BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental, terhadap mencit sebagai hewan coba. Dipilihnya jenis penelitian ini karena dapat menghasilkan data dengan validitas yang tinggi dan perlakuan dapat diatur oleh peneliti (Sastroasmoro dan Ismael, 2011). B. Hewan Uji Hewan uji berupa 30 ekor Tikus putih jantan (Rattus norvegicus), dengan berat badan ± 150-230 gram, dan berumur 4-6 minggu. Tikus putihdiperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan Universitas Setya Budi, Surakarta. Bahan makanan mencit digunakan pakan mencit BR I. C. Rancangan Penelitian Penentuan besar sampel dengan menggunakan rumus Federer (Supranto, 2007) yaitu : (t - 1) (n 1) > 15 jumlah kelompok perlakuan, n>4 dan (n) adalah jumlah Dimana (t)– adalah sampel per kelompok perlakuan. Dengan rumus tersebut diperoleh minimal sampel tiap kelompok adalah lim ekor tikus. Dalam penelitian ini kami menggunakan enam ekor untuk setiap kelompoknya. Setelah diadaptasikan selama dua minggu tikus dikelompokkan menjadi lima kelompok, masing-masing enam ekor. Kelompok (i) kontrol, (ii) Ulkus DM, (iii) Ulkus DM+propolis topikal 2,5%, (iv) Ulkus DM+propolis topikal 5%, (v) Ulkus DM+propolis topikal 10%. Setelahtikus dikorbankan jaringan kaki dikoleksi, untuk kemudian dilakukan pembuatan preparat histologis untuk dideteksi secara imunohistokimia.
1
2 Pengukuran awal tidak dilakukan karena dianggap sama untuk semua kelompok yang berasal dari satu populasi, sehingga dapat dikembangkan rancangan eksperimental tanpa adanya pengukuran awal (pretest) tetapi hanya pengukuran akhir (post test)/post-test only control group design (Sastroasmoro dan Ismael, 2011). D.
Bagan Rancangan Penelitian
36 ekor tikus putih jantan
I
O1
II
O2
III
O3
IV
O4
V
O5
0
30 hari
Gambar 3.Bagan Rancangan Penelitian Keterangan: O1 O2 O3 O4 O5
: Observasi kelompok kontrol negatip setelah 30 hari : Observasi kelompok kontrol positip(DM) setelah 30 hari : Observasi kelompok terapiI (DM+propolis topikal 2,5%) setelah 30 hari : Observasi kelompok terapiII (DM+propolis topikal 5%) setelah 30 hari : Observasi kelompok terapiIII (DM+propolis topikal 10%) setelah 30 hari
E. Kerangka operasional penelitian
Rattus norvegicus jantan
Kelompok normal6 ekor
STZ dosis 65 mg/kgBB kadar glukosa darah ≥200 mg/dL
3
lukapada dorsalis pedis electric shaver
Vaselin albumTopikal
Propolis Topikal 2,5%
Propolis Topikal 5%
Propolis Topikal 10%
(6 ekor)
(6 ekor)
(6 ekor)
(6 ekor)
Ukuran luka,ekspresi TGF-β dan MMP9 Analisis Statistik
Gambar 4.Kerangka operasional penelitian F. Variabel Penelitian Klasifikasi variabel diukur menurut tujuan penelitian dan digolongkan dalam beberapa variabel sebagai berikut: 1.
Variabel bebas: Rangsangan tikus Rattus norvegicus jantandengan cara memberikan injeksi STZ 65
mg/kgBB untuk induksi DM, kemudian dibuat luka pada kakinya. Variabel tersebut meliputi:
a. Propolis topikal salep 2,5%. b. Propolis topikal salep 5%. c. Propolis topikal salep 10%.
2.
Variabel tergantung:
Variabel tergantung adalah variabel yang akan diteliti, yaitu perubahan a. Ukuran luka. b. Ekspresi TGF-β. c. Ekspresi MMP-9.
4 3.
