BAB III METODE PENELITIAN

39

BAB III METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian 1. Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan (BBP4BKP), Kementrian Kelautan dan Perikanan Republik Indonesia, Jakarta Pusat. 2. Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan dari Bulan April hingga Oktober 2015. B. Bahan dan Alat 1. Bahan Bahan utama yang digunakan adalah spesies makroalga hijau Enteromorpha clathrata yang tersebar di pesisir Pantai Binuangeun, Banten. Bahan pendukung antara lain larutan phosphate buffered saline (PBS) (Sigma-Aldrich, USA; Merck, GER), ammonium sulfat (NH4)2SO4 (Merck, GER; Nacalai Tesque, JPN), kantong dialisis (Sigma-Aldrich, USA; Thermo Fisher ScientificTM, USA), natrium klorida (NaCl) (SigmaAldrich, USA; Merck, GER), eritrosit manusia (A, B, O) (RS. Pelni, Jakarta Pusat), eritrosit kelinci (BBP4BKP, Jakarta Pusat), nitrogen cair, akuades, milliQ water, enzim trypsin (Sigma-Aldrich, USA), matriks butyl sepharose fast flow (GE Healthcare, SWE), spectra page ruler plus prestained (Thermo Fisher ScientificTM, USA), ultrapure tris (Thermo Fisher ScientificTM, USA), gliserol (Thermo Fisher Scientific TM, USA), bromophenol blue (Sigma-Aldrich, USA), β 2-mercaptoethanol (SigmaAldrich, USA), akrilamid/N’N’–bis-metyhlene-acrylamide (Thermo Fisher ScientificTM, USA), TEMED (Sigma-Aldrich, USA), ammonium persulfat (Thermo Fisher ScientificTM, USA). 9 jenis gula yaitu D-glucose (Sigma-Aldrich, USA), D-mannose (SigmaAldrich,

USA),

D-galactose

(Sigma-Aldrich,

USA),

N-acetyl-D-

glucosamine (Sigma-Aldrich, USA), N-acetyl-D-galactosamine (SigmaAldrich, USA), L-fucose (Sigma-Aldrich, USA), D-xylose (Sigma-Aldrich, USA), L-rhamnose (Sigma-Aldrich, USA) dan Lactose (Sigma-Aldrich,

40

USA), 6 jenis glikoprotein yaitu transferin human (Sigma-Aldrich, USA), fetuin from fetal bovine serum (Sigma-Aldrich, USA), thyroglobulin from porcine thyroid gland (Sigma-Aldrich, USA), thyroglobulin from bovine thyroid (Sigma-Aldrich, USA), mucin from bovine submaxillary glands (Sigma-Aldrich, USA), dan yeast mannan (Sigma-Aldrich, USA), 5 larutan buffer untuk uji ketahanan terhadap pH yaitu glisin-HCl (SigmaAldrich, USA), asetat (Sigma-Aldrich, USA), tris-HCl (Sigma-Aldrich, USA), karbonat (Sigma-Aldrich, USA) dan fosfat (Sigma-Aldrich, USA), untuk uji ketahanan terhadap kation divalen yaitu EDTA (Sigma-Aldrich, USA), magnesium klorida (MgCl2) (Sigma-Aldrich, USA) dan kalsium klorida (CaCl2) (Sigma-Aldrich, USA) serta bahan kimia yang digunakan untuk pengujian protein (Thermo Fisher ScientificTM). 2. Alat Alat yang digunakan dibedakan menjadi dua macam, yaitu alat yang digunakan untuk preparasi ekstrak alga dan presipitasi ammonium sulfat, antara lain mortar, gunting, spatula, tabung nitrogen cair, gelas beker, gelas ukur, neraca, neraca analitik, magnetic bar, stirrer, refrigerated centrifuged, refrigerator, centrifuge tubes, hot plate, pinset, pH meter, dialysis tubes, penjepit dialysis tubes, tali dialisis, falcon tubes dan alat yang digunakan untuk analisa, antara lain 96-well microtiter Vplate, mikropipet, vortek, spektrofotometer UV-vis, inkubator, laminar air flow, AKTA purifier, dan SDS-PAGE.

C. Tahapan Penelitian 1. Penapisan Senyawa Bioaktif Lektin a. Preparasi Fraksi Kasar Lektin Enteromorpha clathrata Sampel beku spesies Enteromorpha clathrata pesisir pantai Pantai Binuangeun dikeluarkan dari ruang dingin bersuhu -20 0C, dithawing, dan ditimbang seberat 50 gram yang digunakan sebagai starting material pada proses ekstraksi. Sementara pengecilan ukuran dilakukan dengan memotong dan menumbuk sampel menggunakan

41

mortar disertai penambahan nitrogen cair agar cepat menjadi bubuk dan homogen serta menjaga suhu protein sampel. Ektraksi fraksi kasar lektin dilakukan menggunakan metode Praseptiangga (2013) dengan modifikasi. Proses ekstraksi dilakukan dengan cara menambahkan 20 mM larutan phosphate buffer yang mengandung 0,85% NaCl (PBS, pH 7.0) ke dalam sampel yang telah menjadi bubuk dengan rasio 1:2 (b/v). Kemudian larutan diaduk menggunakan stirrer semalam (minimal 8 jam) pada suhu 40C. Kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 30 menit pada suhu 40C. Hasil sentrifugasi diambil supernatannya untuk dipresipitasi dengan penambahan ammonium sulfat yang telah dihaluskan hingga mendapatkan konsentrasi akhir kejenuhan 75%. Supernatan disimpan semalam pada suhu 40C dan disentrifugasi kembali (8000 rpm) selama 30 menit pada suhu 40C. Presipitat yang diperoleh dilarutkan kembali dengan penambahan buffer sesedikit mungkin dan didialisis menggunakan PBS selama 10 jam dengan Pengecilan ukuran2 jam. Setelah perlakuan penggantian PBS sebanyak 4 kali setiap dialisis, fraksi bagian dalam (inner fraction) disentrifugasi (10.000 Penambahan PBS dengan rasio PBS 20 mM pH rpm) selama 30 menit pada suhu 4 0C. Supernatan yang diperoleh alga bubuk : PBS sebesar 1 : 2 7 dengan rasio disebut 1sebagai fraksi kasar lektin (salting-out fraction) yang :2 0 dengan stirrerkasar lektin kemudian disimpan dalam freezerPengadukan pada suhu -20 C. Fraksi o pada suhu 4 C selama semalam ini yang akan digunakan untuk analisa lebih lanjut, yaitu uji aktivitas

hemaglutinasi, kadar protein, kestabilan terhadap suhu, Sentrifugasi 8.000pH, rpm padadan kation o suhu 4oleh C selama 30 menit divalen serta penghambatan spesifik gula/glikoprotein. Proses

ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 3.1. Supernatan Ammonium sulfat padat yang dihaluskan

Enteromorpha clathrata (Penambahan ammonium sulfat 200C) hingga konsentrasi kejenuhan 75% Pencairan pada suhu ruang Penyimpanan pada suhu 40C Penimbangan 50 gram selama seberat semalam Sentrifugasi 8.000 rpm pada suhu 40C selama 30 menit Presipitat

42

Penambahan larutan buffer sesedikit mungkin Pemurnian dengan dialisis selama 10 jam dengan penggantian larutan buffer setiap 2 jam sekali (penggantian 4 kali) Sentrifugasi 10.000 rpm pada suhu 40C selama 30 menit Gambar 3.1 Ekstraksi Fraksi Kasar Lektin menurut Prasptiangga (2013) dengan modifikasi Fraksi kasar lektin Pembuatan PBS 20 mM (0.85 % NaCl, pH 7.0) a. Membuat Larutan PB A: 0.2 M larutan monobasik sodium fosfat (NaH2PO4 Mr: 137.99) (27.598 gr dalam 1000 ml) B: 0.2 M larutan dibasik sodium fosfat (Na2HPO4 Mr: 141.96) (28.392 gr dalam 1000 ml) Formulasi pH 7.0 untuk larutan PB adalah 39 ml A + 61 ml B ditambahkan dengan akuades hingga 200 ml.

43

b. Membuat larutan PBS 20 mM Diambil 100 ml dari stok PB, ditambah 8.5 gr NaCl, kemudian di ditambah dengan akuades hingga 1000 ml. PBS yang telah jadi dicek pH nya hingga 7.0 dimana adjust pH PBS menggunakan HCl atau NaOH hingga mencapai pH 7.0. Preparasi kantong dialisis dilakukan sesuai prosedur SigmaAldrich D9402 SIGMA (average flat width 76 mm (3.0 inchi), average diameter 49 mm, molecular weight cut-off 14000 dalton) yaitu kantong yang telah dipotong direndam dengan miliQ 3-4 jam untuk menghilangkan gliserol. Kemudian dimasukkan dalam larutan natrium sulfida 0.3 % (b/v) 800C selama 1 menit untuk menghilangkan komponen sulfur. Setelah itu dicuci dengan air panas 60 0C selama 2 menit dan langsung diasidifikasi dengan memasukkan kantong dalam larutan asam sulfat 0.2 % (b/v). Terakhir dibilas lagi dengan air panas untuk menghilangkan asam. Penyimpanan kantong yang telah dicuci dengan cara direndam dalam miliQ. b. Preparasi Fresh Red Blood Cell (RBC) Preparasi native eritrosit atau disebut sebagai Fresh Red Blood Cell (RBC) dilakukan dengan metode Praseptiangga (2013). RBC disiapkan dari darah kelinci dan manusia (golongan A, B dan O). RBC disentrifugasi pada kecepatan 1000 rpm pada 40C selama 10 menit. RBC merupakan bagian paling bawah. Kondisi RBC dikatakan masih baik apabila dari 1 ml darah didapatkan paling tidak 200 µl sel darah merah. Adapun plasma darah, sel darah putih dan komponen lain selain RBC diambil dengan pipet secara perlahan-lahan. 1 ml darah dimasukan ke dalam falcon tube 50 ml. 0.85% NaCl (w/v) atau disebut saline ditambahkan pada falcon tube hingga volume 50 ml. Campuran ini disentrifugasi dengan kecepatan 2.500 rpm selama 5 menit pada suhu 40C. Proses sentrifugasi ini disebut pencucian dan dilakukan sebanyak 3 kali. Saline kemudian ditambahkan pada falcon tube untuk membentuk 2% (v/v) suspensi RBC.

44

Fresh blood kelinci/manusia Pemasukan ke dalam vacutainer tube Pemisahan dengan sentrifugasi pada 1000 rpm suhu 40C selama 10 menit 1 ml fresh RBC Pemasukan ke dalam test tube ukuran 50 ml 0.85% NaCl

Penambahan sampai 45 ml (b/v) Pemisahan dengan sentrifugasi pada 2500 rpm suhu 40C selama 5 menit Presipitat RBC

0.85% NaCl

0.85% NaCl

Penambahan sampai 4.5 ml (b/v) 1 ml fresh RBC kelinci/manusia Pemisahan dengan sentrifugasi pada 2500 rpm suhu 40C selama 5 menit Pemasukan ke dalam test tube ukuran 50 ml Presipitat RBC Pencucian RBC dengan total tiga kali

Penambahan sampai 4.5 ml (b/v) Gambar 3.2 Preparasi Fresh RBC menurut Praseptiangga (2013) Penambahan sampai 50 ml membentuk 0.5% (w/v) tripsin 2 % (v/v) suspensi TRBC dan 0.85% NaCl (1/10 bagian volum) Pemisahan dengan0 sentrifugasi pada 2500 rpm suhu 4 C selama 5 menit c. Preparasi Trypsin-treated Erythrocytes (TRBC) 0 Penginkubasian pada(TRBC) suhu 37menggunakan C selama 90 Preparasi Trypsin-treated Erythrocytes menit, dengan penggojogan setiap 30 menit Presipitat RBC dari fresh RBC kelinci metode Praseptiangga (2013). TRBC disiapkan dan manusia (golongan darah A, B dan O). sentrifugasi Kemudian 0.5% (w/v) Pemisahan dengan pada 2500 Penambahan hingga volume 50 ml rpm suhu 40Cditambahkan selama 5 menit enzim tripsin dan saline (1/10 bagian volum) ke dalam 2% (v/v) suspensi dari RBC untuk selanjutnya diinkubasi pada suhu Presipitat 370C selama 60 menit. Setelah itu, campuran dicuciTRBC empat kali dengan

0.85% NaCl

Pencucian TRBC dengan total empat kali dilanjutkan penambahan sampai 50 ml

2% (v/v) suspensi TRBC

45

saline untuk kemudian ditambahkan saline lagi pada falcon tube setelah pencucian keempat untuk membentuk 2% (v/v) suspensi TRBC. Preparasi TRBC dapat dilihat pada Gambar 3.3.

