BAB III METODE PENELITIAN

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan adalah jenis penelitian eksperimen. Termasuk jenis penelitian ekperimen karena observasi di bawah kondisi buatan (artificial condition), dan kondisi tersebut dibuat dan diatur. Penelitian ini dilakukan dengan mengadakan manipulasi objek penelitian serta adanya kontrol sebagai perbandingan dalam eksperimen (Nazir, 2003:63) Objek dalam penelitian ini adalah produksi pigmen yang dihasilkan oleh M. purpureus yang dinyatakan dalam satuan Unit Absorbansi per gram substrat. Kontrol dalam penelitian ini yaitu substrat tepung biji durian yang tidak diberikan inokulum spora M. purpureus.

B. Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan adalah desain Rancangan Acak lengkap (RAL). Pada penelitian terdapat tiga variabel penelitian yaitu variabel bebas, variabel terikat dan variabel kontrol. Variabel bebasnya yaitu konsentrasi inokulum spora M. purpureus. Sedangkan variabel terikatnya yaitu produksi pigmen M. purpureus. Kemudian untuk variabel kontrolnya adalah Jenis substrat, jenis organisme yang digunakan, pH substrat, waktu dan suhu inkubasi. Penelitian ini terdiri dari 4 perlakuan yaitu inokulum spora M. purpureusdengan konsentrasi 0%, 5%, 10%, 15%. Setiap perlakuan akan dilakukan pengulangan dengan mengikuti rumus (t) (r) – 1 ≥ 20 (Gomez, 1995). Dimana t adalah perlakuan (treatment), sedangkan r adalah pengulangan (replication).

21

Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

22

Dengan demikian: (t) (r − 1) ≥ 20 (4) (r − 1) ≥ 20 (r − 1) ≥ 5 r≥6 Berdasarkan perhitungan di atas, maka banyaknya pengulangan yang harus dilakukan adalah minimal enam kali. Maka terdapat 24 unit percobaan. 24 unit percobaan ini diletakkan secara acak, mengikuti aturan bilangan acak yang diperoleh dengan menggunakan pengocokan secara manual.Unit percobaan disusun seperti Tabel 3.1 dan untuk penempatan botol dalam inkubator tersaji dalam Gambar 3.1. Tabel 3.1. Desain Rancangan Acak Lengkap 91

