BAB III METODE PENELITIAN
A.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan November sampai Desember 2015 di Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Laboratorium Hewan Coba Fakultas Kedokteran, Universitas Sebelas Maret, Surakarta serta LPPT (Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu) Unit 1 Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. B. 1.
Alat dan Bahan
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain kandang tikus sebanyak 4 buah dengan ukuran kecil untuk perlakuan kimpul secara individu, dan 8 kandang ukuran besar untuk perlakuan kelompok beserta tempat air minum dan pakannya, timbangan elektrik untuk menimbang hewan model, alat-alat gelas, jarum kanul digunakan untuk pencekokan dan mikrohematokrit untuk pengambilan darah melalui vena orbital, tube 1,5 ml untuk tempat darah tikus dan tabung Eppendorf untuk pembuatan serum. Untuk pembuatan umbi kimpul kukus digunakan pisau, panci, dan kompor. Kamera digunakan untuk dokumentasi data. Untuk mengukur analisis proksimat antara lain kadar air dan kadar abu digunakan timbangan krus, oven, eksikator. Untuk mengukur kadar protein digunakan timbangan analitik, labu Kjeldahl, labu godog, almari asam dan kompor gas elpiji. Untuk mengukur kadar lemak total digunakan Waterbath, erlemeyer, oven, eksikator, vortex dan timbangan, sedangkan untuk mengukur kadar serat kasar digunakan labu godog, penggerus, pendingin, spatula, eksikator, dan timbangan. 2.
Bahan
Untuk pengukuran nilai IG, hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) jantan dewasa dengan umur 2–3 bulan sebanyak 12 ekor. Hewan diberi pakan pelet dan air minum bersumber PDAM.
Bahan uji untuk penelitian ini adalah umbi kimpul putih yang diambil dari daerah Wonogiri. Umbi kimpul yang didapatkan kemudian dideterminasi untuk memastikan bahwa sampel yang diperoleh benar-benar kimpul seperti yang dikehendaki. Determinasi dilakukan di Laboratorium Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret. Hasil dari determinasi, umbi kimpul yang diperoleh memiliki nama latin Xanthosoma sagittifolium Schott, umbi yang akan diuji nilai indeks glikemik dan analisa proksimat berupa umbi kimpul yang diproses dengan cara pengukusan dengan suhu 70o selama 20 menit sebanyak 100150 gr, umbi kimpul yang dipanen berumur sekitar 10 bulan. Untuk menginduksi kadar gula darah hewan model menjadi meningkat, hewan model diberi glukosa standar dosis 6,75 g/kgbb. Untuk pengukuran analisis proksimat umbi kimpul kukus bahan kemikalia yang digunakan antara lain natrium sulfat anhidrat, tembaga (II) sulfat, asam sulfat, batu didih, natrium hidroksida 50%, aquadest, asam klorida, diethyl ether, petroleum benzene, alkhohol 95%, kalium sulfat 10%, larutan Luff Schroll, kalium iodida, natrium tiosulfat dan kertas saring. C. Cara Kerja 1. Persiapan Bahan Uji Kerangka operasional penelitian ini dimulai dari hewan uji yang diadaptasikan dalam kondisi lingkungan laboratorium yang relatif sama selama 7 hari dengan pemberian pakan pelet dan air minum secara ad libitum. Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus) galur Wistar dengan berat badan 200-250 gram, jantan dan berumur 2-3 bulan. Tikus ditempatkan dalam kandang besi yang diberi alas sekam dan berada dalam ruangan dengan suhu 23o-25oC. 2. Perlakuan Hewan Uji Pada masa adaptasi, hewan uji ditimbang berat badannya untuk menentukan dosis perlakuan. Penelitian yang dilakukan termasuk eksperimental murni menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan jumlah ulangan yang sama
yaitu 4 ulangan dalam 1 kelompok perlakuan. Pemberian umbi kimpul kukus dilakukan secara ad libitum . 3. Analisis Indeks Glikemik Pada hari ke-8 setelah masa adaptasi, hewan uji dikelompokkan menjadi 3 kelompok perlakuan. Masing-masing kelompok terdiri dari 4 ekor tikus dari 3 kelompok perlakuan. Kelompok perlakuan terdiri dari : a.
Kelompok I : adalah kelompok tikus yang diberi pelet dan air minum secara ad libitum
b.
Kelompok II : adalah kelompok tikus yang diberi glukosa (glukosa murni) sebagai pakan acuan secara peroral
c.