Gambar 3.3 Preparasi TRBCmenurut Praseptiangga (2013) d. Uji Aktivitas Hemaglutinasi Pengujian aktivitas hemaglutinasi dilakukan dalam 96-well microtiter v-plate dan dilakukan dengan dua kali ulangan. Pertama, 25 µl salin dimasukkan dalam tiap sumuran. Kedua, pada sumuran pertama di setiap barisnya diisi 25 µl fraksi kasar lektin kemudian dilakukan dilusi pada sumuran tersebut agar tercampur, diambil 25 µl campuran dari sumuran pertama dimasukkan ke sumuran berikutnya untuk didilusi lagi, begitu seterusnya hingga 12 sumuran atau sebaris

46

menyamping, yang biasa disebut two fould dilution. Setelah itu, tiap sumuran diisi 25 µl TRBC. Microtiter plate kemudian digoyang perlahan selama kurang lebih 30 detik agar tercampur serta diinkubasi pada suhu kamar selama 1 jam. Hemaglutinasi diamati secara makroskopik dan dinilai positif apabila lebih dari 50% TRBC dalam sumuran teraglutinasi. Aktivitas hemaglutinasi ini dinyatakan sebagai titer, yang berarti kebalikan dari pengenceran dua kali lipat tertinggi yang menunjukan hemaglutinasi positif. Uji aktivitas hemaglutinasi menyertakan kontrol negatif berupa 25 µl salin dengan 25 µl TRBC. Berikut merupakan Uji aktivitas hemaglutinasi berdasarkan metode Hori et al. (1986) seperti pada Gambar 3.4.

Penyiapan 96-well microtiter V-plate 25 µl NaCl 0,85% 25 µl Fraksi Kasar Lektin 25 µl TRBC

Penambahan ke dalam tiap sumur secara memanjang Penambahan ke dalam sumuran yang pertama Pemipetan atau pendilusian memanjang pada 12 sumuran (two fold dilution) Penambahan ke dalam masing-masing sumur Pencampuran dan penggojogan dengan perlahan selama kurang lebih 30 detik

47

Penginkubasian selama 1 jam pada suhu ruang Pengamatan aktivitas hemaglutinasi secara makroskopis Gambar 3.4 Uji Aktivitas Hemaglutinasi menurut Hori, et al. (1986) e. Penentuan Kadar Protein Kadar protein ditentukan dengan BCA Protein Assay Kit (Thermo ScientificTM PierceTM) menggunakan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar dan dilakukan dengan dua kali ulangan.Larutan standar (A-I) dan larutan working reagent (WR) disiapkan sesuai kebutuhan uji. BSA standar dibuat dengan pengenceran larutan albumin standar dan pelarut yang sama dengan pelarut untuk sampel yaitu PBS (20 mM pH 7.0). Setiap 1 ml dari 2 mg/ml albumin standar dapat digunakan untuk preparasi satu set larutan standar. Pengenceran larutan standar dapat dilihat di Tabel 3.1.

Tabel 3.1Formulasi BSA Standar Vial Pelarut (µl) A 0 B 125 C 325 D 175 E 325 F 325 G 325 H 400 I 400

BSA (µl) 300 dari stok 375 dari stok 325 dari stok 175 dari B 325 dari C 325 dari E 325 dari F 100 dari G 0

Konsentrasi akhir BSA (µl/mg) 2000 1500 1000 750 500 250 125 25 0

Preparasi WR dilakukan dengan menghitung total volum WR yang dibutuhkan. Semua sumuran yang diisi sampel atau larutan standar kemudian diisi WR masing-masing 200 µl ((jumlah larutan

48

standar + jumlah sampel) x 2 ulangan x 200 µl).Setelah mendapatkan total WR yang dibutuhkan, dibuat larutan WR dari campuran reagen A (50 bagian) dan reagen B (1 bagian) (rasio 50:1). Terdapat dua jenis Pierce BCA Assay Kit yang diproduksi oleh Thermo Scientific yaitu kode 23225 dan 23227. Kit terdiri dari reagen A, reagen B, dan albumin standar ampules, 2 mg/ml. Reagen A adalah 1000 ml (pada produk kode 23225) atau 500 ml (pada produk kode 23227) yang terdiri dari sodium karbonat, sodium bikarbonat, asam bicinchoninic, dan sodium tartrat dalam 0.1 M sodium hidroksida. Sedangkan reagen B yaitu 25 ml berisi 4% tembaga sulfat. Albumin standar ampules, 2 mg/ml yaitu 10 x 1 ml ampules terdiri dari 2 mg/ml bovine serum albumin (BSA) dalam 0.9% saline dan 0.05% sodium azida. Uji ini dilakukan menggunakan 96-well microplate flat bottom. Masing-masing 25 µl larutan standar atau sampel dimasukkan dalam sumuran. Kemudian ditambahkan 200 µl larutan WR pada tiap sumuran. Selanjutnya plate digoyang perlahan agar tercampur dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37ºC. Setelah itu sampel ditera dengan spektrofotometer UV-vis pada range 562 nm. Data yang didapat diolah dengan menggunakan kurva standar.

49

Penyiapan 96-well microtiter flat-plate 25 µl larutan standar maupun sampel fraksi kasar lektin 200 µl Working Reagent

Penambahan masing-masing ke dalam 2 sumuran Penambahan ke dalam semua sumuran Pencampuran dan penggojogan dengan perlahan selama kurang lebih 30 detik Penginkubasian selama 30 menit pada suhu 370C Pendinginan pada suhu ruang Peneraan pada absorbansi 562 nm

Gambar 3.5 Uji Kadar Protein dengan BCA Kit Setelah didapatkan absorbansi baik pada masing-masing larutan standar maupun sampel, kedua ulangan sampel di rata-rata absorbansinya. Absorbansi larutan standar kemudian di plotting ke dalam persamaan linier bersama dengan konsentrasi akhir BSA. Kadar protein sampel dihitung menggunakan persamaan linier standar, dimana absorbansi sampel sebagai y dan kadar protein sebagai nilai x.

