BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian non eksperimental dan eskperimental, dengan menggunakan rancangan penelitian pre test post test control group design.
Penelitian non eksperimental meliputi determinasi
tanaman pegagan, ekstraksi, uji kualitatif flavonoid dan triterpenoid pegagan, uji kuantitatif flavonoid tanaman pegagan, dan pembuatan sediaan krim. Penelitian eksperimental meliputi uji aktivitas anti aging. Rancangan penelitian dapat digambarkan sebagai berikut:
Gambar 3.1. Bagan rancangan penelitian pre test post test control group design. Hewan uji sejumlah 30 ekor mencit jantan balb/c yang memenuhi kriteria inklusi dikelompokkan secara acak menjadi 5 kelompok. Selanjutnya dilakukan pengukuran parameter anti aging sebelum perlakuan. Proses perlakuan selama 4 minggu. Setelah proses perlakuan, kembali dilakukan pengukuran parameter anti aging.
B. Variabel Penelitian 28 UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
1.
Variabel bebas
: Konsentrasi THC dan ekstrak pegagan
2.
Variabel tergantung
: Sensitivitas kulit, kadar air, kadar kolagen, elastisitas dan besar pori-pori
3.
Variabel terkendali
: Galur mencit, umur mencit, berat badan mencit, jenis kelamin mencit, luas punggung yang
diolesi THC, ekstrak pegagan, dan
kombinasi
THC-ekstrak pegagan, nutrisi,
kandang, jumlah dosis
mencit
bahan yang dioleskan,
penyinaran UVA dan UVB, durasi
penyinaran UVA dan UVB
C. Definisi Variabel Operasional 1. Variabel bebas Tetrahydrocurcumin (THC) diperoleh dari RONGSHENG®. Pegagan segar diambil dari daerah Sumbang, Banyumas. Ekstrak pegagan diperoleh dari remaserasi serbuk herba pegagan kering dengan menggunakan pelarut etanol 70%. 2. Variabel tergantung 1. Sensitivitas
adalah jumlah dan luas area kulit
hewan uji yang
mengalami eritema sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U. 2. Kadar air (moisture) adalah persentase jumlah air pada kulit hewan uji sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U. 3. Kadar kolagen adalah prosentase jumlah kolagen
kulit hewan uji
sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U. 4. Elastisitas kulit adalah kekenyalan kulit hewan uji sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U. 5. Besar pori adalah besarnya pori kulit hewan uji sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U.
3.
Variabel terkendali 29 UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
Mencit yang digunakan adalah mencit galur balb/c, berjenis kelamin jantan
berumur
6-8 minggu dengan berat 20-25 gram. Luas area
punggung mencit yang diolesi bahan adalah 2x2 cm2. Nutrisi untuk mencit berupa konsentrat makanan ayam 30%, jagung giling 40%, dan dedak 30%, diberikan secara ad libitum 12-25 gram/ekor/hari. Kandang mencit berupa kandang pemeliharaan berupa kotak plastik ukuran 25x20x10 cm dengan tutup kawat strimin pada bagian atas, diletakkan pada ruangan yang cukup ventilasi dan pencahayaan. Tiap kelompok perlakuan ditempatkan dalam satu kandang atau 1 kandang berisi 6 ekor mencit. Jumlah bahan yang dioleskan adalah 2 mg/cm2 per hari yang terbagi menjadi 2 kali/hari. Dosis sinar UVA 630 µW/cm2 dan UVB 105 µW /cm2. Durasi penyinaran UVA
dan
UVB 10 menit setiap hari
