BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan termasuk penelitian
deskriptif.
Penelitian deskriptif adalah metode penelitian yang bertujuan membuat gambaran secara sistematis, faktual dan akurat mengenai fakta, sifat serta hubungan antar fenomena yang diselidiki, sehingga metode ini berkehendak untuk mengadakan akumulasi data dasar semata (Nazir, 1998).
B. Objek Penelitian Sampel DNA indukan Osphronemous gouramy yang berasal dari dua kota yang berbeda, masing-msing 10 gurame indukan Sukabumi dan 10 gurame indukan Tasikmalaya.
C. Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilakukan sejak bulan Maret 2010 sampai Juli 2010 di Laboratorium
Mikrobiologi
Jurusan
Pendidikan
Biologi,
Fakultas
Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Indonesia.
D. Alat dan Bahan yang digunakan Alat dan bahan yang digunakan mencakup alat dan bahan yang digunakan dalam isolasi DNA, eleltroforesis dan polymerase chain reaction. Adapun Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada tabel 3.1 dan tabel 3.2.
20
21
Tabel 3.1 Alat yang digunakan No. 1. 2.
Alat Tabung mikrosentrifuga 1,5 ml Lemari es/Freezer
3. 4. 5. 6.
Mikropipet dan tips Pisau bedah dan pinset Botol duran Waterbath
7.
Mikrosentrifuga
8.
Mini spin
9. 10. 11.
Spatula Microwave Horizontal electrophoresis
12. 13. 14. 15. 16.
Timbangan digital Tray dan Comb UV-transillumeter Mesin PCR Gloves
17.
Kamera digital
Fungsi Menyimpan hasil isolasi DNA Menyimpan sampel, bahan isolasi dan bahan PCR Mengambil larutan Mengambil sulur ikan Menyimpan larutan Menginkubasi saat melakukan isolasi DNA Memisahkan molekul menurut berat jenis Menghomogenkan bahanbahan PCR Mengambil bahan padatan Menghomogenkan agarosa Elektroforesis hasil isolasi dan hasil PCR Menimbang bahan Mencetak agarosa Melihat hasil elektroforesis Perbanyakan potongan DNA Mengurangi kontaminasi dari tangan Alat dokumentasi hasil isolasi dan hasil PCR
Tabel 3.2 Bahan yang Digunakan No. 1.
Bahan Es batu
2.
Air deion
3. 4. 5.
Primer DNA MgCl2 Buffer taq DNA polymerase
6. 7.
dNTPs Taq polymerase (merek Fermentas) Larutan TBE dan TAE
8.
Fungsi Mempertahankan suhu sampel tetap dingin Pelarut yang tidak mengandung ion Faktor inisiasi dalam PCR Kofaktor dalam proses PCR Menjaga kondisi optimal dari taq polymerase Bahan nukleotida dalam PCR Enzim dalam proses PCR Buffer dalam proses elektroforesis untuk menjaga pergerakan DNA saat elektroforesis
22
9.
Gel agarosa
10. 11. 12.
Buffer lisis 2x CTAB Sodium dodecyl sulfate (SDS) 20% Proteinase K
13.
Potasium asetat 5M
14. 15. 16. 17. 18.
CIAA (Chlorofom –Isoamyl alcohol) RNAse Sodium asetat 3M Etanol absolute Alkohol 70%
19. 20.
Buffer TE (Tris-EDTA) Loading dye
21. 22.
DNA marker Ethidium Bromide
Media untuk mengelektroforesis Menghancurkan membran sel Melarutkan lemak, mendenaturasi protein Memutuskan rantai polipeptida protein Mengendapkan protein yang terdenaturasi Melarutkan protein, mengikat lemak Mendegradasi molekul RNA Mengendapkan protein Mengendapkan asam nukleat Memisahkan garam-garam yang menempel pada DNA Pelarut DNA Pelarut DNA saat elektroforesis Standar ukuran DNA Pewarna DNA yang dapat berpendar bila diberi sinar UV
E. Cara Kerja 1.
Persiapan alat dan bahan Sebelum melakukan penelitian, dilakukan persiapan alat dan bahan
yang akan digunakan. Persiapan meliputi pengecekkan bahan-bahan yang akan digunakan, pencucian botol-botol duran, pembuatan stok larutan bahanbahan yang akan digunakan ketika isolasi DNA maupun elektroforesis, sterilisasi tabung mikrosentrifuga 1,5 ml, tabung PCR, tips dan air deion, kalibrasi mikropipet dan penataan letak bahan-bahan baik dalam lemari maupun di dalam freezer.