2. Purifikasi Parsial Fraksi Kasar Lektin a. Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC) Purifikasi parsial dilakukan dengan menggunakan metode Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC). Terdapat tiga tahap

50

pendahuluan yang dilakukan sebelum running AKTA yaitu preparasi sampel, packing dan pembersihan kolom. Preparasi sampel dilakukan dengan dialisis sampel selama sepuluh jam menggunakan 20mM Phospate buffer pH 7.5 yang mengandung 1 M (NH 4)2SO4 dengan penggantian buffer setiap dua jam sekali (empat kali penggantian). Pada tahap packing, terlebih dahulu dilakukan penghampaan udara. Setelah dalam kondisi vakum, dilakukan pembuatan media HIC dengan slurry method yaitu mencampurkan 20% etanol dengan matriks butyl sepharose fast flow hingga membentuk 70% slurry. Campuran didiamkan selama 15 menit hingga matriks mengendap (memadat) dibagian bawah (berwarna putih). Matriks yang telah mengendap selanjutnya diinjeksikan ke dalam kolom menggunakan syringe 1 cc dengan terlebih dahulu dilakukan penghilangan etanol dalam campuran dengan teknik penyedotan. Kolom kemudian disimpan dalam etanol 20%. Pada running AKTA terlebih dahulu dilakukan pembersihan kolom menggunakan milliQ water dengan flowrate 2 ml/menit. Selanjutnya ekuilibrasi kolom menggunakan 20mM Phospate buffer pH 7.5 yang mengandung 1 M (NH4)2SO4 dengan flowrate 0.5 ml/menit, kemudian dilakukan injeksi fraksi kasar lektin sebanyak 2 ml. Fraksi kasar lektin akan terelusi hingga hasil fraksinasi masuk ke dalam tabung pada flowrate 0.5 ml/menit. Pengontrolan terhadap hasil fraksinasi dilakukan agar jatuh tepat pada tabung. Setelah fraksinasi selesai clean up AKTA dengan flowrate 2 ml/menit. Terakhir dilakukan pengecekan kadar protein dan aktivitas hemagglutinasi untuk menentukan fraksi yang akan di pool yang selanjutnya dilakukan pengeringan menggunakan metode freeze drying dan dilakukan elektroforesis.

Fraksi Kasar Lektin Peningkatan hidrofobisitas dengan dialisis selama 10 jam menggunakan 20mM Phospate buffer pH 7.5 yang mengandung 1 M Gambar 3.6 Preparasi Sampel Hydrophobic Interaction Chromatography (NH4)2SO4 (penggantian setiap 2 jam sekali)

51

Penghilangan udara (vakum) pada kolom butyl sepharose fast flow Pencampuran 20% etanol dengan butyl sepharose fast flow membentuk 70% slurry

Pendiaman selama 15 menit hingga mengendap (memadat) Endapan butyl sepharose fast flow Penghilangan etanol dalam campuran dengan teknik penyedotan Gambar 3.7 Packing Kolom Butyl Sepharose Fast Flow Penginjeksian endapan ke dalam kolom menggunakan syringe 1 ml Penyimpanan kolom dalam 20% etanol

Pembersihan kolom menggunakan milliQ water dengan flowrate 2 ml/menit Pengekuilibrasian kolom menggunakan 20mM Phospate buffer pH 7.5 yang mengandung 1 M (NH4)2SO4 dengan flowrate 0.5 ml/menit 2 ml Fraksi Kasar Lektin Penginjeksian sampel Pengelusian sampel pada flowrate 0.5 ml/menit Pengontrolan sampel hasil fraksinasi Fraksi Kasar Lektin hasil fraksinasi Pembersihan (clean up) AKTA dengan flowrate 2 ml/menit menggunakan buffer fosfat

52

Pengecekan kadar protein dan aktivitas hemagglutinasi Pengoleksian fraksi aktif (pool active fractions) Pengeringan dengan freeze drying Penyimpanan dalam freezer bersuhu -200C Gambar 3.8 Pengujian Hydrophobic Interaction Chromatography

b. Sodium Dodecyl Sufate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-

PAGE) Penghitungan jumlah pita protein dilakukan menggunakan teknik SDS-PAGE. Sebelum dilakukan SDS PAGE, terlebih dahulu dilakukan preparasi running buffer serta reagen untuk pembuatan stacking dan separating gel sebagai berikut: 1. Preparasi Sample Buffer  0,5 M Tris-HCl pH 6 (100 ml) - Ditimbang tris 6,06 gr, kemudian add dengan H2O sampai 60 ml. - Adjust pH menjadi 6,8 dengan HCl, kemudian add dengan H2O sampai 100 ml. - Simpan pada 40C  SDS-PAGE Sample Buffer/Loading Buffer (2x, 8 ml) - Dicampurkan 1ml 0,5 mM Tris-HCl pH 6,8 dengan 2 ml

gliserol 25%, bromophenol blue 1% (5mg/500µl), 1,6 ml 10% SDS, dan H2O 2,92 ml. Ketentuan: 1 ml 0,5 mM Tris-HCl pH 6,8 = (0,1 ml 1 ml 0,5 M TrisHCl pH 6,8 + 99,9 ml MilliQ Water) 25 % Gliserol = (2 ml Gliserol 85% + 4,8 ml MilliQ Water) 1% Bromophenol blue = (5 mg/500 µl)

53

- Disimpan masing-masing 960 µl dalam microtube pada

kondisi -700C (total 8 microtube) 2. Preparasi Gel Casting Reagent  Acrylamide/Bis (30% T, 2,67%C) - Ditimbang acrylamide sebanyak 87,6 gr - Ditimbang N’N’–bis-metyhlene-acrylamide sebanyak 2,4gr - Add dengan H2O hingga volume 300 ml - Disimpan pada suhu 40C dengan kemasan alumunium foil 

diseluruh bagian. (Masa pakai 30 hari) 1,5 M Tris-HCl pH 8,8 (150 ml) - Ditimbang tris sebanyak 27,23 gr, kemudian di add dengan