selama 4 minggu. Penyinaran UVA dan UVB menggunakan lampu Repti Glo 13 W dari Exoterra®. D. Waktu dan Tempat Penelitian Waktu penelitian dilakukan dari bulan Oktober 2016 – Juni 2017. Tempat penelitian dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan dan Laboratorium Biologi, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto. Laboratorium Biologi Farmasi, Laboratorium Teknologi Farmasi, dan Laboratorium Farmakologi Universitas Muhammadiyah Purwokerto. E. Sampel Penelitian 1. Kriteria inklusi Kriteria inklusi untuk sampel adalah mencit jantan sehat, galur balb/c, umur 6-8 minggu, berat badan 20-25 gram, terlihat aktif. 2. Kriteria dropout Mencit mati saat penelitian berlangsung. 3. Besar sampel Dalam penelitian ini masing-masing perlakuan PN, PP, P1, P2, dan P3 direplikasi sebanyak 6 kali, sehingga jumlah mencit yang digunakan adalah 30 ekor. Jumlah mencit yang digunakan tidak menggunakan rumus Federer (1977) dan jumlah 30 ekor. F. Bahan dan Alat 1. Bahan uji 30 UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
Pada penelitian ini digunakan herba pegagan yang diperoleh dari daerah Sumbang, Banyumas, Tetrahydrocurcumin (Rongsheng®),
quersetin
(PT Brataco, Indonesia), HCl pekat, Mg, etanol 96%, AlCl3, metanol, Ethyl Ascorbyl Ether (PT. Brataco, Indonesia), Natrium benzoat, asam stearat, trietanolamin, gliserin ( PT. Brataco, Indonesia). 2. Alat penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: a.
Alat untuk pembuatan simplisia Lemari pengering, nampan untuk wadah herba.
b.
Alat untuk pembuatan serbuk simplisia Grinder, ayakan.
c.
Alat untuk remaserasi Alat gelas (Iwaki-pyrex), timbangan analitik, bejana maserasi, cawan porselen, kertas saring, rotary evaporator, waterbath.
d.
Alat untuk penetapan kadar flavonoid esktrak pegagan Alat gelas (Iwaki-pyrex),
timbangan analitik, spektrofotometer
UV-Vis ( Shimadzu). e.
Alat untuk pembuatan basis krim Alat gelas (Iwaki – pyrex), timbangan analitik, cawan porselen, waterbath, mortir, stamper, sudip, pot salep.
f.
Alat untuk uji anti aging Lampu UVA dan UVB Repti Glo 13 W dari Exoterra®, kandang mencit, holder, kerokan bulu, Skin Analyzer EH 900 U, dan seperangkat komputer.
G. Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman pegagan Determinasi tanaman dilakukan untuk menetapkan kebenaran sampel yang digunakan dalam penelitian. Determinasi dilakukan terhadap sampel herba segar pegagan (Centella asiatica) di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, purwokerto. 2. Pengeringan herba pegagan
31 UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
Herba pegagan yang telah disortasi basah dan ditiriskan, kemudian dikeringkan dalam oven suhu 40-500 C, selama 72 jam (Darwati dan Makmun, 2012). 3. Penyerbukan herba pegagan kering Herba pegagan kering diserbuk dengan grinder, kemudian diayak dengan ayakan ukuran 80 mesh (Sapri et al., 2014). 4. Ekstraksi herba pegagan Metode ekstraksi yang digunakan adalah remaserasi dengan pelarut etanol 70% yang mengacu pada metode remaserasi yang dilakukan oleh Pratiwi (2010) dengan modifikasi. Remaserasi herba pegagan dengan pelarut etanol 70% dilakukan dengan cara sebanyak 200 gram serbuk herba pegagan kering dimasukkan ke dalam bejana maserasi, kemudian dituangi penyari etanol 70% 2000 ml. Diaduk selama 4-5 jam pertama, lalu direndam hingga 24 jam. Kemudian dilakukan pengadukan kembali selama 4-5 jam dan diamkan lagi hingga 48 jam. Lakukan kembali pengadukan setiap hari selama 4-5 jam kemudian diamkan lagi hingga 24 jam hingga 5 hari. Selanjutnya maserat disaring dengan kain katun. Filtrat dimaserasi kembali dengan 1000 ml etanol 70% selama 3 hari. Maserat disaring dengan kain katun, lalu ditambahkan dengan maserat sebelumnya, selanjutnya diuapkan dengan rotay evaporator suhu 50-600 C kecepatan 100 rpm, dan dipekatkan dengan waterbath suhu 40-500 C hingga diperoleh ekstrak kental. 5. Uji total flavonoid ekstrak pegagan a. Uji kualitatif flavonoid Ekstrak pegagan sebanyak 1 gram ditambahkan etanol 95%, lalu dipanaskan. Lapisan atas dipipet dan ditambahkan dengan HCL pekat 2 N dan serbuk mg. Adanya flavonoid ditandai dengan munculnya warna merah (Lumbessy et al., 2013). b. Uji kuantitatif flavonoid 1)
