BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pengertian dan Peranan Air Air merupakan sesuatu yang esensial bagi berlangsungnya kehidupan. Makhluk hidup tidak akan bertahan hidup tanpa adanya air. Air merupakan kebutuhan yang tidak dapat di tinggalkan bagi kehidupan manusia, karena air di gunakan untuk bermacam-macam kegiatan misalnya minum, makan, mencuci, pertanian industri, perikanan, rekreasi dan juga pembangkit listrik. Bagi tubuh manusia, air merupakan materi penting karena jika tubuh kehilangan cairan maka akan berakibat buruk bagi manusia seperti dehidrasi dan kematian (Prasetyo, 2009).

2.2 Bakteri 2.2.1. Definisi Bakteri Bakteri adalah salah satu golongan organisme prokariotik (tidak mempunyai selubung inti). Bakteri sebagai makhluk hidup tentu memiliki informasi genetik berupa DNA, tapi tidak terlokalisasi dalam tempat khusus (nukleus) dan tidak ada membran inti. Bentuk DNA bakteri adalah sirkuler, panjang dan biasa disebut nukleoid. Pada DNA bakteri tidak mempunyai intron dan hanya tersusun atas ekson saja. Bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal yang tergabung menjadi plasmid yang berbentuk kecil dan sirkuler (Yulika, 2009).

2.2.2. Struktur Bakteri

Gambar 2.1: Menunjukan struktur bakteri. Sumber: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Average_prokaryote_cell-_en.svg

1. Inti/nukleus: Badan inti tidak mempunyai dinding inti/membrane inti. Di dalamnya terdapat benang DNA yang panjangnya kira-kira 1mm. 2. Sitoplasma: Tidak mempunyai mitokondria atau kloroplast sehingga enzim – enzim untuk transport electron bekerja di membrane sel. 3. Membran Sitoplasma: Terdiri dari fosfolipid dan protein. Berfungsi sebagai transport bahan makanan, tempat transport electron, biosintesis DNA, dan kemotaktik. Terdapat mesosom yang berperan dalam pembelahan sel. 4. Dinding sel: Terdiri dari lapisan peptidoglikan, berfungsi untuk menjaga tekanan osmotik, pembelahan sel, biosintesis, determinan dari antigen permukaan bakteri. Pada bakteri Gram-negatif, salah satu lapisan dinding sel

mempunyai

aktivitas

endotoksin

yang

tidak

spesifik,

yaitu

lipopolisakarida yang bersifat toksik. 5. Kapsul: Disintesis dari polimer ekstrasel yang berkondensasi dan membentuk lapisan di sekeliling sel, sehingga bakteri lebih tahan terhadap efek fagositosis.

6. Flagel: Berbentuk seperti benang, yang terdiri dari protein berukuran 12-30 nanometer. Flagel adalah alat pergerakan. Protein dari flagel disebut flagelin. 7. Pili/fimbriae: Berperan dalam adhesi bakteri dengan sel tubuh hospes dan konjugasi 2 bakteri. 8. Endospora: Beberapa genus dapat membentuk endospora. Bakteri-bakteri ini mengadakan diferensiasi membentuk spora bila keadaan lingkungannya menjadi jelek, misalnya bila medium sekitar kekurangan nutrisi. Spora bersifat sangat resisten terhadap panas, kekeringan dan zat kimiawi. Bila kondisi lingkungan telah baik, spora dapat kembali melakukan germinasi dan memproduksi sel vegetatif (Yulika, 2009).

2.2.3. Ciri-ciri Bakteri 1. Uniselular (bersel tunggal), prokariotik (tidak mempunyai membran inti atau membran). 2. Ukuranya sangat kecil, lebar 0,5–1,0 milimikron dan panjang 1,0–6,0 milimikron, tetapi ada bakteri yang berukuran 100 mikron. 3. Hidupnya ada yang soliter (secara sendiri-sendiri) dan ada yang koloni (berkelompok), ada yang bersimbiosis, parasit, dan saprofitik. 4. Pada umumnya tidak mempunyai kloroplas, kecuali bakterioklorofil dan bakteriopurpurin. 5. Berkembang biak secara vegetatif dengan pembelahan binner dan generatif (paraseksual) dengan konjugasi, transformasi dan transduksi. 6. Hidupnya kosmopolit, artinya bakteri dapat hidup dan ditemukan dimana saja. Akan tetapi, dalam kondisi ekstrim bakteri akan membentuk endospora.

