BAB III METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian eksperimental. Tempat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang dan PT Windika Utama Semarang. Waktu penelitian dimulai pada bulan Februari 2011 sampai September 2011 yang meliputi penyusunan proposal, penelitian, pengolahan data dan penyusunan laporan. B. Bahan dan Alat Bahan untuk pasteurisasi adalah daging rajungan matang yang diperoleh dari Desa Mangkang Kulon, Kec. Tugu, Semarang dengan kriteria fisik berwarna putih, diambil dari bagian badan rajungan, aroma segar dan tekstur kompak (tidak hancur). Daging rajungan matang berasal dari pengumpul/supplier rajungan yang mengolah rajungan segar/mentah dengan cara dikukus lalu didinginkan dan dikupas sehingga diperoleh daging rajungan untuk pengujian ketahanan panas. Penggunaan bahan uji berupa daging rajungan matang sesuai dengan bahan baku yang diterima oleh industri pengolahan pasteurisasi daging rajungan. Media untuk pengujian angka lempeng total (ALT) adalah larutan NaCL 0,85%, plate count agar (PCA) dan alkohol 70 %. Bahan untuk uji organoleptik adalah daging rajungan pasteurisasi dengan 12 kombinasi suhu dan waktu pasteurisasi. Peralatan yang digunakan untuk pasteurisasi adalah timbangan analitik OHAUS, thermostatic water bath (electrically heated), termometer gelas (mercury in glass) dan tabung reaksi 150 mm x 20 mm. Alat uji ALT adalah timbangan analitik OHAUS, autoclave merk Hirayama, oven merk Teka, inkubator merk Binder, mixer merk Thermolyne vortex, tabung reaksi 150 mm x 15 mm, cawan petri 15 mm x 90 mm, erlenmeyer 250 ml, pipet
15
mikro 1000 µl, blue tip, pipet volum 10 ml. Alat uji organoleptik terdiri dari formulir uji organoleptik dan piring kecil. C. Prosedur Penelitian Prosedur pengujian ketahanan panas total mikroba dalam daging rajungan adalah sebagai berikut: 1. Penelitian Pendahuluan Tujuan penelitian pendahuluan yaitu untuk mengetahui jenis dan jumlah total mikroba dalam daging rajungan yang dipasteurisasi. Jenis mikroba yang dominan dengan jumlah pengenceran pada penelitian pendahuluan digunakan untuk penelitian utama sehingga pengujian angka lempeng total (ALT) pada penelitian utama dapat ditentukan secara efisien. a. Persiapan Bahan : 1) Daging rajungan matang dari pengumpul ditimbang sebanyak 25 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup (Sukasih et al., 2005 dan Sukasih et al., 2009, SNI 01-2332.3-2006). 2) Daging rajungan dipasteurisasi dengan perlakuan pada suhu terendah dan waktu terpendek yaitu titik terdingin mencapai suhu 80 oC selama 0, 5 menit (Sukasih et al., 2005 dan Sukasih et al., 2009). 3) Daging rajungan diuji jumlah mikroba sebelum pasteurisasi dan setelah pasteurisasi (Sukasih et al., 2005 dan Sukasih et al., 2009). 4) Media untuk pengujian angka lempeng total dibuat sesuai jumlah contoh yang akan diuji dan disterilisasi dengan autoclave suhu 121oC selama 15 menit. b. Persiapan Alat : 1) Water bath diisi air kemudian dinyalakan dan disetel sesuai suhu pasteurisasi. 2) Alat gelas untuk pengujian ALT disterilisasi dengan autoclave suhu 121oC selama 15 menit.
16
3) Oven disetel pada suhu 100 oC untuk menyimpan alat gelas yang sudah disterilisasi. 4) Inkubator disetel pada suhu 35oC dan 45 oC untuk pengujian ALT (SNI 01-2332.3-2006). 2. Penelitian Utama Prosedur penelitian utama dilakukan berdasarkan hasil penelitian pendahuluan.