23
2. Isolasi DNA Sampel indukan gurame yang digunakan berasal dari koleksi indukan Balai Perikanan Air Tawar Sukabumi. Sampel ikan disimpan pada wadah sterofoam yang berisi es dan disiapkan pisau, pinset dan gunting yang sebelumnya telah diberi alkohol 70%
untuk mencegah kontaminasi
mikroba. Kemudian diambil bagian sulurnya sebanyak ±2 cm kemudian sulur tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikrosentifuga steril ukuran 1,5 ml yang telah diberi tanda nama sampel baik Sukabumi maupun Tasikmalaya. Kemudiaan dimasukkan buffer lysis CTAB 2x fresh sebanyak 500 µl dan SDS 20% sebanyak 7 µl ke dalam tiap tabung mikrosentrifuga. Semua bahan dalam tabung dihomogenkan (dibolak-balik) minimal 50 x lalu diinkubasi pada suhu 65oC selama 1 jam. Setelah itu, enzim proteinase K sebanyak 10 µl dimasukkan lalu dihomogenkan terlebih dahulu lalu diinkubasi kembali pada suhu 65oC selama 2 jam. Selanjutnya dimasukkan kembali proteinase K sebanyak 5 µl lalu dihomogenkan dan diinkubasi kembali pada 65oC selama 16 jam. Untuk mencegah penurunan air yang banyak, waterbath ditutup dengan menggunakan wadah plastik yang kurang lebih seukuran dengan waterbath.
Setelah diinkubasi selama semalam
kemudian potassium asetat 5 M ditambahkan ke dalam tabung sebanyak 1/10 volume dan diinkubasi dalam freezer selama 20 menit. Tabung disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit dan fasa cair bagian atas (supernatan) yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuga baru. Enzim RNAse ditambahkan ke dalam tabung tersebut sebanyak 1/100 volume dan diinkubasi pada 37oC selama 1 jam. Kemudian,
24
kloroform : isoamil alkohol (24 : 1) sebanyak ½ volume dimasukkan ke dalam tabung dan dihomogenkan dengan cara dibolak-balik minimal sebanyak 50 x. Tabung disentrifuga kembali pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit. Fasa bagian atas dipindahkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga baru yang steril dan sodium asetat 3 M sebanyak 1/10 volume ditambahkan lalu dihomogenkan. Setelah itu, etanol absolut dingin sebanyak 2 x volume ditambahkan dan dihomogenkan kemudian diinkubasi dalam freezer suhu -20oC selama semalam. Setelah semalam, tabung disentrifuga kembali pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit lalu etanol absolut dalam tabung mikrosentrifuga tersebut dibuang. Tabung mikrosentrifuga dibilas dengan alkohol 70% sebanyak 1x volume. Kemudian bagian dalam tabung dikeringkan secara alami dengan membalikkan tabung diatas kertas tissue. Setelah DNA kering, sebanyak 30-50 µl TE ditambahkan ke dalam tabung. Tabung diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit dan simpan dalam freezer sebagai DNA stok untuk selanjutnya dilakukan elektroforsesis DNA hasil isolasi.
3. Elektroforesis DNA Hasil Isolasi Sebanyak 20 tabung mikrosentrifuga yang berisi DNA stok sampel Sukabumi dan Tasikmalaya dipersiapkan di dalam wadah sterofoam berisi es. Konsentrasi gel agarosa 1% sebanyak 0,25 gram dilarutkan dalam buffer 1 x TAE dengan menggunakan alat microwave selama ±3 menit. Gel yang telah cair didinginkan terlebih dahulu pada suhu kamar kemudian pada
25
keadaan hangat-hangat kuku gel dituangkan ke dalam cetakan bersisir secara merata dan didiamkan hingga membeku.
Setelah gel membeku,
kemudian disimpan dalam alat elektroforesis hingga terendam seluruhnya oleh buffer 1x TAE. DNA dalam tabung mikrosentrifuga kemudian diambil sebanyak 5 µL dan dicampurkan dengan 2 µL Loading dye diatas parafilm hingga benar-benar homogen. Dengan hati-hati DNA yang telah dicampur Loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel. Selanjutnya gel dielektroforesis selama 30 menit pada tegangan 100 volt. Setelah elektroforesis selesai, dilakukan pewarnaan dengan merendam gel selama 5 menit dalam larutan Etidium Bromida dan dibilas dengan air deion steril selama 3 menit. Selanjutnya, hasil elektroforesis diamati pada UVTransiluminator (520 nm) dan didokumentasikan dengan kamera digital Nikkon cool-pix 2200.
4. Amplifikasi dengan RAPD Dilakukan PCR terhadap DNA sampel dan kontrol. Amplifikasi menggunakan dua primer yaitu OPA2 dan OPA20. Suhu annealing yang digunakan sesuai dengan penelitian Holipah (2006) yaitu 35oC. Adapun komposisi reaksi PCR yang digunakan terlihat pada Tabel 3.3 dan tahapan siklus amplifikasi dapat dilihat pada Gambar 3.1.
