BIOMARKER INVESTIGATIONS IN ACUTE BRAIN INJURY
Tihamér Molnár M.D.
PhD Thesis
Department of Anesthesiology and Intensive Therapy University of Pécs, Hungary
Leader of the project: Assist. Prof. Zsolt Illés M.D., Ph.D. Leader of program: Prof. Sámuel Komoly M.D., DSc. Leader of Doctoral School: Prof. Sámuel Komoly M.D., DSc.
Pécs 2009
CONTENT
ABBREVIATIONS .................................................................................................................. 5
I. INTRODUCTION: Background of Theses ........................................................................ 6 The ideal biochemical serum marker ............................................................................. 6 Biomarkers of brain tissue damage ................................................................................ 6 Neurone specific enolase ................................................................................................ 6 S100beta protein ............................................................................................................. 7 Biomarkers of inflammation........................................................................................... 8 C-reactive protein ........................................................................................................... 8 Procalcitonin................................................................................................................... 8 Role of leukocytes in acute ischemic stroke................................................................... 9 Leukocyte antisedimentation rate................................................................................... 9 N-terminal –prohormone of brain derived natriuretic peptid ....................................... 10 Transient Ischemic Attack ............................................................................................ 11 Acute ischemic stroke................................................................................................... 11 Postoperative cognitive deficit ..................................................................................... 12 Post-cardiac arrest syndrome........................................................................................ 12 REFERENCES ............................................................................................................. 13
II. AIM OF THE STUDIES .................................................................................................. 18 I. The role of innate immune response in patients with acute ischemic stroke complicated by post-stroke infection............................................................................ 18 II. Measurement of brain derived biomarkers in the sera of cardiac patients with accidentally provoked transient neurological signs by intravenous dipyridamole (DP) stress test....................................................................................................................... 19 III. Measurement of biomarkers of endothel and platelet activation in the sera of patients with non-cardiac surgery................................................................................. 19 IV. Measurement of biomarkers in the sera of successfully resuscitated cardiac arrest victims .......................................................................................................................... 20
2
III. SUMMARY OF PAPERS SUPPORTING THESES ................................................... 21
I. THE ROLE OF INNATE IMMUNE RESPONSE IN PATIENTS WITH ACUTE ISCHEMIC STROKE COMPLICATED BY POST-STROKE INFECTION............. 21 Paper 1 .......................................................................................................................... 21 Deficient leukocyte antisedimentation is related to post-stroke infections and outcome Paper 2 .......................................................................................................................... 22 Relationship between C-reactive protein and early activation of leukocytes indicated by leukocyte antisedimentation rate (LAR) in patients with acute cerebrovascular events Paper 3 .......................................................................................................................... 23 Impaired function of innate T lymphocytes and NK cells in the acute phase of ischemic stroke Paper 4 .......................................................................................................................... 24 Immune responses and neuroimmune modulation in the pathogenesis of acute ischemic stroke and post-stroke infections II. MEASUREMENT OF BRAIN DERIVED BIOMARKERS IN THE SERA OF CARDIAC PATIENTS WITH ACCIDENTALLY PROVOKED TRANSIENT NEUROLOGICAL SIGNS BY INTRAVENOUS DIPYRIDAMOLE (DP) STRESS TEST............................................................................................................................. 24 Paper 5 .......................................................................................................................... 24 Dipyridamole stress test in the early evaluation of cerebral circulatory disorders ? Paper 6 .......................................................................................................................... 25 “Cerebrovascular
stressing”:
drug-induced
S100B
elevation
and
transient
neurological signs predict ischemic cerebrovascular events III. MEASUREMENT OF BIOMARKERS OF ENDOTHEL ACTIVATION IN THE SERA OF PATIENTS WITH NON-CARDIAC SURGERY...................................... 26 Paper 7 .......................................................................................................................... 26 Increased levels of baseline biomarkers reflecting platelet and endothelial activation predict early cognitive dysfunction after lung surgery IV. MEASUREMENT OF BIOMARKERS IN THE SERA OF SUCCESSFULLY RESUSCITATED CARDIAC ARREST VICTIMS.................................................... 28
3
Paper 8 .......................................................................................................................... 28 Prognostic role of serum S100β and procalcitonin in patients after cardio-pulmonary resuscitation Paper 9 .......................................................................................................................... 29 NT-proBNP as early marker of septic complications in patients after cardiopulmonary resuscitation
IV. SUMMARY OF THESES ............................................................................................... 31
V. BIBLIOGRAPHY ............................................................................................................. 34 Articles ......................................................................................................................... 34 Congress abstracts ....................................................................................................... 36 Awarded lectures .......................................................................................................... 42 Chapter ......................................................................................................................... 43
VI. ACKNOWLEDGEMENTS ............................................................................................ 44
VII. PAPERS .......................................................................................................................... 45
4
ABBREVIATIONS AIS
acute ischemic stroke
CI
confidence interval
CNS
central nervous system
CPC
cerebral performance category
CPR
cardio-pulmonary resuscitation
FasL
Fas ligand
GCS
Glasgow Coma Scale
GOS
Glasgow Outcome Scale
hsCRP
high-sensitivity C-reactive protein
IFN-γ
interferon-γ
Ig
immunoglobulin
IL
interleukin
IQR
interquartile range
LAR
leukocyte antisedimentation rate
MCP-1
monocyte chemoattractant protein-1
MMSE
Mini Mental State Examination
NIHSS
National Institute of Health Stroke Scale
NK cells
natural killer cells
NKT-like cells
natural killer T-like cells
NSE
neurone specific enolase
OR
odds ratio
PCT
procalcitonin
POCD
postoperative cognitive dysfunction
sCD40L
soluble CD40 ligand
sP-selectin
soluble P-selectin
sVCAM-1
soluble vasculare cell adhesion molecule-1
TBI
traumatic brain injury
TIA
transient ischemic attack
TNS
transient neurological sign
tPA
tissue plasminogen activator
WBC
White Blood Cell
WHO
World Health Organization
5
I. INTRODUCTION Background of Theses Biomarkers The ideal biochemical serum marker. In 1983, Bakay and Ward (1) suggested that an ideal serum marker should have high specificity for the brain, high sensitivity for brain injury, be released only after irreversible destruction of brain tissue, have a rapid appearance in serum, and be released in a time-locked sequence with the injury. The age- and sex-related variability should be low to ensure a predictable relationship between the serum concentration and the amount of brain injury. Furthermore, reliable assays for immediate analyses should be available. Finally, and most importantly, it should show clinical relevance. These prerequisites remain the most important properties of a biochemical serum marker of acute cerebral damage. In clinical practice a biomarker can serve several objectives. There are a large number of studies assessing the value of biomarkers in the prognosis of i. infection, ii.. acute focal brain injury (stroke, traumatic brain injury-TBI), iii. global hypoxic brain damage due to cardiac arrest. However, biomarkers can provide additional information to the clinical evaluation namely in the diagnosis of infection, minor head injury, TIA/minor stroke (when neuroimaging is not sensitive enough), furthermore they are suitable for risk stratification and assessment of the response to a certain therapy (antibiotics, immunmodulators, fibrinolytics, therapeutic hypothermia etc.). Biomarkers are not static but dynamic, presenting marked changes in response to different inflammatory stimulus, specifically, bacterial infection and unspecifically various type of tissue necrosis. Consequently, serial measurements could be more informative than a single one. Additionaly, there is a continous search for novel markers to better predict the outcome of patients with acute cerebral insults.
Biomarkers of brain tissue damage Neuron specific enolase (NSE). NSE was originally described by Moore and McGregor in 1965 (2). Enolases are glycolytic enzymes occurring as a series of dimeric isoenzymes made of three immunologically distinct subunits, the α, β, and γ chains (3) The isoforms γγ and αγ are restricted to neurons, peripheral neuroendocrine tissue, and tumors of the amine precursor uptake and degradation system, and referred to as NSE (3). The major distinctive feature of NSE compared with other enolases is its high degree of stability. NSE is
6
located in the cytoplasm of neurons and is probably involved in increasing neuronal chloride levels during the onset of neural activity (4) The molecular mass of NSE is 78 kDa and the biologic half-life is probably more than 20 hours (5) Serum NSE levels of more than 10 µg/L are considered pathologic (6,7). In clinical practice, NSE is predominantly used as a marker for tumors of the amine precursor uptake and degradation system, such as small-cell lung cancer, neuroblastoma, and melanoma (3) NSE is also released in the blood by hemolysis, which may be a serious source of error (8). S100beta protein. The S100 protein, whose name is derived form its solubility in 100% saturated ammonium sulfate at neutral pH, was first described by Moore in 1965 (9). These proteins are a group of small Ca2+-binding modulator proteins with a molecular mass of about 21 kDa. Members of this protein family have been implicated in the Ca2+-dependent regulation of a variety of intracellular activities such as protein phosphorylation, enzyme activities, cell proliferation and differentiation, the dynamics of cytoskeleton constituents, the structural organization of membranes, intracellular Ca2+ homeostasis, inflammation, and in protection from oxidative cell damage (10). S100 is a mixture of similar proteins composed of two immunologically distinct subunits, the α and β chains, which combine to yield αα(S100a0), αβ(S100a), and ββ (S100B) forms. The isoforms αβ and ββ are predominantly present in astroglial cells of the CNS and commonly referred to as the brain-specific S100B protein. S100B is eliminated by urinary excretion and renal metabolism (11). The biologic halflife has not been exactly established. Recent studies suggest that it is well below 60 minutes (12). Concentrations of S100 have been determined in CSF and in blood. Van Engelen and Nygaard reported that S100 concentrations in CSF increase with age (13,14). This was recently confirmed by Wiesmann et al.,(15) who determined the concentration of S100 in blood in 200 healthy blood donors between 18 and 65 years of age. The median plasma concentration of S100b was 0.05 µg/L. There was no difference between men and women. Serum S100 level >0.2 µg/L is considered pathologic (16). In line with the possibility that astrocytes respond to brain insults with increased S100B release is the observation that serum levels of S100B increase significantly after head injury (Rothoerl et al., 1998), cardiac arrest (Rosen et al., 1998), cardiac surgery (Kumar et al., 1997) and stroke (Buttner et al., 1997). Other evidence suggests that serum S100B may be a marker of blood–brain barrier opening that is not necessarily related to neuronal damage (17). It is reasonable to hypothesise that S100B accumulates in the extracellular space after astrocyte death or due to increased release by activated astrocytes, or after cellular disintegration of the damaged parenchyma. 7
Biomarkers of inflammation C-reactive protein (CRP). This acute phase protein is produced by the liver (18) and by adipocytes (19). It is a member of the pentraxin family of proteins. C-reactive protein was originally discovered by Tillett and Francis in 1930 as a substance in the serum of patients with acute inflammation that reacted with the C polysaccharide of pneumococcus (20). Plasma CRP rises whenever an inflammatory process is present and characteristically, its serum concentration depends only on the intensity of the stimulus and on the rate of synthesis (2127). Recently, it was shown that elevated CRP levels independently predict the risk of future stroke and transient ischemic attack in the elderly (28). After acute stroke, a single CRP concentration measured within 72 hours was found to be an independent predictor of survival in a subgroup analysis from a prospective observational study (29). In this study survival in patients with CRP levels >1.01 mg/dL was significantly worse (29). Di Napoli et al (30) studied the 1-year prognostic influence of CRP measured within 24 hours after ischemic troke and described an association between increased levels of CRP and unfavorable outcome. A recent investigation analyzed the association between CRP measured within 24 hours after ischemic stroke, after 48 to 72 hours, and at hospital discharge and long-term outcome (31). The authors found that CRP concentration at discharge was better related to outcome than earlier measurements. One can conclude that a reactive acute phase response due to an accompanying infection could not be ruled out if blood samples were taken within 24 hours after symptom onset. Similarily, the CRP level measured within 12 hours after symptom onset of an acute ischemic stroke is not independently related to long-term prognosis. In contrast, a CRP increase between 12 and 24 hours after symptom onset predicts an unfavorable outcome and is associated with an increased incidence of cerebrovascular and cardiovascular events (32). Procalcitonin (PCT). PCT is classifeid as hormokine since it has simultaneously hormone and cytokine properties (33). Procalcitonin is a prohormone physiologically transformed into calcitonin by the medullary cells of the thyroid. However, the origin of this substance can be extrathyroidal. High PCT levels were found in thyroidectomized septic patients, while calcitonin levels were undetectable. Furthermore, the rise in PCT in the absence of an increase of mature calcitonin has been described during bacterial infection (34). Inflammatory response is a principal early component in the pathophysiology of stroke (35). PCT—a marker of septicemia and infection severity (36)—has also been proposed as an indicator of systemic inflammatory response in noninfectious situations (37,38). There are 8
only few studies related to PCT in stroke. A pilot study on the prognostic value of PCT in acute stroke found no correlation between serial serum PCT levels and stroke mortality or neurologic outcome at discharge (39). Studies have correlated laboratory parameters with prognosis in acute stroke, sometimes with conflicting results (40-42). Prognostic utility of laboratory parameters in acute stroke is limited by the need to perform serial measurements, together with the interrelation of at least some of the inflammatory markers. Hence, determination of stroke severity by clinical criteria and appropriate imaging techniques remains the main prognostic tool in acute stroke settings (43), and the optimal biochemical marker (if any) is still unknown.
Role of leukocytes in acute ischemic stroke Leukocytes accumulate in the region of cerebral ischemia in the early stage of stroke, within hours (44). The neurological outcome was shown to be worse and the infarct larger in patients with severe polymorphonuclear leukocyte (PMNL) accumulation (45). A significant correlation between stroke volume or stroke severity and an acute increase of white blood cell (WBC) in the peripheral blood have been reported (46-48). Increased aggregation of peripheral leukocytes in the absence of WBC elevation was also reported in major stroke (47). Increased in vitro adhesive properties, activation of leukocytes indicated by increased plasma oxidation of adrenaline to adrenochrome and higher plasma levels of cytokines and proteases have been shown in ischemic stroke and TIA (49-52). While these studies addressed the detrimental effect of leukocyte activation, it may also play a major role in defense against pathogens, and participate in combating infections. A deficient activation of leukocytes may thus contribute to an increased susceptibility to post-stroke infections. Leukocyte antisedimentation rate (LAR). We have recently established a simple test to examine activation of leukocytes by measuring upward floating in a tube during one hour of gravity sedimentation. The LAR indicates the percentage of leukocytes crossing the middle line of the blood column upwards during 1 hour of sedimentation (53). In short, Westergreen blood sedimentation rate technique was modified for measuring leukocyte motion during gravity sedimentation of the whole blood. After one hour sedimentation, the leukocyte counts of upper and lower half sections were measured with an automatic cell counter (Coulter Counter CBC5, Coulter Electronics Ltd, Luton, UK) and results were expressed as a rate (53,54).
9
Figure 1. Calculation of leukocyte antisedimentation rate
10.000/µl 8.000/µl
By definition, LAR can be calculated after 1 hour gravity sedimentation by the following equation:
6.000/µl
[upper-lower/upper+lower]x100 = LAR (%) (upper=content of wbc in the upper half,
0’
60’ LAR: 25%
lower=content of wbc in the lower half of the blood column.)
It has been shown that a raised LAR is positively correlated with enhanced leukocyte adherence proportional to activation, with an increased cell volume and higher vacuole content of polymorphonuclear leukocytes (54). LAR correlated significantly with serum procalcitonin (PCT) and C-reactive protein (CRP) concentration in critically ill patients with severe sepsis (55). The simple LAR test was a good positive predictor of bacteraemia in critically ill patients presenting their first febrile episode without preceding antibiotic treatment (56,57).
N-terminal –prohormone of brain derived natriuretic peptid (NT-proBNP) Natriuretic peptides play an importent role in the regulation of cardiovascular homeostasis and fluid volume. Increased plasma levels of natriuretic peptide hormones have been identified as predictors of cardiac dysfunction and death in many critical care settings, including congestive heart failure, myocardial infarction and septic shock (58-60). The prohormone brain natriuretic peptide (pro-BNP) is produced by ventricular myocytes in response to wall stress (61). In the circulation the biologically active hormone is separated from the N-terminal part of the prohormone termed NT-proBNP. It promotes natriuresis and diuresis, acts as vasodilator and aldosterin antagonist and also inhibits the endothelin release and smooth cell proliferation (62). Because BNP- or NT-proBNP-guided therapy of heart failure could reduce the occurance of cardiac events (63) and thereby decrease mortality (64), the marker itself seems to be an early predictor of prognosis and myocardial dysfunction in patients with septic shock (60), investigation of their levels and prognostic significans in patients after CPR with or without sepsis is of great interest.
10
Transient Ischemic Attack (TIA) Neurological event with the signs and symptoms of a stroke, but which go away within a short period of time (less than 24 hours). Also called a mini-stroke, a TIA is due to a temporary ischemia to the brain. This is often caused by the narrowing (or, less often, ulceration) of the carotid arteries. TIAs typically last 2 to 30 minutes and can produce problems with vision, dizziness, weakness or trouble speaking. If not treated, there is a high risk of having a major stroke in the near future. People who have a TIA have a 25% greater risk of having a stroke or other serious complication within 90 days (65). In one study of people followed for 3 months after a TIA, about 10% had strokes, half of them in the 2 days after their TIA (66). This was more than 50 times the stroke rate than expected in people of their age. One fifth of the strokes were fatal and nearly two-thirds were disabling.
Acute ischemic stroke The World Health Orginazation’s (WHO) standard definition of stroke is „a focal (or at times global) neurological impairment of sudden onset, and lasting more than 24 hours (or leading to death) and of presumed vascular origin”. Approximately 80% of cases are ischemic, 20% are hemorrhagic. In addition to stroke being the third leading cause of death, many survivors of stroke have to adjust to a life with varying degrees of disability (67). Stroke has a high incidence worldwide – in the United States 700,000 people are affected each year leading to over 150,000 death (68). In Hungary, approximately 40,000 patients per year are admitted to hospital with the diagnosis of stroke and stroke mortality is extremely high in Central-Eastern European countries (69). While the direct neurological deficit cause early death, infectios complications prevail in the postacute phase of stroke contributing to the poor outcome. 18-28% of patients developed a poststroke infection in different studies. In addition, infectious complications (predominantly chest and urinary tract infections) have been frequently reported within the first few days after stroke resulting in an increased mortality rate and worse clinical outcome (70). Acute infections may also increase the risk of stroke, particularly during the first 3 days of infection (74,75). Immunodepression has been reported in other potentially life-threatening conditions, such as myocardial infarction, polytrauma or major surgery, causing an increased risk of infectious complications (76,77). Immunodepression after stroke could be partially overcome by suppression of the sympathetic nervous system resulting in enhanced cellular immune responses and prevention of bacterial infections (78,79). Thus, early identification of those at increased risk of post-stroke infection should represent a significant contribution to 11
health improvement so that interventions (early antibiotic therapy) can be targeted to those most likely to benefit.
Perioperative cognitive dysfunction (POCD) Advances in anaesthetic and surgical techniques have led to the assumption that postoperative cognitive decline is currently less common than previously. The benefits of such technological advances, however, may have been offset by inclusion of older patients with more comorbidity. The neurobehavioural outcomes range from the well-documented incidence of stroke to the less well-delineated postoperative delirium, cognitive difficulties (such as memory loss and visuospatial deficits), and depression. Prolonged postoperative cognitive dysfunction (POCD) is reported to occur frequently after cardiac surgery (80). However, it is rarely assessed in routine clinical practice and receives little attention after noncardiac major surgery. The incidence of cognitive dysfunction has been reported to be between 1% and 60%, depending on the type of operation (81). Multiple etiologies, including age, preexisting cerebrovascular disease, prior functional and American Society of Anesthesiology (ASA) status, urgency of operation, general versus regional anesthesia, have been proposed to explain cognitive dysfunction but the causative factors are unknown and the severity of dysfunction is unpredictable (82-85). Few previous studies have focused on thoracic and vascular surgical patients as a primary study group with a long-term follow-up, despite aortic aneurysm and noncardiac thoracic operations were found to be high-risk procedures for delirium with 7% of incidence (82). Even less data can be found concerning POCD related to lung surgery, where one-lung anesthesia should cause transient hypoxia, which could be associated with cognitive dysfunction, nevertheless there was no association of intraoperative oxygenation with cognitive dysfunction (86,87).
Post-cardiac arrest syndrome (PCAS) Among cardiac arrest survivors, brain injury is the major determinant of functional outcome and quality of life. A major goal is to identify patients destined for poor neurological outcomes (88). The failure of injured structures to recover leads to a spectrum of neurological dysfunction including the inability to perform tasks independently, persistent vegetative state, coma, and brain death (Cerebral Performance Category: 3,4 and 5 respectively)(89). The need for protracted high-intensity care of neurologically devastated survivors presents an immense burden to healthcare systems and society in general (90). To limit this burden, clinical factors and diagnostic tests are needed to prognosticate functional outcome. Many studies have 12
identified (pre-, intra- and post-cardiac arrest) factors associated with poor functional outcome after resuscitation, but no studies have shown a reliable predictor of outcome. Beside others, biochemical markers have been used to prognosticate functional outcome after cardiac arrest. Numerous studies show varying thresholds of NSE < from 30 to 65 µg/L for poor outcome and mortality (91-94). In cardiac arrest survivors, S100B similarily showed high specificity with low sensitivity (93,95,96) The prognosis of survival in patients with cardiac arrest still remains poor due to the whole-body ischemia/reperfusion syndrome, with alteration in immuno-inflammatory profile and consequently serious infectious complications (97). The importance of early recognition of systemic inflammatory response, leading to an exacerbation of the inflammatory balance is not questionable. During the last years procalcitonin (PCT) has become a well established marker to determine severe infections or sepsis in the early stage (98). The non brainoriginated PCT was found in successfuly resuscitated out-of-hospital cardiac arrest victims as sensitive and specific as the brain originated S100B regarding the neurological outcome becoming a surrogate marker for hypoxic brain damage, reflecting the severity of tissue oxigen depth (99). Thereafter, PCT levels per se should be interpreted with caution regarding the diagnosis of infection after cardiopulmonary resuscitation (CPR). Similarily, the diagnostic role of PCT in contrast to CRP as a marker for ventilator associated pneumonia (VAP) after successful CPR was also proven (100). There is a great need for further biomarkers or their combination in order to distinguish the acute phase response due to tissue injury and the infectious complications which might lead us to new therapeutic approaches in postresuscitation care.
REFERENCES 1. 2. 3. 4. 5. 6.
7.
8.
Bakay RA, Ward AAJ. Enzymatic changes in serum and cerebrospinal fluid in neurological injury. J Neurosurg. 1983;58:27–37. Moore BW, McGregor D. Chromatographic and electrophoretic fractionation of soluble proteins of brain and liver. J Biol Chem.1965;240:1647–1653. Cooper EH. Neuron-specific enolase. Int J Biol Markers. 1994; 4:205–210. Marangos PJ, Schmechel DE. Neuron specific enolase, a clinically useful marker for neurons and neuroendocrine cells. Ann RevNeurosci. 1987;10:269–295. Johnsson P. Markers of cerebral ischemia after cardiac surgery. J Cardiothorac Vasc Anesth. 1996;10:120–126. Nygaard Ø, Langbakk B, Romner B. Neuro-specific enolase concentrations in serum and cerebrospinal fluid in patients with no previous history of neurological disorder. Scand J Clin Lab Invest. 1998;58:183–186. Raabe A, Grolms C, Keller M, Döhnert J, Sorge O, Seifert V. Correlation of computed tomography findings and serum brain damage markers following severe head injury. Acta Neurochir (Wien). 1998;140:787–792.). Johnsson P. Merkers of cerebral ischemia after cardiac surgery. J Cardiothorac Vasc Anesth. 1996;10:120–126.
