1
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan adalah eksperimen, karena penelitian ini dilakukan dengan memberikan suatu manipulasi terhadap objek penelitian serta adanya kontrol (Nazir, 1999).
B. Desain Penelitian Pada penelitian dilakukan beberapa tahap yaitu pra penelitian yang mencakup pembuatan kurva tumbuh dan kurva produksi metabolit sekunder pada mengkudu dan kurva tumbuh Saccharomyces cerevisiae H Dari tahap ini diperoleh waktu elisitasi terbaik kalus dan waktu pemanenan terbaik S. cerevisiae H untuk digunakan sebagai elisitor. Penelitian utama adalah memberi empat perlakuan dengan kontrol yaitu penambahan elisitor dengan konsentrasi 0%, 2.5%, 5.0%, 7.5% (v/v) untuk perlakuan dan pemberian akuades untuk kontrol (Modifikasi Survanalatha et al., 1994). Tahap selanjutnya adalah dilakukan elisitasi pada kalus berusia 12 hari setelah subkultur kedua, kemudian dipanen pada hari ke-0, 2, dan 4, (Purwianingsih, 1997). Kalus hasil pemanenan kemudian diekstrak menggunakan metanol pro analisis absolut, dan diuji dengan Gas Chromatograph Mass Spectrometer (GCMS ).
2
Variabel bebas dan variabel terikat pada penelitian ini adalah sebagai berikut : Variabel Bebas
: Konsentrasi elisitor dan waktu pemanenan kalus
Variabel terikat
: Peningkatan senyawa alkaloid pada kultur kalus M. citrifolia L
Setiap perlakuan disusun sebanyak tiga kombinasi dengan kontrol. Adapun jumlah pengulangan didasarkan pada perhitungan dengan rumus (Gomez & Gomez, 1985): (t) (r) – 1 ≥ 20 (7) (r) – 1 ≥ 20
Keterangan: r
7r
≥ 20 + 1
7r
≥ 21
r
≥3
= jumlah pengulangan
t
= jumlah perlakuan
20
= faktor nilai derajat kebebasan
Kalus yang telah dielisitasi kemudian dipanen setiap dua hari sekali yaitu nol, dua, dan empat hari. Kalus hasil pemanenan kemudian diekstrak menggunakan metanol absolut, diuji dengan GCMS dan diamati ada tidaknya peningkatan kandungan bioaktif senyawa oksazol (alkaloid) pada setiap perlakuan.
3
28
Perlakuan dimulai dengan penyuntikan 0.5 ml elisitor berupa homogenat Saccharomyces cerevisiae H. pada kalus subkultur ke-2 dengan konsentrasi 0%, 2.5%, 5.0%, 7.5% (v/v). Kemudian kalus yang telah dielisitasi dipanen setelah diinkubasi di ruang kultur selama 0, 2, dan 4 hari.
C. Populasi dan Sampel 1. Populasi : Seluruh kalus Morinda citrifolia L (mengkudu) yang berasal dari subkultur kedua. 2. Sampel
: Sebagian dari kultur kalus Morinda citrifolia L yang akan diberi
perlakuan dielisitasi
D. Lokasi penelitian Lokasi penelitian dilakukan pada tiga laboratorium yaitu, laboratorium Fisiologi Tumbuhan jurusan pendidikan biologi untuk pembentukan kalus Morinda citrifolia, laboratorium Mikrobiologi jurusan pendidikan biologi untuk persiapan elisitor Saccharomyces cerevisiae H, dan laboratorium Analitik Instrumen jurusan pendidikan kimia Universitas Pendidikan Indonesia untuk analisis alkaloid dengan GCMS
29
E. Alat dan bahan 1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini cukup banyak. Rincian alat tersedia dalam lampiran 1. 2. Bahan a. Bahan yang digunakan sebagai eksplan adalah dari organ daun yang berasal dari kecambah Morinda citrifolia L yang berumur kurang lebih 1,5 bulan (gambar 3.1).
Gambar 3.1 Tanaman Morinda citrifolia L yang berusia 1,5 Bulan
b. Medium kultur yang digunakan untuk menanam Mengkudu adalah medium Murashige dan Skoog (MS) dengan penambahan ZPT 2,4 D (3.10-1 mg/L) (Purwaningsih dan Novianny, 2003) komposisi medium dapat dilihat pada lampiran 2. c. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah metanol yang berderajat pro analitis absolut. d. Bahan yang digunakan untuk proses sterilisasi eksplan adalah Bayclin 30% (5,25 Na-hipoklorit) selama 15 menit dan alkohol 70%.