Variabel kendali:
1. Hewan coba: jenis tikus, umur dan jenis kelamin, homogen. 2. Pemeliharaan dan bahan makanan, minuman, sanitasi kandang, kelembaban dikondisikan sama. 3. Injeksi: teknik injeksi pada tikus. 4. Pengambilan kulit. 5. Penghitungan ekspresi TGF-β dan MMP-9: teknik imunohistokimia.
G. Batasan Operasional 1. Hewan percobaan Tikus putih jantan (Rattus norvegicus), dengan berat badan ± 150-230 gram, dan berumur 4-6 minggu. 2. Tikus sehat Tikus dengan kondisi mata bersinar, bulu tidak kusam, aktif, nafsu makan baik (Kusumawati, 2004). 3. Hewan coba model kaki diabetes Tikus putih diadaptasikan selama satu minggu, sebelum dilakukan perlakuan. Untuk membuat model DM, tikus diinjeksi STZ dosis 65 mg/kgBB dalam 0.02 M citrate saline buffer (Kim et al., 2006) (100 mM asam sitrat dan 100 mM Na sitrat pada pH 4.5) (Gurney and Howarth, 2009) secara i.p. Hanya tikus dengan kadar glukosa darah sewaktu (GDS) ≥200 mg/dL yang digunakan dalam penelitian ini. Hewan
coba
dianestesi
menggunakan
campuran
ketamine/xylazine
(50 mg/kgBB ketamine dengan 50 mg/kgBB xylazine) secara i.p. Untuk kemudian pada dorsal pedis dibuat luka ukuran 0,5x0,5 cm menggunakan electric shaver. Luka ditutup dengan Tegaderm (3M Corporation, St. Paul, MN).Pada akhir perlakuan semua hewan coba dikorbankan menggunakan eter, untuk kemudian dikebumikan. 4. Propolis Lebah Proses pembuatan ekstrak propolis lebah dilakukan dengan teknik maserasi. Propolis kering dibersihkan dan diblender hingga halus selanjutnya ditimbang
5 sebanyak 500 gram, kemudian dimasukkan ke dalam gelas beaker. Proses maserasi dilakukan dengan menambahkan 3,75 liter etanol 95% sebagai pelarut (Trusheva dkk., 2007). Campuran bahan disimpan selama tujuh hari pada ruangan yang tidak terkena sinar matahari dengan dikocok kuat atau pengadukan dengan spatula pengaduk sebanyak dua kali tiap hari (Susilo, 2007). Tahap selanjutnya dilakukan penyaringan dengan corong buchner dan kertas saring untuk memisahkan filtrat dari ampas ke dalam labu erlenmeyer sehingga diperoleh fitrat. Hasil filtrasi (penyaringan) yang didapat dievaporasi dengan rotary evaporator pada suhu 45 oC dengan tekanan vakum (<1 atm) sehingga diperoleh ekstrak propolis yang konsentrasinya kental (± 100 g). Selanjutnya ekstrak propolis diuapkan selama 24 jam di dalam gelas beaker sehingga kandungan etanolnya menguap (Mawardi dkk., 2002; Sabir, 2005). Selain itu untuk mengetahui kandungan etanol dalam ekstrak propolis benar-benar hilang, maka dilakukan metode uji bobot tetap terhadap propolis. 5. Pengukuran kadar Glukosa Darah Kadar glukosa darah ditentukan menggunakan Blood Glucose Test Meter (Gluco Dr ), dengan range : 20 – 600 mg/dL, dari darah ekor tikus.
Tabel 2. Parameter dan definisi alat ukur penelitian Parameter
Definisi
Ukuran
Luka diukur pada hari 0 dan 30
luka
pasca pembuatan luka. Persentase luka dihitung menggunakan rasio
Alat ukur
mistar
Satuan
Skal
Data
a
mm2 Dilakukan dengan standar
Data Rasio
6 area luka sebelum sampai sesudah
Panjang X Lebar. Akhir penelitian dilakukan pengukuran ulang. Luas luka akhir dibanding kan dengan
pembuatan luka, berdasarkan metode yang dilakukan Trousdale et al.,2009.
luas luka awal x 100% sehingga didapatkan nilai akhir dalam % Ekspresi
Ekspresi TGF-β1 penilaian
visual
TGF-β
positifitas pemeriksaan IHC
dengan
menggunakan antibodi
mikroskop
monoklonal terhadap TGF-β1.
