BAB III METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian Waktu Penelitian
: Februari 2016 sampai dengan selesai.
Tempat Penelitian
: Perlakuan pada tikus dan proses pengambilan jaringan dilakukan di Laboratorium Hewan Coba UNS, Surakarta, dilanjutkan dengan proses pembuatan preparat dan pewarnaan yang dilakukan di Laboratorium Histologi Anatomi UNS, Surakarta.
B. Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk eksperimental laboratorik dengan desain Randomized Controlled Trial yang menggunakan tikus Wistar sebagai obyek penelitian, dengan tujuan mencari perbedaan pengaruh pemberian Ketotifen dibandingkan kontrol terhadap luas luka dan infiltrasi sel Mast pada luka sekitar incisi. Kelompok penelitian dibagi menjadi dua, yaitu kelompok kontrol negatif (K1), kontrol perlakuan (K2), penjelasannya sebagai berikut : K1
: Kelompok kontrol, tikus Wistar yang dilakukan incisi sepanjang 2 cm, dengan pemberian placebo .
K2
: Kelompok perlakuan, tikus Wistar yang dilakukan incisi sepanjang 2 cm, yang diberikan Ketotifen 2 jam sebelum incisi dilanjutkan tiap 12 jam sampai hari ke-6 setelah incisi. Dosis tiap 12 jam yang telah dikonversi yaitu 0,3 mg/kg BB (Shaw et al., 2007)
29
30
Skema rancangan penelitian adalah sebagai berikut : Incisi K1
6 hari, penghitungan Pemberian placebo Incisi
K2
6 hari, penghitungan Pemberian Ketotifen 0.3 mg/kgbb/12 jam
C. Sampel Penelitian Hewan coba adalah tikus Wistar yang diperoleh dari Laboratorium Hewan Coba Universitas Sebelas Maret. 1. Kriteria Inklusi : a.
Tikus Wistar keturunan murni sehat
b.
Berjenis kelamin betina
c.
Belum pernah digunakan untuk penelitian
d.
Umur dua sampai dua setengah bulan
e.
Berat badan 250 – 300 gram
2. Kriteria Eksklusi a.
Tikus Wistar sakit selama masa adaptasi 7 hari (gerakan tidak aktif)
b.
Mati selama perlakuan berlangsung
c.
Infeksi di sekitar tempat yang akan dilakukan incisi
3. Besar Sampel Untuk analisis multivariat, di mana pada penelitian terdapat satu variabel bebas yaitu pemberian Ketotifen dan dua variabel terikat yaitu infiltrasi sel Mast dan luas luka, maka besar sampel minimal dihitung dengan menggunakan kalkulator sampsize berdasarkan penelitian yang dilakukan sebelumnya oleh Hsu dan kawan-kawan pada tahun 2014, dengan data sebagai berikut: Alpha
=5
Mean 1 =16.4 sd 6.1 Mean 1 =53.7 sd 28.7
31
n2/n1
=1
Didapatkan besar sampel minimal untuk masing masing kelompok adalah minimal 7 . 4. Randomisasi Untuk mengurangi kemungkinan terjadi kerusakan atau kematian sampel, besar sampel menjadi 10 ekor tiap kelompok. 20 tikus dikelompokkan secara random menjadi dua kelompok yaitu: Kelompok K1 : 10 tikus Kelompok K2 : 10 tikus D. Variabel dan Definisi Operasional Variabel 1. Variabel Penelitian a. Variabel Bebas Ketotifen b. Variabel Tergantung 1) Infiltrasi Sel Mast 2) Luas luka c. Variabel luar
:
1) Variabel luar yang dapat dikendalikan Variasi genetik, jenis kelamin, umur, suhu udara, berat badan, jenis makanan dan minuman mencit semua disamakan. 2) Variabel luar yang tidak dapat dikendalikan Kondisi psikologis tikus Wistar, keadaan awal intestinal, reaksi hipersensitivitas, kepekaan mencit terhadap suatu zat. 2. Definisi operasional variabel a.