Pembuatan kurva baku kuersetin Ditimbang baku kuersetin 5 mg, dimasukkan dalam labu ukur 5 ml, kemudian ditambah etanol 80% ad 5 ml, sehingga diperoleh larutan induk kuersetin 1000 μg/ml (A). Larutan A diambil 1 ml 32 UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
kemudian ditambahkan etanol 80% hingga 10 ml (B). Selanjutnya dari larutan B diambil 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45 ml dan masing – masing larutan tersebut ditambah dengan 1 ml AlCl3 2% dan aquabidest hingga 5 ml. Setelah diinkubasi 30 menit pada suhu 250 C, serapannya
diukur
pada
λ
400-800
nm,
menggunakan
spektrofotometer UV Vis. Kemudian dilihat lamda maksimum hasil spektrofotometri
dan
dibuat
kurva
kalibrasi
dengan
menghubungkan sumbu X sebagai nilai konsentrasi larutan standar dan sumbu Y sebagai nilai serapan (Azizah et al., 2014). 2)
Pembuatan larutan uji ekstrak pegagan Ektrak etanol pegagan ditimbang 10 mg, kemudian dilarutkan dalam etanol 80% hingga 10 ml. Selanjutnya dari larutan tersebut diambil 1 ml ditambah 1 ml AlCl3 2% dan akuabidest hingga 5 ml. Selanjutnya diinkubasi hingga 30 menit pada suhu 250 C, dan dibaca serapannya pada lamda maksimum (Azizah et al., 2014)
3)
Penentuan kadar flavonoid Penentuan kadar flavonoid menggunakan rumus penentuan kadar flavonoid yang dilakukan oleh Azizah et al. (2014) yaitu sebagai berikut: F = c x V x f x 10-6 x 100% m Keterangan: F : Jumlah flavonoid metode AlCl3 c : kesetaraan kuersetin (μm/ml) V : volume total esktrak f : faktor pengenceran m : berat sampel (g)
6. Uji kualitatif triterpenoid ekstrak pegagan Ekstrak pegagan sebanyak 5 mg dilarutkan dalam 5 ml etanol 96%, kemudian ditambahkan 2 ml kloroform dan 3-5 tetes asam sulfat pekat. Campuran ini dikocok-kocok, lalu didiamkan hingga beberapa saat, dan diamati warna yang tebentuk (Patel et al., 2016).
33 UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
7. Pembuatan sediaan krim Sediaan krim sebagai pembawa berupa krim tipe minyak dalam air (o/w). Formulasi krim mengacu kepada formulasi krim ekstrak pegagan yang dibuat oleh Putri (2013). Tabel 3.1 Formula krim Bahan
Kontrol negatif 7,5 0,75 5 0,1 Ad 50
Asam stearat Trietanolamin Gliserin Natrium benzoat Ethyl ascorbil ether Tetrahydrocurcumin Ekstrak pegagan Aquadest
Formula krim (gram) Kontrol THC positif 7,5 7,5 0,75 0,75 5 5 0,1 0,1 1,5 1 Ad 50 Ad 50
EP 7,5 0,75 5 0,1 5 Ad 50
THC EP 7,5 0,75 5 0,1 1 5 Ad 50
a. Pembuatan basis krim Fase minyak asam stearat dan fase air (trietanolamin, gliserin, natrium benzoat dan akuades) masing-masing dilebur dalam
cawan
porselen di atas waterbath suhu 700 C. Fase minyak dituang ke dalam fase air, diaduk dalam mortir hangat hingga dingin. Bahan-bahan untuk masing-masing perlakuan dituang ke mortir lain, lalu ditambahkan basis krim sedikit demi sedikit, sambil diaduk hingga homogen. b. Kontrol negatif (KN) Kontrol negatif berupa basis krim 50 gram tanpa penambahan bahan
lain.