cahaya
Cara ukur dinilai secara
pembesar
kuantitatif, visual dengan
an 400x
mikroskop cahaya pembesaran 400x terhadap 1000 sel makrofag sebagai sel yang mengekspresikan TGF-β1. Kemudian dihitung jumlah sel-sel tersebut yang imunoreaktif tercat coklat perak, pada membran sel. Jumlah semua sel immunoreaktif yang ditemukan kemudian dijumlahkan dan selanjutnya dimasukkan sebagai data (bilangan dalam tabel untuk tiap hewan coba) (Tomino, 2000; Susilo, 2006).
Per 100 sel makrofag
Rasio
7 Ekspresi
Ekspresi MMP-9 penilaian
visual
Per 100
MMP-9
positifitas pemeriksaan
dengan
sel PMN
imunohistokimia dengan
mikroskop
menggunakan antibodi
cahaya
monoklonal terhadap MMP-
pembesar
9. Cara ukur dinilai secara
an 400x
Rasio
kuantitatif, visual dengan mikroskop cahaya pembesaran 400x terhadap 1000 sel, yang terdiri PMN sebagai yang mengekspresikan MMP-9. Kemudian dihitung jumlah sel-sel tersebut yang imunoreaktif tercat coklat perak, pada membran sel. Jumlah semua sel immunoreaktif yang ditemukan kemudian dijumlahkan dan dimasukkan sebagai data (bilangan dalam tabel untuk tiap hewan coba) (Tomino, 2000; Susilo, 2006).
H. Prosedur Pelaksanaan Penelitian Setelah mencit dikorbankan kulit dikoleksi untuk kemudian dibuat blok parafin. Selanjutnya dilakukan pemotongan jaringan untuk pembuatan preparat histologis. Preparat digunakan untuk pengukuran ekspresi TGF-β dan MMP-9 menggunakan imunohistokimia (IHC) sesuai dengan protokol yang sudah dianjurkan dari pabriknya (Pharmingen, San Diego, California, USA). I.
Tempat penelitian Penelitian ini dikerjakan di :
8 1. Kandang Hewan Percobaan Laboratorium Histologis Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret sebagai tempat pemeliharaan hewan. 2. Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran untuk pemeriksaan IHC. J. Waktu Waktu yang diperlukan dalam penelitian ini selama 5 bulan dengan jadwal penelitian sebagai berikut.
Tabel3. Jadwal penelitian Jenis Kegiatan
1
2
Bulan ke3 4
5
1. Persiapan : memesan bahan-bahan, mengumpulkan kepustakaan, diskusi, membuat log book 2. Pelaksanaan Penelitian: Induksi hewan coba
model
kaki
diabetik,
hitung
ekspresi TGF-β dan MMP-9, dan analisis data 3. Penyusunan Laporan Tesis
K. Biaya Biaya penelitian ini diperkirakan ± Rp 35.000.000,L. Analisis Data Data disajikan dalam bentuk mean ± SD kemudian dianalisis menggunakan SPSS 22 for windows dengan nilai p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Apabila hasil uji normalitas data variabel untuk masing-masing kelompok sampel berdistribusi normal, maka uji variasi atau perbedaan beberapa mean dapat menggunakan alat uji statistik Analysis of
9 Variance (ANOVA) atau disebut juga Uji F. Dan apabila terdapat variasi rata-rata untuk ke enam kelompok sampel itu, analisis akan diteruskan dengan mencari perbedaan 2 mean masing-masing kelompok menggunakan uji lanjutan ANOVA yaitu Post Hoc Test. Namun apabila hasil uji normalitas data variabel menunjukkan bahwa distribusi data untuk masingmasing kelompok sampel adalah berdistribusi tidak normal maka uji variasi atau beda beberapa mean dapat menggunakan uji statistik non parametrik Kruskal Wallis. Penelusuran lebih lanjut untuk menguji beda mean masing-masing sampel kelompok dapat menggunakan analisis statistik non parametrik Mann-Whitney.