66

65

9

162 158 105

24

114 112

17

42

31

142

23

150

85

133

27

40

100

68

161

73

52

14

16

8

156

34

26

144

90

148

94

97

13

87

54

25

145

55

113

67

77

63

15

82

110

81

12

20

125

19

123

10

152 136 107

39

121

32

28

1

137

62

108

56

69

99

57

102

72

38

45

103 129

11

134

92

79

75

126

61

50

109 118

37

60

166 131 143

30

153

78

95

80

46

146 111

44

155 104

76

70

164

93

101

89

98

160 124

84

21

159 140

53

147 106

59

128

4

29

41

83

48

2

139

88

74

33

132 122 115 138

71

119

49

141

22

6

58

130

47

154

3

51

36

167 120

135

35

151 168 165 116

86

149

96

18

163

43

5

117 151

7

127

64


23

Keterangan: 1. Konsentrasi inokulum 0%

2. Konsentrasi inokulum 5%

a. Hari ke 1: botol nomor 1-6


b. Hari ke 3 : botol nomor 7-12

b. Hari ke 3: botol nomor 49-54

c. Hari ke 5 : botol nomor 13-18

c. Hari ke 5: botol nomor 55-60

d. Hari ke 7 : botol nomor 19-24

d. Hari ke 7: botol nomor 61-66

e. Hari ke 9 : botol nomor 25-30

e. Hari ke 9: botol nomor 67-72

f. Hari ke 11: botol nomor 31-36

f. Hari ke 11:botol nomor 73-78

g. Hari ke 13: botol nomor 37-42





a. Hari ke 1 : botol nomor 127-132

b. Hari ke 3: botol nomor 91-96

b. Hari ke 3 : botol nomor 133-138

c. Hari ke 5: botol nomor 97-102

c. Hari ke 5 : botol nomor 139-144

d. Hari ke 7: botol nomor 103-108

d. Hari ke 7 : botol nomor 145-150

e. Hari ke 9: botol nomor 109-114

e. Hari ke 9 : botol nomor 151-156

f. Hari ke 11: botol nomor 115-120

f. Hari ke 11 : botol nomor 157-162


g. Hari ke 13 : botol nomor 163-168


24

Gambar 3.1 Penempatan botol fermentasi (Sumber: Dokumentasi Pribadi )

C. Populasi dan Sampel Populasi

: Seluruh substrat tepung biji durian yang berada dalam botol fermentor.

Sampel

: 1 gram substrat tepung biji durian yang diambil dari botol fermentor

untuk

pengukuran

produksi

pigmen

M.

purpureus.

D. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Februari 2013 sampai dengan bulan Juli 2013.Serta dilakukan di Laboratorium Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI.


25

E. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Alat Tabel 3.2 Alat Penelitian No. Alat

Spesifikasi

Jumlah

1.

Autoclave

HL36AE

1 unit

2.

Jarum inokulasi

3.

Tabung reaksi

Pyrex

10 unit

4.

Timbangan digital

PT25.221.03.018BF

1 unit

5.

Gelas ukur

Pyrex, 250 mL

3 unit

6.

Vorteks homogenizer

PT25.221.03.044BM

1 unit

7.

Shaker bath

PT25.2221.03004 BM

1 unit

8.

Spektrofotometer

PT25-22103021BF(2/2)

1 unit

9.

Alumunium foil

10.

Plastik tahan panas

11.

Karet gelang

200 unit

13.

pH indikator

50 lembar

14.

Kain sumbat

60 unit

15.

Haemocytometer

1 unit

16.

Inkubator

1 unit

17.

Erlenmayer

Pyrex 500 mL

20 unit

18.

Erlenmayer

Pyrex 100 mL

25 unit

19.

Termometer

0-100˚C

2 unit

20.

Wadah plastik

21.

Mikroskop Listrik

3 unit

1 pack Ukuran ½ kg

40 lembar

168 unit Shimadzu BI-71-16126

1 unit


26

22.

Spatula

4 unit

23.

Pembakar spirtus

1 unit

24.

Korek api

1 kotak

25.

Batang pengaduk

1 unit

26.

Botol gelas ukuran 1 L

1 unit

27.

Papan miring

1 unit

28.

Hot plate & magnetic stireer

29.

Oven

1 unit

30.

Loyang

1 unit

31.

Pisau

1 unit

PT25.221.03.023 BM (1/2)

1 unit

2. Bahan No.

Bahan

Spesifikasi

Jumlah

1.

Monascus purpureus

Kapang

18 isolat

2.

Tepung biji durian

Serbuk

1680 gram

4.

Medium PDA

Serbuk

10,4 gram

5.

Ethanol 95%

Cairan

840 mL

6.

Aquades steril

Cairan

500 mL

7.

KH2PO4

Serbuk

2 gram

8.

NH4NO3

Serbuk

5 gram

9.

NaCl

Serbuk

1 gram

10.

MgSO47H2O

Serbuk

1 gram

11.

Spirtus

Cairan

Secukupnya


27

F. Prosedur Kerja 1. Tahap Persiapan a. Pembuatan Medium PDA Medium

yang

digunakan

untuk

menumbuhkan

M.

purpureusadalah PDA (Potato Dekstrose Agar). Medium dibuat dengan mencampurkan serbuk PDA dengan aquades dengan takaran tertentu. Standar pembuatannya yaitu untuk 1 liter medium PDA, dibutuhkan 39 gram serbuk PDA.Setelah dicampurkan dengan aquades dan diaduk hingga homogen, medium dipanaskan di hot plate dan magnetic stirer hingga mendidih.

b. Sterilisasi Mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Semuanya disterilkan di autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah selesai, semua alat dan bahan disimpan di tempat yang aman. Alatalat yang tidak tahan panas disterilkan dengan menggunakan alkohol.

