AUTOMATIZÁLT MINTA-ELŐKÉSZÍTÉSI MÓDSZER POLICIKLUSOS AROMÁS SZÉNHIDROGÉNEK ÉS BIOMARKER VEGYÜLETEK GÁZOLAJMINTÁBÓL TÖRTÉNŐ ELVÁLASZTÁSÁRA

 Tudományos Diákköri Dolgozat 

KIRCHKESZNER CSABA

AUTOMATIZÁLT MINTA-ELŐKÉSZÍTÉSI MÓDSZER POLICIKLUSOS AROMÁS SZÉNHIDROGÉNEK ÉS BIOMARKER VEGYÜLETEK GÁZOLAJMINTÁBÓL TÖRTÉNŐ ELVÁLASZTÁSÁRA

Dr. Eke Zsuzsanna egyetemi adjunktus ELTE TTK Analitikai Kémiai Tanszék Novák Márton PhD hallgató ELTE TTK Analitikai Kémiai Tanszék

 Eötvös Loránd Tudományegyetem   Természettudományi Kar   Budapest, 2013 

Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke ............................................................................................................................ 2 1. Bevezetés .......................................................................................................................................... 3 2. Szakirodalmi áttekintés..................................................................................................................... 5 2.1. Gázkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria ................................................................. 5 2.2. A gázkromatográfiás elemzések során alkalmazott mintabeviteli technikák ............................. 7 2.2.1. A split/splitless injektálás ................................................................................................... 7 2.2.2. A nagytérfogatú injektálás és a programozott hőmérsékletű injektor ................................ 9 2.2.3. Kétlépcsős oldószer-lefúvatás .......................................................................................... 11 2.3. Minta-előkészítési módszerek .................................................................................................. 12 2.3.1. Szilárd fázisú extrakció .................................................................................................... 12 2.3.2. MEPS®: Microextraction by Packed Sorbent módszer .................................................... 13 2.4. A szénhidrogén-szennyezések analitikája ................................................................................ 14 2.4.1. A kémiai ujjlenyomat módszer alkalmazása a petrolkémiai kutatásokban ...................... 16 2.4.2. A petróleum biomarkerek és a policiklusos aromás szénhidrogének jelentősége a kémiai ujjlenyomat módszerekben ......................................................................................................... 19 3. Célkitűzés ....................................................................................................................................... 22 4. Kísérletek és vizsgálatok ................................................................................................................ 23 4.1. Felhasznált vegyszerek és eszközök ......................................................................................... 23 4.1.1. A CTC Combi PAL mintaadagoló rendszer ..................................................................... 25 4.2. Manuális szilárd fázisú extrakciós eljárás .............................................................................. 26 kőolajszármazék minták előkészítésére .......................................................................................... 26 4.3. A MEPS® alkalmazásának lehetőségei.................................................................................... 29 4.4. Az automatizált szilárd fázisú extrakció megvalósítása a CTC Combi PAL mintaadagoló rendszerrel...................................................................................................................................... 31 4.5. Az automatizált szilárd fázisú extrakciós módszer optimálása................................................ 34 4.5.1. Az állófázis kiválasztása és a töltet kondicionálásának, illetve előkészítésének vizsgálata .................................................................................................................................................... 34 4.5.2. A leoldáshoz használt eluensek kiválasztása .................................................................... 35 4.5.3. A nagytérfogatú injektálás optimálása ............................................................................. 37 4.5.4. A töltet kapacitásának vizsgálata és a leoldási térfogatok optimálása ............................ 43 4.5.5. A kifejlesztett automatizált minta-előkészítési módszer .................................................... 46 5. A vizsgált minta-előkészítési módszerek összehasonlítása ............................................................ 47 6. A kifejlesztett automatizált technika alkalmazása .......................................................................... 49 7. Összefoglalás .................................................................................................................................. 50 Köszönetnyilvánítás ........................................................................................................................... 51 Hivatkozások jegyzéke ....................................................................................................................... 52

1

Rövidítések jegyzéke Rövidítés GC MS SIM AMU PTV SPE MEPS® LC TPH EPH VPH FID GC×GC IRMS EPA SVOC ASTM PCA PAH EI TLC TIC LVI MSZE CIS

Kifejtés

Magyar jelentés

Gas Chromatography Mass Spectrometry Selected Ion Monitoring Atomic Mass Unit Programmed Temperature Vaporiser Solid Phase Extraction Microextraction by Packed Sorbent Liquid Chromatography Total Petroleum Hydrocarbons Extractable Petroleum Hydrocarbons Volatile Petroleum Hydrocarbons Flame Ionization Detector Two Dimensional Gas Chromatography

Isotope Ratio Mass Spectrometry Environmental Protection Agency Semi-Volatile Organic Compounds

gázkromatográfia tömegspektrometria szelektív ionkövetés atomi tömegegység programozott hőmérsékletű injektor szilárd fázisú extrakció nincs magyar fordítása, egy márkanév folyadékkromatográfia összes szénhidrogén-tartalom extrahálható szénhidrogén-tartalom illékony szénhidrogén-tartalom lángionizációs detektor kétdimenziós gázkromatográfia izotóparány-mérő tömegspektrometria Környezetvédelmi Ügynökség (USA) közepesen illékony vegyületek

American Society for Testing and Materials

Principal Component Analysis Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Electron Impact Ionization Thin-Layer Chromatography Total Ion Chromagtogram Large Volume Injection Magyar Előszabvány Cooled Injection System

2

főkomponens analízis policiklusos aromás szénhidrogének elektronütközéses ionizáció vékonyréteg kromatográfia totál ion kromatogram nagytérfogatú injektálás hűtött injektorrendszer

1. Bevezetés Napjainkban az emberiség energiaigénye egyre nagyobb méreteket ölt. Mind a mai napig a legfontosabb és a legtöbbet használt energiaforrások a fosszilis energiahordozók, mint a szén, a kőolaj és a földgáz. Ezek széleskörű felhasználása magában hordozza, sőt jelentősen növeli ezen anyagok környezetbe kerülésének veszélyét. Így óriási problémát jelentenek az óceánok mélyén húzódó kőolajvezetékek, mélytengeri fúrótornyok szivárgása, felrobbanása, olajszállító tankerek megfeneklése, valamint a talajok kőolajszármazékokkal történő szennyezése. Azonban nem szabad megfeledkezni arról sem, hogy a szénhidrogén-szennyezések különös kockázati tényezőt jelentenek a felszíni és felszín alatti édesvízkészletekre, s azok élővilágára is.

1. ábra. A szénhidrogén-szennyezés néhány megjelenési formája.

Az elmúlt évtizedekben jelentősen megszaporodó környezeti problémák súlyosbodásával a társadalomban egyre nagyobb igény támad a környezetszennyezés mérséklésére, adott környezeti terhelés hatásainak pontosabb megismerésére. A környezetszennyezések esetén a humán, illetve az ökológiai toxicitáson alapuló hatástanulmányok és kockázatbecslések eredményes elkészítéséhez, valamint a kárelhárítás megfelelő és ésszerű lebonyolításához elengedhetetlen, hogy megismerjük a szennyezés fizikai és kémiai tulajdonságait, valamint a szennyező anyagok emberre gyakorolt egészségkárosító és ökotoxikológiai hatásait [1]. Így egyre nagyobb hangsúlyt kell fektetni a gyors, pontos és megbízható környezetanalitikai vizsgálati módszerek kidolgozására, fejlesztésére. Különösen fontos, hogy a kidolgozott analitikai módszerek 3

eleget tegyenek a zöld kémia alapelveinek. Tehát a környezetre ártalmas vegyi anyagok és laboratóriumi műveletek számát jelentősen csökkenteni kell, vagy megpróbálni ezek kiváltását más, környezetbarát technológiákkal. Tudományos

diákköri

munkám

során

ezen

elvek

figyelembevételével

fejlesztettem egy olyan elválasztástechnikai módszert, mely lehetővé teszi a gázolajmintákban található policiklusos aromás szénhidrogén és biomarker vegyületek gyors és hatékony gázkromatográfiával csatolt tömegspektrometriás elemzését. S amellett, hogy e módszer teljesen automatizált, igen kicsi az oldószerigénye is, eleget téve ezzel a zöld (analitikai) kémia számos kritériumának.

4

2. Szakirodalmi áttekintés 2.1. Gázkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria A gázkromatográfia (Gas Chromatography, GC) az elválasztástechnikai módszerek azon részét képezi, mely lehetővé teszi a bomlás nélkül gőz, illetve gáz halmazállapotúvá alakítható vagy származékképzéssel hőstabillá tehető illékony vegyületek elválasztását [2]. Analitikai célokra manapság a legelterjedtebben az elúciós technikát alkalmazzák. Ennek alapja, hogy a megfelelő szorbenst tartalmazó állófázison inert, nem adszorbeálódó, megfelelő tisztaságú eluenst (gázt) áramoltatunk állandó áramlási sebességgel. Az eluensáramba juttatjuk be impulzusszerűen a minta kis mennyiségét, mely lamináris áramként1 a mintát dugószerűen magával viszi az állófázisra. E fázison a minta komponensei retenciójuknak megfelelően elválnak. A folyamat hajtóereje a termodinamikai egyensúlytól való eltérés, vagyis a különböző fázisok

kémiai

potenciáljainak

kiegyenlítetlensége.

A

kolonnáról

eluálódó

komponenseket detektorok érzékelik, s számítógépes feldolgozást követően megkapjuk a kromatogramot. Ez egy olyan differenciális eloszlásfüggvény, mely az egyes alkotókat reprezentáló elúciós csúcsok intenzitását mutatja az idő függvényében [3]. Így a kromatogram magában hordozza a két legalapvetőbb analitikai – kvalitatív és kvantitatív – információt. A gázkromatográf által az oszlopon elválasztott komponensek kvalitatív és kvantitatív azonosítására számos detektor áll rendelkezésünkre: hővezetőképességi detektor, lángionizációs detektor, elektronbefogási detektor, tömegspektrométer stb. A petrolkémiai kutatásokban igen elterjedten használják a lángionizációs detektorokat, emellett jelentős teret hódított a tömegspektrométer (Mass Spectrometer, MS) is az elmúlt évtizedekben.

A tömegspektrométerek ionforrásból, ionoptikai rendszerből,

analizátorból, detektorból és jelerősítő, adatfeldolgozó rendszerből állnak. Lényegében a tömegspektrométerek tömeg/töltés arányuk alapján választják szét az ionizált molekulákat és fragmenseiket.

1

Az eluensáram lamináris (réteges), amennyiben az R dimenzió nélküli, a v áramlási

sebességtől, az áramlási cső r keresztmetszetétől, az áramló közeg ρ sűrűségétől és az η dinamikai viszkozitástól függő Reynolds-szám egy kritikus érték (R ~ 1200) alatti. 5

A mérés legfontosabb részfolyamatai: (1) a

gázkromatográfiás

oszlopról

érkező

komponens

ionizációja

és

fragmentációja, (2) a keletkezett ionok, fragmensek m/z arányuknak megfelelő szétválasztása, (3) detektálás (4) adatfeldolgozás. A

petrolkémiai

kutatásokban

leggyakrabban

alkalmazott

kvadrupol

MS-eket

használhatjuk pásztázó (ún. SCAN) és szelektív ionkövetési (ún. Selected Ion Monitoring, SIM) adatgyűjtési üzemmódokban. Pásztázó üzemmódban egy előre meghatározott tömegtartományt pásztáz folyamatosan a készülék. SIM módban viszont ismernünk kell a vegyületek retenciós idejét és karakterisztikus ionjaikat, ezen információkhoz különböző spektrumkönyvtárakból vagy SCAN mérési eredményekből juthatunk. A SIM módszer előnye, hogy mintegy 1-1,5 nagyságrenddel kisebb kimutatási határok érhetők el, mivel kisebb lesz a mérési zaj.

