BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Kelautan untuk membuat ekstrak daun sirih, Laboratorium Fisiologi Hewan Air (FHA) untuk mengukur nilai hematokrit ikan dan di Hatcery Ciparanje Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran Jatinangor untuk pemeliharaan ikan. Penelitian ini dilaksanakan selama 2 bulan mulai bulan Februari 2013 sampai dengan April 2013. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya : 1. Wadah penelitian (akuarium) dengan ukuran 40x40x80 cm sebanyak 20 buah sebagai wadah ikan uji yang akan dipelihara 2. Selang aerasi dan batu aerasi 3. pH meter digunakan untuk mengukur derajat keasaman (pH) 4. DO meter digunakan untuk mengukur oksigen 5. Termometer digunakan untuk mengukur suhu air 6. Timbangan digital digunakan untuk menimbang bobot ikan dan berat pakan 7. Serokan ikan digunakan untuk mengambil ikan uji 8. Dissecting kit digunakan untuk membedah ikan dalam pengambilan darah 9. Rotary evaporator digunakan untuk mengesktrak daun sirih 10. Penjepit arteri digunakan untuk membendung aliran darah agar tidak keluar dari jantung 11. Sentrifuse digunakan untuk memisahkan senyawa dari berat molekul yang berbeda 12. “Hematocrit reading chart” untuk membaca nilai hematokrit Alat-alat penelitian disajikan pada Lampiran 11.
18
19
3.2.2 Bahan Penelitian 1. Ikan Uji (ikan nila gift) yang digunakan untuk penelitian berukuran 8-10 cm dengan bobot 30gram/ekor. Jumlah ikan uji sebanyak 325 ekor 2. Pakan uji yang digunakan sebanyak 40 kg dengan merk 781. 3. Bubuk daun sirih yang digunakan untuk membuat ekstrak daun sirih sebanyak 1 kg 4. Wax/malam lilin untuk menyumbat salah satu ujung pipa kapiler yang berisi darah segar. 5. Tabung kapiler digunakan untuk tempat saat darah ikan akan diukur hematokrit, tabung kapiler yang digunakan sebanyak 160 buah. 6. Methanol sebanyak 6 liter yang digunakan untuk membuat ekstrak daun sirih (Lampiran 12)
3.3 Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan empat kombinasi perlakuan ditambah satu perlakuan kontrol dan diulang sebanyak tiga kali. Perlakuannya adalah pemberian pakan dengan penambahan ekstrak daun sirih yang berbeda yaitu : Perlakuan A
: 100 g pakan tanpa penambahan ekstrak daun sirih (kontrol)
Perlakuan B
: 100 g pakan yang di campur dengan 2 ml ekstrak daun sirih
Perlakuan C
: 100 g pakan yang di campur dengan 4 ml ekstrak daun sirih
Perlakuan D
: 100 g pakan yang di campur dengan 6 ml ekstrak daun sirih
Perlakuan E
: 100 g pakan yang di campur dengan 8 ml ekstrak daun sirih
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Tahap Pesiapan 1.
Wadah Pemeliharaan Sebelum digunakan wadah pemeliharaan berupa akuarium dibersihkan
terlebih dahulu dengan cara membilasnya menggunakan air bersih agar wadah yang digunakan tidak kotor dan bersih dari penyakit.
20
2.
Pembuatan ekstrak daun sirih
Tahapan Pembuatan ekstrak daun sirih yaitu : -
Daun sirih yang telah kering di dihaluskan dengan menggunakan blender
-
Daun sirih yang telah halus direndam dengan pelarut methanol selama 1x24 jam
-
Kemudian daun sirih yang telah halus disaring, hasil saringan di evaporasi dengan menggunakan rotari evaporator pada suhu 650C selama 3 jam
-
Setelah itu didapat ektrak daun sirih murni dengan cairan kental yang berwarna coklat. (Lampiran 13)
3. Penambahan ekstrak daun sirih pada pakan Penambahan ekstrak daun sirih pada pakan dilakukan dengan menggunakan spray, ekstrak yang akan digunakan diukur terlebih dahulu sebelum disemprotkan, kemudian campurkan pada pakan dengan merata.
3.4.2
Tahap Pelaksanaan Penelitian
1. Persiapan Ikan Uji dan Stok Ikan Ikan uji yang telah diadaptasi selama 1 hari dalam bak fiber, dimasukan ke dalam akuarium yang telah disiapkan sebanyak 15 ekor, kemudian diadaptasi selama 1 hari di akuarium. Stok ikan ditempatkan dalam akuarium yang sama dengan akuarium yang digunakan sebanyak 5 buah. Stok ikan ini dipelihara selama penelitian (satu bulan) dan digunakan sebagai ikan pengganti dalam penelitian utama. Pada masing-masing akuarium penelitian dimasukkan benih ikan nila sebanyak 15 ekor dengan padat tebar 1ekor/L dan diberi pakan yang ditambah ekstrak daun sirih sesuai dengan pelakuan (2ml, 4ml, 6ml,8ml/ 100 g pakan) pada penelitian. Pemberian pakan sebanyak 12 % dari biomassa ikan perhari Pemberian pakan dilakukan selama satu bulan dengan cara disebar keseluruh permukaan media pemeliharaan dengan frekuensi pemberian pakan tiga kali sehari yaitu pukul 08.00, 12.00, 16.00 WIB.