2. Tahap Pra Penelitian a. Identifikasi Monascus purpureus Isolat kapang M. purpureus yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi ITB selanjutnya dibiakan dalam medium kultur PDA di laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi FPMIPA UPI. Penyimpanan dilakukan di suhu ruang. Identifikasi M. purpureus dilakuakan melalui pengamatan morfologi secara makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan makroskopis dilakuakan dengan mengawati warna miselia dan bentuk koloni M. purpureus. Sedangkan pengamatan mikroskopis dilakukan dengan pembuatan slide culture lalu mengamati bentuk spora, hifa, kleistotesia dan aleurokonidia M. purpureus di bawah


28

mikroskopdengan perbesaran 400x. Identifikasi mengacu pada Chairoite et al. (2008) dan Pattangul et al. (2007).

b. Pemeliharaan dan Perbanyakan Monascus purpureus Stok biakan disimpan pada suhu 40C. Sedangkan kapang yang digunakan untuk penelitian dikultur pada inkubator suhu 30-310C. Berikut kultur M. purpureus yang dibiakan dalam tabung reaksi yang disajikan pada Gambar 3.2.

Gambar 3.2 Monascus purpureus Usia Kultur Enam Hari pada Tabung Reaksi (Sumber: Dokumentasi Pribadi )

c. Pembuatan Kurva Produksi Spora Monascus purpureus Pembuatan kurva produksi spora M. purpureus bertujuan untuk mengetahui jumlah spora yang diproduksi oleh M. purpureus. Adapun cara yang dilakukan yaitu dengan mengambil koloni M. Purpureus yang tumbuh di cawan Petri menggunakan pelubang gabus berdiameter 0,6 mm. Potongan miselium M. Purpureus dari koloni yang tumbuh pada cawan Petri ini kemudian diinokulasikan Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

29

pada medium PDA miring dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 30-31oC. Jumlah spora diamati setiapa hari dengan cara memasukkan 9 ml aquades ke dalam PDA miring (Tim QC APH golongan jamur, 2009). Melepaskan spora dengan cara mengeruk secara perlahan suspensi spora dengan menggunakan jarum ose sampel dihomogenkan dengan vortex dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi kosong, kemudian diteteskan satu tetes pada bidang hitung haemocytometer, lalu menutupnya dengan gelas penutup, Selanjutnya menghitung spora M. Purpureus di bawah mikroskop. Kemudian dengan perbesaran 400x, hingga didapatkan bidang hitung pada haemocytometer.Spora yang dihitung hanya yang terletak pada kotak hitung (1 + 2 + 3 + 4 + 5) dengan perbesaran 400x. penghitungan spora hanya di daerah bertanda kotak seperti yang tersaji dalam Gambar 3.3.

Gambar 3.3 Haemocytometer (Sumber: http://toolboxes.flexiblelearning.net.au/)

Dalam daerah yang diberi tanda kotak itu, terdapat 25 persegi seperti Gambar 3.4.dari ke-25 persegi itu, dipilih lima kotak saja untuk dijadikan tempat menghitung spora, yaitu kotak 1, 2, 3, 4, 5.


30

Gambar 3.4 Kotak Penghitungan Spora M. purpureus (Sumber: Henderson, 2010)

Setiap kotak 1, 2, 3, 4, 5 memiliki empat kotak kecil. Perhitungan spora mengikuti aturan seperti yang dijelaskan dalam Gambar 3.5.