6

2.2. A gázkromatográfiás elemzések során alkalmazott mintabeviteli technikák A mintabevitel a gázkromatográfiás elválasztás egyik legkritikusabb műveletét jelenti. Ennek egyik oka, hogy folyadékos injektálás esetén a mintát a fűtött injektorba juttatjuk, ahol biztosítani kell a minta pillanatszerű és kvantitatív elpárologtatását. Az injektálás során fontos, hogy minél inkább csak a célkomponensek kerüljenek az oszlopra torzításmentesen, vagyis a mintában lévő arányuknak megfelelően [2]. Manapság egy-egy gázkromatográfiás módszerfejlesztésnél nagy hangsúlyt kell fektetni az injektor és az injektálási paraméterek optimális beállítására. Az alábbiakban ismertetném az általam alkalmazott mintabeviteli eljárásokat.

2.2.1. A split/splitless injektálás Az ún. split injektálás (2. ábra) során az injektor hőmérsékletén gőzállapotba kerülő mintának töredéke jut csak az oszlopra, míg a legnagyobb része lefúvatásra kerül. A kolonnára jutó minta mennyiségét a vivőgáz áramlási sebessége és a split ágon szabályozott áramlási sebesség hányadosa határozza meg, amit splitaránynak nevezünk [2]. Ennek a módszernek a legfőbb hátránya a minta alkotói közötti diszkrimináció, ami azt jelenti, hogy az injektált minta elpárolgása során a minta első részlete az illékonyabb alkotókban dúsul fel, így ezek nagyobb része távozik a split ágon [3]. Tehát a kolonnára kevesebb illékonyabb komponens kerül, mint kevésbé illékony, vagyis az eredeti mintában található alkotók aránya jelentősen megváltozik. A technika további korlátja, hogy csak a megfelelően tömény minták vizsgálatára alkalmas, így nyomelemzéseknél nem vagy csak nagyon korlátozottan alkalmazható. A környezetanalitikai vizsgálatok során számos esetben csak nyomnyi mennyiségben megtalálható szennyezőket vizsgálunk. Ekkor nem alkalmazhatunk split injektálást, hiszen a mintaáram-elosztás miatt elveszítenénk a célkomponensek nagy részét. Így az ún. splitless injektálási technikát kell használnunk. Ennek lényege, hogy a megfelelő térfogatú mintát beinjektáljuk a fűtött injektorba, ahol az elpárolog. Eközben a split szelep zárva van, ezáltal a vivőgáz az elpárologtatott minta teljes részét az oszlopra juttatja. A splitless idő leteltével a split ág nyit, és az injektor gőztere lefúvatásra kerül. A splitless idő az az idő, mely eltelik a minta injektorba juttatása és a split ág nyitása között [3]. Splitless injektálásnál a minta kolonnára juttatása egyáltalán nem

impulzusszerű.

Az

ebből

adódó 7

csúcskiszélesedést

elkerülhetjük

az

oszlopfókuszálás alkalmazásával. Ekkor a gázkromatográf termosztátjának – s egyben az oszlopnak – a kiindulási hőmérsékletét is úgy állítjuk be, hogy a minta legalacsonyabb forráspontú komponensének (általában az oldószer) forráspontjánál mintegy 20 °C-kal alacsonyabb legyen [2, 3]. Az elpárologtatott minta komponensei így kondenzálnak, és egyben fókuszálódnak is a kolonna elején. A gázkromatográf hőmérsékletprogramjának elindulása és az oldószer elpárologtatása után megfelelően keskeny dugó képződik az oszlop elején.

2. ábra. A split/splitless injektor felépítése [4].

8

2.2.2. A nagytérfogatú injektálás és a programozott hőmérsékletű injektor A hagyományos split vagy splitless injektálási technikák csak néhány mikroliternyi minta elpárologtatását és oszlopra juttatását teszik lehetővé. Ez jelentősen korlátozza az ezen technikákkal elérhető kimutatási határt. Így a minta előzetes koncentrálására

van

szükség

(például

nitrogénáramú

bepárlás,

rotációs

vákuumbepárlás), azonban ezek a módszerek igen költségesek és időigényesek, másrészt könnyen veszíthetünk el célkomponenseket. Amennyiben lehetőségünk lenne számottevően nagyobb térfogatok injektálására, alacsonyabb kimutatási határt érhetnénk el, és egyszerűsíthetnénk a minta-előkészítést. 1979-ben Wolfgang Vogt és munkatársai írták le először 250 µl minta 1-10 µl/s sebességgel történő injektálását programozott hőmérsékletű injektorral kapilláris oszlopra [5]. Vogt kísérletei után elindultak a nagytérfogatú injektálással kapcsolatos kutatások, melyeknek köszönhetően új technikák láttak napvilágot, mint például a nagytérfogatú

on-column

injektálás.

A

nagytérfogatú

injektálás

sikeres

megvalósításához szükség van a programozott hőmérsékletű injektorra (Programmed Temperature Vaporiser, PTV), amit már Vogt és munkatársai is felismertek. Ők egy split/splitless injektort szereltek fel elektronikus hőmérsékletszabályozó rendszerrel. A ma használt PTV injektorokhoz hasonló felépítésű injektort Poy 1981-ben fejlesztett ki Vogt munkái alapján. A

napjainkban

használatos

programozott

hőmérsékletű

injektorok

a

hagyományos split/splitless injektorokhoz képest alapvetően abban különböznek, hogy programozottan hűthetők és fűthetők. Másrészt a hagyományos injektorokhoz képest jóval kisebb a bennük lévő injektorbetét belső átmérője. Így a minél kisebb hőkapacitásra való törekvés következtében az injektor sokkal gyorsabban fűthető és hűthető [6]. A PTV injektorok számos üzemmódban (cold split/splitless, hot split/splitless, on-column, solvent split, solvent vent) működtethetők. Ezek közül tudományos diákköri dolgozatomban az általam használt oldószer-lefúvatás (solvent vent) üzemmódot ismertetem. Ennek során lényegében az történik, hogy a mintát folyamatosan, meghatározott sebességgel juttatjuk a kezdetben hideg PTV injektorba, ahol ez idő alatt folyamatosan fúvatjuk le a split ágon keresztül az oldószert vagy

9

oldószerelegyet. A PTV injektorok esetén beállítható egy ún. stop flow2 módszer, így minimalizálni lehet az oszlopra feleslegesen kerülő oldószer mennyiségét [6, 7]. Miután a mintát beinjektáltuk, a tű visszahúzódik, s elindul az injektor hőmérsékletprogramja. Kezdetben még a split szelep nyitva van, hogy a maradék oldószer nagyobb része is eltávozzon a rendszerből, majd bezárul, ezt követően az injektor felfűt, a minta komponensei elpárolognak. Ezután következik a minta kolonnára juttatása. Az oszlop hőmérsékletét mintegy 20 °C-kal kisebbre állítjuk be, mint a minta legillékonyabb komponensének forráspontja, így a komponensek az oszlop elején kondenzálnak és fókuszálódnak. A splitless idő elteltével nyit a split szelep, s az injektorbetétben maradt esetleges szennyező anyagokat a vivőgázzal lefúvatjuk [6, 7, 8]. Tehát az oldószerlefúvatás tulajdonképpen splitless injektálással zárul. Miután kialakult a megfelelően keskeny dugó az oszlop elején, elindul a termosztát hőmérsékletprogramja, s ezzel kezdetét veszi a kromatográfiás analízis. Az injektor programjának végén annak fűtése megszűnik, s miután az oszloptér visszahűlt a kiindulási hőmérsékletre, akkor az injektor hűtőrendszere bekapcsol, s beállítja a kezdeti – injektálási – hőmérsékletet. A módszer lényegét a 3. ábrán foglaltam össze.

3. ábra. Nagytérfogatú injektálás programozott hőmérsékletű injektorral oldószer-lefúvatás üzemmódban. 2

Stop flow üzemmódban a fejnyomás elvileg zérus, gyakorlatilag megegyezik az oldószer-

lefúvatás során alkalmazott fejnyomás a légköri nyomással, így az oszlop irányába a vivőgáz áramlási sebessége minimális. 10

2.2.3. Kétlépcsős oldószer-lefúvatás Az előző alfejezetben ismertetett oldószer-lefúvatás üzemmód hátránya, hogy az olyan illékonyabb komponensek, melyek forráspontja kevesebb, mint 150 °C-kal magasabb az oldószer forráspontjánál, részlegesen lefúvatásra kerülnek a split ágon keresztül. E probléma megoldására SZEKERES 2007-ben kifejlesztette a kétlépcsős oldószer-lefúvatás módszerét [6]. Kutatásai során megállapította, hogy az illékony komponensek

hatékonyabban

visszatarthatók,

ha

az

oldószernek

nem

teljes

mennyiségét, de jelentős részét lefúvatjuk a split ágon. A visszamaradó oldószert pedig az oszlopon át fúvatjuk le. Mivel a kolonna felé csak kis áramlási sebességet biztosíthatunk a hatékony lefúvatás érdekében az oldószer egyensúlyi gőznyomását meg kell emelni. Ehhez a PTV injektor hőmérsékletprogramjában egy hőmérsékleti lépcső beállítása szükséges. A technika alkalmazásával a kolonna felé történő lefúvatás során az illékony összetevők fókuszálódnak az oldószerrel duzzasztott állófázison. Ezáltal a veszteség

vagy

diszkrimináció

lecsökkenthető.

A

kétlépcsős

hőmérsékletprogramja a 4. ábrán látható.

4. ábra. A kétlépcsős oldószer-lefúvatás hőmérsékletprogramja [6].

11

lefúvatás

2.3. Minta-előkészítési módszerek Manapság az analitikusok számos minta-előkészítési eljárás közül választhatják ki az adott mintához és feladathoz alkalmas módszert. A leghatékonyabb metodika kiszűrésében nagy szerepet játszik, hogy milyen mintáról van szó; mik a célkomponensek, amelyeket szeretnénk elválasztani a mátrix vegyületektől; milyen fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek a célkomponensek és a mátrix összetevői.

2.3.1. Szilárd fázisú extrakció Egy minta célkomponensei szilárd fázison történő extrakcióval (Solid Phase Extraction, SPE) is elválaszthatók a mátrixtól és részben egymástól. A szilárd fázisú extrakció során az alábbi lépéseket hatjuk végre: (1) A töltet kondicionálása, amikor a szorbenst előkészítjük a minta fogadására. A töltet ekvilibrálása, melynek célja az egyensúly beállítása a szorbensen. (2) A minta felvitele a szorbensre, melyen az alkotók retenciójuknak megfelelően elválnak. (3) Az oszlop mosása, melynek során az oszlopon gyengébben kötődő szennyezőket és a mátrix nem kötődő komponenseit eltávolítjuk. (4) Szárítás. (5) Elúció. A célkomponensek szelektív leoldása a szorbensről [8,9]. Az SPE tulajdonképpen egy oszlopkromatográfiás elválasztási technika, mellyel általánosan három célt tudunk megvalósítani: a meghatározandó komponensek koncentrálását, a zavaró komponensek elkülönítését, valamint az oldószercserét. Ezek valójában a szilárd fázisú extrakció előnyei. Legfőbb hátránya, hogy automatizálása igen költséges és nehezen kivitelezhető, másrészt a kereskedelmi forgalomban kapható SPE-patronok többsége csak egyszer használható [7].

5. ábra. A szilárd fázisú extrakció folyamatábrája [10].