Persiapan bahan dan alat pada penelitian utama sama
dengan yang digunakan pada penelitian pendahuluan kecuali jumlah daging rajungan yang dipasteurisasi. Daging rajungan dipasteurisasi sebanyak jumlah kombinasi suhu dan waktu pasteurisasi (12 kombinasi yaitu titik terdingin mencapai suhu 80, 85, 90 oC selama 0, 5, 10, 15 menit), jumlah ulangan; 3 ulangan, jumlah kontrol suhu titik terdingin daging rajungan selama pasteurisasi; 3 tabung kontrol suhu, jenis pengujian; uji ALT dan uji organoleptik sehingga total ada 75 tabung (Sukasih et al., 2005 dan Sukasih et al., 2009). Pemilihan kombinasi suhu dan waktu pasteurisasi berdasarkan standar pasteurisasi daging rajungan dalam kemasan kaleng tinplate 16 oz (401x301) dalam water bath dengan suhu pemanasan 88 oC sampai titik terdingin mencapai suhu 85 oC minimal selama 1 menit (Rippen et al., 1993). Pasteurisasi daging rajungan berdasarkan pasteurisasi produk surimi dengan suhu internal mencapai 90 oC selama 10 menit (FDA, 2001). 3. Prosedur Pasteurisasi Metode Tabung (Yamazaki et al., 1997 dalam Sukasih et al., 2005). Daging rajungan sebanyak 25 g dimasukkan ke dalam tabung reaksi ukuran 150 mm x 20 mm lalu dicelupkan ke dalam water bath dan dipasteurisasi sesuai suhu perlakuan (80, 85 dan 90 oC).
Pada saat
pasteurisasi, titik terdingin atau bagian tengah daging rajungan dalam tabung reaksi harus mencapai suhu yang ditentukan. Pengukuran suhu titik terdingin dilakukan dengan mencelupkan termometer gelas ke tengahtengah daging rajungan dalam tabung reaksi kontrol. Perambatan panas 17
pada daging rajungan bersifat konduksi sehingga bagian tengah merupakan bagian yang paling lambat menerima panas. Setelah suhu titik terdingin mencapai suhu perlakuan, selanjutnya waktu perlakuan mulai dihitung (0, 5, 10 dan 15 menit). Setelah waktu perlakuan tercapai, tabung reaksi diangkat dan didinginkan dalam air es hingga mencapai suhu di bawah 20 ºC.
Setelah pendinginan, daging rajungan disimpan dalam
lemari pendingin sampai digunakan untuk pengujian ALT (Moeljanto, 1992, Rippen et al., 1993, Sukasih et al., 2005 dan Sukasih et al., 2009). Prosedur pasteurisasi dapat dilihat pada Gambar 3 sebagai berikut: Daging rajungan 25 g dalam tabung reaksi bertutup
Pasteurisasi sesuai suhu yang ditentukan (80, 85, 90 ºC)
Pengukuran suhu titik terdingin daging rajungan dalam tabung reaksi kontrol
Perhitungan waktu pasteurisasi (0, 5, 10, 15 menit)
Pendinginan dalam air es sampai suhu di bawah 20 oC
Penyimpanan dalam lemari pendingin
Pengujian ALT Gambar 3. Diagram alir pasteurisasi daging rajungan metode tabung 4. Pengujian Angka Lempeng Total Metode Cawan Agar Tuang (SNI 01-2332.3-2006 dan Fardiaz, 1989). a. Preparasi Contoh Contoh daging rajungan kira-kira sebanyak 1 g dimasukkan secara aseptik ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan NaCl 0,85%
18
lalu dihomogenkan dengan mixer. -1
larutan pengenceran 10 .
Homogenat tersebut merupakan
Larutan pengenceran 10-2 dibuat dengan
memipet 1 ml larutan pengenceran 10-1 dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan NaCl 0,85%.
Larutan pengenceran
10-3 dibuat dengan memipet 1 ml larutan pengenceran 10-2 dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan NaCl 0,85%. Selanjutnya pengenceran 10-4, 10-5, 10-6 dilakukan dengan cara yang sama. Pada setiap pengenceran dihomogenkan dengan mixer. Jumlah pengenceran pada penelitian pendahuluan dilakukan mulai 10-1 sampai 10-6. Sedangkan jumlah pengenceran pada penelitian utama dilakukan berdasarkan hasil penelitian pendahuluan. b. Prosedur Pengujian Media PCA dengan suhu 45 oC dimasukkan sebanyak 15 ml (mesofilik) dan 40 ml (thermofilik) ke dalam tabung reaksi kemudian disterilkan.
Penggunaan media PCA dalam pengujian thermofilik
lebih banyak jumlahnya karena suhu inkubasi yang lebih tinggi sehingga media PCA tidak pecah selama inkubasi. Penentuan jenis mikroba yang diuji yaitu mesofilik dan thermofilik sesuai pendapat Fardiaz (1992a) bahwa mikroba tersebut adalah mikroba tahan panas dan terdapat pada produk yang telah mengalami pemanasan. Dari setiap pengenceran 10-1 sampai 10-6 dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi PCA steril kemudian
dihomogenkan
dengan
mixer.