c. Kontrol positif (KP) Ethyl ascorbyl ether sebanyak 1,5 gram
dicampurkan dengan
basis krim hingga 50 gram. d. Tetrahydrocurcumin (THC) Tetrahydrocurcumin 1 gram
dicampur dengan basis krim hingga
50 gram. e. Ekstrak pegagan (EP) Ekstrak kental pegagan 5 gram dicampur dengan basis krim hingga 50 gram. f. Kombinasi tetrahydrocurcumin dan ekstrak pegagan (THCEP) Tetrahydrocurcumin 1 gram dan ekstrak kental pegagan 5 gram dicampur dengan basis krim hingga 50 gram.
34 UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
8. Uji aktivitas anti aging a. Pendekatan
uji aktivitas anti aging
ini adalah Pre Test Post Test
Control Group Design, mengacu pada uji anti aging yang dilakukan oleh Herawati (2014) dan Nazliniwaty (2016) dengan modifikasi. b. Mencit yang memenuhi kriteria inklusi dipilih secara acak, lalu ditimbang berat badannya. Mencit dikelompokkan secara acak menjadi 5, yaitu 6 mencit untuk kontrol negatif, 6 mencit untuk kontrol positif, 6 mencit untuk perlakuan 1, 6 mencit untuk perlakuan 2, dan 6 mencit untuk perlakuan 3. c. Mencit diletakkan dalam kandang ukuran 25 cm x 20 cm x 10 cm. Suhu ruangan 25-27° C, cahaya berasal dari jendela pada siang hari, kelembaban udara 50-60%, ventilasi silang. Dalam 1 kandang diisi 6 ekor mencit. d. Kandang mencit dijaga kebersihannya setiap hari. Kotoran dan sisa makanan dibuang. Setiap satu minggu sekali alas kandang berupa sekam kering diganti. e. Seluruh mencit diaklimatisasi selama selama 7 hari dengan tujuan agar hewan uji mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang akan ditempati selama penelitian berlangsung. f. Nutrisi untuk mencit berupa konsentrat makanan ayam 30%, jagung giling 40%, dan dedak 30%, diberikan secara ad libitum 12-25 gram/ekor/hari. Air minum berupa air putih matang
diberikan ad
libitum setiap hari. g. Seluruh
kelompok mencit dicukur bulunya pada bagian punggung
belakang
seluas 2x2 cm2 menggunkaan alat cukur bulu elektrik dan
alat cukur bulu manual. h. Pengukuran
kondisi hewan uji sebelum perlakuan dengan Skin
Analyzer EH 900 U meliputi sensitivitas kulit, kadar air, kadar kolagen, elastisitas, dan besar pori-pori. i. Penyinaran UVA dan UVB
terhadap seluruh mencit dilakukan 10
menit setiap hari selama 4 minggu. Dosis penyinaran UVA sebesar 630 µW/cm2 dan UVB 105 µW/cm2. Jarak kulit dorsal mencit dengan lampu UV adalah 15 cm. 35 UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
j. Pengaplikasian bahan anti aging dengan cara kelompok kontrol negatif diolesi KN, kelompok kontrol positif diolesi KP, kelompok perlakuan 1, 2, 3 diolesi THC, EP, dan THCEP. Bahan dioleskan 2 kali per hari, yaitu 2 jam sebelum penyinaran UV, dan 15 menit setelah penyinaran UV dengan dosis 2 mg/cm2 selama 4 minggu (Ashawat et al., 2007). k. Pengontrolan berat badan dan kesehatan hewan uji dilakukan dengan cara berat badan mencit dikontrol dengan cara ditimbang setiap 2 minggu selama penelitian berlangsung, untuk memastikan bahwa berat badan mencit tidak naik ataupun berkurang terlalu jauh dari rentang berat badan yang sudah ditentukan. Kesehatan mencit juga selalu dipantau dengan mengamati keaktifan bergerak dan nafsu makan mencit. l. Pengukuran parameter aktivitas anti aging pada kulit hewan uji setelah perlakuan yaitu setelah 4 minggu dengan Skin Analyzer EH 900 U meliputi sensitivitas kulit, kadar air, kadar kolagen, elastisitas, dan besar pori. Evaluasi anti aging dengan Skin Analyzer EH 900 U mengacu kepada Aramo (2012) dan Susana (2013). Evaluasi dilakukan kepada hewan uji dalam keadaan