12

2.3.2. MEPS®: Microextraction by Packed Sorbent módszer A MEPS® minta-előkészítési eljárást Mohamed Abdel-Rehim és munkatársai dolgozták

ki

2004-ben

humán

vérplazmából

helyi

érzéstelenítők

gáz-

és

folyadékkromatográfiás meghatározására [11, 12, 13]. A MEPS® valójában a szilárd fázisú extrakció miniatürizált változata. A módszerhez szükséges eszköz felépítését a 6. ábra mutatja. Közvetlenül a tűben helyezkedik

el

a

szorbens,

mely

csatlakoztatható egy 100-250 µl térfogatú fecskendőhöz. Amikor a mintát átpumpáljuk a

tölteten,

akkor

a

célkomponensek

adszorbeálódnak a szorbensen. Ezután a tölteten

megkötődött

szennyező

komponenseket lemossuk a töltetről, majd a célkomponenseket közvetlenül eluálhatjuk a gáz6. ábra. A MEPS® felépítése. [7]

vagy

folyadékkromatográfiás

rendszerbe [12, 13]. A MEPS®-szel történő extrakció

hatásfokát

növelhetjük,

ha

többször pumpáljuk át a tölteten a mintát. A módszer előnye, hogy kiválóan automatizálható automata mintaadagoló segítségével. A töltet akár többször is felhasználható. Igen kicsi az oldószerigénye, viszonylag olcsó és környezetbarát is.

7. ábra. A MEPS® minta-előkészítés.

13

2.4. A szénhidrogén-szennyezések analitikája A szénhidrogén-szennyezések analitikájának sarkalatos pontja, hogy a komponensek szelektív azonosítása és koncentrációjuk meghatározása rendkívül nehezen megvalósítható az alkotók nagy száma miatt. Ezért egy adott szennyezés analízise előtt el kell dönteni, hogy a környezetbe kikerült szénhidrogén-származékok együttes mennyiségének vagy a szennyezők közül csak bizonyos komponensek, illetve komponenscsoportok meghatározása a cél. A szénhidrogének együttes meghatározására manapság elterjedten alkalmazzák az összes ásványiolaj-eredetű szénhidrogén-tartalom (Total Petroleum Hydrocarbons, TPH) gázkromatográfiás mérését. A TPH-mérés tovább bontható az extrahálható (Extractable Petroleum Hydrocarbons, EPH) és az illékony ásványiolaj-eredetű szénhidrogének (Volatile Petroleum

Hydrocarbons, VPH) mérésére

[14].

E

vizsgálatokhoz általában gázkromatográfiával kapcsolt lángionizációs detektort (Gas Chromatography – Flame Ionization Detector, GC-FID) vagy mobilanalitikai vizsgálatok esetén az ún. szelektív oxidimetriás módszert alkalmazzák, mely eljárás nemvizes közegben végzett oxidimetriás titráláson alapul [15]. Ezen kívül még alkalmaznak gravimetriás módszert is, melynek lényege, hogy a szénhidrogénszármazékkal szennyezett mintát megfelelő oldószerrel extrahálják, majd az oldószert elpárologtatják, s a visszamaradt olaj tömegét mérik [16]. A szénhidrogén-szennyezések analízisének másik útja az egyes komponensek vagy komponens csoportok elemzése. A célkomponensek lehetnek bizonyos indikátorvegyületek, amelyek például a szennyezés eredete vagy biodegradációja, fotooxidációja szempontjából specifikusak. A szénhidrogén-származékok adott összetevőinek

meghatározására

legelterjedtebben

használt

módszereket

a

következőkben foglalnám össze. Az UV és fluoreszcens spektrofotometriával főként a policiklusos aromás vegyületek mérhetők, hiszen az UV-tartományban igen jelentős moláris abszorpciós koefficiensük van, s e tartományban gerjeszthető és magasabb, rájuk jellemző, sajátos hullámhosszúságon emittálnak fényt. Hátránya abban áll, hogy csak az aromás gyűrűket tartalmazó szénhidrogénekre érzékeny, emellett felmerülnek kalibrációs nehézségek, s nincs általános referencia olaj [15]. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás technikákat szénhidrogén-szennyezések analízisénél elsősorban csoportelválasztásra (például az aromások gyűrű tagszáma szerinti elválasztásokra) használják [15]. Ugyanakkor napjaink szénhidrogén analitikájában a legnagyobb 14

szerepet a gázkromatográfiás technikák játsszák, köztük is elsősorban a GC-FID és a GC-MS

módszerek.

gázkromatográfiás

Bár

(Two

egyre

nagyobb

Dimensional

teret

Gas

hódítanak

a

Chromatography,

többdimenziós GC×GC)

és

gázkromatográfiával kapcsolt stabil izotóparány-mérő tömegspetrometriás (Gas Chromatography – Isotope Ratio Mass Spectrometry, GC-IRMS) eljárások is [17, 18, 19]. Egy

ismeretlen

eredetű

szénhidrogén-szennyezés

esetén

például

gázkromatográfiás áttekintő vizsgálatok elvégzésével a kapott kromatogramot a szennyezés „ujjlenyomataként” felfogva lehetőség nyílik a szénhidrogén-szennyezés típusának, eredetének és öregedési mértékének megállapítására. Ezt a technikát nevezzük kémiai ujjlenyomatok módszerének [17].

8. ábra. A szénhidrogén-szennyezések analízisének főbb lehetőségei.

15

2.4.1. A kémiai ujjlenyomat módszer alkalmazása a petrolkémiai kutatásokban A kiömlő nyersolaj és más szénhidrogén-származékok kémiai ujjlenyomat módszerrel történő azonosítása az 1970-es években kezdődött. S az elmúlt 43 évben jelentősen kibontakozott – köszönhetően az újabb analitikai, valamint statisztikai módszereknek, és sajnos nem utolsó sorban a szénhidrogén-szennyezések fokozott elterjedésének. Ahhoz, hogy a kémiai ujjlenyomatok módszerét alkalmazni tudjuk a szénhidrogén-szennyezések típusának, eredetének és korának feltérképezésében szükségünk van azon faktorok ismeretére, melyek együttesen járulnak hozzá a kőolajszármazékok kémiai jellemzőinek alakulásához a természeti környezetben. Ezen faktorokat a 9. ábrán foglaltam össze [17].

9. ábra. Négy faktor, amely hatással van a petrolkémiai szennyezés kémiai ujjlenyomatára [17].

A petrolkémiai ujjlenyomat-elemzés hajnalán a gázkromatográfiás módszerek az U.S. EPA szabványok által javasolt mérési eljárásokon alapultak. Az U.S. EPA 8015B szabvány a nem halogénezett szénhidrogének GC-FID, míg a 8270C. jelű a közepesen illékony szerves komponensek (Semi-Volatile Organic Compounds, SVOC) GC-MS analízisével foglalkoztak. Azonban az EPA által előírt illékony és közepesen illékony szerves vegyületek közül csak húszat analizálnak szénhidrogén-szennyezés esetén. S ezen összetevőknek jó közelítéssel csak a fele található meg szignifikáns koncentrációban a kőolaj-származékokban. Másrészt az ujjlenyomat technikáknál problémát okoz, hogy e vegyületek nem specifikusak a szennyezés eredetére és környezetbe kerülésének idejére.

16

E hiányosságok és problémák kiküszöbölésére új és a szénhidrogénszennyezésekre specifikusan alkalmazható mérési utasításokat, szabványokat kellett kidolgozni. Ilyenek az ASTM3 és a Nordtest Project keretében íródott protokolok. A Nordtest Project – mely magában foglalja az ASTM módszereit is – keretében egy komplex analitikai rendszert dolgoztak ki a kiömlő nyersolaj és más szénhidrogénszennyezések eredetének és korának meghatározására [20, 21, 22]. A rendszerben az első lépést a begyűjtött minták előkészítése és tisztítása jelenti, ezt követi a szennyezés környezetbeli degradációjának vizsgálata GC-FID módszerrel. Majd különböző indikátorkomponensek GC-MS analízisével meghatározzák a szennyezés eredetét. A protokol részletes folyamatábrája az alábbiakban látható. Ismeretlen eredetű szennyezés és a gyanúsított forrásból származó minták

A minta előkészítése és tisztítása

1. szint

GC-FID

Kromatogram és az n-alkánok eloszlása különböző?

Igen

A különbséget a környezeti degradáció okozhatja

Nem

Igen

2. szint

GC-MS

Környezeti degradáció ellenőrzése (az n-alkánok eloszlása)

Biomarker és PAH összetétel különböző?

3. szint

Konklúzió

Igen

A különbséget a környezeti degradáció vagy a minta inhomogenitása okozhatja

Nem

Igen Kiértékelés a diagnosztikai hányadosok alapján

Igen

Környezeti degradáció ellenőrzése (a PAH-ok eloszlása)

A diagnosztikai hányadosok összemérhetők? Részben

Igen Egyezés

Lehetséges egyezés

? Nem eldönthető

Nem Nincs egyezés

Nem

10. ábra. A Nordtest protokol részletes folyamatábrája. [22]

A különböző eredetű petrolkémiai termékek megkülönböztetésére vagy a szénhidrogén-szennyezések eredetének és öregedési mértékének meghatározására napjainkban az ún. CEN metodikát alkalmazzák [23, 24]. E rendszer a Nordtest protolkoljaiból fejlődött ki [20, 21]. A módszer azt veszi alapul, hogy az eltérő eredetű szénhidrogén-szennyezőknek vagy petrolkémiai termékeknek különböző a biomarker és

3

ASTM: American Society for Testing and Materials 17

az alkil-PAH összetétele. A CEN metodika útmutatást ad egészen a mintavételtől, mintakezeléstől az analitikai módszereken át az eredmények kiértékeléséig. Az analízis első lépése az előkészített minták GC-FID mérései módszerrel történő elemzése. A felvett GC-FID kromatogramok lehetővé teszik bizonyos diagnosztikus hányadosok kalkulálását (n-C17/prisztán, n-C18/fitán, prisztán/fitán) [22]. Ezek információt adnak a vizsgált szénhidrogén-származék vagy -szennyezés biodegradációjának mértékéről. További megerősítő vizsgálatok és az eredetmeghatározás céljából GC-MS-SIM méréseket is végeznek, melyek során a megfelelő biomarker és az alkil-PAH vegyületek arányaiból képzett diagnosztikus hányadosokat alkalmazzák a fenti célokra. A kémiai vizsgálatokat követően a meghatározott diagnosztikus hányadosokat főkomponens analízisnek (Principal Component Analysis, PCA) alávetve kapják az eredetvizsgálat végső eredményét.

18

2.4.2. A petróleum biomarkerek és a policiklusos aromás szénhidrogének jelentősége a kémiai ujjlenyomat módszerekben

Szénhidrogén-szennyezés esetén felmerül a kérdés, hogy az adott komplex környezeti mintából milyen komponenseket határozzunk meg, amelyek majd elvezetik a hatóságokat a szennyezés forrásának és környezetbe kerülésének becsült időpontjához, valamint a megfelelő kárelhárítási tervek kidolgozásához, s a környezeti rendszer rekultiválásához. Olajömlések és más petrolkémiai forrásból származó szennyezők esetén az eredet és a kor meghatározására leggyakrabban a policiklusos aromás szénhidrogéneket

és

a

petróleum

biomarkereket

használják,

mint

„kémiai

ujjlenyomatokat”. Felmerül a kérdés, miért éppen ezek azok a vegyületek, amelyek alkalmasak lehetnek

a

fent

kitűzött

célokra.