13
9. 10. 11. 12. 13.
14.
15. 16.
17.
18. 19. 20. 21.
22.
23. 24. 25.
26.
27. 28.
29. 30. 31. 32. 33.
Moore BW. A soluble protein characteristic of the nervous system. Biochem Biophys Res Commun. 1965;19:739–744. Donato R. Functional roles of S100 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type. Biochim Biophys Acta. 1999; 1450:191–231. Ytrebø LM, Nedredal GI, Korvald C, et al. Renal elimination of protein S-100beta in pigs with acute encephalopathy. Scand J Clin Lab Invest. 2001;61:217–225. Jönsson H, Johnsson P, Höglund P, Alling C, Blomquist S. The elimination of S-100b and renal function after cardiac surgery. J Cardiothorac Vasc Anesth. 2000;14:698–701. van Engelen BG, Lamers KJB, Gabreels FJM, Wevers RA, van Geel WJA, Borm GF. Age-related changes of neuron-specific enolase, S-100 protein, and myelin basic protein concentrations in cerebrospinal fluid. Clin Chem. 1992;38:813–816. Nygaard Ø, Langbakk B, Romner B. Age- and sex-related changes of S-100 protein concentrations in cerebrospinal fluid and serum in patients with no previous history of neurological disorder. Clin Chem. 1997;43:541–543. Wiesmann M, Missler U, Gottman D, Gehring S. Plasma S-100b protein concentration in healthy adults is age and sex independent. Clin Chem. 1998;44:1056–1058. Ingebrigtsen T, Romner B, Kongstad P, Langbakk B. Increased serum concentrations of protein S-100 after minor head injury: a biochemical serum marker with prognostic value? J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1995;59:103–104. Kapural M.; Krizanac-Bengez L.; Barnett G.; Perl J.; Masaryk T.; Apollo D.; Rasmussen P.; Mayberg M.R.; Janigro D.Serum S-100 as a possible marker of blood-brain barrier disruption Brain Research 2002; 940:102-104. Pepys MB, Hirschfield GM. C-reactive protein: a critical update. J. Clin. Invest. 2003, 111 (12): 1805– 12. Lau DC, Dhillon B, Yan H, Szmitko PE, Verma S. Adipokines: molecular links between obesity and atheroslcerosis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2005, 288 (5): H2031–41. Tillett WS, Francis Jr T. Serological reactions in pneumonia with a nonprotein somatic fraction of pneumococcus J Exp Med 1930, 52: 561–585. Povoa P, Coelho L, Almeida E, Fernandes A, Mealha R, Moreira P, SabinoH. Pilot study evaluating Creactive protein levels in the assessment of response to treatment of severe bloodstream infection. Clin Infect Dis 2005, 40:1855-1857. Elevated levels of CRP are present among patients at risk for further first-ever myocardial infarction and stroke (Ridker PM, Buring JE, Shih J, Matias M, Hennekens CH. Prospective study of C-reactive protein and the risk of future cardiovascular events among apparently healthy women. Circulation. 1998;98:731–733. Lagrand WK, Visser CA, Hack CE, Niessen HW, Nijmeijer R. C-reactive protein and cardiovascular disease: linked by complement? Nephrol Dial Transplant. 2000;15:1709–1710. Lagrand WK, Visser CA, Hermens WT, Niessen HW, Verheugt FW, Wolbink GJ, Hack CE. C-reactive protein as a cardiovascular risk factor: more than an epiphenomenon? Circulation. 1999;100:96–102. Liuzzo G, Biasucci LM, Gallimore JR, Grillo RL, Rebuzzi AG, Pepys MB, Maseri A. The prognostic value of C-reactive protein and serum amyloid a protein in severe unstable angina. N Engl J Med. 1994;331: 417–424. Koenig W, Sund M, Frohlich M, Fischer HG, Lowel H, Doring A, Hutchinson WL, Pepys MB. Creactive protein, a sensitive marker of inflammation, predicts future risk of coronary heart disease in initially healthy middle-aged men: results from the MONICA (Monitoring Trends and Determinants in Cardiovascular Disease) Augsburg Cohort Study, 1984 to 1992. Circulation. 1999;99:237–242. Koenig W. Inflammation and coronary heart disease: an overview. Cardiol Rev. 2001;9:31–35. Rost NS, Wolf PA, Kase CS, Kelly-Hayes M, Silbershatz H, Massaro JM, D’Agostino RB, Franzblau C, Wilson PW. Plasma concentration of C-reactive protein and risk of ischemic stroke and transient ischemic attack: the Framingham Study. Stroke. 2001;32:2575–2579. Muir KW, Weir CJ, Alwan W, Squire IB, Lees KR. C-reactive protein and outcome after ischemic stroke. Stroke. 1999;30:981–985. Di Napoli M, Papa F, Bocola V. Prognostic influence of increased C-reactive protein and fibrinogen levels in ischemic stroke. Stroke. 2001;32:133–138. Di Napoli M, Papa F, Bocola V. C-reactive protein in ischemic stroke: an independent prognostic factor. Stroke. 2001;32:917–924. Stroke. 2002;33:2459-2464. Christ-Crain M, Muller B. Procalcitonin in bacterial infections – hype, hope more or less? Swiss Med Wkly 2005,135:451-460.
14
34. Assicot M, Gendrel D, Carsin H et al. High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection. Lancet 1993;341:515-518. 35. Emsley HC, Smith CJ, Gavin CM, et al. An early and sustained peripheral inflammatory response in acute ischaemic stroke: relationships with infection and atherosclerosis. J Neuroimmunol 2003;139:93– 101. 36. Assicot M, Gendrel D, Carsin H et al. High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection. Lancet 1993;341:515-518. 37. Carsin H, Assicot M, Feger F, et al. Evolution and significance of circulating procalcitonin levels compared with IL-6, TNF alpha and endotoxin levels early after thermal injury. Burns 1997;23:218–24. 38. Mimoz O, Benoist JF, Edouard AR, Assicot M, Bohuon C, Samii K. Procalcitonin and C-reactive protein during the early posttraumatic systemic inflammatory response syndrome. Intensive Care Med 1998;24:185– 188. 39. Serial serum procalcitonin changes in the prognosis of acute stroke Clinica Chimica Acta 2004,350:237–239. 40. Czlonkowska A, Ryglewics D, Lechowicz W. Basic analytical parameters as the predictive factors for 30-d case fatality rate in stroke. Acta Neurol Scand 1997;95:121–4. 41. Canova CR, Courtin C, Reinhart WH. C-reactive protein (CRP) in cerebrovascular events. Atherosclerosis 1999;147: 49– 53. 42. Winbeck K, Poppert H, Etgen T, Conrad B, Sander D. Prognostic relevance of early serial C-reactive protein measurements after first ischemic stroke. Stroke 2002;33:2459– 64. 43. Boysen G, Christensen H. Early stroke: a dynamic process. Stroke 2001;32:2423. 44. Pozzilli C, Lenzi GL, Argentino C, et al. Imaging of leukocyte accumulation in human cerebral infarcts. Stroke 1985;16:251-255., Wang PY, Kao CH, Mui MY, et al. Leukocyte accumulation in acute hemispheric ischemic stroke. Stroke 1993;24:236-240. 45. Akopov SE, Simonian NA, Grigorian GS. Dynamics of polymorphonuclear leukocyte accumulation in acute cerebral infarction and their correlation with brain tissue damage. Stroke 1996;27:1739-1743. 46. Audebert HJ, Rott MM, Eck T, et al. Systemic inflammatory response depends on initial stroke severity but is attenuated by succesful thrombolysis. Stroke 2004 ;35: 2128-2133. 47. Silvestrini M, Pietroiusti A, Troisi E, et al. Leukocyte count and aggregation during the evolution of cerebral ischemic injury. Cerebrovasc Dis 1998;8:305-309. 48 Kammersgaard LP, Jorgensen HS, Nakayama H, et al. Leukocytosis in acute stroke: relation to initial stroke severity, infarct size, and outcome: the Copenhagen stroke study. J Stroke Cerebrovasc Dis 1999;8:259-263. 49 Grau AJ, Berger E, Sung KL, et al. Granulocyte adhesion, deformability, and superoxide formation in acute stroke. Stroke 1992;23: 33-39. 50. Violi F, Rasura M, Alessandri C, et al. Leukocyte response in patients suffering from acute stroke. Stroke 1988;19:1283-84. 51. Vila N, Castillo J, Dávalos A, et al. Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke. Stroke 2000;31:2325-29. 52. Elneihoum AM, Falke P, Axelsson L, et al. Leukocyte activation detected by increased plasma levels of inflammatory mediators in patients with ischemic cerebrovascular diseases. Stroke 1996;27:1734-38. 53. Bogar L, Tekeres M. Leukocyte flotation during gravity sedimentation of the whole blood. Clin Hemorheol Microcirc 2000;22:29-33. 54. Bogar L, Tarsoly P, Jakso P. Characteristics of light and heavy polymorphonuclear leukocytes. Clin Hemorheol Microcirc 2002;27:149-53. 55. Bogar L, Tarsoly P. Leukocyte sedimentation and inflammatory complications after thoraco-abdominal operations. Biorheology 1999;36:91-92. 56. Bogar L, Molnar Z, Kenyeres P, et al. Sedimentation characteristics of leukocytes can predict bacteremia in critical care patients. J Clin Pathol 2006;59:523-25. 57. Bogar L, Molnar Zs, Tarsoly P, et al. Serum procalcitonin level and leukocyte antisedimentation rate as early predictors of respiratory dysfunction after oesophyageal tumour resection. Critical Care 2006;10:R110. 58. Gottlieb S, Kukin ML, Ahren D et al: Prognostic importance of atrial natriuretic peptide in patients with chronic heart failure. J Am Coll Cardiol. 1989; 13:153-159., 59 Hall C, Rouleau JL, Moye L et al: N-terminal proatrial natriuretic factor: an independent predictor of long-term prognosis after myocardial infarction. Circulation. 1994; 89:1934-1942., 60 Brueckmann M, Huhle G, Lang S. et al: Prognostic value of plasma N-Terminal pro-Brain Nautriuretic Peptide in patients with svere sepsis. Circulation. 2005; 112:527-534. 61. Magga J, Marttila M, Mantymaa P et al: Brain natriuretic peptide in plasma, atria, and ventricles of vasopressin- and phenylephrin infused consciuous rats. Endocrinology 1994; 134:2505-2515.
15
62. Hunt PJ, Espiner EA, Nicholls MG et al: Differing biological effects of equimolar atrial and brain natriuretic peptide infusions in normal man. J Clin Endocrinol Metab 1996; 81:3871-3876. 63. Troughton RW, Frampton CM, Yandle TG, et al. Treatment of heart failure guided by plasma aminoterminal brain natriuretic peptide (N-BNP) concentrations. Lancet 2000, 355:1126-1130. 64. Richards AM, Doughty R, Nicholls MG, et al.Plasma N-terminal pro-brain natriuretic peptide and adrenomedullin:Prognostic utility and prediction of benefit from carvedilol in chronic ischemic left ventricular dysfunction. Australia-New Zealand Heart Failure Group. J Am Coll Cardiol 2001, 37:17811787. 67. Truelsen T, Bonita R, Jamrozik K. Surveillance of stroke: a global perspective. Int J Epidemiol. 2001;30 Suppl 1:S11-6. 68. Millin MG, Gullett T, Daya MR. EMS management of acute stroke – out-of-hospital treatment and stroke system development. Prehosp Emerg Care. 2007;11:318-25 69. Mihálka L, Fekete I, Csépány T, Csiba L, Bereczki D. Basic characteristics of hospital stroke services in Eastern Hungary. Eur J Epidemiol. 1999;15:461-6. 70. Davenport RJ, Dennis MS, Wellwood I, Warlow CP. Complications after acut stroke. Stroke. 1996;27:415-420. 71. Johnston KC, Li JY, Lyden PD, Hanson SK, Feasby TE, Adams RJ, Faught RE, Jr., Haley EC. Medical and neurological complications of ischemic stroke: experience from the RANTTAS trial. RANTTAS investigators. Stroke. 1998;29:447-453. 72. Grau AJ, Buggle F, Schnitzler P, Spiel M, Lichy C, Hacke W. Fever and infection early after ischemic stroke. J Neurol Sci. 1999;171:115-120. 73. Langhorne P, Stott DJ, Robertson L, MacDonald J, Jones L, McAlpine C, Dick F, Taylor GS, Murray G. Medical complications after stroke: a multicenter study. Stroke. 2000;31:1223-1229. 74. Lindsberg PJ, Grau AJ. Inflammation and infection as risk factors for ischemic stroke. Stroke. 2003;34: 2518-2532. 75. Smeeth L, Thomas SL, Hall AJ, Hubbard R, Farrington P, Vallance P. Risk of myocardial infarction and stroke after acute infection or vaccination. N Engl J Med. 2004;351:2611-2618. 76. Livingston DH, Appel SH, Wellhausen SR, Sonnenfeld G, Polk HC, Jr. Depressed interferon gamma production and monocyte HLA-DR expression after severe injury. Arch Surg. 1998;123:1309-1312. 77. Woiciechowsky C, Asadullah K, Nestler D, Eberhardt B, Platzer C, Schoning B, Glockner F, Lanksch WR, Volk HD, Docke WD. Sympatetic activation triggers systemic interleukin-10 release in immunodepresssion induced by brain injury. Nat Med. 1998;4:808-813. 78. Konstantin P, Meisel C, Höflich C, Braun J, Halle E, Wolf T, Ruscher K, Victorov IV, Priller J, Dirnagl U, Volk HD, Meisel A. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. J Exp Med. 2003;198:725-736. 79. Sander D, Winbeck K, Kingelhöfer J, Etgen T, Conrad B. Prognostic relevance of pathological sympathetic activation after acute thromboembolic stroke. Neurology. 2001;57:833-838. 80. Newman MF, Kirchner JL, Phillips-Bute B et al. Longitudinal assessment of neurocognitive function after coronaryartery bypass surgery. N Engl J Med 2001; 344: 395–402. 81. Parikh SS, Chung F. Postoperative delirium in the elderly. Anesth Analg 1995;80:1223–32. 82. Marcantonio ER, Goldman L, Mangione CM, et al. A clinical prediction rule for delirium after elective noncardiac surgery. JAMA 1994;271:134–139. 83. Williams-Russo P, Urquhart BL, Sharrock NE, Charlson ME. Postoperative delirium: predictors and prognosis in elderly orthopedic patients. J Am Geriatr Soc 1992;40:759– 67. 84. Fisher BW, Flowerdrew G. A simple model for predicting postoperative delirium in older patients undergoing elective orthopedic surgery. J Am Geriatr Soc 1995;43: 175– 8. 85. Chung F, Meier R, Lautenschlager E, Carmichael FJ, Chung A. General or spinal anesthesia: which is better in the elderly? Anesthesiology 1987;67:422–7. 86. Moller JT, Cluitmans P, Rasmussen LS, et al. Long-term postoperative cognitive dysfunction in the elderly ISPOCD1 study. ISPOCD investigators: International Study of Post-Operative Cognitive Dysfunction. Lancet 1998;351: 1888–9. 87. Grichnik PK, Ijsselmuiden JJA, D’Amico AT, Harpole HD, White DW, Blumenthal AJ, Newman FM. Cognitive Decline After Major Noncardiac Operations: A Preliminary Prospective Study. Ann Thorac Surg 1999;68:1786–91 88. Geocadin RG, BuitragoMM,TorbeyMT, Chandra-Strobos N, WilliamsMA, Kaplan PW.Neurologic prognosis and withdrawal of life support after resuscitation from cardiac arrest. Neurology 2006;67:105–8. 89. Nolan JP,Neumar RW, Adrie C, et al. Post-cardiac arrest syndrome: Epidemiology, pathophysiology, treatment, and prognostication. A Scientific Statement from the International Liaison Committee on
16
Resuscitation; the American Heart Association Emergency Cardiovascular Care Committee; the Council on Cardiovascular Surgery and Anesthesia; the Council on Cardiopulmonary, Perioperative, and Critical Care; the Council on Clinical Cardiology; the Council on Stroke. Resuscitation 2008;79:350–79. 90. GrayWA, Capone RJ, Most AS. Unsuccessful emergency medical resuscitation—–are continued efforts in the emergency department justified? N Engl J Med 1991;325:1393—1398. 91. Tiainen M, Roine RO, Pettila V, Takkunen O. Serum neuronspecific enolase and S-100B protein in cardiac arrest patients treated with hypothermia. Stroke 2003;34:2881—6. 92. Prohl J, Rother J, Kluge S, et al. Prediction of short-term and long-term outcomes after cardiac arrest: a prospective multivariate approach combining biochemical, clinical, electrophysiological, and neuropsychological investigations. Crit Care Med 2007;35:1230—7. 93. Martens P, Raabe A, Johnsson P. Serum S-100 and neuronspecific enolase for prediction of regaining consciousness after global cerebral ischemia. Stroke 1998;29:2363—6. 94. Martens P. Serum neuron-specific enolase as a prognostic marker for irreversible brain damage in comatose cardiac arrest survivors. Acad Emerg Med 1996;3:126—31. 95. Hachimi-Idrissi S, Van der Auwera M, Schiettecatte J, Ebinger G, Michotte Y, Huyghens L. S-100 protein as early predictor of regaining consciousness after out of hospital cardiac arrest. Resuscitation 2002;53:251—7. 96. Piazza O, Cotena S, Esposito G, De Robertis E, Tufano R. S100B is a sensitive but not specific prognostic index in comatose patients after cardiac arrest. Minerva Chir 2005;60:477—80. 97. Adrie C, Adib-Conquy M, Laurent I, Monchi M, Vinsonneau C, Fitting C, Fraisse F, Dinh-Xuan T, Carli P, Spaulding C, Dhainaut JF, Cavaillon JM. Successful cardiopulmonary resuscitation after cardiac arrest as a "sepsis-like" syndrome. Circulation. 2002, 106:562-568. 98. Karzai W, Oberhoffer M, Meier-Hellmann A, et al. Procalcitonin-a new indicator for the systemic response to severe infections. Infection 1997, 25:329-34. 99. Fries M, Kunz D, Gressner AM, Rossaint R, Kuhlen R. Procalcitonin serum levels after out-of-hospital cardiac arrest. Resuscitation 2003, 59:105-109. 100. Oppert M, Reinicke A, Müller C, Barckow D, Frei U, Eckardt KU. Elevations in procalcitonin but not C-reactive protein are associated with pneumonia after cardiopulmonary resuscitation. Resuscitation 2002, 53:167-170.
17
II. AIM OF THE STUDIES
I. The role of innate immune response in patients with acute ischemic stroke complicated by post-stroke infection Cerebrovascular diseases of acute onset, including ischemic stroke, are associated with diverse immune repsonses. The high incidence of infections in stroke patients is likely to be a result of an impaired immune function. Therefore, we investigated different biomarkers in patients within hours after onset of acute ischemic stroke and TIA to characterize the innate immune response and its relation to post-stroke infection and functional outcome. Furthermore, the aim of our study was to evaluate the most reliable markers in identifying a subset of stroke patients, which later develop infection. Therefore, we addressed, whether: 1. What is the relation of leukocyte activation to post-stroke infections? 2. Does post-stroke leukocyte activation depends on the duration of ischemia and the extent of infarct? 3. Can we use simple bed-side tests to predict outcome and susceptibility for poststroke infections? 4.
Does serial measurement of leukocyte activation show differences in acute ischemic stroke and TIA?
5. Does serial measurement of leukocyte activation show differences in patients with or without post-stroke infection? 6. Is there a relationship between leukocyte activation and functional outcome? 7. Does plasma hsCRP of patients with acute ischemic stroke differ from either TIA or healthy controls? 8. Are there differences in plasma hsCRP as marker of stroke in first-ever or recurrent stroke subpopulation? 9. Is there an association between plasma hsCRP level and NIHSS indicating the severity of symptoms? 10. Is there an association between the inflammatory aspect of atherogenesis represented by hsCRP and inflammation mediated by leukocytes? 11. Does serial measurement of hsCRP show any differences in patients with or without post-stroke infection?
18
12. Is there a relationship between hsCRP and functional outcome of acute ischemic stroke? 13. What is the best cut-off value of hsCRP in prediction of infectious complications after acute ischemic stroke? 14. To analyze functional alterations in cytokine production and cytotoxicity of innate lymphocyte subsets capable of shaping adaptive T cell responses in the acute phase of ischemic stroke.
II. Measurement of brain derived biomarkers in the sera of cardiac patients with accidentally provoked transient neurological signs by intravenous dipyridamole (DP) stress test Intravenously administered DP can induce short lasting and reversible minor neurologic deficit in high-risk vascular patients, that can be detected by using brain SPECT imaging providing a very early assessment of patients at risk of threatening cerebrovascular event. The aim of this prospective study was to determine: 15. Does DP-stress impact biomarkers (S100B, NSE, hsCRP)? 16. What is the frequency of transient neurological signs (TNS) during DP-stress? 17. Do induced biomarkers and TNS predict manifest cerebrovascular events? What is the incidence of a new cerebrovascular event in the high risk population selected by DP stress test and/or elevated S100B after DP stress within 7 years? 18. What is the best predictor of future cerebrovascular events in patients with coronary artery disease?
III. Measurement of biomarkers of endothel and platelet activation in the sera of patients with non-cardiac surgery Cardiac operations are frequently complicated by postoperative cognitive decline. Less common and less studied is postoperative cognitive decline after noncardiac surgery. Therefore, we examined: 19. What is the incidence of POCD after lung surgery at the Department of Surgery, University of Pécs, Hungary? 20. Is MMSE suitable for determination of POCD? 21. Could biomarkers reflecting immuno-endothelial dysfunctions be related to ischemia and neurocognitive alterations after lung surgery? 19
22. Which molecules are the best predictors of susceptibility for POCD before major surgeries?
IV. Measurement of biomarkers in the sera of successfully resuscitated cardiac arrest victims Increased plasma levels of natriuretic peptide hormones have been identified as predictors of cardiac dysfunction and death in many critical care settings. To date no studies were addressed to investigate the relationship between NT-proBNP and PCT in the serum of patients sucessfuly resuscitated after in-hospital cardiac arrest with or without concomitant infection or sepsis. Therefore, we performed a serial analysis of S100B, PCT and NT-proBNP in the first 72 postresuscitation hours in cardiac arrest victims to examine the role of these markers in prediction of septic complication: 23. Are there any difference in plasma level of PCT, S100B and NT-proBNP of patients resuscitated due to either ventricular fibrillation or asystole/pulsless electrical activity? 24. Are there any differences in plasma level of PCT, S100B and NT-proBNP of cardiac arrest victims with or without septic complication? 25. Is there any relationship between the measured biomarkers and clinical outcome?