Kelompok III : adalah kelompok tikus yang diberi umbi kimpul kukus (proses pengukusan dengan suhu 70oC selama 20 menit) dalam bentuk potongan utuh
Pada penelitian ini diberikan perlakuan glukosa standar dosis 6,75 g/kgbb tikus. Perhitungan dosis glukosa didapat dari dosis glukosa pada tes toleransi glukosa oral manusia dewasa yang dikonversikan pada tikus berdasarkan rumus konversi Laurence dan Bacharach = 75g x 0,018 =1,35g/200g = 6,75 g/kgbb, kemudian menurut Ulfa (2013), umbi kimpul kukus yang diberikan secara ad libitum, banyaknya umbi yang dimakan dapat diketahui dengan cara menimbang berat umbi sebelum dan sesudah dimakan, sehingga diketahui sebanyak 2,7g/200g bb banyak umbi kimpul yang dimakan tiap hewan uji. Sebelum perlakuan dengan pakan uji, tikus dipuasakan selama 24 jam dengan tujuan pakan uji yang akan direaksikan tidak tercampur dengan kadar glukosa dari pakan lain. Nilai indeks glikemik diperoleh dengan cara melakukan sampling (pengambilan darah) untuk mengetahui kadar glukosa darah pada seluruh hewan uji jam ke-0, 1 dan 2. Darah selanjutnya diproses untuk ditetapkan kadar glukosanya dengan menggunakan pereaksi GOD-PAP, ditetapkan secara spektrofotometri dengan melakukan pembuatan kurva baku kadar glukosa dalam darah sesuai protokol GOD-PAP (Puspitaningrum et al., 2014).
Penetapan kadar glukosa darah dengan cara tidak langsung atau dengan metode yang lebih spesifik yaitu dengan menggunakan metode GOD-PAP (glucose oxidase-phenol + aminophenazone). Glukosa dari sampel darah hewan uji diukur kadarnya secara enzimatis menggunakan enzim GOD atau glukosa oksidase, dengan prinsip peroksida (H2O2) yang terbentuk kemudian bereaksi dengan fenol dan 4aminokuinon dengan katalis enzim peroksidase (POD) yang membentuk kuinonimin. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan kadar glukosa dalam sampel. Dalam pengujian tersebut larutan Reagensia (GOD-PAP + Buffer) antara lain GOD-PAP : 4-aminofenazon + peroksidase + glukosa oksidase, Buffer (buffer fosfat + fenol). Larutan sampel (serum) dan larutan standar (larutan glukosa 5,55 mmol/L). Plasma darah yang telah terpisah kemudian diambil, dipreparasi untuk kemudian ditambahkan reagen yang mengandung enzim GOD, aminofenazon dan indikator, kemudian dibuat larutan standar dan blanko juga disiapkan untuk perbandingan, larutan standar terdiri dari larutan glukosa standar dan blanko sebagai reagen pembanding yang dibuat dari aquades. Preparat sampel disiapkan secara kuantitatif dengan menggunakan mikropipet dengan volume yang telah ditentukan, yaitu : a.
Sampel terdiri dari
: 100 μL sampel + reagen ad 1000 μL
b.
Blanko terdiri dari
: reagen 1000 μL
c.
Standar terdiri dari : 100 μL larutan standar + reagen ad 1000 μL
Masing-masing larutan dalam kuvet dicampurkan dan diinkubasikan selama 20 menit dalam suhu ruangan (37°C). Setelah diinkubasi, kuvet yang berisi larutanlarutan di atas dimasukkan ke instrumen spektrofotometer UV-Vis sebanyak dua kali pengulangan (duplo) pada panjang gelombang 546 nm sehingga nantinya akan didapatkan data berupa absorbansi sampel (Brunner and Suddart, 1997). Pengukuran ini dilakukan dengan menggunakan perhitungan kadar glukosa dengan rumus sebagai berikut :