A

választ

a

petróleum

biomarkerek

molekulaszerkezetükben hordozzák. Ezek egyfajta kémiai indikátorok, amiktől azt várjuk, hogy a vizsgálatokból nyert információk alapján megtudjuk, honnan származott az adott petrolkémiai termék, ami az adott szennyezést okozta. Évmilliók történetét magukban hordozó, ún. molekula fosszíliák, melyek igen összetett molekulaszerkezettel rendelkeznek [17, 25]. Legkiemelkedőbb tulajdonságuk a biodegradációval szembeni jelentős mértékű rezisztenciájuk, ami lehetővé teszi, hogy így váljanak a kőolajszármazékok által okozott környezeti szennyezések korának és eredetének indikátoraivá. Többségük a Földön elsőként élt élőlények lipidjeiből származik [25]. Ennek ellenére biomarker vegyületek ma is képződnek a természetben, elsősorban fotoés kemoszintetikus folyamatok során melléktermékként, valamint heterotróf mikrobák által. Ilyenek például a metanogén baktériumok, amik főként metánt állítanak elő primer szerves anyagokból, de emellett sokkal változatosabb szerkezetű szkvalánt is termelnek [25]. Jellemző petróleum biomarkerek a szeszkvi-, di- és triterpánok, szteránok és aromás

szteránok,

valamint

az

adamantánok

és

diadamantánok.

Néhány

gázolajmintában előforduló, s arra jellemző biológiai markervegyületet mutat be a 11. ábra.

19

11. ábra. Néhány - gázolajmintában előforduló - petróleum biomarker.

A biomarker vegyületek kvalitatív azonosításán alapuló kémiai ujjlenyomat módszerek rendkívül megbízható eredményeket nyújtanak. Azonban hátrányuk, hogy már a nyersolajban is igen kicsi a biomarkerek koncentrációja (µg/ml-es nagyságrendű). A problémát csak fokozza, hogy a finomított petrolkémiai termékekben még sokkal kisebb mennyiségben vannak jelen, megnehezítve ezzel az azonosításukat. Így e vegyületek elemzése során igen komplex minta-előkészítésre van szükség, ami sokszor nem veszi figyelembe a zöld kémia és a környezettudatosság elveit. Az elmúlt mintegy 50 évben számos tudományos cikk íródott, amelyek beszámolnak arról, hogy egy-egy olajömlés során miként azonosították víz- és talajmintákból az adott nyersolaj eredetét és környezetbe kerülésének idejét. E publikációkban alkalmazott minta-előkészítési módszerek többsége közös abban, hogy a gyűjtött környezeti mintáktól először elválasztották az analizálandó szennyezőanyagot. Erre több eljárás is létezik, azonban a szabványok többsége vízminták esetén még mindig az n-hexánnal vagy diklórmetánnal végzett folyadék-folyadék extrakciót, míg talajminták esetén a Soxhlet-extrakciót írja elő. Ezután a kapott extraktumot szilárd fázisú extrakciós eljárással tisztítják, majd különböző oldószerek, oldószerelegyek segítségével alifás, policiklusos aromás, fenol és biomarker vegyületeket tartalmazó frakciókat gyűjtenek. Ezeket aztán TLC-FID4, GC-FID vagy GC-MS analízisnek vetik alá [17, 22, 26, 27]. Az e területen írt publikációk többsége a szilárd fázisú extrakció során alkalmazott töltetek és eluensek anyagi minőségében és felhasznált mennyiségében különböztek, valamint a műszeres analízis módszerében. Az 1970-es években írt cikkekben

4

inkább

alumínium-

és

magnézium-oxidot

alkalmaztak

töltetként,

TLC-FID: Thin-Layer Chromatography – Flame Ionization Detector, vagyis lángionizációs

detektálással kapcsolt vékonyréteg kromatográfia 20

eluálószerként pedig petrolétert és n-hexán – dietil-éter vagy n-hexán – benzol elegyét. A XX. század végén írt cikkekben napjainkig töltetként a szilikagélt, eluensként pedig n-hexán vagy n-pentán és n-hexán – benzol vagy n-hexán – aceton 1:1 vagy 2:3 térfogatarányú elegyét ajánlják. Előbbi frakcióban az alifás szénhidrogének és számos biomarker vegyület, míg utóbbiban a policiklusos aromás szénhidrogének alkilszármazékai dúsulnak fel. Egyes publikációk egy metanolos frakcióról is írnak, melyben a fenolok dúsulnak [17, 28, 29, 30].

21

3. Célkitűzés Kutatócsoportunk célul tűzte ki a szénhidrogén-szennyezések különböző gázkromatográfiás módszerekkel (például GC-FID, GC-MS, GC×GC) történő komplex elemzését. E munka lényege, hogy megállapítsuk ezen szennyezők kémiai összetételét, környezetben történő degradációjuknak idejét és mértékét, valamint a szennyezések eredetét kémiai ujjlenyomat módszerrel. Azonban ahhoz, hogy megismerjük és megértsük a természeti környezetben való viselkedésüket, öregedési folyamataik mértékét és az emittált szennyezők eredetét, szükség van a petrolkémiai termékek (például gázolaj, benzin) kémiai összetételének elemzésére. E cél megvalósítását jelentősen megnehezíti a minta összetettsége, hiszen akár 300-500 komponenst is tartalmazhat. Továbbá a kibocsátott szénhidrogén-szennyezés időbeli változása, amit például az alkotók különböző mértékű biodegradálódása és fotooxidációja okoz. Ma már tudjuk, hogy a szennyezés környezetbe kerülési idejének és eredetének megállapításához olyan komponensek analízisét kell elvégezni, melyek rezisztensek a degradációs folyamatokkal szemben. Ilyenek a petróleum biomarkerek és a policiklusos aromás szénhidrogének. Tudományos diákköri munkám célja tehát gázolajminták GC-MS vizsgálatában alkalmazott hagyományos szilárd fázisú extrakciós eljárás automatizált változatának fejlesztése, mely lehetővé teszi a petróleum biomarkerek és policiklusos aromás szénhidrogének elválasztását a mintákból. Továbbá célom, hogy a frakciók hagyományos nitrogénáramban történő bepárlását, majd a hagyományos split/splitless injektálással egybekötött GC-MS-sel végzett analízist nagytérfogatú injektálással váltsam ki. Az általam kidolgozott módszertől elvárom, hogy segítségével a mintaelőkészítés ideje és oldószerigénye jelentősen lecsökkenjen, eleget téve ezzel a zöld (analitikai) kémia elveinek. Emellett célom a nagytérfogatú injektálással történő koncentrálás

segítségével

a

nitrogénáramban

reprodukálhatóság elérése.

22

történő

bepárlásnál

jobb

4. Kísérletek és vizsgálatok 4.1. Felhasznált vegyszerek és eszközök Kutatásaim során Agilent 6890 típusú gázkromatográfot és a hozzá kapcsolt Agilent 5973 tömegszelektív detektort használtam. (12. ábra) A nagytérfogatú injektálás során Peltier-hűtőrendszerrel ellátott Gerstel CIS 4 injektort alkalmaztam hideg splitless5 és kétlépcsős oldószer-lefúvatási üzemmódban. A gázkromatográf CTC Combi PAL automata mintaadagoló rendszerrel volt felszerelve. A mérések során 30 m hosszúságú, 0,25 mm belső átmérőjű és 0,25 µm filmvastagságú Agilent DB-5 MS ultrainert kapilláris oszlopot használtam, melyben az állófázis (5%)-fenil-(95%)poli(dimetil-sziloxán) volt. Vivőgázként 5.0-ás tisztaságú héliumot alkalmaztam 1,0 ml/perc áramlási sebességgel. A gázkromatográfiás hőmérsékletprogram 50 °C-ról indult (ezt 6,16 percig fenntartva), majd 10 °C/perc felfűtési sebességgel 310 °C-ig emelkedett, végül e véghőmérsékletet 10 percig tartva végződött. A tömegszelektív detektort 45 – 550 AMU6 tartományban pásztázó (SCAN) és szelektív ionkövetési (SIM) üzemmódban használtam. Ionforrásként elektronütközéses ionizációt (Electron Impact Ionization, EI), analizátorként pedig kvadrupol tömegszűrőt alkalmaztam.

12. ábra. Az Agilent 6890 gázkromatográf az Agilent 5973 tömegszelektív detektorral és a CTC Combi PAL rendszerrel.

5

A hideg splitless üzemmód elvét tekintve megegyezik a 2.2.1. fejezetben ismertetett splitless

technika elvével, a különbség annyi, hogy az injektálás alatt a PTV injektor hőmérséklete alacsony (50 °C alatti). 6

AMU (Atomic Mass Unit): atomi tömegegység 23

A minta-előkészítési módszer fejlesztéséhez, valamint a szilárd fázisú extrakció hatékonyságának

vizsgálatához

2-etilnaftalin,

n-hexakozán

és

n-tetrakontán

bemérésével készült n-hexános oldatot használtam. A minta-előkészítés alkalmával ISOLUTE 3 g-os, 5 g-os és 200 mg-os szilikagél töltetű SPE-patronokkal dolgoztam. A különböző oldatok elkészítéséhez és a különböző frakciók eluciójához nagy tisztaságú, gázkromatográfiás célokra ajánlott n-hexánt, diklórmetánt, acetont és etil-acetátot használtam, melyek a Merck Kft-től származtak. A 100 µl térfogatú MEPS® fecskendő és a szilikagél töltet az SGE Analytical Science gyártmányai voltak. Az n-hexán – diklórmetán oldószereleggyel készült oldatok nagytérfogatú injektálási paramétereinek optimálására alkalmazott n-alkán mixet a tiszta anyagok megfelelő arányú hígításával készítettem. Az n-alkán mix a következő komponenseket tartalmazta: n-nonán, n-dekán, n-undekán, n-dodekán, n-tetradekán, n-pentadekán, nhexadekán, n-heptadekán, n-oktadekán, n-tetrakozán és n-hexakozán.

24

4.1.1. A CTC Combi PAL mintaadagoló rendszer

A napjainkban alkalmazott gáz- és folyadékkromatográfiás rendszerekben automata mintaadagolókkal juttatják az analizálandó mintát az injektorba, hiszen e mintaadagolók nagyobb bemérési pontosságot és jobb reprodukálhatóságot tesznek lehetővé, mint a manuális mintabevitel. Emellett e rendszerek segítségével különböző minta-előkészítési eljárások is megvalósíthatók (például MEPS®, statikus és dinamikus gőztéranalízis, szilárd fázisú mikroextrakció). Ilyen intelligens mintaadagoló a CTC Combi PAL is. A rendszer legfontosabb egysége a vezető sínpályára merőlegesen álló, mozgatható robotkar. Ebbe beépítve kapott helyet a fecskendő és annak adaptere, valamint a fecskendő dugattyújának programozott mozgatására képes elektronika. Az alapfelszereltségéhez tartoznak a tűmosó folyadékok, valamint a minták tárolására alkalmas tálcák és tartóik, továbbá egy fűthető és rázatható blokk, az agitátor. A rendszer vezérelhető a vezérlőpanel és a CTC PAL Cycle Composer szoftver segítségével is. Folyadék adagolására alkalmas fecskendő és fecskendő adapter Mozgatható robotkar

Vezérlőpanel

Mintatartó tálca

Tálcatartó

Tűmosó folyadékok

Agitátor

13. ábra. A CTC Combi PAL mintaadagoló rendszer felépítése.