Setiap
pengenceran
dilakukan secara duplo. Setelah homogen kemudian dituang ke dalam cawan petri secara aseptis dan dibiarkan sampai padat. Cawan petri diinkubasi dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada 35 oC (mesofilik) dan 45 oC (thermofilik).
Kemudian
diamati adanya pertumbuhan koloni. Jumlah koloni dihitung berdasarkan standar plate count. Preparasi contoh dan prosedur pengujian angka lempeng total dapat dilihat pada Gambar 4 sebagai berikut:
19
Daging rajungan 1 g dalam 9 ml larutan NaCl 0,85 % dihomogenkan (10-1)
1 ml
PCA 15 ml
inkubasi 35 oC, 48jam (mesofilik)
PCA 40 ml
inkubasi 45 oC, 48 jam (thermofilik)
PCA 15 ml
inkubasi 35 oC, 48 jam (mesofilik)
PCA 40 ml
inkubasi 45 oC, 48 jam (thermofilik)
PCA 15 ml
inkubasi 35 oC, 48 jam (mesofilik)
PCA 40 ml
inkubasi 45 oC, 48 jam (thermofilik)
PCA 15 ml
inkubasi 35 oC, 48 jam (mesofilik)
PCA 40 ml
inkubasi 45 oC, 48 jam (thermofilik)
PCA 15 ml
inkubasi 35 oC, 48 jam (mesofilik)
PCA 40 ml
inkubasi 45 oC, 48 jam (thermofilik)
PCA 15 ml
inkubasi 35 oC, 48 jam (mesofilik)
PCA 40 ml
inkubasi 45 oC, 48 jam (thermofilik)
1 ml 9 ml NaCl 0,85 % 10-2 1 ml 1 ml
1 ml 9 ml NaCl 0,85 % 10-3 1 ml 1 ml
1 ml 9 ml NaCl 0,85 % 10-4 1 ml 1 ml
1 ml 9 ml NaCl 0,85 % 10-5 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml NaCl 0,85 % 10-6 1 ml
Gambar 4. Prosedur pengujian ALT 20
5. Penilaian Organoleptik Metode Skoring (Soekarto, 1990) Parameter pengujian organoleptik daging rajungan pasteurisasi meliputi warna, aroma, rasa dan tekstur. Uji organoleptik menggunakan metode skoring untuk menilai sifat produk yang disajikan. Pengujian organoleptik ini menggunakan 3 panelis terlatih dari PT Windika Utama Semarang. Panelis memberikan tanggapan dengan mengisi lembar penilaian yang tersedia. Kriteria penilaian organoleptik daging rajungan bagian badan menurut SNI 6929.1:2010 sebagai berikut: a. Warna : 9 = warna daging putih susu sangat cerah, bersih, sangat cemerlang, sangat menarik 7 = warna daging putih susu cerah, sedikit sekali warna kekuningan, bersih, cemerlang, menarik. 5 = warna daging putih susu kusam, banyak warna kekuningan, tidak cemerlang, tidak menarik. 3 = warna daging sangat kusam, banyak warna kekuningan, tidak cemerlang, berlendir, tidak menarik. 1 = warna daging sangat kusam, banyak warna kekuningan, lendir tebal, tidak menarik b. Aroma 9 = sangat segar, harum khas daging rajungan 7 = segar, harum khas daging rajungan 5 = kurang segar, netral, tidak ada bau khas daging rajungan 3 = tidak segar, timbul bau amoniak 1 = bau amoniak kuat, busuk c.
Rasa 9 = sangat manis, enak, sangat gurih khas daging rajungan 7 = manis, enak, gurih khas daging rajungan 5 = tawar, tidak gurih, tidak ada rasa khas rajungan 3 = sedikit pahit, terdapat penyimpangan rasa 1 = pahit, sepat
21
d.
Tekstur 9 = serat sangat kuat, sangat kompak, kenyal, sangat elastis 7 = serat kuat, kompak, kenyal, elastis 5 = serat tidak kuat, kurang kompak, kurang elastis 3 = tidak kompak, tidak elastis, lunak 1 = lunak sekali
D. Rancangan Percobaan Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor dengan perlakuan kombinasi suhu dan waktu pasteurisasi sebanyak 12 level.