H2O sampai volume 80 ml Adjust pH hingga 8,8 dengan HCl 6 N - Add dengan H2O hingga volume 150ml - Disimpan pada suhu 40C 3. Preparasi Running Buffer  10x SDS-PAGE - Ditimbang tris sebanyak 30,30 gr; Glisin 144,10 gr; dan -

SDS 10 gr. - Add dengan H2O sampai volume 1 L 4. Preparasi Staining dan Destaining Solution  Staining Solution - 1 gr Coomasie Brilliant Blue R-250 - 450 ml metanol - 450 H2O - 100 ml glacial acetic acid  Destaining Solution - 100 ml metanol - 100 ml glacial acetic acid - 800 ml H2O 5. Pencetakan Separating Gel (konsentrasi 12,5%) Pencetakan separating gel dilakukan

dengan

mencampurkan 3,4 ml H2O; 4 ml 30% Acr/bis; 2,5 ml Tris-HCl 1,5M pH 8,8; 50 µL 10% SDS; 75 µL 10% APS; dan 30 µL TEMED. Campuran kemudian dimasukkan kedalam cetakan separating gel. Setelah itu dimasukkan akuades secara cepat untuk menghilangkan

gelembung

pada

gel. Kemudian

dilakukan

pendiaman beberapa menit hingga membentuk gel. Setelah

54

memadat, akuades dihilangkan dari cetakan pada rangkaian alat SDS-PAGE. 6. Pencetakan Stacking Gel (konsentrasi 12,5%)

Pencetakan stacking gel dilakukan dengan mencampurkan 3,05 ml H2O; 0,65 ml 30% Acr/bis; 1,25 ml Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 50 µL 10% SDS; 75 µL 10% APS dan 30 µL TEMED. Campuran kemudian dimasukkan kedalam cetakan stacking gel. Selanjutnya

dilakukan

pendiaman

beberapa

menit

hingga

membentuk gel. Setelah memadat, cetakan diangkat dari rangkaian alat SDS-PAGE. SDS-PAGE dilakukan dengan terlebih dahulu menyiapkan sampel uji. Masing-masing 20 µL sampel (fraksi kasar lektin dan fraksi kasar hasil HIC) dicampurkan dengan 10 µL sample buffer ke dalam microtube 0.5 ml. Sample buffer yang digunakan terdiri atas dua komposisi sample buffer yang berbeda yaitu dengan penambahan β 2mercaptoethanol (950 µL sample buffer + 50 µL β mercaptoethanol); dan tidak dengan penambahan β 2-mercaptoethanol (1000 µL sample buffer). Campuran kemudian di vortex, dan selanjutnya dipanaskan dalam thermoblock suhu 1000C selama 5 menit. 20 µL masing-masing sampel uji (fraksi kasar lektin dan fraksi kasar hasil HIC) dan 10 µL marker berupa ruler plus prestained selanjutnya dimasukkan kedalam stacking gel menggunakan mikropipet dan kemudian dilakukan elektroforesis dengan set tegangan listrik 180 Volt, arus 71 Ampere, dan waktu selama 1 jam. Gel hasil elektroforesis dilakukan staining selama 2 jam untuk selanjutnya dilakukan destaining selama semalam dengan bantuan mini rocker shaker. Hasil berupa pita protein pada sampel dan marker selanjutnya dihitung berupa plot logaritma dan interpolasi menggunakan nilai Rf dan dinyatakan sebagai berat molekul.

55

20 µL Fraksi Kasar Lektin (sebelum dan sesudah HIC) Pencampuran dengan 10 µL sample buffer dalam microtube 0.5 ml Penghomogenisasian dengan vortex Pemanasan pada suhu 1000C dengan thermoblock Sampel Uji Penginjeksian 20 µL (0.963 µg protein) sampel uji dan 10 µL marker ke dalam stacking gel menggunakan mikropipet Penginjeksian ke dalam stacking gel menggunakan mikropipet Running elektroforesis pada set tegangan listrik 180 Volt, arus 71 ampere selama 2 jam Pewarnaan selama 1 jam menggunakan Staining solution dengan perlakuan agitasi menggunakan mini rocker shaker Gambar 3.9 Running SDS-PAGE Keterangan: Running elektroforesis dilakukan pada set waktu selama 2 jam, Penghilangan warna selama semalam menggunakan

Destaining solution hanya dengan perlakuanselama agitasi1.5 jam. namun dalam prosesnya berlangsung menggunakan mini rocker shaker

Penghitungan berat molekul pita protein

3. Karakterisasi Awal Fraksi KasarLektin a. Stabilitas terhadap pH

Efek terhadap pH, temperatur dan kation divalen pada aktivitas hemaglutinasi selanjutnya diteliti. Pada perlakuan pengaruh terhadap pH, 500 µl sampel fraksi kasar lektin didialisis dengan 100 ml 50 mM larutan buffer berbagai pH (3 hingga 10) selama semalam pada suhu

56

4oC. Sampel kemudian didialisis lebih lanjut dengan PBS (20 mM pH 7.0) selama 10 jam untuk selanjutnya diuji aktivitas hemaglutinasi. Pengujian aktivitas hemaglutinasi dilakukan dengan menyertakan kontrol positif berupa 25 µl salin yang ditambahkan 25 µl sampel tanpa perlakuan pH dan 25 µl TRBC; serta kontrol negatif berupa 25 µl salin dengan 25 µl TRBC. Adapun buffer yang digunakan adalah glisin-HCl untuk pH 3.0, asetat untuk pH 4.0 dan 5.0, fosfat untuk pH 6.0 dan 7.0, tris-HCl untuk pH 8.0 dan karbonat untuk pH 9.0 dan 10.0. Pembuatan buffer untuk uji kestabilan pH antara lain: 1. Glisin-HCl untuk pH 3.0

A: 0.2 M larutan glisin (15.01 gram dalam 1000 ml akuades) B: 0.2 M HCl 50 ml A + x ml B, dilarutkan dalam 200 ml akuades pH 3 50 ml A + 11.4 ml B, dilarutkan dalam 200 ml akuades Dikondisikan pH campuran A+B tersebut mendapatkan konsentrasi akhir 50 mM, maka: V1 x M1 = V2 x M2 V1 x 0.2 = 1000 ml x 0.05 V1 = 250 ml Jadi, dilakukan pembuatan 250 ml larutan glisin-HCl 0.2 M kemudian ditambahkan dengan akuades hingga 1000 ml dan dilarutkan agar mendapatkan konsentrasi akhir 0.05 M. Setelah itu dilakukan pengecekan pH pada larutan. 2. Asetat untuk pH 4.0 dan 5.0