25

4.2. Manuális szilárd fázisú extrakciós eljárás kőolajszármazék minták előkészítésére Vizsgálataim során ZHENDI WANG és munkatársai által kidolgozott szilárd fázisú extrakción alapuló minta-előkészítési módszert vettem alapul [17]. Azért e módszert választottam, mert ez hatékonyan alkalmazható petrolkémiai termékek mintaelőkészítésére is, míg a többi eljárás nyersolajra és kenőolajokra íródott. E mintaelőkészítési módszer lényege, hogy 0,4 g olajmintát kell feloldani n-hexánban, majd térfogatát 5 ml-re kiegészíteni. Ennek 200 µl térfogatát 3 g szilikagéllel töltött SPEpatronra viszik fel, melyet előzőleg 20 ml n-hexánnal kondicionáltak. Ezt követően 12 ml n-hexánnal eluálják az alifás szénhidrogéneket és biológiai markervegyületeket, majd 20 ml n-hexán – diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyével a policiklusos aromás szénhidrogének alkilezett származékait oldják le a töltetről. A frakciókat ezután nitrogénáramban 1,0 ml-re kell bepárolni. Majd az így előkészített frakciókat GC-MS analízisnek vetik alá. Az n-hexános frakció és az n-hexán – diklórmetános frakció maradékát 1:1 térfogatarányban összeöntve GC-FID segítségével meghatározható az összes ásványiolaj-eredetű szénhidrogén-tartalom (Total Petroleum Hydrocarbon, TPH). A fent ismertetett előkészítési eljárást az alábbi ábra szemlélteti.

14. ábra. A Zhendi Wang és munkatársai által kidolgozott minta-előkészítési módszer folyamatábrája.

26

Az előbbiekben ismertetett eljárást alkalmaztam kezdetben a gázolaj minták előkészítésére. A minta-előkészítést követően az 1,0 ml-re bepárolt frakciók splitless üzemmódban kerültek injektálásra a 310 °C-os split/splitless injektorba 1,5 perces splitless idő mellett. A gázkromatográf termosztátja 50 °C (2 perc) kiindulási hőmérsékletről 10 °C/perc felfűtési sebességgel 320 °C-ig (10 perc) fűtött. Az alábbiakban (15. és 16. ábra) egy a fenti módszerrel előkészített és mért minta nhexános és n-hexán – diklórmetános totál ion kromatogramját (Total Ion Chromatogram, TIC) mutatnám be.

15. ábra. Az n-hexános frakció totál ion kromatogramja.

16. ábra. Az n-hexán - diklórmetános frakció totál ion kromatogramja.

27

E minta-előkészítési módszer előnye, hogy segítségével jól elválaszthatók egymástól a gázolajmintákban található biomarkerek és policiklusos aromás szénhidrogén vegyületek alkil-származékai. Hátránya abban rejlik, hogy az előkészítés rendkívül idő- és oldószerigényes. Így tudományos diákköri munkám során célul tűztem ki egy automatizált szilárd fázisú extrakciós eljárás kidolgozását.

28

4.3. A MEPS® alkalmazásának lehetőségei Kutatómunkám kezdetén vizsgáltam a MEPS® technika

minta-előkészítési

alkalmazásának

lehetőségeit a gázolaj-analitikában. A MEPS® a CTC Combi PAL mintaadagoló rendszerrel együtt egy automatizált

minta-előkészítési

Vizsgálataim szorbenssel

során töltött

2

mg

MEPS®

technológia.

tömegű tűt

szilikagél

használtam.

E

technikával elérhetővé válik az oldószer-felhasználás minimalizálása

és

az

előkészítési

folyamat

®

automatizálása. A MEPS -szel való kísérleteim során 17. ábra. A MEPS® tű és a CTC Combi PAL mintaadagoló.

100 µl n-hexánnal kondicionáltam a töltetet, majd 5,0 µl 20 mg/ml koncentrációjú gázolaj mintaoldatot

pumpáltam át a szorbensen. Ezt követően 50 µl n-hexánt szívattam át a tölteten, majd a Gerstel CIS 4 injektorba injektáltam. Az első frakció GC-MS analízisét követően 60 µl n-hexán – diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyével elkészítettem a második frakciót, amit ismét a Gerstel CIS 4 injektorba injektáltam. A kapott kromatogramok alapján arra a megállapításra jutottam, hogy a MEPS ® technika nem alkalmazható jól a gázolajminták PAH- és biomarker vegyületek analízisében (18. és 19. ábra). A fő problémát ugyanis a kis tömegű töltet kis kapacitása okozza. Ez abban nyilvánult meg, hogy az n-hexános frakcióban igen nagy koncentrációban voltak jelen az ún. zsírsav-metilészterek, melyeknek csak az n-hexán – diklórmetános frakcióban kellene eluálódniuk (18. és 19. ábra). Vagyis az 5 µl térfogatban felvitt 20 mg/ml koncentrációjú gázolaj mintaoldat túltelítette a töltetet. Felmerülhet a kérdés, hogy miért nem hígítottam nagyobb mértékben a mintát. Azonban a minta 100 – 1000-szeres hígításával sem érnék célt, hiszen ilyen mértékű hígítás esetén már nagyon lecsökkene a biomarkerek – amúgy is kis – koncentrációja a mintában. Tehát ilyen mértékű hígítás esetén e vegyületek koncentrációja a kimutatási határ alatt van.

29

Jelintenzitás 18. ábra. A MEPS® módszerrel előkészített gázolajminta n-hexános frakciójának totál ion kromatogramja.

zsírsav-metilészter

19. ábra. A MEPS® módszerrel előkészített gázolajminta n-hexán – diklórmetános frakciójának totál ion kromatogramja.

30

4.4. Az automatizált szilárd fázisú extrakció megvalósítása a CTC Combi PAL mintaadagoló rendszerrel A rutin környezetanalitikában egyre elterjedtebben alkalmaznak automata mintaelőkészítő rendszereket lecsökkentve ezzel az aktív munkaerő igényét és az előkészítési lépések idejét. Tudományos diákköri munkám során egy automatizált szilárd fázisú extrakción alapuló minta-előkészítési eljárással és nagytérfogatú

injektálással

egybekötött GC-MS módszert fejlesztettem. Az automatizált SPE módszert a CTC Combi PAL mintaadagoló rendszer, valamint a CTC Cycle Composer szoftver felhasználásával dolgoztam ki. Az automatizált szilárd fázisú extrakció megvalósításához szükségem volt az ISOLUTE SI 200 mg-os szilikagél töltetű patronokra, 10 ml-es üveg fiolákra és az ezekhez megfelelő mágnesezett kupakokra. Ezekre azért van szükség, mert a robot a mágnesesség elvét felhasználva képes mozgatni a fiolákat. A 100 °C-on 1 óráig fűtött SPE patronokat 3,5 cm hosszúságúra vágtam. A 10 ml-es üveg fiolákra mágnesezett kupakokat csavartam, amelyekbe beleilleszthető az előbbiekben elkészített patron. E folyamatot mutatja be a 20. ábra.

20. ábra. Az automatizált szilárd fázisú extrakcióhoz szükséges eszközök elkészítése.

A CTC Combi PAL mintaadagoló segítségével kifejlesztett szilárd fázisú extrakciós eljáráson alapuló minta-előkészítési módszer során a robot az SPE töltetre 31

méri az n-hexán megfelelő térfogatát, ezzel kondicionálja és ekvilibrálja azt. Majd felviszi a minta adott térfogatú és koncentrációjú oldatát. Ezután a kondicionáló fiolából átviszi a töltetet a második fiolába, amibe adott térfogatú eluenssel leold. Az első frakciót tartalmazó fiolát a robot átteszi az 1. tálcára, ahonnét 100 µl-t injektál a CIS 4 injektorba. (21. ábra) Amíg az első frakció GC-MS mérése folyik, addig a robot elkészíti a második frakciót.

21. ábra. Az SPE-hez szükséges eszközök elhelyezése és konfigurálása a CTC Combi PAL rendszer mintatartó tálcáin.

A CTC Combi PAL rendszer két mintatartó tálcával rendelkezik. Az első tálcán helyeztem el azon 10 ml-es fiolákat, melyek a kondicionáláshoz és leoldáshoz szükséges oldószereket, valamint a minták n-hexános oldatát tartalmazzák. Míg a második tálcán az előkészített SPE patron és mintánként három darab 10 ml-es fiola kapott helyet. Majd a vezérlőpanelen beállítottam a megfelelő paramétereket, így a fiolák magasságát és a tű fiolákba történő behatolásának mélységét. Miután konfiguráltam az egyes mintatartó tálcákat a vezérlőpanelon, azután beprogramoztam a műveletlistát a CTC Cycle Composer szoftverben. A szoftverben különböző típusú, ún. makrók segítik a felhasználót. (22. ábra) Egy teljes automatizált frakcionálási folyamat hat különböző makróból épül fel. Az első makró az ún. Clean Syringe, itt lehet beprogramozni, hogy a robotkar a tűt először n-hexán, majd diklórmetán mosófolyadékkal mossa kétszer-kétszer. Az ún. Aspirate makróban adtam meg, hogy valamely tálca adott pozíciójában lévő fiolából meghatározott térfogatú oldószert szívjon fel a fecskendő, adott sebességgel. A következő makró az ún. 32

Dispense, aminek az a célja, hogy a felszívott anyagot kiengedje a beprogramozott pozíciójú fiolába vagy a töltetre. A Transport Vial makró lehetővé teszi, hogy a 2. tálcán az egyik fiolából a másik fiolába vigye a robotkar az SPE patront. Majd a már gyűjtött frakciót tartalmazó fiolát a 2. tálcáról a robot elviszi az 1. tálcára, ahonnan a nagytérfogatú injektálás történik. A GC-Inj makróban pedig beállítottam, hogy az 1. tálca mely fiolájából injektáljon vezérelt sebességgel a Gerstel CIS 4 programozott hőmérsékletű injektorba. E makrók mellett szükség volt az ún. Wait makró beépítésére is. Ezzel be tudtam állítani azt az időt, ami ahhoz szükséges, hogy a töltetre rámért kondicionáló vagy eluálószer lecsepegjen, s csak ezt követően vigye a robot a töltetet a másik szedőfiolába. Egy teljes szilárd fázisú minta-előkészítési folyamat 90 makróból áll. A minta-előkészítés 20 percet vesz igénybe.

22. ábra. A CTC Cycle Composer szoftver felépítése.

33

4.5. Az automatizált szilárd fázisú extrakciós módszer optimálása A szilárd fázisú extrakció egyszerűségének ellenére olyan mikroanalitikai oszlopkromatográfiás

technika,

amelyben

számos

tényező

kölcsönhatását

és

variabilitását figyelembe kell venni [2]. A megfelelő módszer kidolgozása során a következő paraméterekre célszerű nagy figyelmet fordítani: a megfelelő állófázis kiválasztására; a töltet kondicionálásának és előkészítésének vizsgálatára; a különböző anyagi minőségű és összetételű oldószerek, oldószerelegyek kipróbálására, majd az elúcióhoz legmegfelelőbbek kiválasztására; a leoldáshoz használt oldószerek, oldószerelegyek

optimálás

térfogatának

meghatározására;

valamint

a

töltet

kapacitásának tesztelésére. Emellett el kell végezni a szilárd fázisú extrakció hatékonyságának ellenőrzését megfelelő standard oldattokkal.