30
e. Untuk mengkultur Saccharomyces cerevisiae H diperlukan medium tumbuh berupa medium Glukosa Yeast Ekstrak Agar (GYEA). Komponen GYEA dapat dilihat pada lampiran 3.
F. Cara Kerja 1. Penyediaan Kalus Morinda citrifolia L a. Persiapan Eksplan Bagian yang diambil dan dijadikan sebagai sumber eksplan adalah potongan daun dari kecambah M. citrifolia L berumur 1,5 bulan yang ditumbuhkan dari biji. Biji diperoleh dari kebun botani Jurusan Pendidikan Biologi (Gambar 3.2). Pengecambahan biji dilakukan dengan menanamkan biji terpilih pada media pemeliharaan berupa tanah sekam dengan perbandingan 2:1. Penyiraman dilakukan tiap hari dan disimpan pada tempat yang tidak terlalu banyak terkena sinar matahari.
Gambar 3.2 Biji Morinda citrifolia L yang digunakan untuk penanaman.
31
b. Pembuatan Medium Penelitian ini menggunakan medium dasar Murashige & Skoog (MS) dengan komposisi tertera pada lampiran 2. Menurut Novianny (2004) salah satu medium yang cocok untuk mengkultur Morinda citrifolia L adalah medium MS dengan zat pengatur tumbuh berupa 2,4-D (3.10-1 mg/L). Setelah medium dibuat dengan komposisi yang tertera pada lampiran 2, pH larutan diatur dengan pH meter sampai pH 5,6-5,8 jika terlalu basa, sebaiknya larutan ditambah dengan HCl 0,1 N dan tambahkan NaOH 0,1 N jika medium terlalu asam. Medium MS dipanaskan di atas hot plate yang dilengkapi dengan magnetic stirrer sampai mendidih. Kemudian 10 ml medium MS dituangkan pada setiap botol kultur. Kemudian mulut botol kultur ditutup dengan aluminium foil. Medium MS untuk induksi kalus disiapkan sebanyak 300 botol. c. Sterlisasi Eksplan, Alat dan Medium Sterilisasi eksplan yaitu daun mengkudu dicuci dengan air mengalir, kemudian eksplan diletakan di cawan Petri yang telah dilapisi kertas hisap dan selanjutnya eksplan dimasukan ke dalam Laminar. Di dalam laminar, eksplan dipotong kira-kira sebesar 1cmx1cm setelah eksplan tersebut direndam dalam desinfektan yang mengandung 5,25 % Nahipoklorit seperti larutan Bayclin 20% selama 15 menit digoyang perlahan
32
agar seluruh permukaan eksplan terbasuh desinfektan. Setelah eksplan steril kemudian dipindahkan ke cawan Petri steril yang dilapisi kertas saring. Alat-alat, medium yang akan digunakan untuk tahap penanaman dan subkultur seperti cawan Petri berisi kertas saring, akuades dalam tabung Erlenmeyer, aluminium foil, scalpel, dan pinset, disterilisasi dengan menggunakan autoclave pada suhu 121oC dan tekanan 15 lb/inc selama 15 menit. Setelah dilakukan sterilisasi, botol kultur yang berisi medium disimpan di ruang inkubasi. d. Penanaman Eksplan dan Penyimpanan Kultur Penanaman eksplan dilakukan dalam Clean Benc. Clean Benc dibersihkan dengan alkohol 70%, semua alat dan bahan untuk penanaman dimasukan ke dalam Clean Benc
kecuali eksplan. Alat dan bahan yang
digunakan pada penanaman eksplan diantaranya adalah medium MS 0.3 M, eksplan, akuades yang telah disterilkan, larutan bayclin 20%, alkohol 70%, lampu spirtus, gelas Erlenmeyer, pinset, scalpel, cawan Petri, gelas ukur, aluminium foil dan karet. Kemudian sinar ultraviolet dinyalakan, selama kurang lebih 30 menit dan udara dibiarkan mengalir selama 30 menit pula. Tahap penanaman dilakukan secara aseptik, dan semua kegiatan di dalam laminar dilakukan selalu dekat dengan api. Dua sampai tiga potong eksplan daun dimasukan pada setiap botol medium. Kemudian dipelihara dalam ruang kultur dan dilakukan penyinaran dengan intensitas cahaya 1500 lux pada suhu kamar secara terus menerus sampai kalus terbentuk.