Pembentukkan

endospora

diawali

dengan

sel

mulai

mereplikasikan DNAnya dan satu salinan DNAnya dikelilingi oleh dinding sel yang tebal dan kuat. Selanjutnya, dinding sebelah luar hancur, tetapi endospora tetap bertahan hidup melewati segala jenis trauma yang meliputi kekurangan makanan dan air, panas atau dingin ekstrim, dan sebagian besar racun. Jika linkungan sudah berubah menjadi normal kembali endospora

akan mengalami hidrasi dan hidup kembali secara vegetatif untuk membentuk koloni (Susilowarno et al, 2002).

2.3 Coliform 2.3.1. Definisi Coliform Coliform merupakan suatu kelompok bakteri yang digunakan sebagai indikator sanitasi air dan produk bahan makanan seperti daging, susu, telur dan bahan makanan olahan lainya. Adanya bakteri Coliform di dalam makanan atau minuman menunjukkan kemungkinan adanya mikroorganisme yang berbahaya bagi kesehatan. Gangguan yang ditimbulkan pada manusia adalah mual, nyeri perut, muntah, diare, tinja darah, demam tinggi bahkan pada beberapa kasus bisa kejang dan kekurangan cairan atau dehidrasi. Bakteri Coliform dapat dibedakan menjadi dua golongan yaitu: 1. Bakteri Coliform golongan fekal, misalnya Escherichia coli. 2. Bakteri Coliform golongan non fekal, misalnya Enterobacter aerogenes. Escherichia coli merupakan bakteri yang berasal dari tinja manusia atau hewan sedangkan Enterobacter aerogenes biasanya ditemukan pada hewan atau tanaman-tanaman yang telah mati (Rhiyan, 2012). Berbagai metode untuk mengidentifikasi bakteri patogen di dalam air telah dikembangkan. Akan tetapi, penentuan semua jenis bakteri patogen ini membutuhkan waktu dan biaya yang besar, sehingga penentuan kelompok bakteri Coliform dianggap sudah cukup baik dalam menilai tingkat kualitas air. Escherichia coli adalah salah satu bakteri Coliform berbahaya yang ditemukan dalam tinja manusia dan hewan. Selain Escheriachia coli, bakteri patogen juga terdapat dalam tinja. Keberadaan Escherichia coli di perairan secara berlimpah menggambarkan bahwa perairan tersebut tercemar oleh tinja manusia atau hewan, yang mungkin juga disertai dengan cemaran bakteri patogen. Penentuan bakteri Coliform sebagai indikator adanya pencemaran tinja pertama kali dilakukan di Amerika Serikat pada tahun 1914 (Effendi, 2003).

2.3.2. Klasifikasi Coliform Tabel 2.1: Famili, Genera dan Species Beberapa Coliform Umum Famili Genera Species Enterobacteriaceae Escherichia Escherichia coli (E.coli) Klebsiella Klebsiella pneumonia (K.pneumonia) Enterobacter Enterobacter aerogenus (E.aerogenus) Citobacter Citobacter freundii (C.freundii) Sumber: National Health and Medical Research Council, Australian Government

Tabel 2.2: Distribusi Bakteri Coliform Total Dalam Tinja Manusia dan Hewan Jenis sampel % 0f Total Coliform E.coli Klebsiella spp. Enterobacteri Citrobacter spp. 96.8 1.5 1.7 Tinja Manusia 94.1 5.9 94 2 4 Tinja Hewan 92.6 7.4 Sumber: National Health and Medical Research Council, Australian Government.

Tabel 2.3: Pensyaratan Kualitas Air Secara Mikrobiologis Parameter Satuan Kadar maksimum yang diperbolehkan A) Air minum E.coli atau fecal coli

Jumlah per 100ml sampel

0

B) Air yang masuk system distribusi E.coli atau fecal coli

Jumlah per 100ml sampel

0

Total bakteri Coliform

Jumlah per 100ml sampel

0

C) Air pada system distribusi E.coli atau fecal coli

Jumlah per 100ml sampel

0

Total bakteri Coliform

Jumlah per 100ml sampel

0

Sumber: Kusnaedi, 2010.

2.4. Escherichia Coli 2.4.1. Definisi Escherichia coli Lebih dari 100 tahun yang lalu, ilmuwan menemukan bahwa tinja manusia mengandungi bakteri yang jika hadir dalam air, menunjukkan bahwa air tidak aman untuk diminum. Theodor Escherich pada tahun 1885 mengamati 2 jenis organisme hadir dalam tinja, salah satunya ia menamai bacterium coli (yang sekarang disebut Escherichia coli) dan konsep bahwa kehadiran bacterium coli dalam air menyiratkan pencemaran air siap diadopsi. Escherichia coli adalah salah satu bakteri yang tergolong dalam bakteri Coliform dan hidup secara normal di dalam tinja manusia maupun hewan, oleh karena itu disebut juga Coliform fekal. Bakteri Coliform lainnya berasal dari hewan dan tanaman mati disebut Coliform non fekal. Escherichia coli adalah bakteri bersifat gram negatif, berbentuk batang dan tidak membentuk spora (National Health and Medical Research Council, 2003).