4.5.1. Az állófázis kiválasztása és a töltet kondicionálásának, illetve előkészítésének vizsgálata Kutatásaim során 200 mg szilikagéllel töltött SPE-patronokkal dolgoztam. Vizsgáltam a különböző szorbens tömegű (0,2 g, 3,0 g és 5,0 g) szilikagéllel töltött patronok szelektivitását az analizálandó komponensekre. E vizsgálatok eredményei és oldószer-takarékossági szempontok alapján az automata minta-előkészítési rendszerben az ISOLUTE SI 200 mg-os szilikagél töltetű patronokat használtam, ebben az átlagos szemcseméret 50 µm és a pórusátmérő 60 Å. A 200 mg-os töltet lehetővé tette az elúcióhoz használt oldószerek, oldószerelegyek térfogatának jelentős csökkentését anélkül, hogy az elválasztás hatékonysága és szelektivitása csökkent volna a célkomponensekre nézve. A szilikagélnek számos kedvező tulajdonsága mellett nagy hátránya, hogy a levegő víztartalmát megköti, aminek hatására a szorpciós folyamatok lejátszódásának szempontjából fontos aktív helyek száma jelentős mértékben lecsökken. Munkám során vizsgáltam, hogy a töltet izopropanolos előkezelése vagy kifűtése jelenti e problémára a megoldást. A kísérleteket úgy végeztem el, hogy a patronokat 100 °C-on kifűtöttem vagy a patronokra a kondicionálás előtt 2,5 ml izopropanolt pipettáztam. Majd a tölteteket 1,5 ml n-hexánnal kondicionáltam. Ezután 20 µl 1000 µg/ml koncentrációjú standard oldatot – mely 2-etilnaftalint, n-hexakozánt és n-tetrakontánt tartalmazott nhexánban oldva – mértem az SPE-patronra. S ezt követően két – egy n-hexános és egy 34

n-hexán – diklórmetános – frakciót gyűjtöttem. A frakciókat GC-MS elemzésnek vetettem alá. A kapott eredményeket az MSZE 20361. szabvány ajánlása szerint értékeltem. Eszerint az SPE minta-előkészítési módszer hatékonynak tekinthető, amennyiben a n-hexakozán és a n-tetrakontán minimum 80 %-a az n-hexános frakcióban eluálódik, míg a 2-etilnaftalin legfeljebb csak 10 %-ban jelenik meg e frakcióban. Ezt figyelembe véve az elvégzett kísérletek azt igazolták, hogy a töltetek 100 °C-on 1 órán át történő kifűtése célravezetőbb, mint az izopropanolos kezelés (1. táblázat). Másrészt nincs szükség még egy oldószer – az izopropanol – alkalmazására, ha a probléma megoldható egyszerűen a kifűtéssel. 1. táblázat. Az SPE patronok előkészítésének optimálása.

2-etilnaftalin az n-hexán – diklórmetános frakcióban n-hexakozán az n-hexán – diklórmetános frakcióban n-tetrakontán az n-hexán – diklórmetános frakcióban

Kifűtés 100 °C-on

Izopropanolos kezelés

95 %

72 %

6%

7%

5%

7%

Mivel az előre gyártott SPE-patronok anyaga polipropilén és a töltet kiszóródását megakadályozó frittek polietilénből készülnek. Így meg kell vizsgálni, hogy a tartósan magas hőmérséklet hatására nem degradálódnak-e. Vizsgálataim alapján elmondhatom, hogy 100 °C-on, 1 órás kifűtés hatására a patronok, valamint a frittek nem bomlanak, ugyanis nem jelentek meg újabb – az adott műanyagokra jellemző – csúcsok a kromatogramokban.

4.5.2. A leoldáshoz használt eluensek kiválasztása A ZHENDI WANG és munkatársai által írt cikkben az alifás szénhidrogéneket és biomarkereket n-hexánnal, a policiklusos aromás szénhidrogéneket pedig n-hexán – diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyével eluálják. [17] Az n-hexán – diklórmetán elegy helyett más összetételű oldószerelegyeket is kipróbáltam. Ezek a következők voltak: nhexán – diklórmetán, n-hexán – aceton és n-hexán – etil-acetát 1:1, 2:3, 3:7, 1:4 és 1:9 térfogatarányú elegyei. Az oldószerelegyek összetétel-vizsgálata előtt figyelembe vettem azt a tényt, hogy egy erős és egy gyenge oldószer megfelelő elegyének 35

alkalmazásával elérhető az oldószererősség növelése, minek hatására az oszlopról az állófázishoz erősebben kötődő komponensek is eluálódjanak. Ezáltal megvalósítható például

a

policiklusos

aromás

szénhidrogén

vegyületek

gyűrűszám

szerinti

szétválasztása is. A vizsgált eluenselegyek közül az n-hexán – diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyére kaptam a legjobb eredményeket (25. ábra) ugyanis, az n-hexán – acetonos és – etil-acetátos frakciókban igen nagy intenzitású alkáncsúcsok is megjelentek, melyeknek az n-hexános frakcióba kellene eluálódniuk (23., 24., 25. ábra).

23. ábra. N-hexán - aceton 1:1 térfogatarányú elegyével leoldott frakció totál ion kromatogramja.

24. ábra. N-hexán - etil-acetát 1:1 térfogatarányú elegyével leoldott frakció totál ion kromatogramja.

23. ábra. N-hexán - diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyével leoldott frakció totál ion kromatogramja.

36

4.5.3. A nagytérfogatú injektálás optimálása Vizsgálataim során a Gerstel CIS (Cooled Injection System) 4 típusú injektort használtam, melynek felépítését az 26. ábra mutatja.

24. ábra. A Gerstel CIS 4 programozott hőmérsékletű injektor felépítése [4].

A CIS 4 injektor maximális felfűtési sebessége 720 °C/perc. Az injektor Peltierhűtővel7 van ellátva. A hűtés során 50-50 % víz-etanol elegyet alkalmazunk hőcserélő közegként, e feltételek mellett 10 °C-ra hűthetjük le az injektort. A nagytérfogatú injektálást oldószer-lefúvatás üzemmódban, vezérelt sebességű injektálással végeztem. Az SPE töltetről a célvegyületek eluálására az n-hexán és az n-hexán-diklórmetán 1:1 térfogatarányú

elegye

volt

a

legalkalmasabb,

így

ezen

oldószerre,

illetve

oldószerelegyre optimáltam az injektálást. Mivel az n-hexános oldatból történő nagytérfogatú injektálási módszer kutatócsoportunk korábbi eredményei alapján rendelkezésemre állt, ezért csak az n-hexán – diklórmetános oldatokra optimáltam a nagytérfogatú injektálást [6, 7]. E mérések során a cél egy olyan paraméter-együttes 7

A Peltier-effektus az ún. Seebeck-effektus megfordítása. A Seebeck-hatás szerint, ha két

különböző anyagi minőségű fémes vezetőt összekapcsolunk egy ponton, és a kapcsolódási pontok

között

hőmérséklet-különbség

van,

akkor

a

kapcsolódási

pontok

között

potenciálkülönbséget mérhetünk. Ennek megfordítása a Peltier-effektus, amikor egy ponton összekapcsolt, különböző anyagi minőségű fémes vezetőkre, ha feszültséget adunk, akkor a kapcsolódási pontok eltérő hőmérsékletűek lesznek. 37

megtalálása,

amelynek

alkalmazásakor

az

oldószer

elpárolgásának

sebessége

megegyezik az injektálás sebességével, tehát dinamikus egyensúly alakul ki. Ilyenkor az injektorbetétben állandó, vékony folyadékfilm alakul ki [6, 7]. Ez folyamatosan párolog, miközben a fecskendőből érkezik az utánpótlás. Amíg a párolgás zajlik, addig a mérendő komponensek ebben a folyadékfilmben dúsulnak fel. Az oldószer lefúvatása után a mérendő komponensek az injektorbetéten, és a töltet felületén maradnak. Az optimálandó paraméterek megfelelő beállítása nem egyszerű feladat, hiszen e paraméterek egymással igen szoros kapcsolatban állnak és számuk is nagy. A vezérelt sebességű nagytérfogatú injektálás optimálásában nyújt segítséget a következő formula

(1)

ahol I: az injektálás sebessége [µl/perc], M: az oldószer moláris tömege [g/mol], Ps: az injektor gőznyomása az injektor kiindulási hőmérsékletén [bar], ρ: az oldószer sűrűsége [g/cm3], R: az univerzális gázállandó [(cm3*bar)/(mol*kg)], Ta: az injektor kiindulási hőmérséklete [K], Pa: a légköri nyomás (~1,013 bar), Pinlet: a fejnyomás és a légköri nyomás összege [bar], Fsplit: áramlási sebesség a split ágon [cm3/perc] [4]. Az optimáláshoz egy 50 µg/ml koncentrációjú oldatot készítettem, az alábbi nalkánok felhasználásával: n-nonán, n-dekán, n-undekán, n-dodekán, n-tetradekán, npentadekán, n-hexadekán, n-heptadekán, n-oktadekán, n-tetrakozán és n-hexakozán. Az oldószer pedig n-hexán és diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegye volt. Az elkészített oldat 1 µl-ét hideg splitless módban injektáltam, s az így kapott eredményeket használtam referenciaként. A kapott adatokat az alábbi táblázatban foglaltam össze.

38

2. táblázat. A nagytérfogatú injektálás során referenciaként mért csúcsterületek (3 párhuzamos mérés).

n-alkán

Csúcsterület

Szórás

RSD%

n-C9 n-C10 n-C11 n-C12 n-C14 n-C15 n-C16 n-C17 n-C18 n-C24 n-C26

21704949 36717967 21019633 60431952 51711479 32897444 56761179 39193588 16078824 38951852 33145065

1162959 3033522 1560151 5322141 4259436 2504076 4658514 1556751 965862 2740990 2386034

5.4 8.3 7.4 8.8 8.2 7.6 8.2 3.9 6.0 7.0 7.2

A nagytérfogatú injektálást az előbbi oldat százszoros hígításával, vagyis 0,5 µg/ml koncentrációjú oldat 100 µl-ének injektálásával végeztem. Az optimálás során az injektor kezdeti hőmérsékletét a CIS 4 injektor gyártójának ajánlása alapján 10 °C-nak állítottam be. A felfűtési sebességet a maximális 12 °C/s értékre állítottam be. A szelektív oldószer-lefúvatás alatt alkalmazott fejnyomás stop flow üzemmódban elvileg zérus, gyakorlatilag megegyezik az aktuális légköri nyomással. Az injektálási sebesség n-hexán oldószer esetén 1,35 µl/s, míg a lefúvatási sebesség 150 ml/perc, melyeket kutatócsoportunk korábban már meghatározott. Az nhexán – diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyével készült oldatokat 1,35; 1,37; 1,40 és 1,42 µl/s injektálási sebességgel injektáltam 120, 135 és 150 ml/min lefúvatási sebességgel. Vizsgáltam, hogy mely injektálási – lefúvatási sebesség paraméterpárnál lesz a legnagyobb a komponensek relatív csúcsterülete. Az optimálás során a különböző injektálási és lefúvatási sebességeknél mért relatív csúcsterületek a 27., 28. és 29. ábrákon láthatók. Ezek alapján megállapítható, hogy a legnagyobb

relatív

csúcsterület

értékeket

és

a legkisebb mértékű

csúcstorzulásokat 1,35 µl/s injektálási és 135 ml/perc lefúvatási sebességnél kaptam. A többi esetben jelentősen torzultak a csúcsok vagy részlegesen lefúvatásra kerültek azon célkomponensek, amelyek forráspontjai az oldószerelegy forráspontjánál nem magasabbak 150 °C-nál. Ilyenek az n-nonán, az n-dekán és az n-undekán.

39

1.35 ul/s 1.37 ul/s

n-hexakozán

n-tetrakozán

n-oktadekán

n-heptadekán

n-hexadekán

n-pentadekán

n-tetradekán

n-dodekán

n-undekán

n-dekán

1.4 ul/s n-nonán

Relatív csúcsterület (%)

160 140 120 100 80 60 40 20 0

1.42 ul/s

160 140 120 100 80 60 40 20 0

1.35 ul/s 1.37 ul/s

n-hexakozán

n-tetrakozán

n-oktadekán

n-heptadekán

n-hexadekán

n-pentadekán

n-tetradekán

n-dodekán

n-undekán

n-dekán

1.4 ul/s n-nonán

Relatív csúcsterület (%)

25. ábra. Az injektálási és lefúvatási sebesség optimálása n-hexán és diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyére 120 ml/perc lefúvatási sebességnél.