Gambar 3.5 Alur Penghitungan Spora M. purpureus (Sumber: http://b110-wiki.dkfz.de/)

Setelah didapatkan jumlah spora M. Purpureus pada kotak hitung 1, 2, 3, 4 dan 5, lalu dihitung jumlah spora/ml pada bidang hitung dengan rumus sebagai berikut:


31

x 103

(mm2 ) t (mm) d

Keterangan: S: Jumlah spora/ml X: Jumlah spora yang dihitung (1 + 2 + 3 + 4 + 5) L: Luas kotak hitung (0,04 x 5 = 0,2 mm2) t: Kedalaman bidang hitung (0,1 mm) d: Faktor pengenceran 103: Volume suspense yang diambil (1 ml = 103 mm3) (Sumber: Modifikasi dari Tim QC APH Golongan jamur)

d. Persiapan Tepung Biji Durian Sebagai Subtrat Biji durian yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji durian yang berasar dari durian lokal dengan jenis perwira yang diperoleh dari penjual durian di daerah Sinampeul Majalengka, Jawa Barat.Seperti yang tersaji dalam Gambar 3.6.

Gambar 3.6 Biji dan Buah Durian Jenis Perwira (Sumber: Dokumentasi Pribadi )

Biji durian dicuci, kemudian merebusnya selama 10 menit dalam air mendidih, ditiriskan, selanjutnya kulit biji durian dikupas. Memotong biji durian dengan ketebalan 1 cm (Srianta, 2012). Selanjutnya ditaburi dengan garam untuk menghilangkan lendir,

dicampurkan,

selanjutnya

diaduk-aduk

dibawah

air

mengalir sampai mengeluarkan busa, kemudian mencuci potongan biji durian dengan air mengalir sampai lendir berkurang dan Hayatun Nufus, 2013 Pengaruh Konsentrasi Inokulum Monascus Purpureus Terhadap Produksi Pigmen Pada Sumstrat Tepung Biji Durian Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

32

ditiriskan,

mengoven

sampai

kering.

Menghaluskan

hasil

pengeringan dengan mesin penggiling dan mengayaknya hingga diperoleh tepung biji durian. Seperti yang tersaji dalam gambar 3.7.

Gambar 3.7 Tepung Biji Durian (Sumber: Dokumentasi Pribadi)

e. Persiapan Medium Fermentasi Substrat yang digunakan sebanyak 10 gram tepung biji durian. Kemudian dimasukan ke dalam botol fermentasi.kemudian diautoklaf pada 1210C selama 15 menit. Lalu didinginkan sampai suhu kamar.Kemudian ditambahkan 4 ml larutan nutrisi yang mengandung (dalam gr/L): 2 g KH2PO4, 5 gr NH4NO3, 1 gr NaCl, dan 1 gr MgSO4.7H2O. dilarutkan dengan aquades, ditambahkan ke dalam subkultur lalu kelembaban substrat ini diatur hingga di mencapai 65% dengan menambahkan sejumlah aquades dan tingkat keasaman sebesar pH 6,5. Setelah semua proses telah selesai lalu botol fermentasi tersebut di tutup dengan alumunium foil. Kemudian di autoclave pada 1210C selama 20 menit dan dinginkan sampai suhu kamar (Babitha et al., 2007)


33

f. Persiapan Inokulum Spora Monascus purpureus Inokulum spora M. purpureus dibuat dengan cara mengikis koloni M. purpureusdari permukaan PDA yang berusia 6 hari dengan menggunakan 10 ml aquades steril. Kegiatan ini dilakukan secara aseptik. Lalu suspensi spora yang telah dibuat kemudian divorteks hingga homogen dan dihitung jumlah sporanya menggunakan haemocytometer. Untuk mendapatkan banyaknya suspensi spora yang diinokulasikan maka digunakan rumus sebagai berikut.