2.4.2. Ciri-ciri Escherichia coli Bakteri berbentuk batang kecil (coccobacil, gram negatif, ukuran 0,4-0,7 µm x 1.4 µm, sebagian besar gerak positif dan beberapa strain mempunyai kapsul). Escherichia coli merupakan flora normal saluran pencernaan dan merupakan salah satu bakteri yang menghasilkan indol positif dan tergolong bakteri yang cepat meragi laktosa (Akademi Analis Kesehatan Nasional Surakarta, 2012). Escherichia coli mempunyai beberapa antigen, yaitu Antigen O (somatik) yang bersifat tahan panas atau termostabil, dan terdiri dari lipopolisakarida yang mengandung glukosamin dan terdapat pada dinding sel bakteri gram negatif. Seterusnya adalah Antigen H (flagel) yang bersifat tidak tahan panas atau termolabil dan akan rusak pada suhu 100 oC. Akhirnya Antigen K (kapsul), antigen ini terdapat pada permukaan luar bakteri, terdiri dari lipopolisakarida dan bersifat tidak tahan panas (Akademi Analis Kesehatan Nasional Surakarta, 2012). Pada Escherichia coli paling tidak terdapat dua tipe fimbria yaitu tipe manosa sensitif (pili) dan tipe manosa resisten (CFAs I dan II). Kedua tipe fimbria ini

penting sebagai kolonisasi faktor, yaitu untuk perlekatan sel bakteri pada sel atau jaringan tuan rumah. Misalnya, antigen CFAs I dan II melekatkan Entero phatogenic Escherichia coli (EPEC) pada sel epitel usus hewan (Akademi Analis Kesehatan Nasional Surakarta, 2012). Pada Escherichia coli terdapat 2 macam enterotoksin yang telah berhasil diisolasi dari Escherichia coli yaitu toksin LT (termolabil) dan toksin ST (termostabil). Produksi kedua macam toksin diatur oleh plasmid yang mampu pindah dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya. Toksin LT bekerja merangsang enzim adenil siklase yang terdapat di dalam sel epitel mukosa usus halus dan berakhir dengan diare. Toksin LT adalah asam amino, mempunyai satu atau lebih sulfida, yang penting untuk mengatur stabilitas pH dan suhu. Toksin ST bekerja dengan cara mengaktivasi enzim guanilat siklase menghasilkan siklik guanosin monofosfat, menyebabkan gangguan penyerapan klorida dan natrium, selain itu toksin ST menurunkan motilitas usus halus (Akademi Analis Kesehatan Nasional Surakarta, 2012).

Gambar 2.2: Menunjukan Escherichia coli. Sumber: www.niaid.nih.gov

2.4.3. Klasifikasi Escherichia coli Klasifikasi Ilmiah Kingdom

: Bacteria

Phylum

: Proteobacteria

Class

: Gamma Proteobacteria

Ordo

: Eubacteriales

Family

: Enterobacteriaceae

Genus

: Escherichia

Species

: Escherichia coli

Tabel 2.4: Klasifikasi Keempat Galur Escherichia coli Tempat Mekanisme Galur Penyakit Infeksi Patogen Entero Toksigenic Usus Kecil Traveller’s diarrehea, Enterotoksin Escherichia coli tinja berair, kram perut, LT dan ST (ETEC) mual, subfebris Entero Invasif Usus Besar Shigella-like diarrehea, Invasi dan Escherichia coli Tinja berair-berdarahdestruksi (EIEC) berlendir, kram perut, dan jaringan sel demam. epitel Entero Usus kecil Diare infantile, mirip Perlengketan Pathogenic salmonellosis dengan dan perusakan Escherichia coli demam, mual dan muntah sel epitel (EPEC) Entero Usus besar Kolitis hemoragik, nyeri Verotoksin Haemorrhagic perut hebat, diare berair (sitotoksin Escherichia coli dilanjutkan dengan SLT I dan II) (EHEC) pengeluaran banyak darah Sumber: Buku Ajar Ilmu Gizi: Keracunan Makanan, 2009.