20
III. SUMMARY OF PAPERS SUPPORTING THESES
I. THE ROLE OF INNATE IMMUNE RESPONSE IN PATIENTS WITH ACUTE ISCHEMIC STROKE COMPLICATED BY POST-STROKE INFECTION
Paper 1 Deficient leukocyte antisedimentation is related to post-stroke infections and outcome (J Clin Path, 2008, 61:1209-1213) Patients with stroke are more susceptible to infections suggesting possible deficiencies of early immune responses, particularly of leukocytes. Here, we examined whether postischemic activation of leukocytes is related to duration of ischemia and extent of infarct. We also addressed, if dsyregulated leukocyte activation might be related to post-stroke infection and worsen outcome. We used leukocyte antisedimentation rate (LAR) to detect activation of leukocytes and correlated LAR with clinical and laboratory parameters. An additional aim was to test simple bed-side investigations in predicting outcome and susceptibility for poststroke infections early. LAR, a simple test to detect activation of leukocytes was serially examined and correlated with blood level of S100β related to extent of infarct, procalcitonin indicating infection and outcome in patients with acute ischemic events. Venous blood samples were taken from 61 healthy volunteers and 49 patients with acute ischemic events: 38 patients with acute ischemic stroke, AIS, and 11 patients with transient ischemic attack, TIA where symptoms disappear in 24 hours and cranial CT scan does not indicate infarct. Sampling was done within 6 hours, at 24 and 72 hours after onset of symptoms. LAR was significantly higher in acute ischemic events within 6 hours after onset of stroke regardless of post-stroke infections. In addition, elevation of LAR was delayed and attenuated in TIA in contrast to AIS and we also observed a positive correlation between LAR and S100β at 72 hours after the onset of ischemic stroke both indicating that the extent of tissue injury correlates with the magnitude of innate immune responses. Importantly, a deficiency in early elevation of LAR was associated with post-stroke infections and a poor outcome measured by Glasgow Outcome Scale in AIS. We conclude that an early activation of leukocytes indicated by elevation of LAR is characteristic of acute ischemic cerebrovascular events. A delayed and ameliorated leukocyte
21
activation represented by LAR is characteristic to TIA in contrast to definitive stroke. Our data suggest that acute activation of leukocytes, which has been regarded detrimental so far, serves also to prevent post-stroke infections. Our data imply that concept about the postischemic role of leukocytes should be changed and dissected: recrution of leukocytes in the CNS may be damaging but should be separated from the systemic activation, which may prevent post-stroke infections. A disregulated early immune response or deficient leukocyte activation may result in an increased susceptibilty to infections in some patients with stroke.
***
Paper 2 Relationship between C-reactive protein and early activation of leukocytes indicated by leukocyte antisedimentation rate (LAR) in patients with acute cerebrovascular events (Clin Hemorheol, in press.) A non-specific inflammatory response occurs after stroke and the degree of inflammation is predictive of outcome. The purpose of this study was to determine the relationship between the acute phase reactant C-reactive protein (CRP) and leukocyte antisedimentation rate (LAR) as a specific test to detect early activation of leukocytes providing the first line of defence against infections. Here, we examined relationship among LAR, astroglia specific S100B indicating the extent of brain tissue damage and hsCRP in 49 patients within hours after onset of acute ischemic stroke (AIS) and transient ischemic attack (TIA) to characterize the innate immune response and its relation to the outcome. Serum levels of hsCRP on admission was significantly higher in patients with acute ischemic stroke (AIS) compared to healthy subjects and were higher in patients with recurrent to first ever ischemic stroke. Increased basal levels of hsCRP also correlated with extent of infarct reflected by S100B levels in sera, but did not correlate with post-stroke infections. However, a higher rate of infection was observed among patients, in whom hsCRP was elevated at 72 hours but LAR did not increase. Therefore, such late elevation of hsCRP may indicate pre-clinical infections due to deficient leukocyte activation. Indeed, our data indicate that early (within 6 hours) and late (after 72 hours) changes in serum levels of hsCRP may reflect different pathological processes in stroke. We can conclude that simple tests like LAR and hsCRP may help in predicting outcome and high risk of infectious complications.
22
***
Paper 3 Impaired function of innate T lymphocytes and NK cells in the acute phase of ischemic stroke (Cerebrovasc Dis, in press) While direct neurological deficits cause early deaths, infectious complications prevail in the postacute phase of stroke contributing to the poor outcome. The increased susceptibility to infections after stroke may suggest early alteration of immune responses, thus immunodepression induced by stroke has been proposed. The few animal and human studies all addressed the rapid changes in the adaptive arm of the immune system, mainly T cells. We analyzed rapid changes in immunological functions of cells of the innate immunity or lymphocytes bridging the innate and the adaptive arms of the immune system, all capable of shaping subsequent immune responses through rapid production of cytokines and/or cytotoxicity. The analyzed cell subsets were Vδ2 T cells, CD3+CD56+ natural killer T (NKT)like cells and CD3-CD56+ NK cells. Their frequencies, cytokine production, intracellular perforin, surface Fas ligand (FasL) expression, and NK cytotoxicity were measured in 28 patients’ peripheral blood obtained within 6 hours and also after 72 hours of ischemic stroke. The paired samples were compared both with each other and with 20 healthy controls. Percentages of Vδ2, NKT-like and NK cells at 6 and 72 hours after stroke were constant and similar to percentages in healthy subjects. In contrast, pro-inflammatory intracellular IFN-γ expression by Vδ2 T cells, NKT-like cells and NK cells and IFN-γ production by isolated NK cells in culture was low at 6 hours and reached the level of healthy subjects by 72 hours after stroke. Anti-inflammatory IL-4, IL-5 and IL-10 production of NKT-like and NK cells was not altered. Intracellular perforin expression by Vδ2 T cells, NKT-like cells and NK cells, and NK cytotoxicity were low at 6 hours and reached the level of healthy subjects by 72 hours. According to our results, pro-inflammatory and cytotoxic but not anti-inflammatory responses of NK, NKT-like and Vδ2 T cells become acutely deficient in ischemic stroke, which may contribute to an increased susceptibility to infections.
***
23
Paper 4 Immune responses and neuroimmune modulation in the pathogenesis of acute ischemic stroke and post-stroke infections (Ideggyógyászati Szemle, in press) Acute-onset cerebrovascular diseases are connected to a number of immunological changes. Here, we summarize immune responses participating in the evolution of atherosclerotic plaques and post-stroke local immune responses in the injured CNS as well as in the systemic circulation. Ischemic injury of the CNS alters the balanced neuroimmune modulation resulting in CIDS, the central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Due to the immunodepression and reduced pro-inflammatory immune responses, the susceptibility for infection is increased; indeed, post-stroke infection plays a major role in stroke-related mortality. On the other hand, CIDS may protect against damaging autoimmune responses elicited by exposed CNS antigens. Investigation of immune responses related to ischemic stroke may result in novel therapies indicated by an increasing number of experimental and clinical trials altering post-stroke immune responses and preventing infections.
II. MEASUREMENT OF BRAIN DERIVED BIOMARKERS IN THE SERA OF CARDIAC
PATIENTS
WITH
ACCIDENTALLY
PROVOKED
TIA
BY
INTRAVENOUS DIPYRIDAMOLE (DP) STRESS TEST
Paper 5 Dipyridamole stress test in the early evaluation of cerebral circulatory disorders? (Orv Hetil, 2000, 141:2717-2722) The diagnosis of transient ischaemic attack (TIA) is mainly based on the clinical symptoms presented by the patient. Professionals in nuclear medicine have made a successful attempt to detect TIA by single photon emission tomography (SPECT) imaging. Acetazolamide stress test was used to improve the sensitivity of the examination till now. Here, we examined the importance of dipyridamole (DP) stress induced accidental TIA. Patients with ischaemic heart disease were stressed by intravenously administered DP and considerably higher incidence (23%) of DP induced TIA was found than reported previously in the literature. The so called „TIA positive” patients were re-examined later on using the
24
combination of dipyridamole stress test and brain SPECT imaging which was compared to baseline brain SPECT at rest. The aim of this study was to analyse the relationship between transient neurological symptoms provoked by DP test and the change in regional cerebral blood flow indicated by brain SPECT imaging. Perfusion abnormalities revealed by brain SPECT were topographically consistent with the neurological deficits. We conclude that DP stress test provides an opportunity to provoke TIA safely, determining the high-risk patints threatened by cerebrovascular event. Combined with brain SPECT it may have an important role in the neurologic diagnostic evaluation, management of cardiac patients prior to major surgery and the prevention of stroke.
***
Paper 6 “Cerebrovascular stressing”: drug-induced S100B elevation and transient neurological signs predict ischemic cerebrovascular events (Atherosclerosis, submitted) This study was primarily conducted to compare the profile of serum S100B in the very early stage (within 6 hours after onset of symptoms) between stroke, spontaneous TIA and cardiac patients with and without dipyridamole (DP) induced transient neurological signs (TNS). Furthermore, we investigated the association between the clinical status (symptoms and signs provoked by DP), peak S100B levels and the risk of a future cerebrovascular event in patients with coronary artery disease who were stressed with DP. We found that DP itself did not influence the serum level of hsCRP, which is a good predictor of manifest stroke/TIA. However, DP had an impact on S100B protein release by presumably changing permeability of the BBB. Moreover, the median serum S100B level in cardiac patients with DP-induced TNS was very similar to spontaneous stroke/TIA and significantly differed from cardiac patients without DP-induced TNS. Results of 7 years follow-up: Manifest ischemic events occurred in 48% of patients (TIA: 15/37, stroke: 3/37) in seven years. Importantly, new cerebrovascular events occurred
25
in patients with DP-induced TNS twice as often as in patients without DP-induced TNS (64% vs. 30%, p=0.05). All ischemic events (TIA and stroke, n=18) and TIA (n=15) were more common among patients with DP induced elevation of S100B measured at T60 seven years earlier. When adjusted for age, gender and comorbidities in a multivariate analysis, DPinduced S100B above the cut-off value (S100B≥0.11ng/ml) indicated 70-times increased risk for manifest ischemic cerebrovascular events within 7 years. As the DP stress test is basically performed by cardiologists, symptoms of TIA are often unrecognized. Therefore, S100B can be a surrogate marker to select (cardio)vascular patients with high-risk for cerebrovascular events, who can have the most benefit from early therapy. SPECT brain scan combined with DP test might be an important diagnostic tool in the early recognition of silent cerebral circulatory disorders, stroke prevention and in the preoperative assessment of patients scheduled for cardiac surgery. In this context, for the analogy of “coronary stress” this method can serve as a tool for “cerebrovascular stress” as well.
III. MEASUREMENT OF BIOMARKERS OF ENDOTHEL ACTIVATION IN THE SERA OF PATIENTS WITH NON-CARDIAC SURGERY
Paper 7 Increased levels of baseline biomarkers reflecting platelet and endothelial activation predict early cognitive dysfunction after lung surgery (Eur J Anaesthesiol, 2009, 26:708-10) The reported high incidence of short term postoperative cognitive dysfunction (POCD) (33-83%) after cardiac surgery is mainly related to cardio-pulmonary bypass, however POCD is also frequent and potentially serious after elective lung surgery, where deleterious effect of pump is excluded. The goal of this study was to examine biomarkers reflecting immuno-endothelial dysfunctions, which could be related to ischemia and neuroco gnitive alterations, in the early
26
recognition of POCD after lung surgery: soluble P-selectin (sP-selectin), soluble vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), soluble CD40 ligand (sCD40L), tissue plasminogen activator (tPA), interleukin-6 (IL-6), interleukin8 (IL-8), S100B and high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP). We investigated 35 patients with non-small cell lung cancer, who underwent elective lung surgery. Patients with neuropsychiatric event in the past medical history, pre-existing cognitive dysfunction (defined as MMSE score below 24), and certain types of neoplasm resulting per se elevation in serum level of S100B (e.g. malignant melanoma) were excluded. Biomarkers were measured preoperatively and on the second postoperative day. Early neurocognitive deficit was assessed on admission by mini-mental status examination (MMSE0) and on the second postoperative day (MMSE48). POCD was defined as a decrease in MMSE score >3 points from baseline. Nine patients had POCD within 48 hours (25.7 %). Baseline scores of MMSE showed no significant difference in patients with or without POCD, however MMSE48 was significantly lower in patients with POCD. Similarly, the decline (%) between MMSE0 and MMSE48 was significantly higher in the POCD group. In summary, we found that molecules reflecting platelet and endothelium activation (sCD40L, sP-selectin, sVCAM-1, MCP-1) were increased preoperatively in patients developing POCD and remained elevated at least for 48 hours after lung surgery. We may hypothesize that the endothelium and platelets are more sensitive to immunological responses against tumors in a subpopulation of patients and become activated. Such pre-operative activation of platelets and endothelium can result in an increased activation/transmigration of leukocytes, disruption of blood-brain barrier and can also participate in brain ischemia resulting in POCD. In addition, these molecules may be used as potential biomarkers predicting susceptibility for POCD before major surgeries. Patients known to be at such an increased risk preoperatively may benefit from closer monitoring and earlier medical intervention or being offered non-surgical oncological treatment if the operative risk is considered to be unacceptable.
27
IV. MEASUREMENT OF BIOMARKERS IN THE SERA OF SUCCESSFULLY RESUSCITATED CARDIAC ARREST VICTIMS
Paper 8 Prognostic role of serum S100β and procalcitonin in patients after cardio-pulmonary resuscitation (Újraélesztés, 2004, 1:51-56) The prognostic value of S100β considering the neurological outcome in patients after cardio-pulmonary resuscitation (CPR) is already well documented. The non-SIRS related changes in PCT levels indicating brain cell damage can provide additional information. The aim of this pilot study was to reveal any difference between survivals and non-survivals in serum S100β and PCT levels after CPR, independently from the type of cardiac arrest. A total of 20 victims after either in or out-of-hospital successful resuscitation were investigated. CPR and postresuscitation treatment were carried out according to the current advanced life support (ALS) protocol of the European Resuscitation Council. Physical neurological examination was performed and serum S100β and PCT were serially measured on admission to the ICU (t 0), after 24 hrs (t
24)
and 72 hrs (t
72),
respectively. Biomarkers
were compared in 9 survivors and 11 non-survivers. In accordance with other papers, serum S100β level was higher in non-survivals indicating more severe anoxic brain tissue injury due to cardiac arrest, however the difference between the two groups was not significant (p=0.06). Interestingly, PCT serum level was very similar among survivors and non-survivors at any timepoints. Importantly, a significant negative correlation was found between PCT levels measured at t
24
and the time of anoxia (p<0.01), however such association was not revealed
between S100β and time of anoxia. To decide whether these biomarkers have any impact on the prognosis of patients after CPR, we have to expand the study on larger numbers of patients.
***
28
Paper 9 NT-proBNP as early marker of septic complications in patients after cardio-pulmonary resuscitation (Anesztézia és Intenzív Terápia, in press) In the postresuscitation phase, there is a whole-body ischaemia/reperfusion syndrome, which leads to alteration in the immuno-inflammatory profile and results in potentially serious infectious complications. Interestingly, the non brain-originated PCT investigated in out-ofhospital cardiac arrest was found as sensitive and specific as the CNS-derived S100B, regarding the neurological outcome. Moreover, there is a strict association between outcome and septic complication. Recent studies also suggested that NT-proBNP may be an early prognostic factor of myocardial dysfunction in patients with septic shock. Here, we examined wether NT-proBNP and/or PCT are useful markers in recognition of patients after CPR at risk of sepsis in the early post-resuscitation phase. After excluding preexisting conditions known to increase NT-proBNP levels, such as chronic heart insufficiency and renal insufficiency, a total of 35 patients were included into the study. Twenty-five patients suffered from asystole/pulseless electrical activity (ASYS/PEA) and 10 patients from ventricular fibrillation (VF). In the ASYS/PEA group, 28day survival was significantly decreased compared to the VF group. Definied upon the criteria of the ACCP/SCCM consensus conference, patients were further divided into septic (S) and non-septic (NS) groups. In the ASYS/PEA group, 8 patients were septic and 17 non-septic. Our study confirmed that NT-proBNP levels were elevated in patients with sepsis even after cardiopulmonary resuscitation. Interestingly, we found similarly elevated natriuretic peptide both in patients with severe sepsis (ASYS/PEA-S) and ischaemia induced myocardial dysfunction (VF), despite the marked pathophysiological differences in the circulatory response. The elevated NT-proBNP level in the serum of successfuly resuscitated patients after VF is not surprising, as severe ischemia always preceeds VF similarly to acute coronary occlusion, where the prompt elevation of serum NT-proBNP has been already reported. Obviously, serum procalcitonin levels were also significantly higher in patients with sepsis; however, we also observed an increase in patients, where cardiac arrest was presumably forestalled by significant hypoxic period independently from infection.
29
It seems that on ICU admission, serum NT-proBNP was similar to the inflammatory markers such as procalcitonin in septic patients, who underwent cardiopulmonary resuscitation, therefore it might be useful in early recognition of post-arrest septic complications.
30
IV. SUMMARY OF THESES 1. Activation of leukocytes represented by elevation in LAR happens within hours after onset of ischemic stroke. 2. Although LAR was elevated in TIA compared to healthy subjects, it was delayed and ameliorated compared to definitive ischemic stroke. 3. Decreased activation of leukocytes reflected by a deficient elevation of LAR may predispose to post-stroke infections and predict worse outcome. 4. Concept about uniformly harmful post-ischemic role of leukocytes should be changed and dissected: recruitment of leukocytes in the ischemic brain may be damaging by amplifying brain injury. However, systemic activation of leukocytes plays an important role in preventing post-stroke infections. 5. A positive correlation exists between LAR and S100β on the 3rd post-stroke day indicating a relationship between volume of infarct and innate immune responses. 6. CRP on admission was found significantly higher in patients with acute ischemic stroke (especially in recurrent stroke), however not in TIA patients, demonstrating that CRP is an indicator of atherothrombosis and an independent predictor of increased cardiovascular risk (including stroke) in apparently non-infected patients. 7. CRP has a predictive value for poor prognosis (GOS) and more severe symptoms (NIHSS) irrespective of post-stroke infections. 8. Early elevation of hsCRP also correlated with serum levels of S100B at 72 hours reflecting the size of infarct, supporting the hypothesis that magnitude of tissue injury may have an impact on response of acute phase reactants. 9. We also observed a late increase of hsCRP in patients with a tendency of decreased leukocyte activation, indicating a higher rate of infection. Such a late elevation of hsCRP by 72 hours thus may be an early pre-clinical sign of infections due to deficient leukocyte activation. Indeed, our data indicate that early (within 6 hours) and late (after 72 hours) changes in serum levels of hsCRP may reflect different pathological processes in stroke. 10. The percentages of particular innate lymphocytes Vδ2, NKT-like and NK cells do not change in the acute phase of ischemic stroke in contrast to published decrease of conventional αβT cells.
31
11. In contrast to the percentages, an acute functional deficiency of innate T lymphocytes and NK cells occured in the acute phase of ischemic stroke, within 6 hours: proinflammatory cytokine production, expression of perforin and NK cytotoxicity were decreased, while there was no change in production of Th2 cytokines and Th2-related ICOS expression. We may hypothesize that such early deficiency or its disregulated normalization may substantially influence susceptibility to infections, similar to animal models of cerebral ischemia. 12. The stress agent dipyridamole (DP) can provoke transient neurological signs (TNS) in cardiac patients indicating the disorders of the cerebrovascular system as well. Additionally, DP stress combined with brain SPECT imaging is suitable for an early visualisation of cerebral circulatory disorders, hence it could play an important role in the primary prevention of stroke and preoperative management of patients scheduled for cardiac surgery. 13. Investigating the association between peak S100B and the risk of future cerebrovascular events in cardiac patients, we found that both elevation of S100B and TNS were more common among patients who experienced manifest stroke/TIA within seven years (75% and 67 %, respectively, in seven years). However, in multivariate analysis, only DP-induced elevation of S100B was a good independent predictor of stroke and TIA after adjusting for confounding factors: the risk of such events within seven years was 70-times higher. 14. Molecules reflecting platelet and endothelium activation (sCD40L, sP-selectin, sVCAM-1, MCP-1) are increased preoperatively in patients developing POCD and remaine elevated at least for 48 hours after lung surgery. 15. These molecules may be potential biomarkers predicting susceptibility for POCD before major surgeries; patients known to be at such an increased risk preoperatively may benefit from closer monitoring and earlier medical intervention or being offered non-surgical oncological treatment if the operative risk is considered to be unacceptable. 16. Patients with PEA arrest often have long, undetected preceding hypoxic period, triggering the release of inflammatory markers such as PCT. Contrary, significantly lower inflammatory response can be detected in patients initially in VF arrest, with significantly better survival, independently from anoxic time and time to ROSC reflecting by nearly identical S100B levels.
32
17. NT-proBNP is elevated after successful cardiopulmonary resusitation in patients who became septic and its kinetics was similar to inflammatory markers such as procalcitonin; therefore it might be useful in early recognition of post-arrest septic complications.