absorbansi sampel x konsentrasi standart (100mg/dl) absorbansi standart Kadar glukosa darah yang diperoleh selanjutnya dihitung nilai indeks glikemiknya (IG). Nilai IG umbi kimpul dapat dilakukan dengan cara membandingkan nilai Area Under Curve (AUC) glukosa darah individu setelah pemberian sampel dengan nilai AUC glukosa standar yang bernilai IG 100. Perhitungan AUC mengikuti rumus trapesium yang terbentuk di daerah bawah kurva antara waktu (jam) dengan kadar glukosa (mg/dL) (Wibowo, 1989). Nilai IG umbi kimpul kukus dapat dilakukan dengan cara membandingkan nilai AUC glukosa darah tikus setelah pemberian sampel dengan nilai AUC glukosa standar yang bernilai IG 100. Menurut Sidik (2014), untuk menentukan nilai indeks glikemik (IG) dihitung dengan menggunakan rumus: IG = Luas area di bawah kurva glukosa darah makanan uji x 100 Luas area di bawah kurva glukosa darah makanan standar Dimana dalam penelitian ini, luas area di bawah kurva dihitung dengan menggunakan rumus trapesium yang terbentuk di daerah bawah kurva antara waktu (jam) dengan kadar glukosa (mg/dL) yaitu glukosa pada jam ke-0 dijumlahkan dengan glukosa pada jam ke-1, kemudian dikalikan dengan waktu t1 yang dikurangi dengan waktu t0, dibagi 2. Begitu pula selanjutnya sesuai rumus trapesium hingga didapatkan luas area total dengan cara menambahkan luas area di bawah kurva kadar glukosa darah dari jam ke-0 sampai jam ke-2. Menurut Hakim (2014), perhitungan AUC mengikuti rumus segitiga atau trapesium yang terbentuk di daerah bawah kurva antara waktu (jam) dengan kadar glukosa (mg/dL) sebagai berikut : [AUC] (t1-t0) = (glukosa pada t0+glukosa pada t1)(t1-t0) 2 [AUC[ (t2-t1) = (glukosa pada t1+glukosa pada t2) (t2-t1) 2 AUC Total = [AUC] (t1-t0) + [AUC] (t2-t1)
4. Analisis Proksimat a. Kadar air dan kadar abu Penetapan air dan kadar abu mengikuti metode Gravimetri. Timbangan krus, dikosongkan (a), lalu sampel ditimbang hingga homogeni, dan kemudian dimasukkan ke dalam krus porselen (b), kemudian sampel dipanaskan dalam oven dengan suhu 105o C selama 3 jam hingga berat konstan, lalu dimasukkan eksikator dan ditimbang (c). Krus porselen kemudian ditutup dan dimasukkan ke dalam furnace dan dipanaskan dengan suhu 600o C selama 8 jam (dijadikan abu), hingga berat konstan, lalu dimasukkan ke eksikator (d). Setelah itu dihitung kadar air dengan rumus sebagai berikut : Kadar air = Kadar abu =
(
)
(
)
(Wibowo, 1989).
b. Kadar Protein 1.
Destruksi
Penetapan kadar protein mengikuti metode Kjedahl. Sampel sebanyak 2 gr ditimbang, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjedahl kemudian ditambahkan natrium sulfat anhidrat sebanyak 2,5gr, tembaga (II) sulfat 0,05gr dan 10mL asam sulfat, kemudian dipanaskan dalam almari asam dengan kompor gas elpiji dimana mula-mula api kecil, setelah asap putih hilang, api dibesarkan hingga larutan jernih (Wibowo, 1989). 2.
Destilasi
Hasil destruksi dipindahkan dalam labu godog yang telah dipasang pada rangkaian destilasi, lalu ditambahkan 3 tetes indikator, batu didih 2 butir, natrium hidroksida 50% hingga basa berlebih dan ditambahkan lagi aquadest 200mL kemudian ditutup. Destilat yang dihasilkan kemudian diambil dengan asam klorida 0,1 N 25mL, selanjutnya dipanaskan dengan labu godog hingga tetesan destilat bersifat netral. Hasil destilat ditepatkan menjadi 250mL, diambil 50mL dan dititrasi
dengan natrium hidroksida 0,05 N yang telah distandarisasi. Hal tersebut diulang sebanyak 3 kali pengulangan, dibuat larutan blanko dengan perlakuan sama tetapi tanpa sampel. Kemudian dihitung kadar N dengan menggunakan rumus sebagai berikut : ((
)
))
(
) (Wibowo, 1989).