aktif, karena penggunaan skin
analyzer tidak menyakiti kulit dan tidak bersifat invasif. (1) Sensitivitas Kamera diletakkan di permukaan kulit dorsal hewan uji. Pilih menu sensitivity, shooting, dan freeze. Daerah berwarna kemerahan yang menunjukkan sensitivitas pada foto, ditandai dengan menu tool yang tersedia untuk menentukan jumlah dan luas area kulit yang mengalami sensitivitas. Selanjutnya pilih menu analysis. (2) Kadar air Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal hewan uji. Selanjutnya pilih menu moisture, shooting, freeze, dan analysis. (3) Kadar kolagen Pengukuran kadar kolagen dilakukan dengan perangkat Skin Analyzer EH 900 U dengan kamera sensor CCD resolusi 5.0 mega pixel. Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal hewan uji kemudian pada layar komputer yang menampilkan software skin analyzer dipilih menu collagen fibers, shooting, selanjutnya pilih 36 UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
menu freeze untuk memfoto. Setelah kulit terfoto, pilih menu analysis. Hasil analisis berupa persentase kadar kolagen akan ditampilkan pada layar komputer. (4) Elastisitas Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal hewan uji. Selanjutnya dipilih secara berurutan menu elasticity, shooting, freeze, dan analysis. Kondisi elastisitas kulit berupa persentase ditampilkan pada layar komputer. (5) Besar Pori Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal Pilih
menu
pore,
shooting,
freeze.
hewan uji.
Selanjutnya
dengan
menggunakan tool bergambar pensil, ditentukan diameter pori yang terfoto. Terakhir, pilih menu analysis. m. Penggantian hewan uji Apabila dijumpai adanya hewan uji yang mati sebelum penelitian berakhir, maka hewan uji tersebut diganti dengan hewan uji baru dengan kriteria inklusi yang sama, dan selanjutnya diberi perlakuan sesuai alur protokol penelitian. n. Pemulihan kondisi hewan uji Pada akhir penelitian, kemungkinan pada bagian kulit hewan uji yang dicukur bulunya akan mengalami penuaan dini. Hewan uji dipulihkan kondisinya dengan dibiarkan beraktivitas normal, diberi nutrisi dan air minum yang cukup, bagian kulit yang mendapat perlakuan selama penelitian diolesi etil ascorbyl ether 3% setiap hari selama 1 minggu.
H. Analisis Data Data aktivitas anti aging THC, ekstrak pegagan, kombinasi THC ekstrak pegagan, dianalisis dengan program SPSS 17. Data diuji normalitasnya dengan Shapiro-Wilk dan diuji homogenitasnya dengan uji Levene’s test. Bila data normal dan homogen, data kemudian
diuji dengan
One Way Anova,
dilanjutkan dengan uji Pos-hoc dengan tes LSD. Jika data tidak normal, menggunakan analisis nonparametrik Kruskal –Wallis test yang dilanjutkan dengan Mann-Whitney test. 37 UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