A: 0.2 M larutan asam asetat (11.55 ml dalam 1000 ml akuades) B:0.2 M larutan sodium asetat (16.4 gram C 2H3O2Na atau 27.2 gram C2H3O2Na.3H2O dalam 1000 ml aduades) x ml A + y ml B, dilarutkan dalam 100 ml akuades pH 4  41 ml A + 9 ml B, dilarutkan dalam 100 ml akuades pH 5  14.8 ml A + 35.2 ml B, dilarutkan dalam 100 ml akuades Dikondisikan pH campuran A+B tersebutmendapatkan konsentrasi akhir 50 mM, maka: V1 x M1 = V2 x M2 V1 x 0.2 = 1000 ml x 0.05 V1 = 250 ml

57

Jadi, dilakukan pembuatan 250 ml masing-masing larutan buffer pH 4.0 dan 5.0 0.2 M kemudian ditambahkan dengan akuades hingga 1000 ml dan dilarutkan agar mendapatkan konsentrasi akhir 0.05 M. Setelah itu dilakukan pengecekan pH pada masing-masing larutan. 3. Fosfat untuk pH 6.0 dan 7.0 A: 0.2 M larutan monobasik sodium fosfat (NaH2PO4 Mr: 137.99) (27.598 gr dalam 1000 ml akuades) B: 0.2 M larutan dibasik sodium fosfat (Na2HPO4 Mr: 141.96) (28.392 gr dalam 1000 ml akuades) x ml A + y ml B, dilarutkan dalam 200 ml akuades pH 6  87.7 ml A + 12.3 ml B, dilarutkan dalam 200 ml akuades pH 7  39.0 ml A + 61.0 ml B, dilarutkan dalam 200 ml akuades Dikondisikan pH campuran A+B tersebut mendapatkan konsentrasi akhir 50 mM, maka: V1 x M1 = V2 x M2 V1 x 0.2 = 1000 ml x 0.05 V1 = 250 ml Jadi, dilakukan pembuatan 250 ml masing-masing larutan buffer pH 6.0 dan 7.0 0.2 M kemudian ditambahkan dengan akuades hingga 1000 ml dan dilarutkan agar mendapatkan konsentrasi akhir 0.05 M. Setelah itu dilakukan pengecekan pH pada masing-masing larutan. 4. Tris-HCl untuk pH 8.0 A: 0.2 M larutan tris (hydroxymethyl) aminomethane 24.2 gram dalam 1000 ml akuades) B: 0.2 M HCl 50 ml A + x ml B, dilarutkan dalam 200 ml akuades pH 8  50 ml A + 26.8 ml B, dilarutkan dalam 200 ml akuades Dikondisikan pH campuran A+B tersebut mendapatkan konsentrasi akhir 50 mM, maka: V1 x M1 = V2 x M2 V1 x 0.2 = 1000 ml x 0.05 V1 = 250 ml Jadi, dibuat 250 ml larutan glisin-HCl 0.2 M kemudian ditambahkan dengan akuades hingga 1000 ml dan dilarutkan agar mendapatkan konsentrasi akhir 0.05 M. Setelah itu dilakukan pengecekan pH pada larutan. 5. Karbonat untuk pH 9.0 dan 10.0

58

A: 0.2 M larutan anhydrous sodium karbonat (21.2 gram dalam 1000 ml akuades) B: 0.2 M larutan sodium bikarbonat (16.8 gram dalam 1000 ml akuades) x ml A + y ml B, dilarutkan dalam 200 ml pH 9  4 ml A + 46 ml B, dilarutkan dalam 200 ml pH 10  27.5 ml A + 22.5 ml B, dilarutkan dalam 200 ml Dikondisikan pH campuran A+B tersebut mendapatkan konsentrasi akhir 50 mM, maka: V1 x M1 = V2 x M2 V1 x 0.2 = 1000 ml x 0.05 V1 = 250 ml Jadi, dibuat 250 ml masing-masing larutan buffer pH 9.0 dan 10.0 0.2 M kemudian ditambahkan dengan akuades hingga 1000 ml dan dilarutkan agar mendapatkan konsentrasi akhir 0.05 M. Setelah itu dilakukan pengecekan pH pada masing-masing larutan. b. Stabilitas terhadap Suhu

Pada perlakuan pengaruh terhadap temperatur, 500 µl sampel fraksi kasar lektin dimasukkan ke dalam microtube, kemudian diinkubasi dalam thermoblock selama 30 menit pada berbagai temperatur dari 30oC sampai 100oC. Setelah 30 menit inkubasi, sampel diambil dan langsung didinginkan pada es untuk selanjutnya diuji aktivitas hemaglutinasinya. Pengujian aktivitas hemaglutinasi dilakukan dengan menyertakan kontrol positif berupa 25 µl salin yang ditambahkan 25 µl sampel tanpa perlakuan suhu dan 25 µl TRBC; serta kontrol negatif berupa 25 µl salin dengan 25 µl TRBC. c. Stabilitas terhadap Kation Divalen

Pada perlakuan pengaruh terhadap kation divalen, 500 µl sampel fraksi kasar lektin didialisis selama sepuluh jam pada suhu 4oC dengan 50 mM EDTA dalam 20 mM PBS. Selanjutnya fraksi

59

internalnya diukur sebagai aktivitas hemaglutinasi dengan tiga perlakuan yaitu tanpa penambahan larutan kation divalen, dengan penambahan 25 µl 20 mM CaCl2 dan 25 µl 20 mM MgCl2. Campuran diinkubasi pada suhu ruang selama 1 hingga 2 jam untuk kemudian dilihat hasil aktivitas hemaglutinasinya. Pengujian aktivitas hemaglutinasi dilakukan dengan menyertakan kontrol positif berupa 25 µl salin yang ditambahkan 25 µl sampel tanpa perlakuan kation divalen dan 25 µl TRBC; serta kontrol negatif berupa 25 µl salin dengan 25 µl TRBC. Larutan 50 mM EDTA dalam 20 mM PBS dibuat dengan cara:

M = gram/(Mr.L) dimana Mr dari EDTA adalah 292.24 dan

larutan EDTA yang akan dibuat sebesar 1 liter. maka 0.05 = gram/(292.24 x 1) gram = 292.24 x 0.05 gram = 14.612 jadi, 14.612 gram EDTA dilarutkan dalam 1 liter PBS 20 mM. Larutan 20 mM MgCl2 dibuat dengan cara yang sama, yaitu: M = gram/(Mr.L) dimana Mr dari MgCl 2 = 95.211 dan larutan MgCl2yang akan dibuat sebesar 1 liter. maka 0,02 = gram/(95.211 x 1) gram = 95.211 x 0.02 gram = 1.904 jadi, 1.904 gram MgCl2 dilarutkan dalam 1 liter akuades. Larutan 20 mM CaCl2 dibuat dengan cara yang sama, yaitu: M = gram/(Mr.L) dimana Mr dari CaCl 2= 110.984 dan larutan CaCl2yang akan dibuat sebesar 1 liter. maka 0,02 = gram/(110.984 x 1) gram = 110.984 x 0.02 gram = 2.220 jadi, 2.220 gram CaCl2 dilarutkan dalam 1 liter akuades.

60

d. Uji Aktivitas Hemaglutinasi Inhibisi oleh Gula dan Glikoprotein

Penghambatan

gula

dan

glikoprotein

pada

aktivitas

hemaglutinasi fraksi kasar lektin diteliti lebih lanjut. Pertama-tama dilakukan uji kualitatif dimana serial pengenceran dua kali ulangan (masing-masing 25µl) dari gula atau glikoprotein dipersiapkan pada kondisi saline dalam mikrotiter v-plate. Masing-masing sumur ditambahkan 25 µl fraksi kasar lektin dengan titer hemaglutinasi 4 atau 8 dan v-plate diaduk perlahan kemudian didiamkan pada suhu ruang selama 1 jam. Selanjutnya 25 µl TRBC ditambahkan pada masingmasing sumur dan diaduk dengan hati-hati serta didiamkan selama 1 jam. Hasil uji diamati secara makroskopis dengan adanya dot pada sumuran yang menunjukkan hasil positif menghambat. Setelah dilakukan uji kualitatif, gula dan glikoprotein yang positif

menghambat

aktivitas

hemaglutinasi

secara

kualitatif

dilanjutkan uji kuantitatif. Pada uji kuantitatif, dalam tiap sumuran dimasukkan 25 µl saline, selanjutnya gula atau glikoprotein dimasukkan dalam sumuran pertama kemudian didilusi sebaris, lalu dimasukkan 25 µl fraksi kasar lektin dalam tiap sumuran dan didiamkan selama 1 jam. Setelah itu, tiap sumuran ditambah 25 µl TRBC, digoyang perlahan kemudian didiamkan selama 1 jam. Diamati secara makroskopis, aktivitas penghambatan ditunjukan dengan konsentrasi minimum penghambatan (mM atau µg/ml), konsentrasi paling rendah dari gula atau glikoprotein yang dapat menghambat hemaglutinasi. Gula yang digunakan diantaranya monosakarida D-galactose, D-glucose, D-mannose, D-xylose, L-fucose, L-rhamnose, N-acetyl-Dgalactosamine, dan N-acetyl-D-glucosamine serta disakarida Lactose. Preparasi gula menggunakan rumus M = W/(Mr.V) dimana Mr terdapat pada label kemasan gula, V adalah volum yang dibutuhkan yaitu 1 ml, M adalah molaritas gula yang diinginkan yaitu 100mM atau 0.1 M dan W adalah berat gula yang akan diambil untuk dilarutkan dalam PBS (20 mM pH 7.0).

61

1. D-galactose

Mr: 180.16 Maka: 0.1 M = miligram/(180.16 x 1 ml) miligram = 180.16 x 0,1 miligram = 18.016 jadi, 18.016 miligram D-galactose dilarutkan dalam 1 ml PBS. 2. D-glucose Mr: 180.16 Maka:

0.1 M = miligram/(180.16 x 1 ml) miligram = 180.16 x 0,1 miligram = 18.016

jadi, 18.016 miligram D-glucose dilarutkan dalam 1 ml PBS. 3. D-mannose Mr: 180.16 Maka: 0.1 M = miligram/(180.16 x 1 ml) miligram = 180.16 x 0,1 miligram = 18.016 jadi, 18.016 miligram D-mannose dilarutkan dalam 1 ml PBS. 4. D-xylose

Mr: 150.13 Maka: 0.1 M = miligram/(180.16 x 1 ml) miligram = 150.13 x 0,1 miligram = 15.013 jadi, 15.013 miligram D-xylose dilarutkan dalam 1 ml PBS. 5. L-fucose Mr: 164.16 Maka: 0.1 M = miligram/(164.16 x 1 ml) miligram = 164.16 x 0,1 miligram = 16.416 jadi, 16.416 miligram L-fucose dilarutkan dalam 1 ml PBS. 6. L-rhamnose

Mr: 164.16 Maka: 0.1 M = miligram/(164.16 x 1 ml)

62

miligram = 164.16 x 0,1 miligram = 16.416 jadi, 16.416 miligram L-rhamnose dilarutkan dalam 1 ml PBS. 7. N-acetyl-D-galactosamine

Mr: 221.21 Maka: 0.1 M = miligram/(221.21 x 1 ml) miligram = 221.21 x 0,1 miligram = 22.121 jadi, 22.121 miligram N-acetyl-D-galactosamine dilarutkan dalam 1 ml PBS. 8. N-acetyl-D-glucosamine

Mr: 221.21 Maka: 0.1 M = miligram/(221.21 x 1 ml) miligram = 221.21 x 0,1 miligram = 22.121 jadi, 22.121 miligram N-acetyl-D-glucosamine dilarutkan dalam 1 ml PBS. 9. Lactose Mr: 342.3 Maka: 0.1 M = miligram/(342.3 x 1 ml) miligram = 342.3 x 0,1 miligram = 34.23 jadi, 34.23 miligram Lactose dilarutkan dalam 1 ml PBS. Sementara glikoprotein yang digunakan diantaranya transferin human, fetuin from fetal bovine serum, thyroglobulin from porcine thyroid gland, thyroglobulin from bovine thyroid, mucin from bovine submaxillary glands dan yeast mannan. Preparasi glikoprotein dengan menimbang 2 mg glikoprotein kemudian dilarutkan dalam 1 ml PBS (20 mM pH 7.0). Preparasi glikoprotein menjadi asialo glikoprotein menggunakan metode Hori (1986) dalam Hung et al (2009) dapat dilihat pada Gambar 3.10. Glikoprotein yang sudah disiapkan dicampur dengan 0.05 M HCl dengan perbandingan 10:1 untuk selanjutnya dipanaskan pada suhu 80ºC selama 1 jam. Setelah itu,

63

dimurnikan dengan dialisis menggunakan PBS selama 10 jam dengan penggantian buffer setiap 2 jam.