1. Entero Toxigenic Escherichia coli (ETEC) Golongan pertama disebut Entero Toxigenic Escherichia coli (ETEC) adalah nama yang diberikan kepada sekelompok Escherichia coli yang menghasilkan racun khusus yang merangsang lapisan usus untuk mengeluarkan cairan yang berlebihan, sehingga menghasilkan diare. ETEC pertama kali diakui sebagai penyebab penyakit diare manusia pada tahun 1960. Ini telah muncul sebagai bakteri penyebab utama diare di

negara berkembang. Setiap tahun, sekitar 210 juta kasus dan 380.000 kematian terjadi, terutama pada anak-anak, menurut Center for Disease Control (CDC), ETEC merupakan penyebab paling umum dari traveller’s diarrehea dan anak-anak di negara maju, seperti Amerika Serikat. Infeksi ETEC dapat menyebabkan diare berair dan kram perut. Strain bakteri ini mengeluarkan toksin LT dan ST. Faktor-faktor permukaan untuk perlekatan sel bakteri pada mukosa sel usus penting di dalam patogenesis diare, karena bakteri harus melekat pada sel epitel mukosa usus sebelum bakteri mengeluarkan toksin. Demam, mual tanpa muntah, mengigil, kehilangan nafsu makan, sakit kepala, nyeri otot dan kembung juga dapat terjadi tetapi kurang umum. Penyakit berkembang 1-3 hari setelah terkena dan biasanya berlangsung 3-4 hari. Beberapa infeksi mungkin memakan waktu 1 minggu atau lebih untuk menyelesaikan. Gejala jarang berlangsung lebih dari 3 minggu. Kebanyakan pasien sembuh dengan langkah-langkah dukungan dan tidak memerlukan rawat inap atau antibiotik. 2. Entero Invasif Escherichia coli (EIEC) Menurut CDC, golongan kedua disebut Entero Invasif Escherichia coli (EIEC), dimana sel-sel Escherichia coli mampu menembus dinding usus dan menimbulkan kolitis (radang usus besar) atau gejala seperti disentri. Bakteri menginvasi sel mukosa, menimbulkan kerusakan sel dan terlepasnya lapisan mukosa. Ciri khas diare yang disebabkan oleh strain EIEC adalah tinja mengandung darah, mukosa dan nanah. Waktu inkubasi 8-44 jam (rata-rata 26 jam) dengan gejala demam, sakit kepala, kejang perut dan diare berdarah. 3. Entero Pathogenic Escherichia coli (EPEC) Menurut CDC, golongan ketiga disebut Entero Pathogenic Escherichia coli (EPEC) merupakan bakteri penyebab diare persisten yang dapat berlangsung 2 minggu atau lebih. Menyebar ke manusia melalui kontak dengan air yang terkontaminasi atau hewan yang terinfeksi dan umum di negara-negara

berkembang.

Di

negara-negara

industri,

frekuensi

organisme ini mengalami penurunan, tetapi mereka terus menjadi penyebab penting diare. 4. Entero Haemorrhagic Escherichia Coli (EHEC) Menurut World Health Organization (WHO), golongan keempat disebut Entero Haemorrhagic Escherichia coli (EHEC) merupakan bakteri yang dapat menyebabkan diare berdarah. Sumber utama adalah produk mentah atau daging sapi kurang matang, susu mentah dan kontaminasi tinja dalam sayuran. Dalam kebanyakan kasus, gejala penyakit yang disebabkan oleh EHEC termasuk kram perut dan diare yang mungkin dalam beberapa kasus berkembang menjadi diare berdarah. Demam dan muntah juga dapat terjadi. Masa inkubasi dapat berkisar dari 3-8 hari, dengan rata-rata 3-4 hari. Kebanyakan pasien sembuh dalam waktu 10 hari, tetapi pada sebagian kecil pasien (terutama anak-anak muda dan orang tua), infeksi dapat menyebabkan penyakit yang mengancam jiwa, seperti sindroma uremik hemolitik (SUH), SUH ditandai dengan gagal ginjal, anemia hemolitik akut dan trombositopenia. EHEC adalah peka terhadap panas. Dalam menyiapkan makanan di rumah, pastikan untuk mengikuti praktekpraktek kebersihan makanan dasar seperti memasak secara menyeluruh sampai semua bagian mencapai suhu 70 oC atau lebih tinggi

2.5 .Pengobatan dan Pencegahan Menurut Akademi Analis Kesehatan Nasional Surakarta (2012), Escherichia coli yang diisolasi dari infeksi di dalam masyarakat biasanya sensitif terhadap obat-obatan anti mikroba yang digunakan untuk organisme gram negatif, meskipun juga terdapat strain-strain resisten, terutama pada pasien dengan riwayat pengobatan antimikroba sebelumnya. Berbagai cara dapat digunakan untuk mencegah diare termasuk konsumsi setiap hari substansi bismuth subsalisilat (tidak aktifkan Escherichia coli enterotoksin invitro) dan dosis teratur tetrasiklin atau obat anti mikrobia lain untuk periode tertentu. Karena tidak ada satupun metode yang baik atau tidak mempunyai efek samping, maka dianjurkan untuk memperhatikan makanan dan minuman di area dimana sanitasi lingkungan kurang