33
V. BIBLIOGRAPHY ARTICLES 1. Molnar T, Zambo K, Scmidt E, Tekeres M. Dipyridamole teszt az agyi keringészavarok korai felismerésében? [Dipyridamole stress test in the early evaluation of cerebral circulatory disorders?] Orv Hetil, 2000, 141:2717-2722
2. The In TIME-II Investigators: Intravenous NPA for the treatment of infarcting myocardium early. InTIME-II, a double-blind comparison of single-bolus lanoteplase vs accelerated alteplase for the treatment of patients with acute myocardial infarction. Eur Heart J, 2000, 21:2005-2013 (Impakt factor: 5.153)
3. Molnár T, Kőszegi T, Szakmány T, Bogár L. A szérum S100β és procalcitonin szintjének prognosztikai jelentősége újraélesztett betegeknél. [Prognostic role of serum S100β and procalcitonin in patients after cardio-pulmonary resuscitation] Újraélesztés, 2004, 1:51-56
4. Molnar T, Peterfalvi A, Szereday L, Pusch G, Szapary L, Komoly S, Bogar L, Illes Z. Deficient leukocyte antisedimentation is related to post-stroke infections and outcome. J Clin Pathol, 2008, 61:1209-1213 (Impakt factor: 2.24)
5. Molnár T. S100 fehérje meghatározás és szerepe az intenzív osztályon. [Measurement and importance of serum S100B in the intensive care] Focus Medicinae, 2008, 2:25-31
6. Molnar T, Jakab L, Palinkas L, Molnar FT, Bogar L, Illes Z. Increased levels of baseline biomarkers reflecting platelet and endothelial activation predict early cognitive dysfunction after lung surgery Eur J Anaesthesiol, 2009, 26:708-10 (Impakt factor:1.435)
34
7. Molnar T, Papp V, Szereday L, Pusch G, Szapary L, Bogar L, Illes Z. Relationship between C-reactive protein and early activation of leukocytes indicated by leukocyte antisedimentation rate (LAR) in patients with acute cerebrovascular events Clin Hemorheol and Microcirc, 2009 (in press) (Impakt factor: 0.977)
8. Peterfalvi A, Molnar T, Pusch G, Szereday L, Illes Z. Impaired function of innate T lymphocytes and NK cells in the acute phase of ischemic stroke. Cerebrovasc Dis, 2009 (in press) (Impakt factor: 3.041 )
9. Papp V, Molnár T, Illés Z. Az immunválasz és a neuroimmun moduláció szerepe az akut ischaemiás stroke és a post-stroke infekció patogenezisében. [Immune responses and neuroimmune modulation in the pathogenesis of acute ischemic stroke and poststroke infections] Ideggy Szle/Clin Neursoci, 2009 (in press)
10. Molnar T, Bogar L, Koszegi T, Szakmany T. NT- proBNP: a szeptikus komplikáció korai markere újraélesztett betegekben. [NT-proBNP as early marker of septic complications in patients after cardio-pulmonary resuscitation] Aneszteziológia és Intenzív Terápia, 2009 (in press)
11. Molnar T, Szabo Z, Schmidt E, Barta E, Zambo K, Illes Z. “Cerebrovascular stressing”: drug-induced S100B elevation and transient neurological signs predict ischemic cerebrovascular events Atherosclerosis, 2009 (submitted) (Impakt factor: 4.601)
Cumulative impact factor:
12.85
Cumulative impact factor of published papers related to Theses:
7.69
Cumulative impact factor of a submitted paper under reviewing:
4.60
35
CONGRESS ABSTRACTS
1. Molnár T, Nagy F, Czopf J. Brainstem auditory evoked potentials (BAEP), blink reflex (BR) and masseter inhibitory reflex (MIR) examinations in healthy subjects and patients with brainstem lesions. Congress of Clinical Neurophysiology for Eastern European Countries, 1993, Szczeczin, Poland
2. Molnár T, Nagy F, Schneider J, Czopf J. Experiences with computer-analysed blink reflex (BR) and masseter inhibitory reflex (MIR) data obtained from healthy subjects and from patients with brainstem lesions. VIIth European Congress of Clinical Neurophysiology, 1995, Budapest, Hungary
3. Molnár T, Zámbó K. Agyi SPECT vizsgálatok migrénes betegekben. Migrén Szimpózium, 2000, május, Pécs
4. Molnár T, Zámbó K, Schmidt E, Tekeres M. Új lehetőség az agyi keringészavarok korai felismerésében? Dipyridamole teszt a neurológiai diagnosztikában? XXX. MAITT kongresszus, 2000, Siófok, Hungary
5. Molnár T, Bogár L. Gyulladásos markerek és a neuromuscularis funkció zavarának összefüggése tartósan lélegeztetett betegeken. Fiatal Magyar Aneszteziológusok V.Kongresszusa, 2001 május, Sopron
6. Molnár T, Zámbó K, Schmidt E, Udvaros E, Bogár L. Dipyridamole stress test for early evaluation of cerebral circulatory disorders. Annual Congress of the European Association of Nuclear Medicine, 2001, Napoli, Italy, Eur J Nuc Med, 2001, 28(8):951-1298. (p1222) (Impact factor: 3.464)
7. Molnár T, Zámbó K, Schmidt E, Bogár L. Initial experince with a pharmacological stress test for early evaluation of cerebral circulatory disorders. European Stroke Conference, 29th May-1st June, 2002, Geneva, Switzerland, Cerebrovasc Dis, 2002, 18 (suppl 2): (Impact factor: 1.852) 36
8. Molnár T, Kőszegi T, Szakmány T, Bogár L. Szérum S100B változása gyógyszer indukálta TIA esetén. XXXI. MAITT Kongresszus, 2003 június19-21, Pécs
9. Molnár T, Kőszegi T. Szakmány T, Bogár L. Change of S100B in the sera of patients with drug-induced TIA. Biochemical Markers of Brain Damage Congress, 25th-27th September, 2003, Lund, Sweden
10. Molnár T, Kőszegi T, Szakmány T, Bogár L. Changes of biomarkers in the sera of patients with coronary artery disease after drug-induced Transient Ischemic Attack (TIA). European Stroke Conference, 12-15 May, 2004, Mannheim-Heidelberg, Germany, Cerebrovasc Dis, 2004, 17 (suppl 5):1-125, p120 (Impact factor: 2.150)
11. Molnár T, Kőszegi T, Szakmány T, Bogár L. S100B release in a human model of transient ischemic attack. 6th International Meeting for Brain Energy Metabolism, 2124 May, 2004, Heraklion, Crete, Greece
12. Molnár T, Szakmány T, Kőszegi T, Bogár L. A szérum S100B és PCT szint prognosztikai jelentősége újraélesztett betegeknél. Magyar Aneszteziológiai és Intenzív Terápiás Társaság XXXII. Kongresszusa, 2004, május 26-29, Eger
13. Molnár T.: Központi idegrendszeri prognosztizálás újraélesztett betegekben. Budapest Aneszteziológiai Szimpózium, 2005, február 19, Budapest
14. Molnár T, Zambó K, Szabó Z. Pulse pressure predicts transient myocardial perfusion abnormalities during dipyridamole stress test. Fifth International Congress of The Croatian Society of Nuclear Medicine, May 15-18, 2005, Opatija, Croatia, Nucl Med Rev 2005, 8(1):1-86. (p.56) (Impact factor:1.097)
15. Molnár T, Zambó K, Szabó Z. Pulse pressure predicts transient myocardial perfusion abnormalities during dipyridamole stress test. Fifteenth European Meeting on Hypertension, June 17-21, 2005, Milan, Italy, 37
Hypertension, 2005, 45 (1055) (Impact factor: 6.331)
16. Molnar T, Koszegi T, Szakmány T. Changes of procalcitonin and S100B after ventricular fibrillation and pulseless electrical activity. 18th ESICM Annual Congress, September 25-28, 2005, Amsterdam, The Netherlands, Int Care Med, 2005, 31(Suppl 1):460 (Impact factor: 3.724)
17. Molnar T, Bogar L, Koszegi T, Szakmany T. NT-proBNP: a new sepsis marker in patients after cardio-pulmonary resuscitation? 8th Congress of the ERC, May 11-13. 2006, Stavanger, Norway, Resuscitation, 2006, 69:96. (Impact factor: 2.314)
18. Jónás A, Szakmány T, Molnár T. Az NT-proBNP és a microalbuminuria szerepe subarachnoidalis vérzésben. MAITT Kongresszus, 2006, Május 18-21, Szeged, Aneszteziológia és Intenzív Terápia, 2006, 36(Suppl 1):30.
19. Molnár T, Jónás A, Szakmány T, Bogár L. The role of BNP and microalbuminuria in patients with subarachnoid haemorrhage. 19th Annual Congress of ESICM, 24-27 September, 2006, Barcelona, Spain, Int Care Med, 2006, 32(Suppl 1):0888. (Impact factor: 4.406)
20. Molnár T, Bátai I, Bogár L. Intraoperative SEP monitoring during scoliosis surgery. XXXV. MAITT Kongresszus, május 18 -19, 2007, Debrecen, Aneszteziológia és Intenzív Terápia, 2007, 37(Suppl 1):13.
21. Molnar T, Peterfalvi A, Szereday L, Szapary L, Komoly S, Bogar L, Illes
Z.
Increased level of C-reactive protein (CRP) at onset of acute ischemic stroke correlates with elevation of leukocyte antisedimentation rate and S100b and predicts outcome. 16th European Stroke Conference, Glasgow, UK, 2007, május 29-június1. Cerebrovasc Dis, 2007, 23 (suppl 2):63. 38
(Impact factor: 2.534)
22. Molnar T, Peterfalvi A, Szereday L, Szapary L, Komoly S, Bogar L, Illes Z. A rapid elevation in leukocyte antisedimentation rate differentiates acute ischemic stroke from TIA earlier than S100beta. 16th European Stroke Conference, Glasgow, UK, 2007, május 29-június1 Cerebrovasc Dis, 2007, 23 (suppl 2):64. (Impact factor: 2.534)
23. Péterfalvi Á, Szereday L, Molnár T, Szapáry L, Pál J, Mikó É, Komoly S, Illés Z. Az adaptív immunválasz akut változásai ischaemiás stroke-ban. A Magyar immunológiai Társaság XXXVI. Vándorgyűlése, Hajdúszoboszló, 2007. Október 17-19. Magy Immunol/Hun Immunol, 2007, 6:35
24. Molnár T, Péterfalvi Á, Szereday L, Szapáry L, Komoly S, Bogár L, Illés Z. A rapid elevation in leukocyte antisedimentation rate differentiates acute ischemic stroke from transient ischemic attack (TIA) earlier than S100b. A Magyar immunológiai Társaság XXXVI. Vándorgyűlése, Hajdúszoboszló, 2007. Október 17-19. Magy Immunol/Hun Immunol, 2007, 6:35
25. Molnár T, Péterfalvi Á, Szereday L, Szapáry L, Komoly S, Bogár L, Illés Z. Increased level of C-reactive protein (CRP) at onset of acute ischemic stroke correlates with elevation of leukocyte antisedimentation rate and S100b and predicts outcome. A Magyar immunológiai Társaság XXXVI. Vándorgyűlése, Hajdúszoboszló, 2007. Október 17-19. Magy Immunol/Hun Immunol, 2007, 6:35
26. Molnar T, Peterfalvi A, Szereday L, Szapary L, Komoly S, Bogar L, Illes
Z.
Increased level of C-reactive protein (CRP) at onset of acute ischemic stroke correlates with elevation of leukocyte antisedimentation rate and S100b and predicts outcome. 17th Meeting of the European Neurological Societies, Rhodes, Greece, 2007. június 16-20. J Neurol, 2007, 254 (Suppl 3):III/57. (Impact factor: 2.98)
39
27. Molnar T, Peterfalvi A, Szereday L, Szapary L, Komoly S, Bogar L, Illes Z. A rapid elevation in leukocyte antisedimentation rate differentiates acute ischemic stroke from TIA earlier than S100beta. 17th Meeting of the European Neurological Societies, Rhodes, Greece, 2007. június 16-20. J Neurol, 2007, 254 (Suppl 3):III/143. (Impact factor: 2.98)
28. Molnar T, Peterfalvi A, Szereday L, Szapary L, Komoly S, Bogar L, Illes
Z.
Increased level of C-reactive protein (CRP) at onset of acute ischemic stroke correlates with elevation of leukocyte antisedimentation rate and S100b and predicts outcome. 29th International Danube Symposium, Würzburg, Germany, 2007. Június 2-5. J Neurol Transm, 2007, 114:CXXIV. (Impact factor: 2.93)
29. Molnar T, Peterfalvi A, Szereday L, Szapary L, Komoly S, Bogar L, Illes Z. A rapid elevation in leukocyte antisedimentation rate differentiates acute ischemic stroke from TIA earlier than S100beta. 29th International Danube Symposium, Würzburg, Germany, 2007. Június 2-5. J Neurol Transm, 2007, 114:CXXIV. (Impact factor: 2.93)
30. Molnár T, Péterfalvi Á, Szereday L, Szapáry L, Komoly S, Bogár L, Illés Z. Az ősi immunválasz akut változásai ischaemiás stroke-ban. A Magyar Stroke Társaság VIII. Konferenciája. Budapest, 2007. május 24-26.
31. Péterfalvi Á, Szereday L, Molnár T, Szapáry L, Pál J, Mikó É, Illés Z. Az adaptív immunválasz akut változásai ischemiás stroke-ban. A Magyar Stroke Társaság VIII. Konferenciája. Budapest, 2007. május 24-26.
32. Molnar T and Illes Z. Increased level of C-reactive protein at onset of acute ischemic stroke correlates with elevation of leukocyte anti-sedimentation rate and S100b and predicts outcome. Pecs-Tübingen Neuroimmunology Days, Pécs 2007. április 13-14.
40
33. Molnár T, Péterfalvi Á, Szereday L, Pusch G, Szapáry L, Komoly S, Bogár L, Illés Zs: Korai leukocyte aktiváció vizsgálata akut stroke-ban és annak haszna a post-stroke infekció előrejelzésében. MAITT XXXVI. Kongresszusa, Balatonfüred, 2008, Május 16 -17, Aneszteziológia és Intenzív Terápia, 2008, 38(Suppl 1):10.
34. Molnár T, Péterfalvi Á, Szereday L, Pusch G, Szapáry L, Komoly S, Bogár L, Illés Zs: Post-stroke gyulladásos szövődmények etiológiai megközelítése. Immundepresszió vagy iatrogén infekció? MAITT XXXVI. Kongresszusa, Balatonfüred, 2008, Május 16 -17, Aneszteziológia és Intenzív Terápia, 2008, 38(Suppl 1):11.
35. Molnar T, Peterfalvi A, Szereday L, Banati M, Komoly S, Bogar L, Illes Z. Early activation of leukocytes indicated by a simple test of leukocyte antisedimentation rate (LAR) differentiates TIA from definitive stroke and is related to post-stroke infections resulting in poor outcome. 8th Annual Meeting of the Federation-of-ClinicalImmunology-Societies, JUN 05-09, 2008 Boston, MA, USA. Clin Immunol, 2008, 127 (Suppl):S153 (Impact factor:3.60)
36. Molnar T, Peterfalvi A, Bogar L, Illes Z. Role of leukocyte antisedimentation rate in prediction of early recognition of post-stroke infection. 28th International Symposium on Intensive Care and Emergency Medicine, 18-21 March, Brussels, Belgium. Crit Care, 2008, 12 (Suppl 2):P175 (Impact factor:4.553)
37. Molnár T, Pálinkás D, Pisztrai L, Czeiter Endre, Ezer E, Büki A. Effect of different fluid resuscitation on brain tissue oxygen depth in patients with severe traumatic brain injury. 4th Pannonian Symposium on CNS Injury, Pécs, 2008, szeptember 8-10. Clin Neurosci/Ideggy Szle, 2008,
38. Molnár T, Jakab L, Pálinkás L, Molnár FT, Bogár L, Illés Zs. Vérlemezke és endothel aktivációs biomarkerek szerepe a posztoperatív kognitív deficit előrejelzésében. MAITT XXXVII. Kongresszusa, Balatonfüred, 2009, Május 14 -16. Aneszteziológia és Intenzív Terápia, 2009, 38(Suppl 1):11.
41
39. Molnar T and Illes Z. Early immune response in stroke predicts outcome and post stroke infections. 2nd Pécs-Tübingen Neuroimmunology Days, June 26-27, 2009, Tübingen, Germany
40. Molnár T, Bánáti M, Szereday L, Pusch G, Szapáry L, Bogár L, Illés Zs. A CRP, korai leukocyte aktiváció és a post-stroke infekció összefüggései akut ischemiás stroke-ban. A Magyar Stroke Társaság IX. Konferenciája. Pécs, 2009. szeptember 03-05.
AWARDED LECTURES
1. Molnár T. [Biomarker investigations in acute brain injury] Biomarkerek vizsgálata akut központi idegrendszeri inzultusokban. Környey Társaság Tudományos ülése. Pécs, 2009. március 27. Környey Emlékérem
2. Péterfalvi Á, Szereday L, Molnár T, Szapáry L, Pál J, Mikó É, Illés Z. [Acute changes of adaptive immunity in ischemic stroke] Az adaptív immunválasz akut változásai ischemiás stroke-ban. A Magyar Stroke Társaság VIII. Konferenciája. Budapest, 2007. május 24-26. 2nd prize
3. Jónás A, Szakmány T, Molnár T. [Role of NT-proBNP and microalbuminuria in subarachnoideal bleedings] Az NT-proBNP és a microalbuminuria szerepe subarachnoidalis vérzésben. XXXVI. MAITT Kongresszus, 2006, Május 18-21., Szeged 2nd prize
4. Molnár T, Bogár L. [Relationship between inflammatory markers and neuromuscular dysfunction in patients on long-term ventillatory support] Gyulladásos markerek és a neuromuscularis funkció zavarának összefüggése tartósan lélegeztetett betegeken. Fiatal Magyar Aneszteziológusok V.Kongresszusa, 2001 május, Sopron 1st prize
42
5. Molnár T, Zámbó K, Schmidt E, Tekeres M. [Novel possibilities in early recognition of cerebral circulatory disorders?] Új lehetőség az agyi keringészavarok korai felismerésében? Dipyridamole teszt a neurológiai diagnosztikában? XXX. MAITT kongresszus, 2000, Siófok, Hungary 1st prize of young investigators
CHAPTER
Molnar T: Anesthesia - Central nervous disorders, Anesthesiology and Intensive Therapy, (editor: Bogar L), Budapest, Medicina 2009, 271-275.
43
VI. ACKNOWLEDGEMENTS
I sincerely thank my tutor Zsolt Illés, whose help, stimulating suggestions and encouragement supported me all the time during my research and writing of the thesis. I very much appreciate his leadership through the wonders of neuroimmunology and biomarker research. I would like to express my gratitude to my first suporvisor Prof. József Czopf (Department of Neurology) and Prof. Miklós Tekeres (Department of Anesthesiology and Intensive Therapy), who encouraged me to take the first steps in research work. I am very grateful to Prof. Lajos Bogár (Department of Anesthesiology and Intensive Therapy), whom I consider my honorary tutor for all the help he has given me, for always being there when I was in need, for teaching, explaining, listening, being patient, supporting and forming me, my points of view and attitude towards research and life. I thank Tamás Szakmány for teaching me the principles of statistics and Prof. Sámuel Komoly (Department of Neurology) for the support and useful advices. I thank everybody who contributed to my work with support and advices. I especially thank collaborators and staff in the Department of Anesthesiology and Intensive Therapy, Department of Neurology, Department of Medical Microbiology and Immunology and Department of Immunology and Biotechnology. At last, but not at least, I am especially grateful to my family, my beloved wife, son and daughters and my parents, whose love enabled me to complete this work.
44
VII. PAPERS Paper 1 Deficient leukocyte antisedimentation is related to post-stroke infections and outcome Paper 2 Relationship between C-reactive protein and early activation of leukocytes indicated by leukocyte antisedimentation rate (LAR) in patients with acute cerebrovascular events Paper 3 Impaired function of innate T lymphocytes and NK cells in the acute phase of ischemic stroke Paper 4 Immune responses and neuroimmune modulation in the pathogenesis of acute ischemic stroke and post-stroke infections Paper 5 Dipyridamole stress test in the early evaluation of cerebral circulatory disorders ? Paper 6 “Cerebrovascular
stressing”:
drug-induced
S100B
elevation
and
transient
neurological signs predict ischemic cerebrovascular events Paper 7 Increased levels of baseline biomarkers reflecting platelet and endothelial activation predict early cognitive dysfunction after lung surgery Paper 8 Prognostic role of serum S100β and procalcitonin in patients after cardio-pulmonary resuscitation Paper 9 NT-proBNP as early marker of septic complications in patients after cardiopulmonary resuscitation Paper 10 Measurement and importance of serum S100B in the intensive care
45
Paper 1 Deficient leukocyte antisedimentation is related to post-stroke infections and outcome Tihamer Molnar1, Agnes Peterfalvi2, Laszlo Szereday3, Gabriella Pusch2, Laszlo Szapary2, Samuel Komoly2, Lajos Bogar1, Zsolt Illes2 1
Department of Anaesthesiology and Intensive Therapy, University of Pecs, Pecs, Hungary 2
3
Department of Neurology, University of Pecs, Pecs, Hungary
Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Pecs, Pecs, Hungary
ABSTRACT Background: Patients with stroke are more susceptible to infections suggesting possible deficiencies
of
early
immune
responses,
particularly
of
leukocytes.
Leukocyte
antisedimentation rate (LAR), a simple test to detect activation of leukocytes was serially examined and correlated with S100β, procalcitonin and outcome in patients with acute ischemic events. Materials and Methods: Venous blood samples were taken from 61 healthy volunteers and 49 patients with acute ischemic events (acute ischemic stroke, AIS, n=38 and TIA, n=11) within 6 hours, at 24 and 72 hours after onset of symptoms. Results: LAR was significantly higher in acute ischemic events compared to controls within 6 hours after onset of stroke regardless of post-stroke infections. In addition, elevation of LAR was delayed and attenuated in TIA in contrast to AIS. A deficiency in early elevation of LAR was associated with post-stroke infections and a poor outcome measured by Glasgow Outcome Scale in AIS. We also observed a positive correlation between LAR and S100β at 72 hours after the onset of ischemic stroke. Increased levels of S100β at 24 and 72 hours after stroke were associated with poor outcome. Conclusions: An early activation of leukocytes indicated by elevation of LAR is characteristic of acute ischemic cerebrovascular events. A delayed and ameliorated leukocyte activation represented by LAR is characteristic to TIA in contrast to stroke. Deficient early activation predisposes to post-stroke infections related to poor outcome. In addition, the extent of tissue injury correlates with the magnitude of innate immune responses. Key words: stroke, TIA, post-stroke infection, S100β, leukocyte antisedimentation rate
INTRODUCTION Cerebrovascular diseases of acute onset, including ischemic stroke, are associated with diverse immune responses. The post-ischemic brain tissue per se promotes various
46
inflammatory pathways (1,2). In addition, infectious complications have been frequently reported within the first few days after stroke resulting in an increased mortality rate and worse clinical outcome (3-6). The high incidence of infections in stroke patients is likely to be a result of an impaired immune function similar to other life-threatening conditions (7,8). Leukocytes accumulate in the region of cerebral ischemia in the early stage of stroke, within hours (9,10). The neurological outcome was shown to be worse and the infarct larger in patients with severe PMNL accumulation (11). A significant correlation between stroke volume or stroke severity and an acute increase of white blood cell (WBC) in the peripheral blood have been reported (12-14). Increased aggregation of peripheral leukocytes in the absence of WBC elevation was also reported in major stroke (13). Increased in vitro adhesive properties, activation of leukocytes indicated by increased plasma oxidation of adrenaline to adrenochrome and higher plasma levels of cytokines and proteases have been shown in ischemic stroke and TIA (15-18). While these studies addressed the detrimental effect of leukocyte activation, it may also play a major role in defense against pathogens, and participate in combating infections. A deficient activation of leukocytes may thus contribute to an increased susceptibility to post-stroke infections. We have recently established a simple test to examine activation of leukocytes by measuring upward floating in a tube during one hour of gravity sedimentation. The leukocyte antisedimentation rate (LAR) indicates the percentage of leukocytes crossing the middle line of the blood column upwards during 1 hour of sedimentation (19). It has been shown that a raised LAR is positively correlated with enhanced leukocyte adherence proportional to activation, with an increased cell volume and higher vacuole content of polymorphonuclear leukocytes (20). LAR correlated significantly with serum procalcitonin (PCT) and C-reactive protein (CRP) concentration in critically ill patients with severe sepsis (21). The simple LAR test was a good positive predictor of bacteraemia in critically ill patients presenting their first febrile episode without preceding antibiotic treatment (22,23). Here, we serially examined LAR, S100β and PCT in patients within hours after onset of acute ischemic stroke and TIA to characterize the innate immune response and its relation to post-stroke infections. S100β is an astroglial protein, which is elevated in the peripheral blood in patients with stroke and its peak concentration around day 3 after stroke correlates with the volume of brain lesions and clinical outcome (24-29). Increased PCT levels imply for an infectious origin of fever complicating an underlying non-infectious febrile disease (30). While prognostic value of serum PCT concentrations is not clear in stroke, its predictive value for post-stroke infections has been recently implicated (31). 47
MATERIALS AND METHODS The study protocol was approved by the Regional Local Ethics Committee. Patients and samples. A total of 49 patients suffering from acute ischemic cerebrovascular event and 61 matched healthy controls were selected for this study. All patients were admitted to the Department of Neurology, University of Pecs, Hungary. Exclusion criteria were infectious diseases, fever <4 weeks before stroke, an elevated WBC, erythrocyte sedimentation rate (ESR), high-sensitivity CRP (hsCRP, cut-off value <10 mg/L), PCT on admission (cut-off value <0.05 ng/mL), positive chest X-ray, hemorrhagic stroke defined by an acute cranial CT scan, and decline to participate in the study. Clinical data were collected on admission, at 72 hours and outcome measures obtained at discharge from hospital (Table 1).