Ketotifen adalah obat anti histamin generasi kedua, dengan sediaan bentuk sirup 0.2mg/cc, Ketotifen diberikan 2 jam sebelum incisi, dilanjutkan tiap 12 jam selama 6 hari. Ketotifen diberikan secara per oral dengan spuit 1 cc.
b.
Alat ukur
:
-
Skala pengukuran
: nominal
Infiltrasi sel Mast merupakan suatu interpretasi berupa perhitungan jumlah infiltrasi sel mast pada luka bekas incisi yang dibiopsi dan selanjutnya dipulas dengan menggunakan pewarnaan Toulidine Blue dan diamati dibawah
32
mikroskop dengan perbesaran 400x pada 5 lapangan pandang dan ditampilkan dalam bentuk angka.
c.
Alat ukur
: mikroskop binokuler
Skala data
: rasio
Luas luka merupakan suatu interpretasi berupa pengukuran luas dari luka pada kulit, yang diukur menggunakan teknik fotografi dan diolah menggunakan program IMAGEJ yang ditampilkan dalam bentuk angka. Alat ukur
: penggaris, kamera digital, komputer, perangkat lunak IMAGEJ
Skala data
: rasio
E. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan untuk Perlakuan Hewan coba adalah tikus Wistar dengan umur 2,5 sampai 3 bulan dan berat 250300 gram. Tikus Wistar adalah salah satu galur ratus-ratus, hidup di benua Amerika. Banyak digunakan sebagai hewan coba dalam penelitian di bidang kedokteran, pengobatan, dan kedokteran hewan. Tikus jenis Wistar diperoleh dari Laboratorium Hewan Coba, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Selama proses percobaan, hewan coba ditempatkan pada kandang dan diberi makan dan minum secukupnya. 2. Bahan dan alat a. Alat Penelitian 1) Kandang tikus 2) Tempat makan dan minum tikus 3) Timbangan untuk mengukur berat badan tikus 4) Tabung reaksi 5) Sonde lambung 6) Disposible syringe 7) Pinset sirurgis 8) Blade dan scalpel 9) Gelas objek dan deck glass 10) Mikroskop binokuler
33
11) Counter 12) Sonde setengah bulat 13) Sarung tangan 14) Eksavator 15) Gunting 16) Masker 17) Tempat air 18) Alat cetak parafin 19) Alas kaca 20) Mikrotom b. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah: 1) Aquadest steril 2) Makanan standart untuk tikus Wistar 3) Air 4) Meyer egg albumin 5) Tikus jantan (Strain Wistar) 6) Minyak eter 7) Larutan buffer 8) Alkohol 9) Parafin 10) Cat Toluidine Blue 11) Zenker 12) Xylol 13) Alkohol 70%, 80%, 95%, 100% 14) Formaldehid 10 % 15) Aquabides 16) Eter choride 17) Asam format 50% 18) Gliserin 19) Minyak emersi
34
20) CMC 1% F. Pelaksanaan Penelitian Sejumlah 20 ekor tikus Wistar dilakukan adaptasi di laboratorium dengan dikandangkan dan diberi pakan standar secukupnya selama tujuh hari. Tikus dibagi menjadi dua kelompok masing-masing terdiri dari 10 ekor tikus yang ditentukan secara acak. Sebelum dilakukan incisi, tikus dianestesi menggunakan ketamin 50mg/kgbb IM. Bulu disekitar punggung tikus dicukur dan didesinfeksi menggunakan Iodin. Setelah infiltrasi dengan Lidokain, dibuat irisan sepanjang 2 cm dan kedalaman sampai subkutis. Luka irisan dibersihkan dan dioles larutan Iodin, kemudian luka ditutup steril. Kelompok perlakuan, diberikan Ketotifen dengan dosis 0,3 mg/kg bb. Pemberian Ketotifen dilakukan setelah incisi dan dilanjutkan dengan pemberian dosis ulangan tiap 12 jam selama 6 hari.
