BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif dengan pendekatan cross sectional, merupakan bagian dari penelitian payung yang dilakukan Laboratorium Biomedik FK UNS, Laboratorium Mikrobiologi FK UNS, dan Division of Virology Faculty of Medicine Tottori University, Japan, dengan judul “Studi Epidemiologi Molekuler Human Blood Borne Viruses di Indonesia”. Untuk keperluan skripsi, data yang dilaporkan adalah status infeksi TTV komunitas gigolo di Kota Surakarta. B. Lokasi Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. C. Subjek Penelitian Subjek penelitian adalah komunitas gigolo di Kota Surakarta yang sudah dikumpulkan dan diperiksa infeksi Human Immunodeficiency Virus (HIV) dan Hepatitis C Virus (HCV) oleh Denny Adriansyah, Sofina Kusnadi, Hafriliantika Ramadhani, serta Wike Astrid Cahayani pada tahun 2011. Seluruh gigolo yang menjadi subjek penelitian bersedia untuk menandatangani surat persetujuan dan informed consent. Sebelum menandatangani surat persetujuan dan informed consent, subjek penelitian mendapatkan penjelasan mengenai penelitian yang dilakukan serta semua tindakan yang akan dilakukan dalam penelitian ini. Penelitian ini mendapatkan ethical clearence dari Komisi Etik Penelitian Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta/RSUD Dr. Moewardi Surakarta.
D. Teknik Sampling Teknik sampling yang digunakan adalah respondent driven sampling dengan batasan 30 sampel. Gigolo yang telah bersedia menandatangani informed consent menjalani wawancara secara tatap muka dan mengisi kuisioner. Data wawancara diarsipkan dalam perekam suara untuk dianalisis. Selanjutnya, dilakukan pengambilan sampel darah dengan teknik pungsi intravena. Sampel darah dimasukkan ke dalam tabung ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), kemudian dibawa ke laboratorium untuk dipindahkan ke polypropylane tube 15 ml dan disentrifugasi untuk memisahkan plasma dengan sel-sel dalam darah. Plasma diambil dan dibagi menjadi beberapa aliquot untuk disimpan dalam suhu -
C.
E. Rancangan Penelitian
Komunitas gigolo Surakarta Gigolo yang telah menyetujui informed concern
Ambil darah dan wawancara
Data wawancara direkam dan disimpan
Darah disimpan dalam tabung EDTA
Sampel darah dibawa ke Lab Biomedik
Sampel darah dimasukkan ke polypropilene tube 15 ml, disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit Isolasi asam nukleat
Deteksi HIV
Keterangan :
Deteksi HCV
Deteksi TTV dengan nested PCR
Elektroforesis
: Skripsi Analisis Data
Gambar 3.1. Rancangan Penelitian
F. Instrumen Penelitian 1. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: 1) centrifuge (Eppendorf, Hamburg, Jerman); 2) vortex (Thermo Fisher Scientific, Worcester, MA); 3) incubator shaker (Heidolph, Schwabach, Jerman); 4) thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Jerman); 5) class II safety cabinet (ESSCO, Portland, OR); 6) micropipette (P1000, P200, P10) (Gilson, Middleton, WI); 7) autoclave (Hirayama, Saitama, Jepang); 8) digital scale (Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland); 9) magnetic stirrer (Biomega, Redding, CA); 10) microwave (Panasonic, Osaka, Jepang); 11) aparatus elektroforesis (chamber, comb, power supply) (BioRad, Los Angeles, CA); 12) gel documentation (GelDoc XR) (BioRad, Los Angeles, CA); 13) refrigerator (Sharp, Osaka, Jepang); 14) deepfreezer (New Brunswick Scientific, Edison, NJ); 15) microtube rack; dan 16) gelas beker. 2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: 1) sampel darah; 2) filter tips 10 µl; 3) filter tips 200 µl; 4) filter tips 1000 µl; 5) tips 10 µl; 6) tips 200 µl; 7) tips 1000 µl; 8) tabung microcentrifuge 1,5 ml; 9) PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA); 10) PCR tube dan PCR cap (Axygen, New York, USA); 11) GoTaq®Green master mix M712 (Promega, Wisconsin, USA); 12) Nuclease-free water (Promega, Wisconsin, USA); 13) Loading Quick ФX174/HaeIII (Toyobo, Tokyo, Jepang); 14)
Etidium
bromida
(EtBr);
15)
Agarose
dalam
Tris-Asetat-EDTA;
16)
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 10 mM; 17) Etanol 70%; 18) Buffer Tris-EDTA (TE) pH 8,5; dan 19) Polypropylene tube 15 ml (BD, Franklin Lakes, New Jersey).