21
2. Penyiponan dan pergantian air Selama pemeliharaan dilakukan penyiponan dan pergantian air untuk menjaga kualitas air dan membuang kotoran ikan dari akuarium. Penggantian air sebanyak 50%. Penyiponan dan penggantian air dilakukan seminggu tiga kali. 3. Pengamatan Kelangsungan Hidup Pengamatan kelangsungan hidup dilakukan setiap hari dengan cara mencatat jumlah ikan yang mati pada setiap akuarium. 4. Pengambilan Sampel Darah (Lampiran 14) Pengambilan sampel darah dilakukan seminggu sekali. Ikan yang diambil sebanyak 3 ekor perakuarium sebagai perwakilan ikan yang diberi perlakuan dan diganti dengan ikan baru (stok) sesuai dengan jumlah ikan yang diambil. Prosedur pengambilan dan perhitungan kadar hematokrit ikan yaitu : -
Ikan yang berada di dalam akuarium di timbang dan di catat bobotnya
-
Ikan uji dipegang dengan menggunakan tangan kiri lalu ikan dimatikan dengan cara menusukan sonde pada bagian anterior kepala ikan (tepat dibagian otak depan) hingga terasa ada rongga, putar sonde perlahan-lahan sehingga otaknya rusak dan ikan akan pingsan.
-
Ikan dibedah hingga terlihat organ jantung yang berdenyut secara teratur (exposed organ jantung dengan sinus venosus yang terlihat pucat)
-
Aorta ventralis dijepit menggunakan penjepit arteri ventralis lalu biarkan beberapa saat hingga sinus venosus terisi penuh oleh darah
-
Aorta ventralis diputuskan dengan menggunakan gunting, lalu siapkan dan dekatkan salah satu ujung pipa kapiler sambil dibuka penjepit arteri secara perlahan-lahan dan hati-hati tampung darah dalam pipa kapiler tersebut sampai 3/4 volumenya.
-
Agar heparin yang terdapat dalam dinding sebelah dalam pipa kapiler tercampur secara homogen, maka pipa kapiler yang telah berisi darah tersebut digoyang dengan hati-hati ke kiri dan kanan serta diputar. Ciri bahwa darah tersebut sudah tercampur secara homogen dengan heparin, darah tidak membeku dan bisa bergerak disepanjang kolom pipa kapiler.
22
-
Salah satu ujung pipa kapiler ditutup dengan menggunakan wax/malam lilin yang telah disediakan
-
Sentrifuse hematokrit disiapkan dan pipa kapiler di letakan dalam sentrifuse secara seimbang antara masing-masing pipa kapiler (jangan terbalik meletakan ujung pipa yang bertutup)
-
Sentrifuse selama 4 menit pada kecepatan 11.000 rpm
-
Pipa kapiler yang selesai disentrifuge diletakan pada “Hematocrit reading chart” selanjutnya dibaca kadar plasma darah sebagai batas atas dan sel darah sebagai batas bawah, lalu tentukan dan baca nilai hematokrit pada batas atas sel darah (dalam %)
23
3.5 Parameter yang Diamati Parameter yang diamati diantaranya : 1. Kadar Hematorkrit Ikan Pengukuran kadar hematokrit dilakukan dengan cara membandingkan volume sel darah terhadap volume seluruh darah dengan menggunakan skala hematokrit (Alifuddin 1996). H1 Hematokrit =
x100 % H2
Keterangan : H1 = Volume Sel Darah H2 = Volume Cairan Darah
2. Kelangsungan Hidup Tingkat kelangsungan hidup dihitung berdasarkan persamaan yang dikemukakan oleh Huisman (1987) yaitu : SR (%) = Nt/No x 100 % Keterangan : SR = Kelangsungan Hidup ikan (%) Nt = Jumlah ikan uji pada akhir penelitian (ekor) No =Jumlah ikan uji pada awal penelitian (ekor)
3.6 Analisis Data Data hasil pengukuran persentase hematokrit dan tingkat kelangsungan hidup ikan nila gift pada masing-masing perlakuan dianalisis dengan menggunakan analisis ragam (ANOVA), jika berbeda nyata maka dilanjutkan dengan Uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 95% (Gaspersz 1995). Untuk penentuan dosis optimum ekstrak daun sirih dengan menggunakan analisis regresi.