35
G. Alur Penelitian 20 ekor tikus Wistar Adaptasi 7 hari Randomisasi Kelompok K1, 10 ekor
Kelompok K2, 10 ekor
Incisi+ Pemberian placebo sirup gula per 12 jam s/d hr ke-6
Incisi+ Pemberian Ketotifen 0.3mg/kg BB per 12 j s/d hari ke-6 Hari ke-6 pasca incisi Tikus dimatikan Biopsi eksisi di luka bekas incisi Blok parafin Pemeriksaan histopatologi
Penghitungan infiltrasi sel Mast & pengukuran luas luka Gambar 6.Alur Penelitian
36
H. Prosedur Pemeriksaan 1.
Pengukuran luas luka pada kulit tikus Pada hari ke-6 paska incisi, dilakukan pengukuran luas luka dan pembuatan preparat histopatologi. Tikus dimatikan dengan cara dianestesi dengan Ketamin 50mg/kgbb IM dan kemudian dilakukan dislokasi tulang servikal (Schoell et al., 2009). Setelah tikus dimatikan maka dilakukan pengukuran dengan tahapan sebagai berikut : a.
Tikus diletakkan pada meja pemeriksaan dengan pencahayaan yang cukup
b.
Penggaris diletakkan pada tepi luka untuk skala perbandingan
c.
Dilakukan pemotretan dengan menggunakan kamera digital yang disangga dengan tripod untuk mempastikan pengambilan gambar paralel dengan luka dan skala.
d. 2.
Hasil pemotretan dianalisis dengan menggunakan piranti lunak Imagej
Prosedur Eksisi-biopsi Setelah dilakukan pemotretan untuk pengumpulan data luas luka, maka pada jaringan bekas irisan diusap dengan Alkohol 70% lalu dibuat eksisi biopsi kira-kira 0,5 cm persegi melintasi garis irisan. Jaringan biopsi lalu diproses menjadi preparat histopatologi.
3.
Prosedur Pembuatan Preparat Histopatologi a.
Pembuatan preparat jaringan Pembuatan preparat jaringan histologis dilakukan dengan tahapan sebagai berikut: 1) Jaringan biopsi yang telah dieksisi difiksasi dengan menggunakan larutan Formaldehid 10% selama minimal 12-18 jam. 2) Setelah difiksasi, jaringan dicuci dengan air mengalir. 3) Dehidrasi dengan konsentrasi alkohol yang meningkat sampai Alkohol yang meningkat sampai Alkohol 100%. Dehidrasi dimulai dengan Alkohol 70% selama 15 menit, 80% selama 1 jam, 95% selama 2 jam, 96% selama 1 jam, dan Alkohol 100% selama 3 jam .
37
4) Memasukkan jaringan dalam Xylol (clearing) sebanyak 3 kali pada 3 tabung yang berbeda dengan ketentuan waktu 1 jam, 2 jam, dan tabung yang terakhir juga 2 jam. 5) Melakukan impregnasi dengan suhu 56-58ºC selama 6 jam 6) Menanam jaringan dalam parafin (embedding): a) Alat cetak yang terbuat dari logam berbentuk siku-siku disusun diatas permukaan kaca yang rata. Alat dan alas diolesi Gliserin untuk mempermudah pemisahan alat cetak dan kaca dengan blok parafin yang sudah beku. b) Menuangkan parafin cair ke dalam alat cetak blok, kemudian memasukkan jaringan yang telah diimpregnasi dengan surgical yang kita inginkan dan jangan lupa diberi label ID sample, ditunggu beberapa menit sampai parafin beku. c) Parafin blok sudah siap untuk dipotong, setelah dilepas dari alat cetak blok. 7) Penyayatan blok Parafin menggunakan Mikrotom a) Penyayatan menggunakan Mikrotom, sebelumnya dibersihkan pisau Mikrotom dengan kasa/kertas saring yang telah dibasahi dengan Xylol dengan arah tegak lurus. b) Mengatur ketebalan sayatan Mikrotom antara 4-6 mm, atau sesuai dengan kebutuhan. c) Mengambil sayatan yang telah diperoleh dengan kuas lalu letakkan diatas permukaan air waterbath dengan temperature tetap 56-58ºC hingga sayatan mekar. d) Potongan yang sudah diseleksi dipindahkan pada object glass yang telah diolesi dengan egg albumin, dan dikeringkan dengan suhu 30-35ºC minimal selama 12 jam. Setiap object glass (1 preparat) terdiri dari 3 potongan jaringan.