Table 1.Demographic and clinical data of subjects Acute Cerebrovascular Event
Control
N=49
n=61
P
AIS
TIA
n=38
n=11
GOS at discharge†
3.1 (2.6-3.5)
4.3 (3.6-4.9)
NA
0.006
Length of stay (day) †
8.4 (6.7-10.2)
5.9 (4.0-7.8)
NA
NS
10/38
0/11
NA
<0.001
Onset of infection (day) †
4.3 (3.47-5.13)
NA
NA
NA
PCT on admission (ng/mL) †
0.09 (0.06-0.11)
0.06 (0.02-0.09)
<0.05
NS
8.2 (7.3-9.1)
7.4 (6.6-8.1)
7.8 (7.3-8.4)
NS
Infection rate*
WBC on admission (G/L) † †
Median and interquartile range, comparisons by Mann-Whitney U test; *
2
test. AIS: acute
ischemic stroke, TIA: transient ischemic attack, GOS: Glasgow Outcome Scale, WBC: white blood cell count, PCT: procalcitonin, NA: not applicable, NS: not significant Glasgow Outcome Scale (GOS) at discharge from hospital or death were used as measures of clinical outcome. Venous blood samples were taken serially for measurement of LAR, S100β, and PCT within 6 hours after onset of first symptoms (T0), at 24 (T24) and 72 hours (T72). After 24 hours, patients were enrolled into a definitive acute ischemic stroke
48
(AIS) or transient ischemic attack (TIA) group based on the persistency of clinical signs and cranial CT scan. Levels of PCT were immediately analyzed. Blood samples taken for the analysis of S100β were centrifuged at 3000xg for 10 minutes. Supernatants were frozen and stored at -80°C until analysis. PCT was measured by automated fluorescence immunoassay (BRAHMS Kryptor, B.R.A.H.M.S., Berlin, Germany). Serum levels of S100β were examined by automated electro-chemiluminescent immunoassay (Liaison Sangtec 100 system, DiaSorin, Bromma, Sweden). Diagnosis of AIS, TIA, and detection of infectious complications. Patients with acute neurological deficits were evaluated by a certified neurologist within 6 hours of onset of symptoms. Cranial CT scan was performed acutely to exclude hemorrhagic stroke. TIA and definitive stroke were defined according to international guidelines (32). An evidence-based guideline was followed to detect infectious complications (in short, physical and laboratory measures including WBC, ESR, hsCRP, PCT, fever, abnormal urine, chest X-ray or positive cultures) (33). Leukocyte antisedimentation rate (LAR). LAR was determined as described previously (19,20). In short, Westergreen blood sedimentation rate technique was modified for measuring leukocyte motion during gravity sedimentation of the whole blood. After one hour sedimentation, the leukocyte counts of upper and lower half sections were measured with an automatic cell counter (Coulter Counter CBC5, Coulter Electronics Ltd, Luton, UK) and results were expressed as a rate. Statistical analysis. Statistical calculation was performed using the SPSS 11.0 package. Student-t test,
2
test, Spearman correlation and Mann-Whitney U test were used.
Data were presented as mean, 95% confidence intervals and median, interquartile ranges. A pvalue <0.05 was regarded as significant.
RESULTS Clinical data Based on clinical and neuroimaging data, 38 patients were categorized into AIS and 11 patients into TIA group. Eleven out of 38 AIS were caused by embolism either cardiogenic (n=8) or arterial (n=3). Thirty patients had large territorial and 8 patients had multiple lacunar infarcts. All but one patient had infarct in anterior circulation. Control CT showed hemorrhagic transformation in a single case only. Post-stroke infectious complications occurred only in the AIS group with a 10/38 (32%) rate on the 4-5th day as an average (8 cases with lower airway infection and 2 cases with urinary tract infection) (Table 1). All 49
interventions were done beyond 48 hrs, except one patient (bladder catheter in seven, nasogastric tube in ten, arteficially ventilation in 5 patients).
Serial measurement of LAR in acute ischemic stroke and TIA LAR indicating activation of leukocytes was measured on admission within 6 hours, at 24 and 72 hours after onset of stroke. LAR on admission was significantly higher in patients with acute ischemic events, ie. AIS and TIA, compared to healthy controls, respectively (AIS, median:0.342, IQR:0.229-0.426; TIA, median:0.14, IQR:0.069-0.182; versus Control, median:0.060, IQR:0.024-0.088; p<0.001, p=0.007, respectively). In addition, LAR was significantly higher at T0 and T72 in patients with definitive stroke compared to patients with TIA (T0, AIS, median:0.342, IQR:0.229-0.426, vs. TIA, 0.14, 0.069-0.182, p=0.008 and T72, AIS, median:0.463, IQR:0.264-0.552, vs. TIA, 0.255, IQR:0.147-0.388, p=0.012) (Figure 1A). To exclude the possibility that post-stroke infections in AIS were responsible for the early difference between the two subgroups, TIA was also compared to AIS without poststroke infections (n=28). Difference in median LAR at T0 remained significantly higher in the AIS group without post-stroke infections (median:0.338, IQR:0.240-0.406 vs. 0.14, 0.0690.182, p=0.01) (Figure 1B). Of note, no differences in WBC and serum levels of PCT on admission were observed when AIS and controls, or AIS and TIA were compared to each other, and ESR did not indicate infections either (Table 1).
Serial measurement of LAR in patients with post-stroke infection and poor outcome When LAR was serially analyzed (T0, T24 and T72) in 38 patients with AIS, a continuous increase in LAR was observed (Figure 1B). However, when patients with poststroke infections were separately examined, a significant decrease of LAR was observed at 24 hours compared to AIS without infectious complications (p=0.028) (Figure 2A). Similar although non-significant reduction was observed at 72 hours as well. These data may suggest that deficient elevation in LAR could be related to an increased risk of post-stroke infection due to a dysregulated activation of leukocytes. Therefore, we examined whether LAR indicating activation of leukocytes is related to the outcome of stroke measured by GOS, and compared AIS patients with poor and favorable outcome. AIS patients with favorable outcome had significantly higher LAR24 (median:0.436, IQR:0.273-0.531 vs.median:0.262, IQR:0.236-0.312, p=0.02) (Figure 2B) and the mean value of GOS in patients with poststroke infections was significantly lower (p<0.001) indicating a poor outcome (Figure 2C).
50
Relation of LAR to S100β An important marker of stroke outcome is S100β, which is also related to the extent of infarct (24-29). Median S100β was significantly higher among patients with definitive stroke at 24 hours (median:0.218, IQR:0.09-0.75, p=0.001) and 72 hours (median: 0.228, IQR:0.0751.035 p=0.002) compared to S100β on admission (median:0.10, IQR:0.06-0.22), but was not increased in patients with TIA. In addition, serum S100β protein at T24 and T72 were significantly higher in AIS patients with poor outcome (GOS≤3) compared to good outcome (GOS>3) (T24, median:0.393, IQR:0.13-1.69 vs. median:0.121, IQR:0.08-0.24, p= 0.01; T72, median:1.35, IQR:0.20-2.01 vs. median:0.136, IQR:0.06-0.27, p=0.014, respectively) (Figure 3A). When LAR and serum levels of S100β were compared in patients with definitive stroke, a week, however positive correlation was found on the 3rd post-stroke day (regression analysis with a Spearman rank correlation coefficient of r=0.457, p<0.05) (Figure 3B). These data may indicate that increased levels of S100β correlate with high LAR at T72, suggesting that bigger extent of infarct may be related to increased activation of leukocytes.
DISCUSSION LAR was previously reported in critical care setting as a novel method for detecting activation of circulating leukocytes that can be the earliest sign of systemic inflammatory response syndrome (22). Here, we found that an early activation of leukocytes occurs during acute cerebrovascular events, since patients with both definitive stroke and TIA had significantly higher LAR compared to healthy controls as early as 6 hours after the onset of symptoms. In addition, elevation of LAR was proportional to the extension of brain damage: first, LAR was significantly higher in individuals with definitive stroke compared to TIA within 6 hours after onset of symptoms; in addition, measured on the 3rd post-stroke day, LAR correlated with serum levels of S100β, a marker of infarction size (24-29). Indeed, a possible association between leukocyte activation within the brain and stroke volume has been shown previously (11). In the peripheral blood, association between leukocyte aggregation and infarct size has been also revealed, similar to our data (13). Despite of functional abnormalities, we did not find elevation of WBC. Similar alteration of leukocyte functions without any change in number has been reported, but elevation of leukocytes was also found in the acute phase of stroke (12-16). In TIA group, we detected a significant elevation of LAR compared to healthy controls, but this was delayed and attenuated compared to AIS. We considered the possibility
51
that infectious complications in the AIS group might be responsible for the difference between TIA and AIS. However, such early activation of leukocytes was unlikely to be related to infections 4 days later in AIS. Indeed, when patients with post-stroke infections were excluded from the AIS group, the early difference regarding LAR still remained significant between AIS and TIA. Thus, an early activation of leukocytes represented by increase in LAR within 6 hours after onset of stroke was ameliorated in TIA compared to AIS regardless of post-stroke infections. Previous reports emphasized the detrimental effect of leukocyte activation in stroke, supported by the association between infarct size and leukocyte infiltration in the ischemic tissue (10,11). Accordingly, the magnitude of elevation in LAR also correlated with serum concentration of S100β. However, activation of leukocytes in the systemic circulation may also reflect the mobilization of innate immune responses following tissue damage, which may serve to combat infections by mounting a pro-inflammatory response. Ideally, a delicate balance between detrimental and beneficial effects of early innate immune responses should be required to reduce tissue damage but also fight infections in the acute phase of stroke (34). In our cohort, a progressive increase as “ideal dynamics” of LAR was detected within the first 72 post-stroke hours if patients with post-stroke infections were excluded from the analysis. In contrast, deficient elevation in LAR at 24 hours was found in those patients, who became febrile on the 4-5th days with apparent clinical and laboratory signs of either respiratory or urinary tract infections. A similar, but non-significant defect in elevation of LAR was seen at 72 hours as well. This may refer to a dysregulated activation of leukocytes providing insufficient barrier to bacterial infections. Although PCT was measured serially in order to detect early infections in our cohorts, we also analyzed its relation to definitive stroke, TIA, LAR and S100β, since PCT has been proposed as an indicator of systemic inflammatory response in non-infectious situations (35,36). We did not find any difference in PCT levels measured at 6, 24 and 72 hours after stroke in any subgroup analyses, except that a slight elevation of PCT at 72 hours indicated subsequent post-stroke infections. Similar data regarding PCT were reported by others (31). In summary, although the number of recruited patients is relatively small, our pilot prospective study suggests several important messages: 1, activation of leukocytes represented by elevation in LAR happens within hours after ischemic stroke; 2, although LAR was elevated in TIA compared to healthy subjects, it was delayed and ameliorated compared to definitive ischemic stroke; 3, decreased activation of leukocytes reflected by a deficient elevation of LAR may predispose to post-stroke infections and predict worse outcome; 4, a 52
positive correlation exists between LAR and S100β on the 3rd post-stroke day indicating a relationship between extent of infarct and innate immune responses.
ACKNOWLEDGEMENTS This study was supported by grants from the Hungarian Research Fund (OTKA T049463 to Z. Illes and F060540 to L. Szereday), ETT 50053-2006 and the Bolyai Janos Foundation of the Hungarian Academy of Sciences to Z. Illes.
REFERENCES 1 Ishikawa M, Zhang JH, Nanda A, et al. Inflammatory responses to ischemia and reperfusion in the cerebral microcirculation. Front Biosci 2004;9:1339-47. 2 Ishikawa M, Cooper D, Arumugam TV, et al. Platelet – leukocyte – endothelial cell interactions after middle cerebral artery occlusion and reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab 2004;24:907-15. 3 Davenport RJ, Dennis MS, Wellwood I, et al. Complications after acute stroke. Stroke 1996;27:415-20. 4 Johnston KC, Li JY, Lyden PD, et al. Medical and neurological complications of ischemic stroke: experience from the RANTTAS trial. RANTTAS investigators. Stroke 1998;29:447-53. 5 Grau AJ, Buggle F, Schnitzler P, et al. Fever and infection early after ischemic stroke. J Neurol Sci 1999;171:115-20. 6 Langhorne P, Stott DJ, Robertson L, et al. Medical complications after stroke: a multicenter study. Stroke 2000;31:1223-9. 7 Livingston DH, Appel SH, Wellhausen SR, et al. Depressed interferon gamma production and monocyte HLADR expression after severe injury. Arch Surg 1998;123:1309-12. 8 Woiciechowsky C, Asadullah K, Nestler D, et al. Sympathetic activation triggers systemic interleukin-10 release in immunodepresssion induced by brain injury. Nat Med 1998;4:808-13. 9 Pozzilli C, Lenzi GL, Argentino C, et al. Imaging of leukocyte accumulation in human cerebral infarcts. Stroke 1985;16:251-255. 10 Wang PY, Kao CH, Mui MY, et al. Leukocyte accumulation in acute hemispheric ischemic stroke. Stroke 1993;24:236-240. 11 Akopov SE, Simonian NA, Grigorian GS. Dynamics of polymorphonuclear leukocyte accumulation in acute cerebral infarction and their correlation with brain tissue damage. Stroke 1996;27:1739-1743. 12 Audebert HJ, Rott MM, Eck T, et al. Systemic inflammatory response depends on initial stroke severity but is attenuated by succesful thrombolysis. Stroke 2004 ;35: 2128-2133. 13 Silvestrini M, Pietroiusti A, Troisi E, et al. Leukocyte count and aggregation during the evolution of cerebral ischemic injury. Cerebrovasc Dis 1998;8:305-309. 14 Kammersgaard LP, Jorgensen HS, Nakayama H, et al. Leukocytosis in acute stroke: relation to initial stroke severity, infarct size, and outcome: the Copenhagen stroke study. J Stroke Cerebrovasc Dis 1999;8:259-263. 15 Grau AJ, Berger E, Sung KL, et al. Granulocyte adhesion, deformability, and superoxide formation in acute stroke. Stroke 1992;23: 33-39. 16 Violi F, Rasura M, Alessandri C, et al. Leukocyte response in patients suffering from acute stroke. Stroke 1988;19:1283-84. 17 Vila N, Castillo J, Dávalos A, et al. Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke. Stroke 2000;31:2325-29. 18 Elneihoum AM, Falke P, Axelsson L, et al. Leukocyte activation detected by increased plasma levels of inflammatory mediators in patients with ischemic cerebrovascular diseases. Stroke 1996;27:1734-38. 19 Bogar L, Tekeres M. Leukocyte flotation during gravity sedimentation of the whole blood. Clin Hemorheol Microcirc 2000;22:29-33. 20 Bogar L, Tarsoly P, Jakso P. Characteristics of light and heavy polymorphonuclear leukocytes. Clin Hemorheol Microcirc 2002;27:149-53. 21 Bogar L, Tarsoly P. Leukocyte sedimentation and inflammatory complications after thoraco-abdominal operations. Biorheology 1999;36:91-92. 22 Bogar L, Molnar Z, Kenyeres P, et al. Sedimentation characteristics of leukocytes can predict bacteremia in critical care patients. J Clin Pathol 2006;59:523-25. 23 Bogar L, Molnar Zs, Tarsoly P, et al. Serum procalcitonin level and leukocyte antisedimentation rate as early predictors of respiratory dysfunction after oesophyageal tumour resection. Critical Care 2006;10:R110.
53
24 Herrmann M, Vos P, Wunderlich MT, et al. Release of glial tissue-specific proteins after acute stroke: A comparative analysis of serum concentrations of protein S100B and glial fibrillary acidic protein. Stroke 2000;31:2670-77. 25 Kim JS, Yoon SS, Kim YH, et al. Serial measurement of interleukin-6, transforming growth factor-beta, and S100 protein in patients with acute stroke. Stroke 1996;27:1553-57. 26 Foerch C, Singer OC, Neumann-Haefelin T, et al. Evaluation of serum S100B as a surrogate marker for longterm outcome and infarct volume in acute middle cerebral artery infarction. Arch Neurol 2005;62:1130-1134. 27 Elting JW, de Jager AE, Teelken AW, et al. Comparison of serum S-100 protein levels following stroke and traumatic brain injury. J Neurol Sci 2000;181:104-110. 28 Fassbender K, Schmidt R, Schreiner A, et al. Leakage of brain-originated proteins in peripheral blood: temporal profile and diagnostic value in eraly ischemic stroke. J Neurol Sci 1997;148:101-105. 29 Missler U, Wiesmann M, Friedrich C, et al. S-100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarction volume and prognosis in acute ischemic stroke. Stroke 1997;28:1956-1960. 30 Shin KC, Lee YJ, Kang SW, et al. Serum procalcitonin measurement for detection of intercurrent infection in febrile patients with SLE. Ann Rheum Dis 2001;60:988-989. 31 Miyakis S, Georgakopoulos P, Kiagia M, et al. Serial serum procalcitonin changes in the prognosis of acute stroke. Clin Chim Acta 2004;350:237-239. 32 European Stroke Initiative Recommendations for Stroke Management - Update 2003. Cerebrovasc Dis 2003;16:311-337. 33 Cohen J, Brun-Bruisson C, Torres A, et al. Diagnosis of infection in sepsis: an evidence –based review. Crit Care Med 2004;32:S466-494. 34 Gee JM, Kalil A, Shea C, et al. Lymphocytes. Poteintial mediators of postischemic injury and neuroprotection. Stroke 2007;38:783-788. 35 Assicot M, Gendrel D, Carsin H, et al. High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection. Lancet 1993;341:515-518. 36 Mimoz O, Benoist JF, Edouard AR, et al. Procalcitonin and C-reactive protein during the early posttraumatic systemic inflammatory response syndrome. Intensive Care Med 1998;24:185-8.
54
FIGURE LEGENDS Figure 1. Leukocyte antisedimentation rate (LAR) in healthy controls, patients with TIA and ischemic stroke
Figure 1
A 1.0 p<0.001
LAR at T0
p=0.008 0.6 p=0.007 0.2 0 -.2
healthy
TIA
ischemic stroke
B 1.0
p=0.012 p=0.01
LAR
at T0 0.6 at T24 at T72 0.2 0
ischemic stroke
TIA
A. LAR measured at 6 hours after onset of symptoms in patients with definitive ischemic stroke, TIA and healthy controls. LAR (median, interquartile range, minimum-maximum) was measured on admission, within 6 hours after onset of clinical symptoms in 38 patients with definitive ischemic stroke, 11 patients with TIA and 61 healthy volunteers. Definitive stroke and TIA were determined retrospectively after 24 hours based on clinical and neuroimaging findings. (Mann-Whitney U test was used.) B. Serial examination of LAR in patients with TIA and ischemic stroke without poststroke infections. LAR (median, interquartile range, min.-max.) was measured on admission (T0), at 24 hours (T24) and 72 hours (T72) after onset of symptoms in 28 patients with acute
55
ischemic stroke without infectious complications and in 11 patients with TIA. (MannWhitney U test was used.) Figure 2 Leukocyte antisedimentation rate (LAR) in patients with ischemic stroke related to poststroke infections and clinical outcome Figure 2 A 1.0
p=0.028
0.8 at T0
LAR
0.6
at T24
0.4
at T72
0.2 0 -0.2 no infection
0.8
C p=0.02
0.6 0.4 0.2 GOS>3
GOS<3
GOS (mean, 95 % CI)
LAR at T24
B
infection
5 4 3 2 1 0 no infection
infection
A. Serial examination of LAR comparing patients with definitive stroke with and without post-stroke infections. LAR (median, interquartile range, min.-max.) was measured on admission (T0), at 24 hours (T24) and 72 hours (T72) after onset of symptoms in 28 stroke patients without post-stroke infection and 10 patients with infectious complications. (MannWhitney U test was used.) B. Comparison of LAR measured at T24 in patients with good and poor outcome after definitive ischemic stroke. LAR (median, interquartile range, min.-max.) was examined in 38 patients measured at 24 hours after acute ischemic stroke in good (GOS>3) versus poor (GOS≤3) outcome defined by Glasgow Outcome Scale at hospital discharge. (Mann-Whitney U test was used.)
56
C. Clinical outcome of patients with acute ischemic stroke. Glasgow Outcome Scale (GOS, mean, 95% confidence interval) obtained at discharge from hospital or death in 28 patients without infection compared to 10 patients with infection after acute ischemic stroke (Student-t test , p<0.001).
Figure 3 Correlations of S100β β with outcome measures and leukocyte antisedimentation rate (LAR) A
Figure 3 p=0.002
3
S100β (ng/mL)
p=0.001 at T0
2
at T24 1
0
at T72
favourable outcome poor outcome GOS>3 GOS≤3
B
S100β at T72 (ng/mL)
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 0
0.2
0.4 0.6 LAR at T72
0.8
1.0
A. Comparison of serum S100β β in patients with poor and good outcome after definitive ischemic stroke. Plasma S100β protein concentrations (median, interquartile range, min.max.) were examined in 38 patients measured on admission (T0), at 24 hours (T24) and 72 hours (T72) after acute ischemic stroke in good (GOS>3) versus poor (GOS≤3) outcome defined by Glasgow Outcome Scale at hospital discharge. (Mann-Whitney U test was used.) B. Association between LAR and S100β β measured at 72 hours after onset of symptoms in patients with definitive stroke. Scatterplot of serum S100β level versus LAR measured at
57
T72 was created in 38 patients after acute ischemic stroke. Shown is a regression analysis with a Spearman rank correlation coefficient of r=0.457 (p<0.05).