baik dan pengobatan yang tepat (misalnya ciprofloxacin dan trimethoprim sulfamethoxazole) dilakukan untuk profilaksis. Pada pasien-pasien dengan diare, perlu dijaga keseimbangan cairan dan elektrolitnya. Pencegahan infeksi memerlukan tindakan pengendalian pada semua tahap rantai makanan, dari produksi pertanian untuk pengolahan, manufaktur dan persiapan makanan di kedua perusahan komersial dan dapur rumah tangga. Tidak ada vaksin atau obat yang dapat melindung dari Escherichia coli. Meskipun peneliti sedang menyelidiki potensi vaksin, untuk mengurangi kesempatan terkena Escherichia coli. Hindari makanan berisiko dan hati-hati karena bisa tejadi kontaminasi silang.

Berdasarkan Mayo Foundation for Medical Education and Research (2011), pencegahan dapat dibagi ke 2 kelompok: a) Hindari makanan yang berisiko. b) Hindari kontaminasi silang.

Hindari makanan yang berisiko: 1. Hindari hamburger merah muda. Daging, terutama jika panggang, cenderung coklat sebelum benar-benar matang. Jadi gunakan thermometer daging untuk memastikan daging yang dipanaskan sampai setidaknya 71 oC pada titik paling tebal. 2. Minum susu dan jus yang di pasteurisasi. Setiap kotak jus atau botol disimpan pada suhu kamar, kemungkinan akan di pasteurirasi, bahkan jika label tidak mengatakan demikian. 3. Cuci bahan mentah secara menyeluruh. Meskipun mencuci bahan mentah tidak akan selalu menyingkir semua Escherichia coli, terutama pada sayuran hijau, yang menyediakan banyak tempat bagi bakteri untuk menempel.

Hindari kontaminasi silang: 1. Cuci peralatan. Gunakan air sabun panas pada pisau, meja dan papan memotong sebelum dan sesudah kontak dengan produk segar atau daging mentah. 2. Makanan mentah di pisah dari makanan lain. Ini termasuk menggunakan papan memotong berasing untuk memotong daging mentah dan makanan seperti sayuran dan buah-buahan. 3. Cuci tangan setelah dan sebelum menyiapkan makanan, menggunakan kamar mandi atau mengganti popok. Pastikan juga anak-anak mencuci tangan mereka sebelum makan dan juga setelah kontak dengan hewan.

2.6. Perhitungan Nilai MPN Untuk mengetahui jumlah koliform di dalam contoh digunakan metode Most Probable Number ( MPN ). Pemeriksaan kehadiran bakteri coli dari air dilakukan berdasarkan penggunaan medium kaldu laktosa yang ditempatkan di dalam tabung reaksi berisi tabung durham (tabung kecil yang letaknya terbalik, digunakan untuk menangkap gas yang terjadi akibat fermentasi laktosa menjadi asam dan gas). Tergantung kepada kepentingan, ada yang menggunakan sistem 33-3 (3 tabung untuk 10 ml, 3 tabung untuk 1,0 ml, 3 tabung untuk 0,1 ml) atau 5-5-5 (Prasetyo, 2009). Metode penentuan angka mikroorganisme dengan metode Angka Paling Mungkin di gunakan luas di lingkungan sanitasi untuk menentukan jumlah kuman Coliform di dalam air, susu, dan makanan lainnya. Metode ini adalah metode statistik didasarkan pada teori kemungkinan. Serangkaian sampel diencerkan sampai titik akhir dimana tidak ada mikroorganisme hidup. Untuk mendapatkan titik akhir, serangkaian pengenceran di biakkan di dalam media pertumbuhan yang cocok dan perkembangan atau perubahan sifat-sifat yang mudah di amati seperti pembentukan asam, atau kekeruhan di pakai untuk mengetahui adanya pertumbuhan bakteri.

Pertumbuhan bakteri pada masing-masing tabung di sesuaikan dengan tabel indeks MPN untuk menentukan konsentrasi mikroorganisme di dalam sampel asli. Dan batas kepercayaan 95% untuk berbagai kombinasi hasil positif dan negatif pada penggunaan 3 tabung 10ml, 3 tabung 1ml, dan 3 tabung 0,1ml(Widyanti dan Ristianti, 2004).. Uji kualitatif koliform secara lengkap terdiri dari 3 tahap yaitu (1) Uji penduga (presumptive test), (2) Uji penguat (confirmed test) dan Uji pelengkap (completed test). Uji penduga juga merupakan uji kuantitatif koliform menggunakan metode MPN (Widyanti dan Ristianti, 2004).