Glikoprotein Ditimbang sebesar 2 mg PBS 20 mM pH 7.0 HCl 0.05 M Rasio 10 : 1 20 PBS mM pH 7.0

Dilarutkan dalam 1 ml PBS

Penghidrolisisan dengan 0.05 M HCl pada suhu 800C selama 1 jam dengan perbandingan Sialo glikoprotein dan HCl sebesar 10 : 1 Pemurnian dengan dialisis menggunakan PBS selama 10 jam dengan penggantian buffer setiap 2 jam Asialo glikoprotein menjadi bentuk Asialo Gambar 3.10 Preparasi Glikoprotein menurut Hori et. al. (1986) dalam Hung et. al. (2009) Pengujian

aktivitas

hemaglutinasi

inhibisi

ditentukan

berdasarkan metode Praseptiangga (2013). Uji ini dilakukan dalam 2 tahap yaitu uji kualitatif dan uji kuantitatif dengan dua kali ulangan menggunakan 96-well microtiter v-plate. Uji kualitatif dilakukan terlebih dahulu dengan tujuan mengetahui gula dan glikoprotein yang positif berikatan dengan lektin, dikatakan positif menghambat apabila membentuk dot (lingkaran sentral eritrosit yang dikelilingi zona konsentrik bersih dengan ukuran sama) menunjukkan ikatan lektin dengan sel eritrosit terinhibisi oleh gula atau glikoprotein. Pengujian aktivitas

hemaglutinasi

inhibisi

kualitatif

dilakukan

dengan

memasukkan 25 µl gula atau glikoprotein ke dalam sumuran mikrotiter v-plate. 25 µl fraksi kasar lektin yang sudah diencerkan ke titer 4 atau 8 ditambahkan dalam tiap sumuran tersebut. Kemudian digoyang perlahan selama 30 detik agar tercampur dan diinkubasi pada suhu

64

ruang selama 1 jam. Setelah 1 jam, 25 µl TRBC kelinci ditambahkan dalam sumuran tersebut. Selanjutnya digoyang lagi perlahan selama 30 detik, diinkubasi 1 jam pada suhu ruang, dan diamati secara maskroskopis. Pengujian aktivitas hemaglutinasi inhibisi secara kuantiitatif dilakukan dengan memasukkan25 µl saline ke dalam tiap sumuran mikrotiter v-plate, lalu 25 µl gula dan atau glikoprotein yang positif menghambat aktivitas hemaglutinasi pada uji aktivitas hemaglutinasi secara kuantitiatif ditambahkan ke dalam sumuran pertama dan didilusi hingga sumuran ke 12. Kemudian ditambahkan 25 µl fraksi kasar lektin dalam tiap sumuran tersebut, digoyang perlahan selama 30 detik dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang. Setelah itu, ditambahkan 25 µl TRBC kelinci dalam tiap sumuran tersebut dan digoyang lagi serta diinkubasi 1 jam lagi. Pada pengujian ini disertakan kontrol positif yaitu 25 µl salin yang ditambahkan 25 µl fraksi kasar lektin, kemduain dilakukan pendiaman selama 1 jam, untuk selanjutnya ditambahkan TRBC; serta kontrol negatif berupa 25 µl salin dengan 25 µl TRBC. Hasil uji selanjutnya diamati secara makroskopis dan dikatakan positif apabila terbentuk dot pada sumuran. Uji

aktivitas

hemaglutinasi

inhibisi

menggunakan

metode

Praseptiangga (2013) seperti pada Gambar 3.11 dan Gambar 3.12.

Penyiapan 96-well microtiter v-plate 25 µl glukosa atau glikoprotein

Penambahan masing-masing 1 sumuran

25 µl fraksi kasar lektin titer 22 atau 23

Penambahan ke dalam semua sumuran Pencampuran dan penggojogan dengan perlahan selama kurang lebih 30 detik

65

Penginkubasian selama 1 jam pada suhu kamar 25 µl TRBC Kelinci

Penambahan pada setiap sumuran Pencampuran dan penggojogan dengan perlahan selama kurang lebih 30 detik Penginkubasian selama 1 jam pada suhu kamar Pengamatan secara makroskopis. Positif menghambat jika terbentuk dot. Negatif menghambat jika terbentuk karpet. Gambar 3.11 Pengujian Penghambatan Aktivitas Hemaglutinasi oleh Gula dan Glikoprotein secara Kualitatif menurut Praseptiangga (2013)

Penyiapan 96-well microtiter v-plate 25 µl NaCl 0.85% 25 µl gula atau glikoprotein

Penambahan ke dalam masing-masing sumuran Penambahan pada sumuran pertama Pendilusian memanjang pada 12 sumuran (two fold dilution)

25 µl fraksi kasar lektin dengan titer 22 atau 23

Penambahan ke dalam semua sumuran Pencampuran dan penggojogan dengan perlahan selama kurang lebih 30 detik Penginkubasian selama 1 jam pada suhu kamar

66

25 µl TRBC kelinci

Penambahan pada setiap sumuran Pencampuran dan penggojogan dengan perlahan selama kurang lebih 30 detik Penginkubasian selama 1 jam pada suhu kamar Pengamatan secara makroskopis. Positif menghambat jika terbentuk dot. Negatif menghambat jika terbentuk karpet. Gambar 3.12 Pengujian Penghambatan Aktivitas Hemaglutinasi oleh Gula dan Glikoprotein secara Kuantitatif menurut Praseptiangga (2013)