58
Paper 2 Relationship between C-reactive protein and early activation of leukocytes indicated by leukocyte antisedimentation rate (LAR) in patients with acute cerebrovascular events Tihamer Molnar1, Viktoria Papp2, Laszlo Szereday3, Gabriella Pusch2, Laszlo Szapary2, Lajos Bogar1, Zsolt Illes2 1
Department of Anaesthesiology and Intensive Therapy, University of Pecs, Pecs, Hungary 2
3
Department of Neurology, University of Pecs, Pecs, Hungary
Department of Clinical Microbiology and Immunology, University of Pecs, Pecs, Hungary
ABSTRACT The purpose of this study was to determine the relationship between high-sensitive Creactive protein (hsCRP) and leukocyte antisedimentation rate (LAR) as a specific test to detect early activation of leukocytes providing the first line of defence against infections. In 49 patients with acute ischemic events and 61 healthy subjects (HS), we examined LAR, astroglia specific S100B indicating the extent of brain tissue damage and hsCRP within 6 hours, as well as 24 and 72 hours after onset of symptoms. Serum levels of hsCRP on admission was significantly higher in patients with acute ischemic stroke (AIS) compared to HS and were higher in patients with recurrent to first ever ischemic stroke. Increased basal levels of hsCRP also correlated with extent of infarct reflected by S100B levels in sera, but did not correlate with post-stroke infections. However, a higher rate of infection was observed among patients, in whom hsCRP was elevated at 72 hours but LAR did not increase. Therefore, such late elevation of hsCRP may indicate pre-clinical infections due to deficient leukocyte activation. Simple tests like LAR and hsCRP may help in predicting outcome and high risk of infectious complications. Key words: stroke, CRP, leukocytes, post-stroke infection, outcome of stroke
INTRODUCTION A non-specific inflammatory response occurs after stroke and the degree of inflammation is predictive of outcome [1,23,31]. Moreover, infections, primarily pneumonia and urinary tract infections have been frequently reported within the first few days after stroke resulting in increased mortality rate and worse clinical outcome [8,15,18,20]. If an infection occurs while the blood brain barrier (BBB) is impaired, the immune response directed against
59
the foreign antigen could predispose towards the development of a CNS autoimmune response. Such an assumed autoimmune response could exacerbate the ischemic neurologic injury, since an exaggerated inflammatory response during recurrent strokes has been observed [27]. One of the most reliable biomarker for evaluating the inflammatory aspect of atherogenesis is C-reactive protein (CRP) [25]. First discovered in the 1930s, CRP traditionally has been characterized as a non-specific effector of innate immunity owing to its ability to activate the classic complement cascade and mediate phagocytosis [22]. CRP production initiates with toll-like receptors (TLR) activation and production of interleukins before transcriptional activation of CRP genes within hepatocytes [16]. There is some evidence that CRP is an active participant in atherosclerotic plaque formation [17,28,29,30]. Multiple in vitro effects of CRP have been studied, including the down-regulation of endothelial nitric oxide synthetase transcription, the stimulation of endothelin-1 and IL-6 release from endothelial cells [29,30]. Both processes promote endothelial contraction and dysfunction of relaxation, thereby setting the stage for atherogenesis [17,28]. Plasma CRP levels were related to incidence of first ischemic stroke or transient ischemic attack (TIA) in the Framingham Study original cohort [24]. The number of upward floating leukocytes or anti-sedimentation has been recently reported as a simple functional test to measure activation of leukocytes [2]. An elevated leukocyte anti-sedimentation rate (LAR) positively correlates with enhanced leukocyte adherence, an increased cell volume and higher vacuole content of neutrophil leukocytes, and with the severity of systemic inflammatory reaction syndrome (SIRS) in critically ill patients [2,3,4]. LAR test is based on the observation that during gravity sedimentation of the whole blood the ascending plasma, which in turn is propelled by the descending erythrocyte aggregates, drives leukocytes' upward flotation. Leukocyte "antisedimentation" is further enhanced by the decrease of leukocyte specific gravity caused by cell swelling due to water uptake as part of leukocyte activation [4]. Naturally, the erythrocyte sedimentation is one of the determinants of plasma and leukocyte movement in the sedimentation tube. However, it has been proved that that LAR reflects independent alterations in leukocyte properties that superimposed on “passive” flotation generated by erythrocyte sedimentation process [2,3,4]. Moreover, activation of leukocytes occurs during acute cerebrovascular events, which is apparently proportional to the extension of brain damage and duration of ischemia: the simple LAR test was capable to differentiate individuals with definitive stroke from transient ischemic attack (TIA) within 6 hours after onset of symptoms [21]. Thus, elevation of LAR 60
indicates a very early and rapid activation of innate immune responses in acute ischemic events, especially in definitive stroke. Deficiency of such elevation of LAR, representing dysregulated activation of leukocytes, was predictive for post-stroke infections [21]. Here, we examined relationship among LAR, astroglia specific S100B indicating the extent of brain tissue damage and hsCRP in patients within hours after onset of acute ischemic stroke (AIS) and transient ischemic attack (TIA) to characterize the innate immune response and its relation to the outcome.
MATERIALS AND METHODS The study protocol was approved by the Regional Local Ethics Committee. Patients and sample collection. Forty-nine patients suffering from acute ischemic events were selected for this study. All patients were admitted to the Department of Neurology at the University of Pecs, Hungary. Exclusion criteria were infectious diseases, fever <4 weeks before stroke, an elevated white blood cell count (WBC), procalcitonin (PCT) on admission (cut-off value <0.05 ng/mL), positive chest X-ray, hemorrhagic stroke defined by an acute cranial CT scan, and decline to participate in the study. The demographic data were collected as age, gender, National Institute of Health Stroke Scale (NIHSS) scoring on admission and at 72 hours (Table 1). Glasgow Outcome Scale (GOS) at discharge from hospital or death was used to measure outcome. Patients with acute neurological deficits were evaluated by a certified neurologist within 6 hours after onset of symptoms and cranial CT scan was performed to exclude hemorrhagic stroke. TIA and definitive stroke were defined according to international guidelines [12]. An evidence-based guideline was followed to detect infectious complications (in short, physical and laboratory measures including WBC, ESR, hsCRP, PCT, fever, abnormal urine, chest X-ray or positive blood cultures) [7]. Highsensitivity CRP, LAR and S100B were measured on admission (T0), at 24 hrs (T24) and 72 hrs (T72). Serum hsCRP was measured by automated fluorescence immunoassay (BRAHMS Kryptor) and S100B by automated electrochemiluminescence immunoassay (LIA-mat Sangtec 100).
Leukocyte antisedimentation rate (LAR). LAR was determined as described previously [2,3]. In short, the leukocyte counts of upper and lower half sections were measured after one hour sedimentation with an automatic cell counter (Coulter Counter CBC5, Coulter Electronics Ltd, Luton, UK). The percentage of leukocytes that crossed the middle line of the sedimentation blood column upwards during one hour of sedimentation was calculated by 61
using the formula LAR=100X(upper-lower)/(upper+lower) (normal range <10%).
Statistical analysis. Statistical calculation was performed using the SPSS 11.0 package. ANOVA test,
2
test, Spearman correlation, ROC analysis and Mann-Whitney U test were
used and data were presented as mean, 95% confidence intervals and median, interquartile ranges (IQR).
RESULTS Demographic data Altogether, 49 patients with acute ischemic cerebrovascular events and 61 normal subjects were recruited for this study: thirty-eight patients suffered of AIS and eleven patients of TIA determined by clinical signs and neuroimaging investigations. NIHSS was significantly higher in the AIS group on admission (median:10, IQR:4-19 vs 4.5, 2-18, p=0.002) and on the 3rd post-stroke day (median:5, IQR:1-21 vs. 2, 0-12, p=0.001). Infectious complications occurred only in the AIS group with a 10/38 rate as an average on the 4th day. We have previously found a continuous increase of LAR in the first 72 hours of acute ischemic stroke indicating activation of leukocytes [21]. However, here we found a negative correlation between LAR24 and functional score (NIHSS) observed at 72 hours, indicating that deficient systemic activation of leukocytes at 24 hours was related to more severe symptoms 3 days after onset of stroke (Figure 1). In addition, patients with decreased LAR at this time-point were more susceptible to post-stroke infections [21].
hsCRP and characteristics of ischemic events Although patients with infection were excluded from the study, a significant difference in basal serum hsCRP concentration was found if either the total cerebrovascular event group or AIS group was compared to healthy controls (median: 4.0, IQR:2.7-8.2; 4.4, 2.8-8.7; vs. 2.9, 0.8-3.8; p=0.003, p<0.001 respectively), while per se TIA group was not significantly different from either group. Stroke patients were categorized into first ever ischemic (n=27) or recurrent stroke (n=11) subgroups. Higher basal hsCRP levels were measured in patients with recurrent stroke compared to first-ever ischemic stroke (median: 9.0, IQR:7.7-11.9 vs. 3.8,2.5-6.6, p=0.007), while no significant differences were found regarding LAR or S100B. Based on basal hsCRP levels in sera, patients were cathegorized into three groups. Frequency of co-morbidity
62
parameters were evaluated in these three subgroups. Recurrent stroke was significantly more common among patients with basal hsCRP above 5 mg/L, while hypertension (>140/90 Hgmm) in the past medical history was associated with hsCRP less than 10 mg/L (Table 2). We examined relationship between NIHSS observed on admission and 72 hours later and hsCRP measured at 72 hours. A positive correlation between NIHSS at both timepoints and hsCRP measured on the 3rd post-stroke day was observed (Figure 2A and Figure 2B). As serum concentration of S100B at 72 hours is proportional to the infarct volume, not surprisingly, it positively correlated with hsCRP measured both on admission and at 72 hours after onset of stroke (Figure 2C and Figure 2D).
hsCRP and systemic leukocyte activation represented by LAR High concentration of CRP has been suggested to be a risk factor or marker for stroke [9,14]. In addition, CRP is a useful biomarker for evaluating the inflammatory aspect of atherogenesis and is closely related to inflammation mediated by innate immune cells [16,22,25]. Therefore, we examined the relationship between early levels of hsCRP and LAR in the first 72 hours after ischemic stroke. Plasma hsCRP levels at 72 hours positively correlated with LAR measured on the 3rd post-stroke day (regression analysis with a Spearman rank correlation coefficient of r=0.528, p<0.01) (Figure 3A). This correlation nevertheless disappeared, when patients with post-stroke infections were excluded from the analysis, suggesting that such late elevation of hsCRP might be an early pre-clinical sign of infections (data not shown). Next, the relationship between plasma hsCRP concentrations measured at different timepoints (on admission, at 24 and 72 hours) and the change in LAR from T0 to T24 were examined in patients with AIS. We found a significant negative correlation between the change in LAR (T24-T0) and hsCRP measured at T72. In these stroke patients, the elevation of hsCRP was associated with a decrease in LAR within the first 24 post-stroke hours, indicating that this late elevation of hsCRP may be an early pre-clinical sign of postroke-infections due to a deficient activation of leukocytes (Figure 3B). Accordingly, when good and poor outcome of stroke were compared, serum hsCRP at T0 and T72 were significantly higher in patients with poor outcome (GOS≤3) compared to good outcome (GOS>3) measured by Glasgow Outcome Scale (Figure 4A). The predicting value of basal hsCRP was independent of post-stroke infections (data not shown). To determine the predictive role of hsCRP concerning infectious complications after AIS, ROC analysis was performed (Figure 4B) and the best cut-off value of CRP72 was found 13.95 mg/L with a sensitivity of 100% and a specificity of 81.2% (AUC of CRP72: 0.969, p<0.001). Similarly, 63
we also determined the predictive role of hsCRP regarding the clinical outcome measured by GOS and the ROC analysis (Figure 4C ) showed the best cut-off value of CRP72 as 21.3 mg/L with a sensitivity of 78.6% and a specificity of 91.7% (AUC of CRP : 0.833, p=0.004).
DISCUSSION The acute phase reactant hsCRP on admission was found significantly higher in patients with acute ischemic stroke, however not in TIA patients, in accordance with previous data demonstrating that CRP is an indicator of atherothrombosis and an independent predictor of increased cardiovascular risk (including stroke) in apparently non infected patients [6,9,10]. It has been consistently observed that higher concentrations of CRP were associated with larger brain infarcts and worse neurologic outcome [19]. Our data also support these observations, i.e. hsCRP on admission was elevated in patients with definitive stroke in contrast to TIA and basal hsCRP levels were higher in patients with recurrent stroke. We considered that several processes may be responsible for the elevation of hsCRP related to stroke: i. it may reflect the inflammatory component of the atherosclerotic process that underlies ischemic stroke and therefore, precedes stroke; ii. plasma hsCRP levels are known to be higher in smokers, obese individuals, individuals with abnormal fibrinolytic activity (plasmin-antiplasmin complex), and individuals with subclinical atherosclerosis. iii. stroke may result in an increase of hsCRP due to inactivity, poor alimentation, tissue injury etc.; iv. elevation of hsCRP at 72 hours may be related to a subclinical infection, which became apparent on the 4-5th days in our study. Indeed, our data indicate that early (within 6 hours) and late (after 72 hours) changes in serum levels of hsCRP may reflect different pathological processes in stroke. Here we found, that a basal level or early elevation of hsCRP (>5 mg/ml) measured within 6 hours after onset of stroke had a predictive value for poor prognosis (GOS) and more severe symptoms (NIHSS) irrespective of post-stroke infections. Such early elevation of hsCRP also correlated with serum levels of S100B at 72 hours correlating with the size of infarct supporting the hypothesis, that magnitude of tissue injury may has an impact on response of acute phase reactants. In addition to elevated hsCRP on admission in a subgroup of patients, we also observed a late increase of hsCRP in patients with a tendency of decreased leukocyte activation, i.e. no increase in LAR. Among these patients, a higher rate of infection was observed (data not shown). Such a late elevation of hsCRP by 72 hours thus may be an early pre-clinical sign of infections due to deficient leukocyte activation. Of note, both basal and late elevation of hsCRP was associated with more severe stroke (NIHSS) and worse outcome (GOS). 64
Activated leukocytes are believed to be involved in the pathogenesis and progression of atherosclerotic vascular disease and its consequences [11]. In a 4-year observational follow-up study, leukocyte-derived inflammatory mediators, soluble tumor necrosis factor receptor protein-1 (sTNFR-1), neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and neutrophil protease-4 (NP4) were investigated 1-3 days after cerebral ischemia and found to be significant predictors of long-term cardiovascular mortality, indicating an important role of activated leukocytes in the progression of these diseases [13]. Leukocyte antisedimentation rate (LAR) as a measure of leukocyte activation has been very recently reported in acute cerebrovascular events. Increase in LAR was proportional to the extension of brain damage and capable to differentiate individuals with definitive stroke from TIA within 6 hours after onset of symptoms [21]. Surprisingly, LAR measured at 24 hours correlated negatively with severity of stroke at 72 hours resulting in a higher NIHSS score indicating that deficient systemic activation of leukocytes was associated not only with worse outcome [21] but also with more severe neurological impairment. These patients were more prone for post-stroke infectious complications similarly to recent data [5]. Our data indicate that simple bed-side tests (LAR, hsCRP) may be used in predicting risk for post-stroke infections and outcome of ischemic stroke even in the acute phase of ischemic events. Higher number of patients is warranted to prove the efficiency of these tests in the clinical setting. The better understanding of post-stroke immunodepression may also unravel the clinical meaning of the cross-talk between the nervous system and the immune system, essential to maintaining homeostasis and influencing the outcome of ischemic stroke.
REFERENCES [1] N.B. Beamer, B.M. Coull, W.M. Clark, J.S. Hazel, J.R. Silberger, Interleukin-6 and interleukin-1 receptor antagonist in acute stroke, Ann Neurol 37 (1995), 800-5. [2] L. Bogar, Z. Molnar, P. Kenyeres, P. Tarsoly, Sedimentation characteristics of leukocytes can predict bacteremia in critical care patients, J Clin Path 59 (2006), 523-525 . [3] L. Bogar, M. Tekeres, Leukocyte flotation during gravity sedimentation of the whole blood, Clin Hemorheol Microcirc 22 (2000), 29-33. [4] L. Bogar, P. Tarsoly, P. Jakso, Characteristics of light and heavy polymorphonuclear leukocytes, Clin Hemorheol Microcirc 27 (2002), 149-153. [5] A. Chamorro, S. Amaro, M. Vargas, V. Obach, A. Cervera, M. Gómez-Choco, F. Torres, A.M. Planas, Catecholamines, infection, and death in acute ischemic stroke, J Neurol Sci 252 (2007), 29-35. [6] H. Christensen, G. Boysen, C-reactive protein and white blood cell count increases in the first 24 hours after acute stroke, Cerebrovasc Dis 18 (2004), 214-219. [7] J. Cohen, C. Brun-Bruisson, A. Torres et al, Diagnosis of infection in sepsis: an evidence –based review, Crit Care Med 32 (2004), S466-494. [8] R.J. Davenport, M.S. Dennis, I. Wellwood, C.P. Warlow, Complications after acut stroke, Stroke 27 (1996), 415-420. [9] M. Di Napoli, F. Papa, V. Bocola, C-reactive protein in ischemic stroke, Stroke 32 (2001), 917-924 [10] M. Di Napoli, F. Papa, V. Bocola, Prognostic influence of increased C-reactive protein and fibrinogen levels in ischemic stroke, Stroke 32 (2001), 133-8.
65
[11] A.M. Elneihoum, P. Falke, B. Hedblad, F. Lindgärde, K. Ohlsson, Leukocyte activation in atherosclerosis: correlation with risk factors, Atherosclerosis 131 (1997), 79-84. [12] European Stroke Initiative Recommendations for Stroke Management - Update 2003, Cerebrovasc Dis 16 (2003), 311-337. [13] P. Falke, A.M. Elneihoum, K. Ohlsson, Leukocyte activation: relation to cardiovascular mortality after cerebrovascular ischemia, Cerebrovasc Dis 10 (2000), 97-101. [14] E.S. Ford, W.H. Giles, Serum C-reactive protein and self-reported stroke. Findings from the Third National Health and Nutrition Examination Survey, Arterioscler Thromb Vasc Biol 20 (2000), 1052-1056. [15] A.J. Grau, F. Buggle, P. Schnitzler, M. Spiel, C. Lichy, W. Hacke, Fever and infection early after ischemic stroke, J Neurol Sci 171 (1999), 115-120. [16] D.G. Haider, N. Leuchten, G. Schaller, G. Gouya, J. Kolodjaschna, L. Schmetterer, S. Kapiotis, M. Wolzt, C-reactive protein is expressed and secreted by peripheral blood mononuclear cells, Clin Exp Immun 146(3) (2006), 533-539. [17] T. Ito, U. Ikeda, Inflammatory cytokines and cardiovascular disease, Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2 (2003), 257-265. [18] K.C. Johnston, J.Y. Li, P.D. Lyden, S.K. Hanson, T.E. Feasby, R.J. Adams, R.E. Faught Jr., E.C. Haley Jr., Medical and neurological complications of ischemic stroke: experience from the RANTTAS trial. RANTTAS investigators, Stroke 29 (1998), 447-453. [19] J. Krupinski, M.M. Turu, M. Slevin, J. Martínez-González, Carotid plaque, stroke pathogenesis, and CRP: treatment of ischemic stroke, Curr Cardiol Rep 10 (2008), 25-30. [20] P. Langhorne, D.J. Stott, L. Robertson, J. MacDonald, L. Jones, C. McAlpine, F. Dick, G.S. Taylor, G. Murray, Medical complications after stroke: a multicenter study, Stroke 31 (2000), 1223-1229. [21] T. Molnar, A. Peterfalvi, L. Szereday, G. Pusch, L. Szapary, S. Komoly, L. Bogar, Z. Illes, Deficient leukocyte antisedimentation is related to post-stroke infections and outcome, J Clin Path 61 (2008), 1209-1213. [22] R.F. Mortensen, C-reactive protein, inflammation and innate immunity, Immunol Res 24 (2001), 163-176. [23] K.W. Muir, C.J. Weir, W. Alwan, I.B. Squire, K.R. Lees, C-reactive protein and outcome after ischemic stroke, Stroke 30 (1999), 981-5. [24] N. S. Rost, P.A. Wolf, C.S. Kase, M. Kelly-Hayes, H. Silbershatz, J.M. Massaro, R.B. D’Agostino, C. Franzblau, P.W.F. Wilson, Plasma Concentration of C-Reactive Protein and Risk of Ischemic Stroke and Transient Ischemic Attack. The Framingham Study, Stroke 32 (2001), 2575-9 [25] H. Sun, T. Koike, T. Ichikawa, K. Hatakeyama, M. Shiomi, B. Zhang, S. Kitajima, M. Morimoto, T. Watanabe, Y. Asada, Y.E. Chen, J. Fan, C-reactive protein in atherosclerotic lesions: its origin and pathophysiological significance, Am J Pathol 167 (2005), 1139-1148 . [26] D. Tanne, M. Benderly, U. Goldbourt, M. Haim, A. Tenebaum, E.Z. Fisamn, Z. Matas, Y. Adler, R. Zimmlichman, S. Behar, C-reactive protein as a predictor of incident ischemic stroke among patients with preexisting cardiovascular disease, Stroke 37 (2006), 1720-1724. [27] T. Thom, N. Haase, W. Rosamond, V.J. Howard, J. Rumsfeld, T. Manolio, et al, Heart disease and stroke statistics-2006 update: A report from the American Heart Assocoation Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee, Circulation 113 (2006), 85-151. [28] S. Verma, C-reactive protein incites atherosclerosis, Can J Cardiol 20 (2004), 29B-31B. [29] S. Verma, C.H. Wang, S.H. Li, et al, A self-fulfilling prophecy: C-reactive protein attenuated nitric oxide production and inhibits angiogenesis, Circulation 106 (2002), 913-919. [30] S. Verma, S.H. Li, M.V. Badiwala, et al, Endothelin antagonism and interleukin-6 inhibition attenuates the proatherogenic effects of C-reactive protein, Circulation 105 (2002), 1890-1896. [31] N. Vila, J. Castillo, A. Davalos, A. Chamorro, Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke, Stroke 31 (2000), 2325-9
66
ACKNOWLEDGEMENTS This study was supported by a grant from the Hungarian Research Fund (OTKA T049463), ETT 50053-2006 and the Bolyai Janos Foundation of the Hungarian Academy of Sciences to Z.I. Table 1. Demographic and clinical data of subjects included in the study Cerebrovascular events
p
N=49 AIS
TIA
N=38
N=11
Age (y)
70 (67-74)
58 (48-68)
0.006
Sex, male (%)
18 (47 %)
7 (63 %)
NS
6/38
3/11
NS
NIHSS at T0
10 (4, 19)
4.5 (2, 18)
0.002
NIHSS at T72
5 (1, 21)
2 (0, 12)
0.001
4.4 (2.8-8.7)
3.5 (1.9-5.2)
<0.001
Smoking
hsCRP on admission (mg/L)
Mean and 95% Confidence interval, Median and IQR are shown as appropriate, comparison by Student –t probe, Mann-Whitney U test and
67
2
test for sex and smoking.
Table 2. Association among hsCRP ranges measured on hospital admission (within 6 hours) and co-morbidity in patients with AIS hsCRP at T0
hsCRP at T0
hsCRP at T0
<5mg/L
5-10 mg/L
>10mg/L
Age >70 years
9/21
3/10
2/4
NS
Age <70 years
12/21
7/10
2/4
NS
Atrial fibrillation
2/23
3/8
1/4
NS
15/23a
8/8a
1/4
0.026
Diabetes mellitus
4/23
3/8
0/4
NS
Smoking
5/23
1/8
0/4
NS
Recurrent stroke
1/21
6/10b
2/4b
0.002
Hypertension
2 b
p*
test; ahypertension is significantly more common among patients with hsCRP <10 mg/L;
recurrent stroke is significantly more common among patients with hsCRP >5 mg/L
Data of co-morbidity are missing in three cases with AIS.
68
Figure 1 Negative
correlation
between
NIHSS
observed
at
72
hours
and
leukocyte
antisedimentation rate (LAR) measured at 24 hours after onset of symptoms in patients with definitive ischemic stroke
Figure 1 70
LAR at T24
60 50 40 30 20 10 0
10
20
30
NIHSS at T72
Scatterplot of NIHSS observed at 72 hours vs. LAR measured at T24 was created in 38 patients after acute ischemic stroke. Shown is a regression analysis with a Spearman rank correlation coefficient of r= -0.493 (p=0.004).