26
Tabel 3.3 Komposisi Reaksi PCR RAPD Reagen
Air deion steril MgCl2 Buffer taq polymerase * dNTP
Taq Polymerase DNA Primer
Konsentrasi stok
25 mM 10 X
Konsentrasi Akhir
2 mM 1X
Volume 1 reaksi (µl)
Volume ½ reaksi (µl)
16,1 2 2,5
8,05 1 1,25
100 mM masing- 200 mM untuk 0,2 masing dATP, masing-masing dGTP, dCTP, dTTP dATP, dGTP, dCTP, dTTP 5U/ µl 1 U/ µl 0,2 2 32 ng/ µl 32 ng 2
0,1
0,1 1 2
*Telah mengandung 2 mM MgCl2 maka total konsentrasi akhir MgCl2 dalam reaksi tersebut sebesar 4 mM.
Denaturasi 94oC
Annealing
94oC
Extension 72oC
72oC
35oC 2’
Inkubasi
10oC 2’
5’
1’
∞
35 siklus
Gambar 3.1 Tahapan dan Suhu PCR Primer RAPD
5. Elektroforesis DNA Hasil PCR Untuk mengetahui hasil PCR dengan penanda RAPD, dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 2% (0,50 gram) yang dilarutkan dalam 25 ml buffer 0,5x TBE. Sebanyak 5 µl DNA dari tabung PCR diambil dan dihomogenkan dengan 2 µl Loading dye kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa dengan hati-hati. Elektroforesis
27
dilakukan selama 120 menit dengan tegangan 50 volt menggunakan alat elektroforesis horizontal. Untuk mengetahui ukuran fragmen-fragmen DNA yang muncul digunakan marker 100 pb DNA mix ladder (merek Gene ruler
TM
) sebanyak 3 µl. Setelah elektroforesis selesai dilakukan,
kemudian dilakukan pewarnaan dengan menggunakan etidium bromida selama 5 menit diatas alat shaker dan dicuci dengan air deion selama 3 menit dalam keadaan digoyang-goyangkan. Hasil pewarnaan dilihat dalam UV-transilumeter
(λ=520
nm)
dan
didokumentasikan
menggunakan kamera digital Nikkon cool-pix 2200.
dengan
28
6.
Analisis Data Analisis data dilakukan berdasarkan pola larik DNA pada gel
agarosa. Proporsi larik DNA dihitung untuk masing-masing primer. Pada penelitian ini, larik yang dianalisis adalah larik yang hadir dan jelas terlihat oleh mata, tanpa memperhitungkan intensitasnya. Selanjutnya larik DNA hasil elektroforesis diinterpretasikan menjadi angka satu (1) untuk kehadiran larik dan angka nol (0) untuk ketidakhadiran larik. Data matriks tersebut dianalisis untuk mencari nilai heterozigositas dan koefisien kesamaan genetik. Koefisien kesamaan yang digunakan untuk menguji pasangan objek yang dibandingkan sesuai koefisien Nei dan Li (1979). Rumus kesamaan Nei dan Li : Sxy = 2Nxy/Nx+Ny
Keterangan : Sxy= Koefisien kesamaan genetik nxy= JumLah larik yang dihasilkan oleh individu x dan y nx= JumLah larik yang dihasilkan oleh individu x ny= JumLah larik yang dihasilkan oleh individu y Data
hasil
perhitungan
koefisien
kesamaan
tersebut,
dikonstruksi dendogram dengan metode klaster “Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages” (UPGMA) menggunakan software MVSP 3.1 (Multivariate Statistical Package Ver. 3.1. ). Setelah itu, dilakukan perhitungan nilai heterozigositas menurut Lynch & Milligan (1994). Rumus heterozigositas pada lokus i adalah : H (i) = 2q(i)[1-q(i)]+2 var[q(i)]
29
Keterangan: q(i) = nilai frekuensi dan heterozigositas dari populasi Var [q(i)] = [1-x(i)], dengan N adalah jumlah sampel 4N
Adapun untuk menghitung nilai q(i) tersebut adalah: q(i) = √x (i) 1- Var[x(i)] 8[x(i)]2
-1
Keterangan: x (i) = frekuensi homozigot resesif ”null” pada lokus i, dan Var [x(i)] = [1-x(i)], dengan N adalah jumlah sampel N Setelah itu, dilakukan perhitungan nilai PIC “Polymorphism Information Content” menurut Botsein et al 1980 dalam Rizasti (2010) dengan persamaan: PIC = 1− Σ pi2-( Σ Pi i)2+ Σ pi2
Keterangan: pi adalah frekuensi alel ke-i.
30
7. Alur Penelitian Studi pustaka Pembuatan proposal
Persiapan alat dan bahan
Isolasi DNA gurame kontrol
Isolasi DNA gurame sampel
Elektroforesis DNA hasil isolasi
PCR dengan primer RAPD
Elektroforesis hasil PCR dengan agaroa 2%
Hasil PCR DNA indukan sampel
Analisis data
Gambar 3.2. Alur Penelitian
Hasil PCR DNA kontrol