Keterangan :

x

: Banyaknya suspensi spora yang digunakan

n

: Konsentrasi yang digunakan

10

: 10 gram substrat yang digunakan

Untuk konsentrasi inokulum 0% substrat tepung biji durian tidak diinokulasikan dengan suspensi spora M. purpureus. Untuk konsentrasi 5% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10 gram diinokulasikan dengan 0,5 ml suspensi spora. Untuk konsentrasi 10% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10 gram diinokulasikan dengan 1 ml suspensi spora. Kemudian untuk konsentrasi 15% (v/b), substrat tepung biji durian sebanyak 10 gram diinokulasikan dengan 1,5 ml suspensi spora (Babitha, 2007).

g. Analisis Kandungan Amilum, Protein Tepung Biji Durian Verietas Sinampeul Analisis kandungan amilum (pati) dilakukan di Laboratorium Teknologi Industri Pangan UNPAD dengan menggunakan metode Met Luff School. Sedangkan analisis kandungan protein pada


34

tepung biji durian dilakukan di Laboratorium Teknologi Pangan UNPAS dengan menggunakan metode Kjeldahl.

3. Tahap Penelitian a. Fermentasi Substrat dengan Kapang Monascus purpureus Medium fermentasi yang telah disterilkan tadi dibiarkan hingga suhunya turun hingga ke suhu ruangan. Lalu diinokulasikan dengan suspensi spora kapang M. Purpureus yang jumlah sporanya 106 spora/mL dengan konsentrasi inokulum yang terdiri dari 0%, 5%, 10%, 15% (v/b). Botol fermentasi ditutup dengan alumunium foil steril agar tidak terjadi kontaminasi. Fermentasi akan dilakukan pada suhu 30-32˚C selama 14 hari dalam kondisi statis (Carvalho,2007).

b. Sampling Pengambilan Substrat Sampling pengambilan substrat tepung biji durian yang telah difermentasi oleh Monascus purpureus diambil mulai hari ke-1 hingga hari ke-14 (Carvalho,2007).

c. Penghitungan Absorbansi Pigmen M. purpureus Penghitungan asorbansi pigmen merah dilakukan dengan cara mengambil 1 gram sampel yang telah difermentasi dan dikeringkan. Lalu ditambahkan dengan 5 ml ethanol 90%, lalu dishaker dengan kecepatan 200 rpm selama 1 jam. Setelah itu, pisahkan larutan hasil campuran ethanol dan sampel dengan memasukannya ke dalam tabung 1,5 ml, kemudian disentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan lalu dimasukkan ke dalam

tabung cuvet

dan

diukur dengan

menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 500 nm (pigmen merah), 400 nm (pigmen kuning) dan 470 nm (pigmen


35

jingga). Spektrofotometer terlebih dahulu dikalibrasi menggunakan ethanol 95% sebagai blanko (Pattanagul, 2007).

d. Analisis Data Data yang diperoleh dari penelitian ini berupa nilai absorbansi pigmen M. purpureus pada panjang gelombang 500 nm (pigmen merah), 400 nm (pigmen kuning) dan 470 nm (pigmen jingga). Data yang diperoleh dianalisis menggunakan program SPSS versi 16.0 for window. Setelah dilakukan uji normalitas (SkewnessKurtosis) dan homogenitas (Levene test), didapatkan hasil bahwa data produksi pigmen M. purpureus pada angkak tepung biji durian berdistribusi normal tetapi tidak homogen, oleh karena itu dilakukan analisis data secara non-parametrik menggunakan uji Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney.


36

G. Alur Penelitian Alur penelitian yang dilakukan yaitu sebagai berikut:

Tahap Persiapan a. Pembuatan medium PDA b. Sterilisasi

Tahap Pra Penelitian a. b. c. d. e. f.

Identifikasi Monascus purpureus Pemeliharaan dan perbanyakan Monascus purpureus Pembuatan kurva produksi spora Monascus purpureus Persiapan tepung biji durian sebagai substrat Persiapan medium fermentasi Persiapan inokulum spora Monascus purpureus

Tahap Penelitian a. Fermentasi substrat dengan kapang Monascus purpureus b. Penghitungan absorbansi pigmen Monascus purpureus

Analisis Data dan Penarikan Kesimpulan

Penulisan Skripsi Gambar 3.8 Diagram alir penelitian


BAB III METODE PENELITIAN

Recommend Documents