2.6.1 Uji penduga (presumptive test) Merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri koliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan koli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa, dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara. Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung Durham. Banyaknya kandungan bakteri Escherichia coli dapat dilihat dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel MPN. Metode MPN dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair. Bila inkubasi 1 x 24 jam hasilnya negatif, maka dilanjutkan dengan inkubasi 2 x 24 jam pada suhu 350C. Jika dalam waktu 2 x 24 jam tidak terbentuk gas dalam tabung Durham, dihitung sebagai hasil negatif. Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri. MPN penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN (Widyanti dan Ristianti, 2004).

2.6.2 Uji Penegas (confirmative test) Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan/penegasan. Ada 2 cara untuk melakukan uji ini yaitu: 1. Uji dapat dilakukan seperti pada uji pendugaan, hanya di dalam media perlu ditambahkan zat warna hijau berlian (media BGLB). Kepada

medium ini kemudian dinokulasikan sejumlah ml air yang mengandung bakteri yang menghasilkan gas. Hijau berlian berguna untuk menghambat pertumbuhan gram positif dan menggiatkan pertumbuhan bakteri golongan kolon. Untuk membedakan bakteri golongan coli dari bakteri golongan coli fecal (berasal dari tinja hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana satu seri diinkubasi pada pada suhu 370C (untuk golongan coli) dan satu seri diinkubasi pada suhu 440C (untuk golongan coli fecal). Bakteri golongan koli tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 440C, sedangkan golongan koli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 440C.

2. Menginokulasikan air yang menghasilkan gas ke dalam cawan petri berisi medium yang mengandung laktose dan eosin biru metilen atau laktose dan eosin biru metilen. Jika dalam 24 jam tumbuh koloni-koloni yang berinti dan mengkilap seperti logam maka tes ini positif.

2.6.3 Uji Pelengkap (completed test) Uji kelengkapan ini kadang-kadang tidak dilakukan. Uji dilakukan dengan alasan demi kesempurnaan hasil percobaan. Pada uji ini diambil inokulum dari suatu kolon pada cawan petri (uji konfirmasi cara 2). Inokulum dimasukkan ke dalam medium cair yang mengandung laktose dan dari inokulum tersebut dibuat gesekan pada agar-agar miring. Jika kemudian timbul gas dalam cairan laktose, lagipula pada agar-agar miring ditemukan basil-basil gram negatif yang berupa spora maka tes dinyatakan positif. Uji kelengkapan ini kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri Coliform: berbentuk batang, Gram negatif, tidak-berspora. Jika pada uji penduga tidak menunjukkan adanya Coliform maka tidak perlu dilakukan uji pelengkap. Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni (colonyforming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan,

umumnya per 100 mL atau per gram. Jadi misalnya terdapat nilai MPN 10/g dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10 Coliform pada setiap gramnya. Makin kecil nilai MPN, maka air tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin layak minum. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Ali Tamyis, 2008).

2.7. Identifikasi Bakteri 2.7.1 Pemeriksaan Mikroskopis 1. Pemeriksaan Langsung Pemeriksaan langsung digunakan untuk mengamati pergerakan, dan pembelahan secara biner, mengamati bentuk dan ukuran sel yang alami, yang pada saat mengalami fiksasi panas serta selama proses pewarnaan mengakibatkan beberapa perubahan. Cara yang paling baik adalah dengan membuat sediaan tetesan gantung.

2. Pewarnaan Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan. a. Untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan acidfast/tahan asam untuk Mycobacterium. b. Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagel, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae.

3. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologis dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik. Caranya tidak sulit tetapi membutuhkan kehati-hatian dalam

pembuatannya. Tahap-tahap yang harus dilakukan secara hati-hati, adalah sebagai berikut : a. Menyiapkan kaca objek: menghapus lemak atau minyak untuk membersihkan kaca dengan menggunakan air hangat atau serbuk penggosok, selanjutnya dengan suatu campuran air dan alkohol (alkohol 95%), kemudian kaca dikeringkan dan disimpan di atas lap laboratorium sampai siap untuk digunakan. b. Pembuatan apusan: menghindari apusan yang tebal dan rapat adalah penting secara mutlak. Suatu apusan yang baik merupakan selapis tipis. Apusan dapat dibuat dari kultur kaldu atau medium kultur padat dengan berbagai cara: c. Dari kultur kaldu, pengambilan satu atau dua loop kultur sel dapat langsung dipindahkan ke kaca objek dengan loop inokulasi steril dan sebarkan secara merata kira-kira sebesar uang logam. d. Dari medium padat: mikroorganisme yang diambil dari medium padat menghasilkan pertumbuhan yang tebal dan rapat, tidak dapat langsung dipindahkan ke atas kaca objek.(Kusnadi,dkk. Tt)

4. Pemindahan sel dari kultur dilakukan dengan menggunakan jarum inokulasi steril. Hanya ujung jarum yang menyentuh kultur, untuk mencegah pemindahan sel terlalu banyak. Pengenceran dilakukan dengan memutar ujung jarum di atas tetesan air, sampai kelihatan semitransparan. Sebelum proses selanjutnya , apusan dibiarkan kering. Jangan ditiup, biarkan kering di udara.