69
Figure 2 Relation of hsCRP to stroke severity (NIHSS) and infarct volume represented by serum concentration of S100B
Figure 2
B 400
hsCRP at T72 (mg/L)
hsCRP at T72 (mg/L)
A
300 200 100 0 -100 0
10
20
30
300 200 100 0 -100
0
NIHSS at T0
20
30
NIHSS at T72
C
D hsCRP at T72 (mg/L)
100 hsCRP at T0 (mg/L)
10
60 20 -20 0.0
1.0
2.0
3.0
S100B at T72 (ng/ml)
400 300 200 100 0 -100 0.0
1.0
2.0
3.0
S100B at T72 (ng/ml)
A. Association between NIHSS observed on admission and hsCRP measured at 72 hours after onset of symptoms in patients with definitive ischemic stroke Scatterplot of NIHSS on admission vs. hsCRP plasma level measured at T72 was created in 38 patients after acute ischemic stroke. Shown is a regression analysis with a Spearman rank correlation coefficient of r= 0.650 (p<0.001). B. Association between NIHSS observed at 72 hours and hsCRP measured 72 hours after onset of symptoms in patients with definitive ischemic stroke
70
Scatterplot of hsCRP plasma level vs. NIHSS measured at T72 was created in 38 patients after acute ischemic stroke. Shown is a regression analysis with a Spearman rank correlation coefficient of r= 0.671 (p<0.001). C. Association between S100B observed at 72 hours and hsCRP measured within 6 hours after onset of symptoms in patients with definitive ischemic stroke Scatterplot of hsCRP plasma level vs. S100B measured at T72 was created in 38 patients after acute ischemic stroke. Shown is a regression analysis with a Spearman rank correlation coefficient of r= 0.359 (p=0.04). D. Association between S100B observed at 72 hours and hsCRP measured 72 hours after onset of symptoms in patients with definitive ischemic stroke Scatterplot of hsCRP plasma level vs. S100B measured at T72 was created in 38 patients after acute ischemic stroke. Shown is a regression analysis with a Spearman rank correlation coefficient of r= 0.745 (p<0.001).
71
Figure 3 Relation of hsCRP to activation of leukocytes represented by LAR
Figure 3
400 hsCRP at T72 (mg/L)
A
300 200 100 0 -100 10
30 50 LAR at T72
70
hsCRP at T72 (mg/L)
B 400 300 200 100 0 -100 -40
-20
0
20
40
Change in LAR (T24-T0)
A. Association between LAR and hsCRP measured 72 hours after onset of symptoms in patients with definitive stroke Scatterplot of hsCRP plasma level vs. LAR measured at T72 was created in 38 patients after acute ischemic stroke. Shown is a regression analysis with a Spearman rank correlation coefficient of r= 0.528 (p<0.01). B. Association between change in LAR within the first 24 hours and hsCRP measured 72 hours after onset of symptoms in patients with definitive stroke Scatterplot of hsCRP plasma level vs. change of LAR within the first 24 hours after stroke was created in 38 patients after acute ischemic stroke. Shown is a regression analysis with a Spearman rank correlation coefficient of r= -0.590 (p<0.001).
72
Figure 4 Figure 4
A
hsCRP (mg/L)
400
p<0.01
300 200
hsCRP at T0 hsCRP at T24 hsCRP at T72
p<0.01
100 0
favourable poor outcome outcome (GOS>3) (GOS≤3) GOS at hospital discharge
B
C 1.0 Sensitivity
Sensitivity
1.0 .8 .5 .3 0.0
0.0 .3
.5
.8
1.0
.8 .5 .3 0,0 0.0 .3
1 - Specificity
.5
.8
1.0
1 - Specificity
A. Comparison of serum hsCRP in patients with poor and good outcome after definitive ischemic stroke Plasma hsCRP concentrations (median, interquartile range, min.-max) were examined in 38 patients measured on admission (T0), at 24 hours (T24) and 72 hours (T72) after acute ischemic stroke in good (GOS>3) versus poor (GOS≤3) outcome defined by Glasgow Outcome Scale at hospital discharge. B. ROC analysis of hsCRP measured 72 hours after onset of symptoms concerning infectious complications Receiver operating characteristics (ROC) of hsCRP measured at T72 was analyzed in 38 patients after acute ischemic stroke predicting infectious complications (AUC of hsCRP: 0.969, p<0.001). The best cut-off value of hsCRP72 was found 13.95 mg/L with a sensitivity of 100% and a specificity of 81.2%. C. ROC analysis of hsCRP measured 72 hours after onset of symptoms concerning poor outcome measured by GOS≤3
73
Receiver operating characteristics (ROC) of hsCRP measured at T72 was analyzed in 38 patients after acute ischemic stroke predicting poor outcome (AUC of hsCRP : 0.833, p=0.004). The best cut-off value of hsCRP72 was found 21.3 mg/L with a sensitivity of 78.6% and a specificity of 91.7%.
74
Paper 3
IMPAIRED FUNCTION OF INNATE T LYMPHOCYTES AND NK CELLS IN THE ACUTE PHASE OF ISCHEMIC STROKE Agnes Peterfalvi MD1, Tihamer Molnar MD2, Gabriella Pusch MD1, Laszlo Szereday MD, PhD3*, Zsolt Illes MD, PhD1* *contributed equally 1
Department of Neurology, University of Pecs, Pecs, Hungary 2Department of
Anaesthesiology and Intensive Therapy, University of Pecs, Pecs, Hungary 3Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Pecs, Pecs, Hungary
ABSTRACT Background and Purpose: Functional alterations of innate lymphocytes, which can amount rapid immune responses and shape subsequent T cell reactions, were examined in the acute phase of ischemic stroke. Methods: Frequencies, intracellular perforin and IFN-γ expression of Vδ2 T cells, CD3+CD56+ natural killer T (NKT)-like and CD56+ natural killer (NK) cells were examined sequentially in the peripheral blood of 20 healthy controls and 28 patients within 6 hours of the onset of acute ischemic stroke and after 72 hours by flow cytometry. Pro- and anti-inflammatory cytokine production of isolated NKT-like and NK cells following in vitro activation was measured by cytometric bead array. NK cytotoxicity was examined in the peripheral blood mononuclear cells. Results: Percentage of Vδ2, NKT-like and NK cells at 6 and 72 hours after stroke were constant and similar to percentages in healthy subjects. In contrast, pro-inflammatory intracellular IFN-γ expression by Vδ2 T cells, NKT-like cells and NK cells and IFN-γ production by isolated NK cells in culture was low at 6 hours and reached the level of healthy subjects by 72 hours after stroke. Anti-inflammatory IL-4, IL-5 and IL-10 production of NKT-like and NK cells was not altered. Intracellular perforin expression by Vδ2 T cells, NKT-like cells and NK cells, and NK cytotoxicity was low at 6 hours and reached the level of healthy subjects by 72 hours. Conclusions: Pro-inflammatory and cytotoxic responses of NK, NKT-like and Vδ2 T cells become acutely deficient in ischemic stroke, which may contribute to an increased susceptibility to infections.
75
INTRODUCTION Stroke is associated with high mortality and morbidity, and stroke survivors often remain permanently disabled. While direct neurological deficits cause early deaths, infectious complications prevail in the postacute phase of stroke contributing to the poor outcome.1-6 Such an increased susceptibility to infections after stroke may suggest early alteration of immune responses.7-9 Recently, acute deficiency of T cells has been indicated in experimental stroke models.10,11 Very recently, dramatic loss of T cells in the peripheral blood of patients with acute ischemic stroke, within 12 hours from onset of symptoms, has been indicated.12 These few studies all addressed the rapid changes in the adaptive arm of the immune system, mainly T cells. Cells of the other part of the immune system, innate immunity can initiate immediate non-antigen specific reactions in contrast to T cells. In addition, particular lymphocyte subsets including specific innate T cell populations bridge the adaptive and innate immune responses and are able to amount a rapid immune response either through inflammatory cytokine production or cytotoxicity. These mechanisms are important in defense against pathogens and also shaping subsequent adaptive T cell responses. Such innate lymphocyte subsets have not been thoroughly examined in the acute phase of ischemic stroke. γδT cells express a T cell receptor (TCR) consisting of a γ-chain combined with a δchain, composing a distinct T cell population from the well-known αβT cells. γδT cells have been proposed to bridge the innate and adaptive immune responses.13,14 They are able to produce great amounts of interferon-γ (IFN-γ) in a short period of time, which is characteristic to cells of the innate immune system.13,14 γδT cells are important regulators of immune responses, play a necessary role in protective immune responses against pathogens and tumors through provision of an early source of IFN-γ.15 The Vδ2 subset, expressing a δ2 TCR variable chain, represents the majority of adult γδT cells mainly with a cytotoxic property.14,16 Natural killer T (NKT)-like CD3+CD56+ cells are unique T cells co-expressing a Tcell receptor complex (CD3) and NK receptors (CD56).17 The role of NKT-like cells have been suggested and investigated in various immune responses, including response to infectious agents,18 tumor rejection,19,20 and autoimmunity.21,22 This subset also includes invariant NKT (iNKT) cells being able to produce large quantities of pro-inflammatory IFN-γ and anti-inflammatory cytokines such as interleukin (IL)-4 and IL-10,17,23 and capable of activating NK cells as well.24 Natural killer (NK) cells are crucial components of the innate immune system, which are able to rapidly produce abundant cytokines, mainly IFN-γ, and lyse target cells without prior sensitization.25,26 NK cells play a key role in resistance to infections and destruction of 76
tumor cells.25,26 They express CD56 on their surface, which is widely used as an NK cell marker to identify them, and lack the expression of CD3.25,26 Assistance by NK cells in the development of adaptive immune responses has recently been shown as well.27 Perforin and Fas/Fas ligand (FasL) pathways are the two major mechanisms of cytotoxicity.28,29 Exocytosis of cytotoxic granules containing pre-formed perforin and serine esterase molecules leads to cell lysis by forming pores in target cell membranes.28-30 Perforin is a marker of cytotoxic cells.30,31 FasL produced by effector cells induces apoptosis through Fas, its receptor on target cell surfaces. The Fas/FasL-mediated apoptotic pathway thus depends on cell-surface ligand-receptor interaction.28,29,32 Here, we analyzed functional alterations in cytokine production and cytotoxicity of innate lymphocyte subsets capable of shaping adaptive T cell responses in the acute phase of ischemic stroke.
MATERIALS AND METHODS The study protocol was approved by the Regional Local Ethics Committee. Patients and samples. Altogether 28 Hungarian patients with acute ischemic stroke (16 males, 12 females, mean age: 62 years ± 2.08 years) were prospectively studied and 20 healthy controls were included in this study. All patients were admitted to the Department of Neurology, University of Pecs, Hungary. Written informed consent was obtained from all patients or their authorized representative. Exclusion criteria were infectious diseases, fever <4 weeks before stroke, elevated white blood cells (WBC), erythrocyte sedimentation rate (ESR), high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP, cut-off value <10 mg/L), procalcitonin (PCT, cut-off value <0.05 ng/mL) on admission, positive chest X-ray, hemorrhagic stroke defined by an acute cranial CT scan, transient ischemic attack (TIA, based on the nonpersistency of clinical signs and cranial CT scan after 24 hours) and decline to participate in the study. Patients admitted to hospital more than 6 hours after symptom onset were excluded too. Twenty-two patients had large territorial and 6 patients had lacunar infarct. In 8 cases, stroke was caused by embolism either cardiogenic (n=5) or arterial (n=3). All but one patients had infarct in the anterior circulation. Control CT scan showed hemorrhagic transformation in a single case only. Peripheral blood was drawn from the cubital vein two times from each patient within 6 hours from symptom onset and after 72 hours. Clinical data were collected on admission and at 72 hours. Outcome measures were obtained at discharge from hospital (Table 1). The National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) was assessed as a quantitative measure of stroke-related neurological deficit on admission and at 72 hours. 77
Table 1 Demographic and clinical data of subjects Patients, acute
Healthy
ischemic stroke
subjects
n=28
n=20
62 (40-83)
45.1 (26-64)
16
7
12
13
NIHSS 6h (median, range)
10 (4-19)
N/A
NIHSS 72h (median, range)
6 (1-22)
N/A
GOS at discharge (median, range)
4 (1-5)
N/A
Length of stay (day, mean, range)
9.04 (4-27)
N/A
Age (year, mean, range) Sex : Male Female
Cell isolation and flow cytometry. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from heparinized venous blood on Ficoll-Paque gradient (AP Hungary Kft. Budapest, Hungary) by density gradient centrifugation. After washing in phosphate-buffered saline (PBS), 1x106 PBMCs were incubated for 30 minutes at room temperature with different dual or triple combinations of the following anti-human monoclonal antibodies (mAb): fluorescein
isothiocyanate (FITC)-conjugated
phycoerythrin
(PE)-conjugated
anti-FasL
anti-CD3, anti-Vδ2
(CD178),
anti-IFN-γ,
T cell
receptor,
anti-perforin,
and
allophycocyanin (APC)-conjugated anti-CD56 (all antibodies from BD Pharmingen, Soft Flow Hungary Kft., Pécs, Hungary). In the case of IFN-γ staining, PBMCs underwent a 4hour cytokine stimulation with ionomycin, brefeldin A and phorbol-myristate-acetate (PMA) (all from Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hungary) prior to the immunostaining. In the case of perforin and IFN-γ stainings PBMCs were permeabilized with FACS Permeabilizing Solution 2 (BD Biosciences, Soft Flow Hungary Kft., Pécs, Hungary) before adding the respective antibody. After incubation, the samples were washed in PBS and resuspended in 4% paraformaldehyde, stored at 4ºC in dark to be processed for FACS analysis 24 hours at the latest following fixation. At least 50,000 cells were analyzed using a FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Erembodegen, Belgium) after
78
single gating on lymphoid cells for all mAb combinations. The percentages of positive cells were calculated using CellQuest software (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA). NK and NKT-like CD3+CD56+ T cell separation and Cytometric Bead Array (CBA). Natural killer and CD3+CD56+ T cells were separated by MACS Cell Separation Technology (all reagents and instruments from Miltenyi Biotec, Frank Diagnosztika Kft., Budapest, Hungary). PBMCs were first magnetically labelled with CD56 MicroBeads according to the manufacturer’s instructions and CD56+ cells were positively selected on the cell separation column. In the next step, the magnetic beads bound to the cell surface were enzymatically released from the CD56+ cells, which were then magnetically labelled with CD3 MicroBeads and the CD3+ subpopulation positively selected to compose the CD3+CD56+ T cell population. The remaining fraction of the CD56+ cells, which did not bind the CD3 beads composed the CD3-CD56+ NK cell population. Both cell populations were stimulated with ionomycin and PMA (Sigma-Aldrich, Sigma-Aldrich Kft., Budapest, Hungary) in RPMI 1640 Medium containing 10% foetal bovine serum, penicillin and streptomycin (all from Invitrogen, Csertex Kft., Budapest, Hungary) overnight for cytokine production. The levels of IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ and tumor necrosis factor (TNF)-α were determined from the culture supernatants with Cytometric Bead Array (CBA) (#550749, BD Biosciences, Soft Flow Hungary Kft., Pécs, Hungary) using different capture beads according to the manufacturer’s instructions to detect the respective cytokines. Samples were analyzed right after the experiment on a FACS calibur flow cytometer (BD Immunocytometry Systems, Erembodegen, Belgium) calculating the amount of cytokines with CBA Software (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Cytotoxicity. The cytotoxic activity of NK cells was determined with a nonradioactive, colorimetric cytotoxicity assay (#G1780, Promega, Bio-Science Kft., Budapest, Hungary). PBMCs containing NK cells were co-cultured with K562 cells, conventional target cells of NK cells (NK-sensitive erythroleukaemia cell line)33,34 for 4 hours at 37ºC in 40:1, 20: 1 and 10:1 effector-to-target ratios in a U-bottom 96-well tissue culture plate, according to the manufacturer’s instructions. Absorbance of the final color product was recorded by a standard 96-well plate reader (Thermo Labsystems, Franklin, MA, USA) at 492 nm. Cytotoxicity was expressed as the percentage of lysed target cells in each effector-to-target ratio. Statistical analysis. Statistical comparisons were made by using one- and two-tailed Student’s t-tests. The results were expressed as the mean value±standard error of the mean (SEM). Differences were considered significant when the value of P was equal to or less than 0.05. 79
RESULTS
Innate peripheral lymphocyte frequencies in the acute phase of ischemic stroke. In order to investigate the acute innate cellular immune responses in ischemic stroke, peripheral blood (PB) samples were acquired within 6 hours and after 72 hours of symptom onset and compared both with each other and with healthy controls. We particularly focused on innate T lymphocytes like γδT cells, CD3+CD56+ NKT-like cells and CD3-CD56+ NK cells, which are capable of rapidly producing cytokines and performing cytotoxicity. The frequency of Vδ2+, NKT-like T cells and NK cells in the PB was not different, when samples obtained within 6 hours after onset of stroke were compared to samples obtained 72 hours later. In addition, samples taken from patients did not differ when compared to healthy controls (Table 2).
Table 2 Innate lymphocyte frequencies in the peripheral blood Percentage of PBL
Healthy
Patients, acute ischemic
subjects
stroke within 6 hours after 72 hours
Vδ2 T %
2.02 ± 0.54
1.37 ± 0.24
1.66 ± 0.25
CD3+CD56+ NKT-like %
4.41 ± 1.56
6.22 ± 1.37
5.75 ± 1.37
CD3-CD56+ NK %
17.34 ± 2.23
16.34 ± 2.19
16.63 ± 2.34
mean±SE
Cytokine production of innate lymphocyte subsets in the acute phase of ischemic stroke Intracellular IFN-γ production. Next, intracellular IFN-γ expression was analyzed by flow cytometry in Vδ2+ T cells, CD3+CD56+ NKT-like, and NK cells (Figure 1). The expression of IFN-γ was significantly higher in all subsets after 72 hours compared to samples obtained within 6 hours from the beginning of ischemic stroke. In order to define whether the baseline IFN-γ at 6 hours was deficient or normal, data were obtained from healthy individuals as well. IFN-γ expression in healthy subjects corresponded to percentages of IFN-γ producing cells at
80
72 hours of patients in all subsets, and differed significantly from percentages at 6 hours in CD3+CD56+ NKT-like and Vδ2+ T cells. Pro- and anti-inflammatory cytokine production. Pro- and anti-inflammatory cytokine production of isolated CD3+CD56+ NKT-like and NK cells were also analyzed. NK and NKTlike subsets were separated by magnetic beads, stimulated for 24 hours by PMA/ionomycin and IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5 and IL-10 production was measured in the supernatants. In case of NK cells, significantly higher IFN-γ levels were detected at 72 hours compared to 6 hours after the beginning of stroke in accordance with data obtained by the flow cytometric analysis (37,6 ng/ml vs. 21,8 ng/ml p<0,05). The levels of the other investigated cytokines were not different (data not shown).
Vδ δ2 T cells
IFN-γ expression (%)
80.00
B
p<0.003
NKT-like cells CD3+CD56+ 80.00
IFN-γ expression (%)
A
p<0.05 60.00
40.00
20.00
Intracellular IFN-γγ expression
p<0.05 60.00
Figure 1 by
innate lymphocytes
p<0.02
in acute ischemic 40.00
stroke Intracellular
20.00
IFN-γ
expression by Vδ2 T 0.00 6 hrs 72 hrs after stroke
HS
0.00 6 hrs 72 hrs after stroke
HS
cells
(A), +
CD3 CD56
+
NKT-
like (B) and NK (CD3-CD56+)
IFN-γ expression (%)
C
80.00
NK cells CD3-CD56+
(C)
and in the peripheral blood
60.00
ischemic patients
p<0.05 40.00
of
acute stroke
within
6
hours and after 72 hours from the onset
20.00
of stroke symptoms, and those of healthy
0.00 6 hrs 72 hrs after stroke
HS
subjects is indicated.
81
Cytotoxicity of innate lymphocytess in the acute phase of ischemic stroke Perforin expression. Intracellular expression of perforin was analyzed by flow cytometry in Vδ2+ T cells, CD3+CD56+ NKT-like and NK cells (Figure 2). Significantly increased percentages of perforin-expressing Vδ2+ T cells, NKT-like and NK cells were revealed in samples obtained at 72 hours compared to 6 hours after onset of stroke. Perforin expression in healthy subjects corresponded to percentages of perforin producing cells at 72 hours of patients in all subsets, and differed significantly from percentages at 6 hours in CD3+CD56+ NKT-like cells.
Vδ δ2 T cells
B
90.00
90.00
80.00
80.00
Perforin expression (%)
Perforin expression (%)
A
60.00 p<0.01 40.00 20.00
60.00
NKT-like cells CD3+CD56+
Figure 2 Intracellular perforin expression
p<0.05
by
p<0.01
innate
lymphocytes 40.00
acute
in
ischemic
stroke
20.00
Intracellular 0.00
0.00 6 hrs 72 hrs after stroke
HS
6 hrs 72 hrs after stroke
HS
perforin expression by Vδ2 T cells (A),
CD3+CD56+ NKT-
90.00 Perforin expression (%)
like (B) and NK
NK cells CD3-CD56+
C
(CD3-CD56+) (C) in
p<0.05
the peripheral blood of
80.00
acute
stroke
60.00
ischemic patients
within 6 hours and 40.00
after 72 hours from the onset of stroke
20.00
symptoms, and those 0.00 6 hrs 72 hrs after stroke
of healthy subjects is
HS
indicated.
82
FasL expression. We were also interested in the role of the other major cytotoxic mechanism, the Fas/FasL-mediated apoptotic pathway.28,29,32 Surface expresion of FasL was examined on CD3+CD56+ NKT-like cells and NK cells. FasL expression was significantly decreased by CD3+CD56+ NKT-like and NK cells in samples obtained after 72 hours of symptom onset (Figure 3). FasL expression in healthy subjects corresponded to percentages of FasL expressing cells at 72 hours of patients in both subsets, and differed significantly from percentages at 6 hours in NK cells.
A
NKT-like cells CD3+CD56+
8.00 6.00 4.00 2.00 0.00
NK cells CD3-CD56+ 10.00
p<0.05 FasL expression (%)
FasL expression (%)
10.00
B
8.00 6.00
p<0.01 p<0.02
4.00 2.00
6 hrs 72 hrs after stroke
0.00
HS
6 hrs 72 hrs after stroke
HS
Figure 3. FasL expression by innate lymphocytes in acute ischemic stroke. Surface FasL expression by CD3+CD56+ NKT-like (A) and NK (CD3-CD56+) (B) in the peripheral blood of acute ischemic stroke patients within 6 hours and after 72 hours from the onset of stroke symptoms, and those of healthy subjects is indicated. HS: healthy subjects, mean±SE is shown
NK cytotoxicity. Since we observed significant alterations in expression of mediators of major cytotoxic pathways, we analyzed functional changes of NK cytotoxicity in acute ischemic stroke. Significantly increased percentages of lysed target cells in samples acquired after 72 hours of stroke compared to the 6-hour samples were found in each experimental effector-totarget cell ratio (40:1, 20:1 and 10:1) (Figure 4).