33
e. Penentuan Hasil Subkultur Kalus yang berhasil ditumbuhkan pada medium padat MS kemudian di subkultur pada medium yang sama dengan interval waktu tertentu, untuk memperbanyak jumlah kalus. Kriteria kalus yang harus dilakukan subkultur adalah kalus yang tumbuh sudah 50 % menutupi eksplan dan teksturnya meremah. Kalus yang dihasilkan dari hasil subkultur kedua yang akan digunakan untuk proses elisitasi. f. Pengukuran Pertumbuhan dan Produksi Senyawa Oksazol Untuk menentukan waktu yang tepat dilakukannya proses elisitasi, terlebih dahulu harus dicari fase log dari pertumbuhan kalus. Pembuatan kurva tumbuh untuk menentukan fase log dilakukan dengan mengukur pertambahan berat basah kalus yang akan diukur setiap 4 hari sekali, sampai diperoleh kurva tumbuh dengan fase-fase yang lengkap. Selain pengukuran kurva tumbuh, dilakukan juga pengukuran kurva produksi berdasarkan perubahan kandungan bioaktif pada kalus. Pengukuran kandungan bioaktif secara kualitatif dan kuantitatif dilakukan pada kalus yang telah dipanen setiap 4 hari sekali dengan GCMS, sampai diperoleh kurva produksi lengkap. Sebelum dianalisis menggunakan GCMS terlebih dahulu disiapkan sampel berupa ekstrak kalus.
34
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut metanol pro analitis absolut. Metode yang digunakan untuk membuat ekstrak metanol berdasarkan modifikasi Simes et al. (Novianny, 2004). Kalus basah digerus dan ditambahkan 10 ml metanol, kemudian dimasukan ke dalam sebuah tabung ulir untuk dimaserasi selama lebih kurang 3-4 hari. Setelah dimaserasi kalus disaring menggunakan kertas saring Whatman no.1. Ampas kalus digerus kembali dengan menambahkan metanol kemudian disaring kembali. Apabila hasil saringan masih pekat maka ampas kalus digerus kembali untuk ketiga kalinya dan tambahkan metanol hingga volume metanol seluruhnya 20 ml kemudian disaring kembali. Hasil penyaringan dipindahkan ke dalam gelas erlenmeyer 100 ml dan simpan pada penangas air 50oC untuk menguapkan metanol. Proses menguapkan lebih kurang berlangsung selama satu jam hingga ekstrak kalus berbentuk pasta. Kemudian pasta kalus tersebut ditambahkan 3 ml metanol dan dimasukan ke dalam botol vial tertutup dan siap untuk dianalisis GCMS untuk memperoleh kurva produksi. Kurva produksi yang dihasilkan dihubungkan dengan kurva tumbuh kalus dan dari data ini bisa ditentukan waktu elisitasi terbaik.
2. Persiapan dan Pemeliharaan Kultur Saccharomyces cerevisiae H a. Pembuatan Medium Glukosa Yeast Ekstrak Agar (GYEA) Pemeliharaan dan perbanyakan kultur murni dilakukan pada medium GYEA miring. Medium ini dibuat dengan melarutkan 0,5 g yeast extract, 1 g
35
bacto peptone, 2 g glukosa, dan agar 1,8 g ke dalam akuades sampai mencapai 100 ml sambil dipanaskan hingga mendidih. Medium dituangkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5-7 ml kemudian disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 oC, tekanan 15 lbs/inc (Irdawati, 1999). b. Pemeliharaan Kultur Saccharomyces cerevisiae H Kultur murni S. cerevisiae H, diperoleh dari laboratorium mikrobiologi ITB. Pemeliharaan dan perbanyakan kultur murni dilakukan pada medium Glukosa Yeast Ekstrak Agar (GYEA) miring secara aseptis dengan menggunakan jarum inokulasi. Selanjutnya diinkubasi pada suhu kamar selama dua hari. c. Persiapan Elisitor Untuk persiapan elisitor, dua ose kultur disuspensikan ke dalam larutan fisiologis NaCl 0,85 % sampai mencapai jumlah sel 0,256 x 108 sel/ml. Penghitungan jumlah sel menggunakan haemositometer. Inokulum yang telah diketahui jumlah selnya siap untuk dijadikan sebagai sumber inokulum untuk menyiapkan elisitor.