38
b.
Tahap pengecatan preparat jaringan. Pengecatan preparat jaringan dilakukan dengan tahapan sebagai berikut : 1) Clearing dengan menggunakan Xylol. 2) Preparat dimasukkan ke dalam Xylol selama 2-3 menit lalu diulangi dengan memasukkan kembali ke dalam Xylol dalam wadah yang berbeda selama 2-3 menit. 3) Dilakukan deparafinisasi dengan larutan Alkohol 100%, 95% masingmasing 3 menit. 4) Preparat dibilas dengan air mengalir selama 10-15 menit, mula-mula dengan aliran lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan Alkohol. 5) Preparat diwarnai dengan zat warna Toulidine Blue selama 15 menit. 6) Dibilas kembali dengan air mengalir selama 20 menit. 7) Dilakukan dehidrasi kembali dengan larutan Alkohol konsentrasi meningkat 95% dan 100% masing-masing 2-3 menit sebanyak 2 kali dengan wadah yang berbeda. 8) Setelah melalui Alkohol absolut, preparat dipindahkan ke Xylol dan dilakukan mounting. 9) Beri setetes medium sajian Entellan yang mempunyai indeks refraksi hampir sama dengan indeks refraksi kaca pada sediaan hapus. Kemudian sediaan itu ditutup dengan kaca penutup dan dibiarkan mengering.
4.
Perhitungan Jumlah Sel Mast Penghitungan sel Mast dilakukan dengan menggunakan lensa obyektif yang sesuai pada mikroskop binokuler. Sebelumnya diletakkan satu tetes minyak emersi pada bagian sediaan jaringan yang akan diperiksa. Penghitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400x. Setiap preparat terdiri dari 3 potongan jaringan. Penghitungan dilakukan pada 3 daerah pembacaan pada setiap potongan jaringan. Pada setiap daerah pembacaan, secara sistematis penghitungan di mulai dari pojok kiri bawah kemudian digeser ke kanan dan ditarik ke atas kemudian ke kiri lagi, serta selanjutnya digeser ke atas untuk penghitungan tahap berikutnya. Demikian seterusnya sehingga
39
semua lapang pembacaan terbaca dan dilanjutkan pada daerah pembacaan kedua dan ketiga. Penghitungan jumlah Mast cell ditentukan dengan menghitung jumlah rata-rata sel Mast dari 3 potongan jaringan tiap preparat. I.
Cara Pengumpulan dan Analisis Data 1. Cara Pengumpulan Data Dari masing-masing kelompok dilakukan fiksasi dengan blok parafin, kemudian dilakukan pengukuran luas luka dan pemeriksaan histopatologi untuk menentukan infiltrasi sel Mast jaringan. Dari hasil penghitungan luas luka dan infiltrasi sel Mast jaringan yang sudah diketahui, maka selanjutnya dibandingkan antara luas luka dan infiltrasi sel Mast jaringan dari kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. 2. Analisis Data Setelah data terkumpul, data dianalisis dengan menggunakan program SPSS 22.0 Untuk menguji perbedaan rata-rata hasil
infiltrasi sel Mast antara dua kelompok
dilakukan dengan uji statistik independent t-test, dan dianggap memiliki kemaknaan statistik apabila nilai p yang diperoleh adalah p ≤ 0,05 . J.
Etika Penelitian Karena memakai binatang percobaan, maka untuk penelitian ini binatang tikus diperlakukan dengan layak, diberikan kandang yang bersih, cahaya yang cukup, serta makanan dan minuman yang cukup. Perlakuan binatang percobaan yang menimbulkan nyeri dilakukan dengan menggunakan anestesi untuk meminimalkan penderitaan pada hewan coba. Sebelum dilakukan prosedur eksisi-biopsi, tikus dimatikan dengan menggunakan cara dislokasi tulang belakang, dengan dilakukan anestesi umum sebelumnya.
40
K. Jadwal Penelitian Bulan Pengambilan data Pengolahan dan analisis data Penyusunan laporan penelitian Presentasi hasil penelitian
Februari
Maret
April