5. Fiksasi panas: tanpa difiksasi, apusan bakteri akan tercuci selama memasuki prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dibutuhkan selama protein bakteri mengalami koagulasi dan melekat di atas permukaan kaca objek. 6. Fiksasi panas dilakukan dengan melalukan secara cepat apusan kering, sebanyak dua atau tiga kali di atas lidah api bunsen.

Gambar 2.3 : Teknik dasar pewarnaan sel bakteri untuk pengamatan mikroskopik

2.7.2 Penanaman pada Media Diferensial 1. Agar Garam Mannitol Mengandung konsentrasi garam tinggi (7,5% NaCl), yang dapat menghambat pertumbuhan kebanyakan bakteri, kecuali staphylococcus. Media ini juga mengadakan fungsi differensial karena mengandung karbohidrat mannnitol, dimana beberapa staphylococcus dapat melakukan fermentasi , phenol red (pH indikator) digunakan untuk mendeteksi adanya asam hasil fermentasi manitol. staphylococcusi ini memperlihatkan suatu zona berwarna kuning di sekeliling pertumbuhannya, staphylococcus yang tidak melakukan fermentasi tidak akan menghasilkn perubahan warna.

2. Agar Darah Darah dimasukkan ke dalam medium untuk memperkaya unsur dalam penanaman mikroorganisme pilihan seperti Streptococcus sp. Darah juga akan memperlihatkan sifat hemolysis yang dimiliki streptococcusi: a. gamma hemolisis: tidak terjadi lysis sel darah merah, tidak adanya perubahan medium di sekitar koloni b. alpha hemolisis: terjadi lysis sel darah merah dengan reduksi hemoglobin

menjadi

methemoglobin

menghasilkan

lingkaran

kehijauan sekitar pertumbuhan bakteri c. beta hemolisis: terjadi lysis sel darah merah dilengkapi kerusakan dan penggunaan hemoglobin oleh organisme, menghasilkan zona bening sekeliling koloni.

3. Agar McConkey Menghambat pengaruh kristal violet terhadap pertumbuhan bakteri grampositif, selanjutnya bakteri gram-negatif dapat diisolasi. Media dilengkapi dengan karbohidrat (laktosa), garam empedu, dan neutral red sebagai pH indikator yang mampu membedakan bakteri enteric sebagai dasar kemampuannya untuk memfermentasi laktosa. Pada dasarnya bakteri enteric dipisahkan ke dalam dua kelompok:

a. Coliform basil menghasilkan asam dari fermentasi laktosa. Bakteri memperlihatkan

warna

merah

pada

permukaannya.

E.

coli

menghasilkan kuantitas asam lebih banyak dibandingkan spesies coliform yang lain. Jika ini terjadi medium di sekitar pertumbuhan juga akan berubah menjadi merah seharusnya pengaruh asam terjadi pengendapan garam empedu yang diikuti penyerapan neutral red. b. Disentri, tifoid, dan paratifoid basill tidak memfermentasi laktosa, maka tidak menghasilkan asam. Koloni kelihatan tidak berwarna dan seringkali transparan.

4. Agar Eosin-Methylene Blue (EMB agar) Laktosa dan zat pewarna eosin serta metilen biru mampu membedakan antara enteric fermenter laktosa dengan nonfermenter sebaik identifikasi terhadap basilus colon Escherichia coli. Koloni E. coli tersebut kelihatan biru kehitaman dengan kilat hijau logam/metalik yang disebabkan besarnya kuantitas asam yang dihasilkan dan pengendapan zat pewarna di atas permukaan pertumbuhan. Bakteri coliform lain seperti Enterobacter aerogenes terbentuk tebal, mukoid, koloni berwarna pink diatas medium ini. Bakteri enteric nonfermenter laktosa membentuk koloni tidak berwarna maka kelihatan transparan, kelihatan di atas medium yang berwarna ungu (merah lembayung). Medium ini juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram-positif, sedangkan bakteri gram-negatif tumbuh lebih baik.