G. Pengukuran Pertumbuhan dan Penyiapan Elisitor Pembuatan kurva tumbuh S. cerevisiae H bertujuan untuk mengetahui umur pertumbuhan maksimum (fase akhir eksponensial/ awal stasioner) sehingga dapat ditentukan waktu pemanenan elisitor. Inolukum dengan jumlah yang sudah ditentukan, diambil sebanyak 3 ml (5 % dari jumlah medium inokulasi)
36
diinokulasikan kedalam 50 ml medium Glucose Yeast Ekstrak
(GYE) dan
diinkubasi pada suhu 30 oC tanpa pengocokan selama 24 jam. Selang 2 jam dipanen dan dihitung jumlah selnya dengan metode cawan tuang. Penghitungan sel dilakukan mulai dari pengenceran 10-4–10-6, hal ini dilakukan untuk mengetahui fase-fase pertumbuhan S. cerevisiae H sehingga dapat ditentukan waktu terbaik sel S. cerevisiae H sebagai bahan elisitor. Kultur S. cerevisiae H yang telah dipanen sesuai waktu pemanenan terbaik, selanjutnya di autoklaf kemudian di sentrifugasi 1500 rpm masing-masing selama 30 menit selama 4 kali. Untuk 30 menit pertama supernatan dibuang, kemudian pelet dibilas dengan akuades steril 3 kali. Pelet yang telah dicuci ditambahkan akuades sejumlah volume pelet dan di autoklaf kembali. Pelet hasil autoklaf ini dianggap mempunyai konsentrasi 100 %. Konsentrasi homogenat yang akan digunakan adalah 0%, 2.5%, 5.0%, 7.5% (v/v) (Modifikasi Survanalatha et al., 1994). Konsentrasi tersebut diperoleh dengan cara mengencerkan pelet dengan akuades steril sampai di dapat konsentrasi yang diinginkan. Sedangkan untuk kontrol digunakan akuades steril.
H. Elisitasi Kalus Setelah diketahui waktu yang tepat untuk elisitasi berdasarkan kurva produksi, maka dilakukan elisitasi dengan menambahkan 0,5 ml homogenat S. cerevisiae H dengan berbagai konsentrasi pada kalus subkultur kedua umur 12 hari. Kalus yang telah dielisitasi diinkubasi pada suhu kamar sesuai waktu
37
pemanenan yang ditentukan. Setelah elisitasi, kalus dipanen, selanjutnya diekstraksi untuk dianalisis kandungan bioaktifnya.
I.
Analisis Kandungan Bioaktif Kalus Hasil Elisitasi Penyiapan ekstrak kalus yang akan dianalisis, dilakukan dengan metode ekstraksi yang dilakukan dengan menggunakan pelarut metanol pro analitis. Langkah kerjanya dilakukan dengan cara menggerus kalus basah dengan 10 ml metanol kemudian dimasukan kedalam sebuah tabung ulir untuk dimaserasi selama lebih kurang 3-4 hari. Setelah di maserasi kalus disaring untuk memperoleh senyawa-senyawa yang sudah terlarut dalam metanol kemudian ampas kalus digerus kembali dengan menambahkan metanol kemudian disaring kembali. Apabila hasil saringan masih pekat maka ampas kalus digerus kembali untuk kedua kalinya dan tambahkan metanol hingga volume metanol seluruhnya 20 ml kemudian disaring kembali. Hasil penyaringan dipindahkan ke dalam gelas erlenmeyer 100 ml dan simpan pada penangas air 50oC untuk menguapkan metanol. Proses menguapkan lebih kurang berlangsung selama satu jam hingga ekstrak kalus berbentuk pasta. Kemudian Pasta kalus tersebut ditambahkan 3 ml metanol dan siap untuk dianalisis GCMS. Hasil ekstraksi selanjutnya dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif dengan menggunakan GCMS.
38
J. Analisis Data Secara Statistika Uji statistika yang digunakan untuk mengetahui pengaruh waktu pemanenan dan konsentrasi elisitor terhadap peningkatan senyawa oksazol dalam kultur kalus Morinda citrifolia L dilakukan dengan analisis Two Way Anava dalam rancangan acak lengkap (RAL) dengan tiga kali ulangan pada tingkat kepercayaan 95 %. Jika hasil uji ANAVA menunjukan adanya perbedaan yang nyata, maka analisis dilanjutkan dengan “ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)” pada tingkat kepercayaan 95 %. Uji statistik dilakukan dengan menggunakan Program Statistika SPSS 11.5
