit
Filtrat darah bebas protein didekantasi 1,00 mL filtrat darah
1,00 mL glukosa standar dengan berbagai konsentrasi
1,00 mL aquades
dimasukkan ke dalam tabung reaksi 15 mL ditutup dipanaskan di atas penangas air mendidih selama 20 menit didinginkan pada suhu ruang ditambah 1,00 mL arsenomolibdat dikocok dengan vortex ditambah 7,00 mL aquades dan diaduk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm
Data absorbansi Gambar III.8. Prosedur pemeriksaan kadar GDP dengan metoda Somogyi– Nelson
40