c. Kadar Lemak Total Sampel dilumatkan hingga homogen, kemudian sampel ditimbang hingga ±5 gr, kemudian ditambah 5mL asam klorida pekat dan dilakukan proses hidrolisis dalam waterbath dengan suhu ±80oC selama 90 menit sambil digoyang-goyang lalu didinginkan. Ekstraksi dengan menggunakan 25mL dietil eter, lalu divortex selama 1 menit dan ditambah 25 mL petroleum benzene, dan divortex 1 menit. Ekstrak yang sudah jadi kemudian dituang kedalam erlemeyer yang sebelumnya sudah diketahui beratnya. Proses ekstraksi diulangi dengan menggunakan 15mL dietil eter dan 15mL petroleum benzene. Ekstrak selanjutnya dikeringkan dengan menggunakan oven dalam suhu 100oC hingga berat konstan (1-2) jam lalu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang, lalu dihitung kadar lemak total dengan rumus menurut Wibowo (1989), sebagai berikut:
d. Kadar Serat Kasar Sampel dihaluskan lalu ditimbang ±1gr, kemudian dimasukkan ke dalam labu godog, selanjutnya ditambahkan 100mL asam sulfat 0,255 N mendidih dipasang pada pendingin balik, lalu dipanaskan 30 menit dengan kala digoyang-goyangkan diatas bunsen. Suspensi yang diperoleh disaring melalui kertas saring dan residu yang tertinggal dicuci dengan aquadest mendidih hingga air cucian bersifat netral. Suspensi yang dihasilkan lalu dipindahkan secara kuantitatif residu dari kertas saring ke dalam
labu godog kembali dengan spatula dan sisanya dicuci dengan larutan natrium hidroksida 0,313 N 100mL sampai semua residu masuk dalam labu godog selanjutnya diletakkan pada pendingin balik, dipanaskan selama 30 menit, sambil kadang kala digojog, lalu disaring dengan kertas saring yang telah diketahui beratnya, lalu dicuci dengan aquadest mendidih, dicuci dengan 10 mL kalium sulfat 10%, dicuci lagi dengan aquadest mendidih, dan yang terakhir dicuci dengan 15 mL alkohol 95%. Kertas saring dipanaskan dalam oven dengan suhu 110oC selama 2 jam sampai berat konstan, dan dimasukkan ke dalam eksikator dan ditimbang. Serat kasar dihitung dengan menggunakan rumus menurut Wibowo (1989) sebagai berikut : )
((
)
e. Kadar Karbohidrat Untuk menghitung total karbohidrat sebagai berikut : (
)
f. Gula Reduksi Sampel yang telah dihaluskan sebanyak ±5 gr ditimbang dan dilarutkan dalam 100 mL aquadest. Sebelum inversi, filtrat sebanyak 20 mL ditambah 25mL larutan Luff Schroll dan 2 butir batu didih, dihubungan dengan pendingin balik, kemudian dididihkan selama 10 menit, kemudian didinginkan dan ditambah 15 mL kalium iodida 20% dan dengan hati-hati ditambahkan 25 mL asam sulfat 26,5%, lalu dititrasi dengan menggunakan natrium tiosulfat 0,2024 N dan ditambahkan larutan pati 2-3 mL (penambahan larutan pati dilakukan pada saat titrasi hampir berakhir). Kemudian dibuat blanko dengan perlakuan tanpa sampel, selanjutnya dihitung total gula dalam sampel dengan rumus :
Volume Na2S2O3 = Vol. Blanko – Vol. Pentiter x N Na2S2O3 0,1 % gula reduksi (Sebelum Inversi) = W1 x Fp x 100% W Keterangan :
W1 = glukosa, mg (yang dihasilkan dari daftar Luff Schoorl) Fp = faktor pengenceran W = bobot sampel (mg) Vol. Blanko =23,60 mL N Na2S2O3 = 0,2024 N ( ) ( )
( )
Selanjutnya analisis proksimat dilakukan untuk mengetahui persen kadar karbohidrat, air, protein, lemak dan serat dalam umbi kimpul. Analisis proksimat dilakukan LPPT (Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu) Unit 1 Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
D. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan Rumus AUC Metode Trapezoid dan Rumus program statistika Statistical Product and Service Solutions (SPSS) versi 16. Beda nyata antar perlakuan diuji dengan Analysis of Variance (ANOVA), sedangkan untuk analisis proksimat digunakan tiga metode yaitu analisis kadar air, kadar abu, lemak total dan serat kasar (metode gravimetri) dengan prinsip penimbangan berat yang didapat dari proses pemisahan analit dari zat–zat lain dengan metode pengendapan. Protein (metode Kjedahl) dengan prinsip pengukuran kadar protein secara tidak langsung dengan mengukur kadar N dalam sampel dengan cara destruksi, destilasi dan titrasi. Karbohidrat (by difference) dengan prinsip menjumlahkan kadar abu, lemak, air dan protein dan gula reduksi (metode Luff Schoorl) berdasarkan proses reduksi dari larutan Luff Schoorl oleh gula-gula pereduksi (semua monosakarida, laktosa dan maltosa). Hidrolisis karbohidrat menjadi monosakarida yang dapat mereduksikan Cu2+ menjadi Cu1+.