Variabel dependen adalah jumlah total
mikroba (ALT), sedangkan kombinasi suhu dan waktu pasteurisasi sebagai variabel independen. Masing–masing percobaan dilakukan ulangan sebanyak 3 kali, sehingga diperoleh sebanyak 36 unit percobaan.
Pendenahan
rancangan penelitian adalah sebagai berikut : Kombinasi suhu dan waktu pasteurisasi P1 (80 oC, 0 menit)
U1
Ulangan U2
U3
P1U1
P1U2
P1U3
o
P2U1
P2U2
P2U3
o
P3 (80 C, 10 menit)
P3U1
P3U2
P3U3
P4 (80 oC, 15 menit)
P2 (80 C, 5 menit)
P4U1
P4U2
P4U3
o
P5U1
P5U2
P5U3
o
P6 (85 C, 5 menit)
P6U1
P6U2
P6U3
P7 (85 oC, 10 menit)
P7U1
P7U2
P7U3
P8U1
P8U2
P8U3
P9U1
P9U2
P9U3
P10 (90 C, 5 menit)
P10U1
P10U2
P10U3
P11 (90 oC, 10 menit)
P11U1
P11U2
P11U3
P12U1
P12U2
P12U3
P5 (85 C, 0 menit)
o
P8 (85 C, 15 menit) o
P9 (90 C, 0 menit) o
o
P12 (90 C, 15 menit) Keterangan :
P = Perlakuan kombinasi suhu dan waktu pasteurisasi U = Ulangan
22
E. Analisa Data Data dalam penelitian ini merupakan data primer yang langsung didapat dari hasil perhitungan kecukupan panas. Hasil penelitian dianalisis dengan regresi linier menggunakan program statistik MTBWIN. 1. Nilai D adalah waktu yang diperlukan untuk mereduksi mikroba sebesar satu siklus log pada suhu tertentu. Nilai D ditentukan dengan membuat plot antara waktu (t) dan log jumlah mikroba (log N) sehingga diperoleh persamaan y = ax + b. Nilai D merupakan jarak antara t1 dengan t2 untuk satu siklus log dan merupakan [1/slope] atau [1/a] dari kurva (Gambar 5). Kurva dibuat pada masing-masing suhu pemanasan (80, 85, 90 oC). 2. Nilai z adalah perubahan suhu yang menyebabkan reduksi mikroba sebesar satu nilai D. Nilai z ditentukan dengan membuat plot antara suhu pemanasan dan log D sehingga diperoleh persamaan y = ax + b. Nilai z merupakan [1/slope] atau [1/a] dari kurva (Gambar 5).
Log N
Log D
D t1
z t2
t (menit)
T1
T2
T (oC)
Gambar 5. Penentuan nilai D dan nilai Z 3. Nilai P adalah waktu pemanasan pada suhu tertentu yang diperlukan untuk mencapai nilai pasteurisasi tertentu.
Nilai P daging rajungan
dihitung pada setiap perlakuan kombinasi suhu 80, 85 dan 90 ºC dengan waktu pemanasan 0, 5, 10, 15 menit. Nilai P dihitung dengan persamaan (1) dan (2). LR = 10 (T-Tref)/z P = LR. t
..............................................................(1)
..........................................................................(2)
4. Penetapan nilai P sesuai level steril menggunakan regresi linier dengan membuat plot antara nilai P hasil persamaan (1) dan (2) dengan log jumlah mikroba (log N) sehingga diperoleh persamaan y = ax + b (Gambar 6). 23
Log N
Nilai P (menit) Gambar 6. Penetapan nilai P sesuai level steril 5. Berdasarkan nilai P yang diperoleh dibuat kombinasi suhu dan waktu pasteurisasi yang baru dengan efek lethal yang sama dengan persamaan (1) dan (2). F. Kerangka Penelitian Persiapan bahan dan alat
Pengujian jumlah mikroba daging rajungan awal (sebelum pasteurisasi) dengan metode agar tuang Pasteurisasi daging rajungan pada suhu 80, 85, 90 ºC selama 0, 5, 10, 15 menit dengan metode tabung Pengujian jumlah mikroba daging rajungan setelah pasteurisasi dengan metode agar tuang Perhitungan ketahanan panas mikroba (nilai D dan nilai z) dengan regresi linier Perhitungan kecukupan pemanasan (nilai P) sesuai level steril dengan persamaan (1) dan (2) serta regresi linier
Penetapan kombinasi suhu dan waktu pasteurisasi berdasarkan nilai P dengan persamaan (1) dan (2) Gambar 7. Kerangka penelitian
24