1.42 ul/s

160 140 120 100 80 60 40 20 0

1.35 ul/s 1.37 ul/s

n-hexakozán

n-tetrakozán

n-oktadekán

n-heptadekán

n-hexadekán

n-pentadekán

n-tetradekán

n-dodekán

n-undekán

n-dekán

1.4 ul/s n-nonán

Relatív csúcsterület (%)

26. ábra. Az injektálási és lefúvatási sebesség optimálása n-hexán és diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyére 135 ml/perc lefúvatási sebességnél.

1.42 ul/s

27. ábra. Az injektálási és lefúvatási sebesség optimálása n-hexán és diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyére 150 ml/perc lefúvatási sebességnél.

40

A 100 %-ot meghaladó relatív csúcsterület értékek visszavezethetők arra, hogy a referenciaként alkalmazott hideg splitless üzemmódban végzett injektálás során fellépő veszteségek, diszkrimináció értéke meghaladja a nagytérfogatú injektálásnál fellépő veszteségeket és diszkriminációt. Az előbbi vizsgálataim során kapott eredményeket felhasználva, valamint azt a megfigyelést figyelembe véve, hogy az alkalmazott oldószerhez közeli forráspontú, illékony vegyületek a split ágon eltávoznak bevezettem és optimáltam egy ún. második lépcsőt is az oldószer-lefúvatási üzemmódban. Erre azért is volt szükség, mert a nagytérfogatú injektálás során az analitikai kolonna elejére kerülő – lefúvatás után visszamaradó – oldószer nem tudja megfelelően fókuszálni a meghatározandó komponenseket, vagyis a kellően keskeny dugó kialakulása gátolt. Így jelentős csúcstorzulás

tapasztalható.

A

csúcstorzulást

okozó,

visszamaradó

oldószert,

oldószerelegyet a második hőmérsékleti lépcső során az analitikai oszlopon keresztül fúvattam le. A második lépcsőt az egyensúlyi gőznyomás (tenzió) jelentős megnövelése érdekében 70 °C-nak választottam. A kolonnán át történő lefúvatás időtartamának relatív csúcsterületre gyakorolt hatását vizsgáltam. A kapott eredmények alapján megállapítottam, hogy az oszlopon át történő lefúvatás optimális időtartama 3 perc (30. ábra).

160

Relatív csúcsterület (%)

140 120 100

1.5 perc

80

2 perc

60

2.5 perc 3 perc

40

3.5 perc 20

4 perc n-hexakozán

n-tetrakozán

n-oktadekán

n-heptadekán

n-hexadekán

n-pentadekán

n-tetradekán

n-dodekán

n-undekán

n-dekán

n-nonán

0

28. ábra. A kétlépcsős oldószer-lefúvatás során az oszlopon át történő, második lefúvatás idejének optimálása.

41

A kétlépcsős oldószer-lefúvatási módszerek optimált paramétereit az alábbi táblázatban foglalom össze. 3. táblázat. Az optimált kétlépcsős oldószer-lefúvatási paraméterek.

n-hexán

n-hexán – diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegye

100 µl

100 µl

10 °C (1,23 perc)

10 °C (1,23 perc)

12 °C/s  70 °C (3 perc)

12 °C/s  70 °C (3 perc)

12 °C/s  320 °C (10 perc)

12 °C/s  320 °C (10 perc)

stop flow (1,23 perc)

stop flow (1,23 perc)

splitless time (1,5 perc)

splitless time (1,5 perc)

Injektálási sebesség

1,35 µl/s

1,35 µl/s

Lefúvatási sebesség

150 ml/perc

135 ml/perc

1,0 ml/perc

1,0 ml/perc

Injektált térfogat CIS hőmérséklet program Injektor beállítások

Vivőgáz áramlási sebessége

42

4.5.4. A töltet kapacitásának vizsgálata és a leoldási térfogatok optimálása A szilárd fázisú extrakciós minta-előkészítési módszer fejlesztésénél fontos megvizsgálni, hogy a töltetre mekkora térfogatú és milyen koncentrációjú oldatát vihetjük fel a mintának. Erre azért van szükség, hogy meghatározzuk a töltet mintakapacitását. Az MSZE 20361. szabvány szerint a töltet túlterhelésére akkor kell számtani, ha az oszlopra juttatott minta mennyisége – oldószer nélkül – meghaladja a töltet tömegének néhány tized százalékát. A töltet mintaterhelése kifejezhető az alábbi képlettel ö

ö

(2)

ahol Stöltet(%), a töltet mintaterhelése százalékban kifejezve, mfel, a felvitt minta oldószer nélküli tömege, mtöltet, a töltet tömege. A kapacitás vizsgálatokat gázolajmintával végeztem. A töltet mintaterhelését 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 és 1,0%-nál vizsgáltam. E vizsgálatokat az automatizált rendszerrel végeztem. Kezdetben a robotkar 20 mg/ml koncentrációjú oldatok 20, 40, 60, 80, 100 µl térfogatát vitte fel a töltetre. A mérések során megállapítottam, hogy 20 µl 20 mg/ml koncentrációjú minta felvitelével még nem terhelődik túl a töltet. A többi esetben azt tapasztaltam, hogy már a mintával együtt felvitt oldószer oldja a célkomponenseket, hiszen a mintát n-hexánban oldom fel, és az első frakció leoldásához is n-hexánt használok. Később végeztem olyan vizsgálatokat is, amikor különböző gázolajkoncentrációjú n-hexános oldatok 20 µl-ét injektálta a robot a szorbensre, így elkerülhető volt, hogy már az oldószer leoldja a töltetről a komponenseket. E vizsgálatok eredményei bebizonyították, hogy a 20 mg/ml koncentrációjú mintaoldatok 20 µl-ének felvitele az optimális (31. és 32. ábra).

43

29. ábra. Az SPE töltet kapacitásának vizsgálata 20 µl 20 mg/ml koncentrációjú standard oldat felvitelekor.

30. ábra. Az SPE töltet kapacitásának vizsgálata 40 µl 20 mg/ml koncentrációjú standard oldat felvitelekor.

Szükséges a leoldási térfogatok meghatározására. E vizsgálatokat során a frakcionálást ellenőrző standard oldat 20 µl-ét mértem a patronokra 1,5 ml n-hexánnal való kondicionálás után. Ezt követően 1,0; 1,2; 1,4 és 1,6 ml n-hexánnal, majd rendre párosítva 1,2; 1,4; 1,6 és 1,8 ml n-hexán – diklórmetán eleggyel történő leoldással gyűjtöttem a frakciókat. E frakciók GC-MS analízise után arra a megállapításra jutottam, hogy a legmegfelelőbb leoldási térfogat az n-hexán esetében 1,0 ml, az nhexán – diklórmetán esetén 1,2 ml. Amennyiben az n-hexán nagyobb térfogatával eluálok, akkor már az első frakcióban megjelennek azon célvegyületek, melyek a második frakcióban eluálódnak.

44

4. táblázat. A leoldási térfogatok optimálási vizsgálatainak eredményei.

Az n-hexán – diklórmetános frakció 2-etilnaftalin n-hexakozán n-tetrakontán tartalma %-ban kifejezve

1,0 ml n-hexán 1,2 ml n-hexán – diklórmetán 1,2 ml n-hexán 1,4 ml n-hexán – diklórmetán 1,4 ml n-hexán 1,6 ml n-hexán – diklórmetán 1,6 ml n-hexán 1,8 ml n-hexán – diklórmetán

45

97 %

18 %

14 %

62 %

11 %

7%

46 %

10 %

6%

31 %

8%

5%

4.5.5. A kifejlesztett automatizált minta-előkészítési módszer Az általam kifejlesztett automatizált szilárd fázisú extrakción alapuló mintaelőkészítési módszer lépéseit kívánom összefoglalni az alábbiakban. 0,1 g diesel mintát 5 ml-es mérőlombikba pipettázok, majd n-hexánnal jelre töltöm. A CTC Combi PAL mintaadagoló rendszer robotkarja a beprogramozott módszer alapján 20 µl mintát injektál az SPE töltetre, amit előzőleg 1,5 ml n-hexánnal kondicionált. Ezután a robot 1,0 ml n-hexánnal eluálja az alifás szénhidrogén és biomarker komponenseket. Az első frakció elkészítését követően a mintaadagoló 100 µl mintát injektál a Gerstel CIS 4 injektorba, majd kezdetét veszi az n-hexános frakció GC-MS elemzése. A robot a beprogramozott várakozási idő elteltével eluálja a töltetről a policiklusos aromás szénhidrogén vegyületeket és alkil-származékaikat 1,2 ml n-hexán – diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyével. Majd az előző mérést követően, ebből is 100 µl-t injektál a CIS 4 injektorba. Ezután elkezdődik a második frakció GC-MS analízise is. A teljes minta-előkészítési folyamatot az alábbi ábrán foglalom össze.

31. ábra. A kidolgozott automatizált minta-előkészítési módszer összefoglalása.

46

5. A vizsgált minta-előkészítési módszerek összehasonlítása Tudományos diákköri munkám során olyan minta-előkészítési módszer kidolgozását tűztem ki célul, mely automatizált és alkalmas gázolajmintákból policiklusos aromás szénhidrogének és petróleum biomarker vegyületek elválasztására. Kutatásom kezdetén a petrolkémiai vizsgálatokban leggyakrabban használt szilárd fázisú extrakciós eljáráson alapuló minta-előkészítési módszert tanulmányoztam. Az előkészítést és a GC-MS mérést 4.2. fejezetben leírtak alapján hajtottam végre. Megállapítottam, hogy a módszer kiválóan alkalmas a gázolajminták PAH és biomarker komponenseinek szétválasztására. Azonban óriási hátránya, hogy mintegy 60 ml oldószert igényel, nem automatizált, az automatizálása csak nehezen megvalósítható és költséges. Emellett a gyűjtött frakciókat nitrogén áramban kell bepárolni, ami még inkább növeli az előkészítés idejét, és jelentősen csökkenti a reprodukálhatóságát. Az előbbi kísérletek után áttértem a MEPS® minta-előkészítési módszerre, melynek segítségével megvalósítható a minták gyors frakcionálása, az automatizálás, s emellett a nagytérfogatú injektálással elkerülhető a minták nitrogénáramban történő bepárlása. Továbbá a MEPS® összes oldószer-igénye körülbelül 0,3 ml, vagyis ~0,5 %a az előbbi módszernek. A vizsgálatok alkalmával azonban kiderült, hogy gázolajok analitikájában nem alkalmazható, mert a töltet kapacitása igen kicsi. A minta nagyobb mértékű hígításával viszont a biomarker komponensek a mérési módszer kimutatási határa alatti koncentrációban lennének jelen a megfelelő frakcióban. Ezt követően kidolgoztam a CTC Combi PAL mintaadagoló és Gerstel CIS 4 injekor, valamint a hozzájuk kapcsolt GC-MS rendszer segítségével egy teljesen automatizált (on-line) minta-előkészítési és mérési módszert. E módszer előnye abban áll, hogy a hagyományos szilárd fázisú extrakciós technikához képest összesen csak ~9 ml oldószert igényel, vagyis 75%-kal kisebb az oldószer-felhasználása. Tehát elmondható, hogy a módszer környezetbarát és eleget tesz a zöld (analitikai) kémia elveinek. Ezen felül teljesen automatizált, s felhasználásával lehetővé válik akár 10-15 minta előkészítését és elemzését is anélkül, hogy emberi beavatkozást igényelne. A módszerben a nagytérfogatú injektálással elkerülhetővé vált a frakciók hagyományos nitrogénáramban történő bepárlása, ezzel idő és humán erőforrás megtakarítása, illetve jobb reprodukálhatóság elérése. Az elért eredmények alapján elmondható, hogy a kifejlesztett

automatizált

módszer

korszerű,

idő-

és

oldószer-takarékos,

így

környezetbarát analitikai módszer. Lehetővé teszi a gázolajmintákban található alkil47