5. Agar DarahTelurit Untuk megisolasi Corynebacterium digunakan agar darah telurit (Mc Leod), sebagai media selektif, setelah inkubasi selama 24 jam koloni bakteri terlihat berwarna abu-abu tua-hitam. Selanjutnya untuk biakan murni Corynebacterium digunakan media perbenihan Loeffler dalam tabung.

6. Agar Tioglikolat/Tarrozi (Perbenihan Anaerob) Perbenihan tioglikolat, mengandung asam tioglikolat yang dapat mengikat oksigen sehingga tercapai suasana anaerob dalam perbenihan. Perbenihan Tarrozi, kaya akan enzim peroksidase sehingga zat toksik (H2O2) yang dihasilkan Clostridium tetani berubah menjadi tidak toksik (H2O dan O2) dan kuman dapat tumbuh terus dalam perbenihan.

7. Agar TCBS dan Agar Monsur Agar TCBS (thiosulfat citrat bile sucrose), Agar Monsur (mengandung telurit gelatin agar atau agar bulyon alkalis yang mengandung Natourokholat), digunakan untuk mengisolasi genus Vibrio. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37o C di atas media berwarna hijau kehitaman koloni akan terlihat bundar berwarna kuning muda, transculent dan permukaannya rata.

8. Agar Coklat atau Thayer-Martin Media agar coklat (Thayer-Martin) merupakan media terpilih untuk genus Neisseria. Untuk pertumbuhannya diperlukan suasana anaerob(fakultatif) dengan sedikit gas CO2 dan tidak boleh kekeringan, sehingga pembiakan yang cocok digunakan dalam eksikator yang diberi kapas basah pada bagian bawah petri yang berisi biakan.

9. Media Agar Lowenstein-Jensen Media padat tersebut banyak digunakan untuk perbenihan genus Mycobacterium, bakteri ini dapat tumbuh walaupun dalam waktu relatif lama, kecuali jenis atipik golongan “rapid growers” dapat tumbuh dalam 3-7 hari.(Kusnadi,dkk.Tt)

2.8. Uji Biokimia Metabolisme merupakan reaksi-reaksi kimia yang terjadi pada makhluk hidup. Proses metabolisme dibedakan menjadi dua jenis yaitu anabolisme dan katabolisme. Anabolisme (Biosintesis) yaitu reaksi biokimia yang merakit molekul-molekul sederhana menjadi molekul-molekul yang lebih kompleks. Misalnya pembentukkan protein dari asam amino. Secara umum proses anabolik membutuhkan energi. Sedangkan katabolisme yaitu reaksi biokimia yang memecah atau menguraikan molekul-molekul

kompleks menjadi molekul-

molekul yang lebih sederhana. Proses katabolik melepaskan energi yang dibutuhkan oleh sel(Waluyo, 2004).

Aktivitas metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Berdasarkan tempat bekerjanya, bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim dan eksoenzim. Endoenzim yaitu enzim yang berkerja dalam sel. Sistem endoenzim selain bersifat anabolik dapat juga bersifat katabolik.sedangkan eksoenzim yaitu enzim yang disekresikan ke luar sel dan berdifusi ke dalam media. Sebagian besar eksoenzim bersifat hidroliktik, yang berarti bahwa eksoenzim menguraikan molekul kompleks menjadi molekul yang molekul-molekul yang lebih sederhana. Molekul-molekul yang lebih kecil ini kemudian dapat memasuki sel dan digunakan untuk kepentingan sel(Waluyo, 2004).

Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Selain itu dilihat kemampuannya menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energi (Waluyo, 2004).

E. coli adalah suatu bakteri gram negative berbentuk batang, bersifat anaerobic fakultatif, dan mempunyai flagella peritrikat. E. coli dibedakan atas sifat serologinya berdasarkan antigen o (somatic), K (kapsul) dan H (flagella) (Fardiaz,1992) Medium selektif yang dapat digunakan untuk mengisolasi E.coli misalnya DHL (Desoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose) agar atau MacConkey

Agar. Koloni E.coli pada DHL dan MacConkey Agar berwarna merah dan dikelilingi oleh areal yang menunjukkan pengendapan bile. E.coli akan menfermentasi laktosa di dalam medium menjadi asam, sehingga mengakibatkan terjadinya pengendapan bile dan penyerapan indikator merah netral(Fardiaz,1992) Uji-uji

biokimia

yang

dilakukan

terhadap

E.

coli

termasuk

karakteristik pertumbuhan pada agar TSI (Triple Sugar Iron) dan agar SIM (Sulfite Indole Motility) atau LIM (Lysine Indole Motility). Uji-uji biokimia ditujukan untuk menunjukkan E.coli dan bakteri-bakteri lainnya yang mempunyai sifat-sifat hamper sama, yaitu Klebsiella dan Enterobacter (Fardiaz,1992)