G. Cara Kerja 1. Isolasi DNA Isolasi asam nukleat menggunakan PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit (Invitrogen) sesuai dengan protokol yang terlampir dalam kit sebagai berikut: a. Mempersiapkan Larutan Lysate Proteinase K sebanyak 25 μl dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus, kemudian tambahkan 2
μl plasma dan 2
μl lysis buffer. Tabung mikrosentrifus
ditutup dan campurkan larutan di dalam tabung mikrosentrifus menggunakan vortex selama 15 detik. Kemudian inkubasikan tabung mikrosentri us pada suhu 5 selama 15 menit, setelah itu tambahkan 25 μl etanol 1
C
%. Campurkan larutan di
dalam tabung menggunakan vortex selama 15 detik, selanjutnya inkubasikan tabung mikrosentrifus selama 5 menit pada suhu ruang. b. Prosedur Purifikasi Larutan Lysate dimasukkan ke dalam viral spin column yang berada di dalam tabung penampung. Kemudian dipusingkan dengan kecepatan 6.000 rpm selama satu menit. Lepaskan tabung penampung dan masukkan viral spin column ke dalam tabung penampung baru. Viral spin column dicuci dengan memasukkan 5
μl wash buffer
dan selanjutnya pusingkan dengan kecepatan 6.000 rpm selama satu menit. Cairan di dalam tabung penampung dibuang, kemudian pasangkan kembali tabung ke viral spin column untuk dicuci. Lepaskan tabung penampung setelah dicuci dan masukkan viral spin column ke dalam tabung penampung baru. Pusingkan tabung dengan kecepatan 14.000 rpm selama satu menit, kemudian masukkan viral spin column ke dalam 1,7 ml recovery tube. Terakhir, masukkan 5 μl buffer TE pH 8 dan inkubasikan pada suhu ruang selama satu menit, kemudian pusingkan dengan kecepatan 14.000 rpm
selama satu menit. Hasil purifikasi di dalam recovery tube bisa langsung digunakan atau disimpan pada suhu -
C.
2. Amplifikasi dengan Nested PCR Gen target dari TTV diamplifikasi dengan metode nested PCR menggunakan dua pasang primer (Irshad et al., 2008) (tabel 3.1.). Pembuatan reaksi PCR menggunakan kit GoTaq® Green Master Mix (Promega). Total volume reaksi PCR adalah 25 μl yang terdiri dari: 12,5 μl buffer reaksi, 1 μl primer forward, 1 μl primer backward, 2,5 μl cetakan DNA, dan
μl nuclease-free water.
Tabel 3.1. Primer Deteksi Regio N22 TTV Primer
Sekuens Oligonukleotida
PCR putaran pertama NG059
ACAGACAGAGGAGAAGGCAACATG
NG063
CTGGCATTTTACCATTTCCAAAGTT
PCR putaran kedua NG061
GGCAACATGTTTTGGATAGACTGG
NG063
CTGGCATTTTACCATTTCCAAAGTT
Kondisi PCR yang digunakan untuk PCR putaran pertama dan PCR putaran kedua sama, tercantum pada tabel 3.2. Hasil amplifikasi PCR putaran kedua adalah sekuen regio N22 sepanjang 271 bp (Irshad et al., 2008).
Tabel 3.2. Kondisi PCR Deteksi Regio N22 TTV Proses
Suhu
Waktu
Siklus
Pre-Heating
95°
10 menit
1
Denaturasi
95°
30 detik
35
Annealing
55°
1 menit
35
Elongasi
74°
1 menit
35
Ekstra Elongasi
74°
5 menit
1
Hold
4°
-
-
3. Elektroforesis Analisis produk nested PCR dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 2% dalam buffer TAE 0,8x dan diberi pewarnaan menggunakan etidium bromida. Gel diletakkan dalam bak elektroforesis. Hasil produk PCR (3µl) dan marker Loading Quick ФX174/HaeIII 72-1353bp (5µl) dimasukkan ke dalam sumuran di gel. Eletroforesis dilakukan dalam tegangan 100 V selama 30 menit. Kemudian gel divisualisasikan di Gel Documentation. Pita hasil visualisasi diinterpretasikan dengan marker. H. Analisis Data Data yang diperoleh berupa hasil PCR positif dan risiko penularan TTV, kemudian analisis data menggunakan uji Chi Square program komputer Statistical Product and Service Solution (SPSS) 20.0 for Windows (IBM, New York, United States). Risiko penularan TTV yang dimaksud adalah riwayat seks vaginal tanpa kondom, riwayat seks anal tanpa kondom, riwayat pengguna narkoba suntik, serta riwayat bertato dan bertindik. Ukuran hubungan menggunakan koefesien hubungan Chi Square dengan interpretasi sebagai berikut : 1. Jika p > 0,05, maka tidak terdapat hubungan antara kedua variabel yang diuji. 2. Jika p ≤ , 5, maka terdapat hubungan antara kedua variabel yang diuji.