PAH és biomarker összetevők szétválasztását és elemzését. Nem igényel jelentős aktív munkaerőt. Összességében igaz, hogy e technika kiváló helyettesítője lehet az eddigiekben alkalmazott eljárásoknak. A három módszert az alábbi táblázatban látható összehasonlítva. 5. táblázat. A három vizsgált minta-előkészítési módszer összehasonlítása.

hagyományos

MEPS® – LVI

automatizált

SPE módszer

módszer

SPE módszer

szilikagél töltet tömege

3g

0,002 g

0,2 g

felvitt minta térfogata

200 µl

5 µl

20 µl

összes oldószer-igény

~60 ml

~0,3 ml

~9 ml

nitrogén áramban

kétlépcsős

kétlépcsős

történő

oldószer-

oldószer-

bepárlással

lefúvatással

lefúvatással

nagytérfogatú

nagytérfogatú

injektálás (LVI)

injektálás (LVI)

frakciók koncentrálása

injektálás típusa

splitless

injektált térfogat

1 µl

60 µl

100 µl

automatizálhatóság







~200 perc

~50 perc

~50 perc

a minta-előkészítési és mérési idő mintánként

48

6. A kifejlesztett automatizált technika alkalmazása A kifejlesztett automatizált minta-előkészítési és LVI-GC-MS módszert a kutatócsoportunk által gyűjtött magyarországi és külföldi – összesen 22 – gázolajminták PAH- és biomarker összetételének elválasztására és analízisére kívánom felhasználni. Emellett a technika alkalmazató a felszíni és felszín alatti vizekbe, továbbá talajokba kerülő gázolajok biodegradációjának és fotooxidációjának vizsgálatára is. Az alábbi ábrákon egy az általam kifejlesztett módszerrel, valódi gázolajmintán végzett minta-előkészítés n-hexános és n-hexán – diklórmetános frakciójának GC-MS kromatogramjai láthatók.

32. ábra. Automatizált módszerrel előkészített gázolajminta n-hexános frakciójának GC-MS kromatogramja.

33. ábra. Automatizált módszerrel előkészített gázolajminta n-hexán diklórmetános frakciójának GC-MS kromatogramja.

49

7. Összefoglalás Tudományos diákköri munkám során kidolgoztam egy a gázolajmintákból policiklusos aromás szénhidrogének és biomarker vegyületek elemzésére alkalmas automatizált szilárd fázisú extrakción alapuló minta-előkészítési és nagytérfogatú injektálással egybekötött GC-MS módszert. Munkám során először kipróbáltam a MEPS® technikát és a hagyományos szilárd fázisú extrakción alapuló minta-előkészítési módszert. Előbbiről megállapítottam, hogy a töltet kis kapacitása és a mintafelviteli problémák miatt nem használható a kívánt célra. Utóbbi módszer hátránya viszont az volt, hogy nagy az oldószerigénye és a frakciók nitrogénáramban történő bepárlására van szükség a GC-MS vizsgálat előtt, ami kevéssé reprodukálható, emellett lassú eljárás. Kutatásaim során vizsgáltam a szilárd fázisú extrakciós technika fontos optimálási paraméterei közül a töltet előkezelésének lehetőségeit 100 °C-on történő kifűtéssel és izopropanollal. A mérési eredmények alapján a töltetek 1 órán át 100 °Con történő kifűtése mellett döntöttem. Továbbá optimáltam a töltetre felvihető mintaoldat térfogatát és koncentrációját. A mérések alapján 20 mg/ml koncentrációjú mintaoldat 20 µl-ének felvitele az optimális. Vizsgáltam az n-hexán – diklórmetán, az n-hexán – aceton és az n-hexán – etil-acetát eluenselegyek különböző térfogatarányú oldatainak alkalmazhatóságát a szilárd fázisú extrakció során. Optimáltam a célkomponensek leoldásához szükséges n-hexán és n-hexán – diklórmetán elegy térfogatát. Így a minta-előkészítés során 1,0 ml n-hexán és 1,2 ml n-hexán – diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyével végeztem az elúciót. A frakciók nitrogénáramban történő bepárlását a nagytérfogatú injektálási módszerrel tettem automatizálttá. Ez a hagyományos bepárlásos módszereknél gyorsabb, megbízhatóbb és reprodukálhatóbb. A nagytérfogatú injektálási módszert az n-hexán – diklórmetán 1:1 térfogatarányú elegyére optimáltam. A kifejlesztett automatizált minta-előkészítési és mérési módszer előnye abban áll, hogy segítségével a minta-előkészítés ideje és oldószerigénye jelentősen lecsökken. Tehát elmondható, hogy a módszer környezetbarát és eleget tesz a zöld (analitikai) kémia elveinek. Az elért eredmények alapján tehát elmondhatom, hogy a kifejlesztett automatizált minta-előkészítési eljárás korszerű, idő- és oldószer-takarékos, ezáltal környezetbarát, nem igényel jelentős aktív munkaerőt, tehát kiváló helyettesítője lehet az eddigiekben alkalmazott technológiáknak. 50

Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőimnek, Dr. Eke Zsuzsannának és Novák Mártonnak, akik hasznos tanácsaikkal és iránymutatásaikkal sokat segítettek tudományos diákköri munkám elkészítésében. Dolgozatom elkészítéséhez sok hasznos megjegyzéssel és észrevétellel járultak hozzá az Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium (EKOL) munkatársai: Dr. Torkos Kornél, Bodai Zsolt, Nyiri Zoltán és Juhász Sándorné. Külön köszönet illeti a ELTE TTK Kémiai Intézetét és a Wessling Non-Profit Kft-t, akik az EKOL fenntartóiként rendelkezésemre bocsátották a szükséges eszközöket, vegyszereket és műszereket.

51

Hivatkozások jegyzéke [1] MAGYAR ELŐSZAVBÁNY – MSZE 20361. Útmutató környezetvédelmi talaj- és vízvizsgálatokhoz. A szénhidrogének meghatározására vonatkozó analitikai szabványok és eljárások áttekintése. [2] Kremmer T., Torkos K. 2010: Elválasztástechnikai módszerek elmélete és gyakorlata. – Akadémia Kiadó, Budapest [3] Balla J. 2006: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai. – Edison House Kiadó, Budapest [4] Sample Introduction Techniques for Capillary Gas Chromatography, Gerstel kiadvány. http://www.gerstelus.com (utolsó megtekintés időpontja: 2013. november 7.) [5] W. Vogt, K. Jacob, A. Ohnesorge, H. Werner 1979: Capillary Gas Chromatographic Injection System for Large Sample Volumes. – Journal of Chromatography, pp. 197205. [6] Szekeres Zoltán 2012: Komplex módszerfejlesztés vízminták szénhidrogén szennyezésének gázkromatográfiás meghatározására. – Doktori értekezés, Eötvös Loránd Tudományegyetem, Budapest, pp. 15-26. [7] Novák Márton 2012: A MEPS (Microextraction By Packed Sorbent) mintaelőkészítési módszer alkalmazása környezeti vízminták GC-MS áttekintésében. – Szakdolgozat, Eötvös Loránd Tudományegyetem, Budapest, pp. 11-13. [8] Colin Poole 2012: Gas Chromatography. – Elsevier Press [9] E. M. Thurman, M. S. Mills 1998: Solid-Phase Extraction – Principles and Practice. John Wiley and Sons, pp. 51-69, 105-121. [10] www.gerstelus.com (Az utolsó megtekintés időpontja: 2013. november 7.) [11] M. Abdel-Rehim, Z. Altun, L. G. Blomberg: Microextraction in packed syringe (MEPS) for liquid and gas chromatographic applications. Part II-Determination of ropivacaine and its metabolites in human plasma samples using MEPS with liquid chromatography/tandem mass spectrometry. – Journal of Mass Spectrometry, 2004, 39. pp. 1488-1493. 52

[12] M. Abdel-Rehim 2004: New trend in sample preparation: on-line microextraction in packed syringe for liquid and gas chromatography applications I. Determination of local anaesthetics in human plasma samples using gas chromatography–mass spectrometry. – Journal of Chromatography B, 2004, 801. pp. 317 – 321. [13] M. Abdel-Rehim, Z. Altun, L. G. Blomberg: New trends in sample preparation: online microextraction in packed syringe (MEPS) for LC and GC applications Part III: Determination and validation of local anaesthetics in human plasma samples using a cation-exchange sorbent, and MEPS–LC–MS–MS. – Journal of Chromatography B, 2004, 813. pp. 129 – 135. [14] ASTM D7678-11. – Standard Test Method for Total Petroleum Hydrocarbons (TPH) in Water and Wastewater with Solvent Extraction using Mid-IR Laser Spectroscopy. [15] http://epa.oszk.hu/00000/00025/00007/fekete.html (utolsó megtekintés időpontja: 2013. november 7.) [16] Lee, Kenneth; Neff, Jerry 2011: Produced Water. Environmental Risks and Advances in Mitigation Technologies. – Springer Verlag, pp. 57-84. [17] Zhendi Wang; Scott A. Stout 2007: Oil Spill Environmental Forensics. Fingerprinting and Source Identification. – Academic Press [18] Alex L. Sessions: Isotope-ratio detection for gas chromatography – J. Sep. Sci. 2006, 29, pp. 1946 – 1961. [19] Frysinger, G.S. and R.B. Gaines: Comprehensive two-dimensional gas chromatography with mass spectrometric detection (GC × GC-MS) applied to the analysis of petroleum. – J. High Resolution Chromatography, 1999, 22, pp. 251–255. [20] NORDTEST METHOD – NT CHEM 001: Oil Spill Identification [21] NORDTEST REPORT – NT TECHN REPORT 444: Oil Spill Identification – Absorbing materials for oil spill sampling. [22] NORDTEST PROJECT, 2002. – Revision of the Nordtest Methodology for Oil Spill Identification

53

[23] NORDTEST PROJECT, 2001. – Laboratory and reporting instructions for the CEN/BT/TF 120 Oil Spill Identification – Round Robin Test. [24] NORDTEST PROJECT, 2002. – CEN/BT/TF 120 Oil Spill Identification Summary Report: Round Robin Test Series B [25] Kenneth E. Peters, Clifford C. Walters, J. Michael Moldowan 2005: The Biomarker Guide. – Cambridge University Press [26] Zhendi W., Merv F.: Developments in the analysis of petroleum hydrocarbons in oils, petroleum products and oil-spill-related environmental samples by gas chromatography. – Journal of Chromatography A, 1997, 774., pp. 51-78. [27] Assem O. Barakat, Alaa R. Mostafa, Yaorong Qian, Mahlon C. Kennicut: Application of Petroleum Hydrocarbon Chemical Fingerprinting in Oil Spill Investigations – Gulf of Suez, Egypt, Spill Science & Technology Bulletin, 2002, Vol. 7, Nos. 5–6, pp. 229–239 [28] Roberto Alzaga, Paolo Montuori, Laura Ortiz, Josep M. Bayona, Joan

Albaigés: Fast solid-phase extraction–gas chromatography–mass spectrometry procedure for oil fingerprinting: Application to the Prestige oil spill, Journal of Chromatography A, 2004, 1025., pp. 133–138 [29] R. Fernández-Varela, J.M. Andrade, S. Muniategui, D. Prada, F. Ramı´rezVillalobos: Identification of fuel samples from the Prestige wreckage by pattern recognition methods, Marine Pollution Bulletin, 2008, 56., pp. 335–347 [30] Chun Yang, Zhendi Wang, Bruce P. Hollebone, Carl E. Brown, Mike Landriault: Characteristics of bicyclic sesquiterpanes in crude oils and petroleum products, Journal of Chromatography A, 2009, 1216., pp. 4475–4484

54