83
Within 6 hours % lysed cells 70.0 0 60.0
After 72 hours Healthy subjects
* **
40.0
** * p<0.05 ** p<0.01
20.0 0 0.0 T:E 1:40
T:E 1:20
T:E 1:10
Figure 4. NK cell cytotoxicity in acute ischemic stroke. Cytotoxic activity of NK cells as a percentage of lysed cells is indicated in ischemic stroke patients within 6 hours and after 72 hours from the onset of stroke symptoms, and that of healthy subjects, at different target and effector cell ratios. T=target cell, E=effector cell, mean±SE is shown
DISCUSSION Though the nature of immunological changes due to acute ischemic stroke is not fully described and understood, they seem to occur rapidly, within hours after the cerebrovascular attack. Therefore, in the present study, we analyzed rapid changes in immunological functions of innate lymphocytes, which are capable of rapidly producing cytokines influencing subsequent adaptive immune responses, and performing cytotoxicity. We particularly focused on γδT cells, CD3+CD56+ NKT-like cells and CD3-CD56+ NK cells. We found that counts of innate T lymphocytes and NK cells were consistent in the acute phase of stroke, and did not differ from control subjects. Similarly, a recent report has not found any alterations in NK cell number, only adaptive T lymphocyte subsets showed a decreased percentage in stroke.12 In contrast to T cells participating in adaptive immune responses, number and percentages of innate T lymphocytes were found to be unaltered here. However, extensive functional changes of these cell types were revealed. Cell counts and percentages do not always reflect faithfully the underlying immunological changes, and functional changes may occur without differences of cell counts and percentages even in cell subsets with regulatory functions.35
84
Rapid cytokine production is one of the major mechanisms to influence and regulate subsequent immune responses. Therefore, we analyzed pro- and anti-inflammatory cytokine expression and production in two different ways: expression of intracellular IFN-γ production and anti- and pro-inflammatory cytokine levels in supernatants of isolated innate lymphocyte cultures. Intracellular production of IFN-γ was reduced in all lymphocyte subsets, and NK cell supernatants showed decreased level of IFN-γ in the hyperacute phase of stroke. Such decreased IFN-γ expression and levels normalized by 72 hours. IFN-γ is a major Th1, proinflammatory cytokine with widespread functions in immune cell regulation, which plays a key role in the response to infectious agents.36,37 The low IFN-γ production after stroke contributes to acute immunodeficiency in ischemic stroke. Similarly impaired T and NK cell responses, particularly a reduced IFN-γ production were described in a mouse model of focal cerebral ischemia.10 Of note, production of anti-inflammatory cytokines (IL-4, IL-5, IL-10) was not altered in our patients, and expression of inducible co-stimulatory molecule (ICOS) connected to Th2 cytokine responses was also normal (data not shown). In a previous study, serum levels of IL-10 was normal as well, supporting our data obtained by stimulation of isolated innate lymphocytes.12 Beside cytokine production, we also examined a major effector pathway, alteration of cyotoxicity in the early phase of stroke. The defective cytotoxicity of NK cells within 6 hours from onset indicates a rapid loss of immune functions, and provides further evidence for the existence of stroke-induced immunodepression in humans. Such early deficiency of cytotoxicity correlated well with the decreased production of IFN-γ by NK cells. Since two major pathways are responsible for cytotoxicity,28,29 we analyzed expression of these molecules on Vδ2+ T, NKT-like and NK cells. Interestingly, expression of such mediators showed anti-parallel alterations: decrease of intracellular perforin expression after acute ischemic stroke correlates with decreased IFN-γ production in all three innate lymphocyte subsets and functional cytotoxicity in NK cells, but apparently not with increase of FasL expression in NK and NKT-like cells. However, perforin and FasL represent two different and independent mechanisms of cytotoxicity, and the processes of NK cell-mediated necrotic and apoptotic cytotoxic pathways mediated by perforin and FasL are differentially regulated by cytokines.38 Thus expression of perforin and FasL may change inversely and the overall cytotoxic effect is a consequence of the two pathways together: early decrease in NK cytotoxicity and decreased IFN-γ production and perforin expression by all three subsets was characteristic of acute ischemic stroke.
85
Our data indicate functional impairment of innate lymphocytes in the hyperacute phase of stroke. Considering that innate lymphocytes provide acute defense against infections, particularly by production of IFN-γ and cytotoxicity, such early deficiency or its disregulated normalization may substantially influence susceptibility to infections similar to animal models of cerebral ischemia.10,39 Decreased number of T lymphocytes related to adaptive immune responses has recently been shown in the hyperacute phase of stroke but functional changes have not been addressed.12 Here, we show that besides a decreased frequency of adaptive T cells, function of innate T lymphocytes and NK cells is also deficient in the early phase of stroke, similarly to animal models.10 Such functional impairment of innate lymphocytes may complicate the reported decreased number of adaptive T lymphocytes in the early phase of stroke and contribute to susceptibility to post-stroke infections.12 Altogether, our study offers further evidence to support the development of strokeinduced early immunodepression in humans, suggesting the deficient function of innate lymphocytes. These cells may serve as potential new targets in treatments to avoid strokeinduced immunodepression and its possible consequences, infectious diseases. Controversial results of studies where prophylactic antibiotics were administered in the acute and postacute phase of stroke40,41 highlight the importance of further investigations on the exact, detailed pathomechanism of the phenomenon and the search for new therapeutic targets.
ACKNOWLEDGEMENTS AND FUNDING. This study was supported by grants from the Hungarian Research Fund (OTKA T049463 to Z. Illes and F060540 to L. Szereday), ETT 50053-2006 and the Bolyai Janos Foundation of the Hungarian Academy of Sciences to Z. Illes.
REFERENCES 1. Davenport RJ, Dennis MS, Wellwood I, Warlow CP. Complications after acute stroke. Stroke. 1996;27:415420. 2. Johnston KC, Li JY, Lyden PD, Hanson SK, Feasby TE, Adams RJ, Faught RE, Haley EC. Medical and neurological complications of ischemic stroke: experience from the RANTTAS trial. RANTTAS Investigators. Stroke. 1998;29:447-453.
86
3. Georgilis K, Plomaritoglou A, Dafni U, Bassiakos Y, Vemmos K. Aetiology of fever in patients with acute stroke. J Intern Med. 1999;246:203-209. 4. Grau AJ, Buggle F, Schnitzler P, Spiel M, Lichy C, Hacke W. Fever and infection early after ischemic stroke. J Neurol Sci. 1999;171:115-120. 5. Vargas M, Horcajada JP, Obach V, Revilla M, Cervera A, Torres F, Planas AM, Mensa J, Chamorro A. Clinical consequences of infection in patients with acute stroke: is it prime time for further antibiotic trials? Stroke. 2006;37:461-465. 6. Sellars C, Bowie L, Bagg J, Sweeney MP, Miller H, Tilston J, Langhorne P, Stott DJ. Risk factors for chest infection in acute stroke. A prospective cohort study. Stroke. 2007;38:2284-2291. 7. Meisel C, Schwab JM, Prass K, Meisel A, Dirnagl U. Central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Nat Rev Neurosci. 2005;6:775-786. 8. Chamorro A, Urra X, Planas AM. Infection after acute ischemic stroke: a manifestation of brain induced immunodepression. Stroke. 2007;38:1097-1103. 9. Dirnagl U, Klehmet J, Braun JS, Harms H, Meisel C, Ziemssen T, Prass K, Meisel A. Stroke-induced immunodepression: experimental evidence and clinical relevance. Stroke. 2007;38:770-773. 10. Prass K, Meisel C, Hoeflich C, Braun J, Halle E, Wolf T, Ruscher K, Victorof IV, Priller J, Dirnagl U, Volk H-D, Meisel A. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. J Exp Med. 2003;198:725-736. 11. Offner H, Subramanian S, Parker SM, Wang C, Afentoulis ME, Lewis A, Vandenbark AA, Hurn PD. Splenic atrophy in experimental stroke is accompanied by increased regulatory T cells and circulating macrophages. J Immunol. 2006;176:6523-6531. 12. Vogelgesang A, Grunwald U, Langner S, Jack R, Broeker BM, Kessler C, Dressel A. Analysis of lymphocyte subsets in patients with stroke and their influence on infection after stroke. Stroke. 2008;39:237-241. 13. Lahn M. The role of gammadelta T cells in the airways. J Mol Med. 2000;78:409-425. 14. De Rosa SC, Andrus JP, Perfetto SP, Mantovani JJ, Herzenberg LA, Herzenberg LA, Roederer M. Ontogeny of γδT cells in humans. J Immunol. 2004;172:1637-1645. 15. Gao Y, Yang W, Pan M, Scully E, Girardi M, Augenlicht LH, Craft J, Yin Z. γδT cells provide an early source of interferon γ in tumor immunity. J Exp Med. 2003;198:433-442. 16. Szekeres-Bartho J, Barakonyi A, Miko E, Polgar B, Palkovics T. The role of gamma/delta T cells in the fetomaternal relationship. Semin Immunol. 2001;13:229-233. 17. Kronenberg M, Gapin L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immunol. 2002;2:557-568. 18. Tupin E, Kinjo Y, Kronenberg M. The unique role of natural killer T cells in the response to microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2007;5:405-417. 19. Lu PH, Negrin RS. A novel population of expanded human CD3+CD56+ cells derived from T cells with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficiency. J Immunol. 1994;153:16871696. 20. Mehta BA, Schmidt-Wolf IG, Weissman IL, Negrin RS. Two pathways of exocytosis of cytoplasmic granule contents and target cell killing by cytokine-induced CD3+ CD56+ killer cells. Blood. 1995;86:3493-3499.
87
21. Hammond KJ, Kronenberg M. Natural killer T cells: natural or unnatural regulators of autoimmunity? Curr Opin Immunol. 2003;15:683-689. 22. Hammond KJ, Godfrey DI. NKT cells: potential targets for autoimmune disease therapy? Tissue Antigens. 2002;59:353-363. 23. Miyake S, Yamamura T. NKT cells and autoimmune diseases: unraveling the complexity. Curr Top Microbiol Immunol. 2007;314:251-267. 24. Carnaud C, Lee D, Donnars O, Park SH, Beavis A, Koezuka Y, Bendelac A. Cutting edge: cross-talk between cells of the innate immune system: NKT cells rapidly activate NK cells. J Immunol. 1999;163:46474650. 25. Robertson MJ, Ritz J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood. 1990;76:24212438. 26. Cooper MA, Fehniger TA, Caligiuri MA. The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol. 2001;22:633-640. 27. Strowig T, Brilot F, Münz C. Noncytotoxic functions of NK cells: direct pathogen restriction and assistance to adaptive immunity. J Immunol. 2008;180:7785-7791. 28. Kägi D, Vignaux F, Ledermann B, Bürki K, Depraetere V, Nagata S, Hengartner H, Golstein P. Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell-mediated cytotoxicity. Science. 1994;265:528-530. 29. Lowin B, Hahne M, Mattmann C, Tschopp J. Cytolytic T-cell cytotoxicity is mediated through perforin and Fas lytic pathways. Nature. 1994;370:650-652. 30. Podack ER, Hengartner H, Lichtenheld MG. A central role of perforin in cytolysis? Annu Rev Immunol. 1991;9:129-157. 31. Griffith GM, Mueller C. Expression of perforin and granzymes in vivo: potential markers for activated cytotoxic cells. Immunol Today. 1991;12:415-419. 32. Suda T, Okazaki T, Naito Y, Yokota T, Arai N, Ozaki S, Nakao K, Nagata S. Expression of the Fas ligand in cells of T cell lineage. J Immunol. 1995;154:3806-3813. 33. Nishimura M, Mitsunaga S, Akaza T, Mitomi Y, Tadokoro K & Juji T. Protection against natural killer cells by interferon-γ treatment of K562 cells cannot be explained by augmented major histocompatibility complex class I expression. Immunology. 1994;83:75-80. 34. Kubista B, Trieb K, Herbacek I, Micksche M. Effect of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on natural-killer cell mediated cytotoxicity. Int J Biochem Cell Biol. 2003;35:1056-1060. 35. Viglietta V, Baecher-Allan C, Weiner HL, Hafler DA. Loss of functional suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. J Exp Med. 2004;199:971-979. 36. Young HA, Hardy KJ. Role of interferon-γ in immune cell regulation. J Leukoc Biol. 1995;58:373-381. 37. Young HA, Bream JH. IFN-gamma: recent advances in understanding regulation of expression, biological functions, and clinical applications. Curr Top Microbiol Immunol. 2007;316:97-117. 38. Gardiner CM, Reen DJ. Differential cytokine regulation of natural killer cell-mediated necrotic and apoptotic cytotoxicity. Immunology. 1998;93:511-517. 39. Prass K, Braun JS, Dirnagl U, Meisel C, Meisel A. Stroke propagates bacterial aspiration to pneumonia in a model of cerebral ischemia. Stroke. 2006;37:2607-2612.
88
40. Chamorro A, Horcajada JP, Obach V, Vargas M, Revilla M, Torres F, Cervera A, Planas AM, Mensa J. The Early Systemic Prophylaxis of Infection After Stroke study: a randomized clinical trial. Stroke. 2005;36:14951500. 41. Schwarz S, Al-Shajlawi F, Sick C, Meairs S, Hennerici MG. Effects of prophylactic antibiotic therapy with mezlocillin plus sulbactam on the incidence and height of fever after severe acute ischemic stroke: the Mannheim infection in stroke study (MISS). Stroke. 2008;39:1220-1227.
89
Paper 4 AZ IMMUNVÁLASZ ÉS A NEUROIMMUN MODULÁCIÓ SZEREPE AZ AKUT ISCHAEMIÁS STROKE ÉS A POST-STROKE INFEKCIÓ PATOGENEZISÉBEN Papp Viktória, Dr. Molnár Tihamér1, Dr. Bánáti Miklós, Dr. Illés Zsolt PhD Neurológiai Klinika, Pécsi Tudományegyetem, Pécs 1
Aneszteziológia és Intenzív Terápiás Intézet, Pécsi Tudományegyetem, Pécs
ÖSSZEFOGLALÁS Az akut kezdettel járó cerebrovaszkuláris betegségek számos, különböző immunológiai változással állnak kapcsolatban. Immunológiai folyamatok fontos szerepet játszanak a strokeot megelőző érfali plakkok kialakulásában, meghatározóak azonban a stroke-ot követően is, két fő módon: a post-stroke immunválasz egyrészt az agyban a szöveti sérüléshez járul hozzá, a stroke azonban a szisztémás immunválaszra is hatást gyakorol, mely több következménnyel jár. Az idegrendszer és immunrendszer között fennálló egyensúly megbomlása miatt idegrendszeri deprimáló hatások érik az immunrendszer elemeit, és kialakul a CIDS (central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome). A CIDS kettős hatású: csökkenti a szisztémás immunválasz effektivitását és így növelheti a fertőzésre való hajlamot – a post-stroke infekció okozza a stroke-on átesett betegek halálozásának nagy százalékát -, másrészt véd az infarktus területéből felszabaduló agyszöveti antigénekre adott autoimmun folyamatok ellen. Az új terápiás lehetőségek kutatásaiban az idegrendszer-immunrendszer e finoman regulált folyamatainak összessége és a post-stroke infekció mortalitásra gyakorolt hatása fontos szempont lehet.
Kulcsszavak: stroke, immunrendszer, ateroszklerózis, CIDS, post-stroke infekció
90
IMMUNE RESPONSES AND NEUROIMMUNE MODULATION IN THE PATHOGENESIS OF ACUTE ISCHEMIC STROKE AND POST-STROKE INFECTIONS Viktória Papp, Tihamér Molnár, Miklós Bánáti, Zsolt Illés Department of Neurology, University of Pecs 1
Department of Anesthesiology and Intensive Therapy, University of Pecs
SUMMARY Acute-onset cerebrovascular diseases are connected to a number of immunological changes. Here, we summarize immune responses participating in the evolution of atherosclerotic plaques and post-stroke local immune responses in the injured CNS as well as in the systemic circulation. Ischemic injury of the CNS alters the balanced neuroimmune modulation resulting in CIDS, the central nervous system injury-induced immune deficiency syndrome. Due to the immunodepression and reduced pro-inflammatory immune responses, the susceptibility for infection is increased; indeed, post-stroke infection plays a major role in stroke-related mortality. On the other hand, CIDS may protect against damaging autoimmune responses elicited by exposed CNS antigens. Investigation of immune responses related to ischemic stroke may result in novel therapies indicated by an increasing number of experimental and clinical trials altering post-stroke immune responses and preventing infections.
Key words: stroke, immune system, atherosclerosis, CIDS, post-stroke infection
91
A
STROKE-T
MEGELŐZŐ
ATEROSZKLERÓZIS
IMMUNOLÓGIAI
VONATKOZÁSAI Az ateroszklerózis számtalan kedvezőtlen kimenetelű vaszkuláris történés hátterében állhat. A stroke megbetegedések több mint 80%-a ischaemiás eredetű (1), melynek leggyakoribb etiológiai alapját az erek falában kialakult plakk okozta érszűkület, illetve a destabilizáció komplikációi eredményezik (2). Az ateroszklerózis patomechanizmusának megközelítése mára jóval összetettebbé vált: nemcsak az artériák falában lerakodott patológiás lipid depozitum okozta kórállapotnak, hanem krónikus gyulladásos folyamatnak tartják (3). A veleszületett és szerzett immunrendszer elemei, gyulladásos folyamatok hozzájárulnak az érfali plakkok kialakulásához, progressziójához és destabilizációjához.
A veleszületett, ősi immunrendszer szerepe Az ősi immunrendszer elsődleges védőfunkciót tölt be a károsító ágensekkel szemben. A defenzív immunfolyamatokat beindíthatják exogén - infektív eredetű – antigének, de endogén – pl. módosult lipoprotein – antigének is. Olyan gyakori, az ateroszklerózis kialakulására prediszponáló kórállapotokra, mint az hiperkoleszterinémia, hipertónia, vagy diabétesz jellemző az endothelium diszfunkciója, mely gyulladáskeltő és protrombotikus tulajdonságúvá alakítja az endothel felszínt. Mindezen állapotok genetikai háttere befolyásolja a vaszkuláris betegségek kialakulását és a preventív terápiás lehetőségeket (4). Az ateroszklerotikus léziók egyik legfontosabb független rizikó faktorának a vér összkoleszterin szintje bizonyult (5). Az endotheliális diszfunkció eredményeként e a lipid partikulumok akkumulálódnak az artériák intima rétegében. Az artériafalban
felhalmozódó
koleszterintartalmú
lipid
egységek
enzimek
és
oxigén
szabadgyökök hatására módosulnak, és gyulladáskeltő tulajdonságúvá válnak (1. ábra) (6). Az endogén antigének mellett exogén antigének közül specifikus ágensként a Clamidia pneumoniae, a CMV, és a Helicobacter pylori kóroki szerepét hangsúlyozták (7). A C. pneumoniae DNS-je gyakran kimutatható ischaemiás infarktust okozó arteria carotis-ok ateroszklerotikus plakkjaiból, de ez nem korrelál az ateroszklerózis súlyosságával (8). Az endogén és exogén antigének makrofágokat, dendritikus sejteket, endothel és simaizom sejteket stimulálnak azok ősi antigénmintázatot felismerő receptoraikon, a Toll-like receptorokon (TLRs) keresztül. A TLR-4 az ateroszklerotikus plakkok széli területén, ahol a legnagyobb valószínűséggel következnek be repedések, mutathatók ki nagy számban (9,10). A receptorcsalád egy másik tagja, a TLR-2 szintén szoros összefüggésben áll az
92
ateroszklerózis patogenezisével (11). A Toll-like receptor-ligand kapcsolat intracelluláris jelátvitel útján NF-κB transzkripciós faktor által modulált, és az immunválaszban alapvető gének expresszióját befolyásolja. Az endothel felszínén adhéziós molekulák is megjelennek, többek között az endogén eredetű MM-LDL (minimally modified-LDL) hatására (12,13,14), és a simaizom sejtekből gyulladáskeltő citokinek, kemokinek szabadulnak fel (15). A szekretált kemokinek, pl. MPC-1 már a folyamat korai fázisában kimutathatóak a plakkokban. A simaizom sejt és endothelium fokozott
MPC-1
termelése
CCR-2
receptoron
keresztül
monocitákat
vonz
az
endothelsejtekhez, melyek felszínén az emelkedett számban jelenlévő adhéziós molekulák részvételével leukocita retenció és ezt követő, a szubendotheliális tér felé irányuló transzmigráció történik (16). Az endothel sejt két immunglobulin-szerű adhéziós faktora (VCAM-1, ICAM-1), integrinjei és a leukocitafelszíni szelektinek (E-, P-szelektin) interakciója segíti a több lépésben zajló vándorlást. A TLR-szignál, valamint IL-1 és oxidált foszfolipidek fokozott VCAM-1 expressziót indukálnak. Emellett az ICAM-1 hemodinamikai stresszhatásra is fokozottan expresszálódik a sejtek felszínén, ez magyarázhatja a hipertónia ICAM-1 növelő hatását (17). A korai ateroszklerotikus stádiumban szelektív mononukleáris sejt belépés figyelhető meg valószínűleg azért, mert a VCAM-1-gyel kapcsolatot létesítő VLA-4 molekula csak monociták és limfociták felszínén található, de a granulocitákon nem (18). Az érfalba áramlott monociták lokálisan termelődő gyulladáskeltő citokinek és M-CSF növekedési faktor hatására makrofágokká differenciálódnak (19), melyek számos citokin (INF-γ, TNF-α, IL-6, IL-4) szabályozó hatása alatt scavenger receptorokon keresztül felveszik a módosított lipoproteineket (20,21). A perzisztens hiperkoleszterinémiában a makrofágok túlzott mértékű lipid felvétele habos-sejtek kialakulásához vezet. A folyamat végén a habos-sejtek apoptózist szenvednek, így gyulladáskeltő oxidált lipid származékok szabadulnak fel a plakkokban, és tovább súlyosbítják a gyulladásos gócot. Elsősorban a makrofág által termelt IL-1 és TNF-α járul hozzá a lokális gyulladás keletkezéséhez, további makrofág stimulációhoz, és mátrix metalloproteáz szekréció fokozásával a plakk destabilizálódáshoz (22). Emellett a makrofág eredetű IL-6 az akut fázis fehérje, C-reaktív protein (CRP) fokozott termeléséhez vezet. Az TLRs keresztül aktivált makrofágok interleukineket (IL-18, IL-12 és IL-15) termelve kapcsolatot hoznak létre az ősi és a szerzett immunrendszer között azzal, hogy a pro-aterogén gyulladáskeltő Th1 sejt válasz aktivációját eredményezik: állat modellben IL-18 deficiencia csökkent T sejt aktivációhoz vezetett,
93
jelentősen mérsékelve ezzel az érfali léziók súlyosságát és növelve a stabilitásukat (23). IL-18 hatásra a T sejtek, makrofágok, NK-sejtek INF-γ termelése fokozódik (24). A veleszületett immunrendszer szolubilis faktorai, mint a komplement kaszkád és a CRP, melyek együttesen gyorsan eliminálják a mikrobiális ágenseket, szintén részt vesznek az aterogenezisben. C3 ,C4 depozitumok és C5b-C9 komplement komplexek mutathatók ki az ateroszklerotikus léziókban (25). A leváló komplement fragmentek (C5b) erős kemotaktikus hatással bírnak a monocitákra. A CRP, a filogenetikailag ősi, erősen konzervált pentraxin proteincsalád tagja, képes megkötni az opszonizált oxLDL-t, elősegíti a makrofágok lipidfelvételét és INF-γ termelését, valamint aktiválja a komplement rendszert (26,27). Lokális gyulladást jelezve kimutatható az érfali plakkokban, emellett a szisztémás keringésben is emelkedik a szintje, mely prognosztikai hatással is rendelkezik (28,29).
Az adaptív immunrendszer szerepe Az adaptív immunválasz, ezen belül is a T sejtek működése fontos komponense az ateroszklerózis minden állomásának (1. ábra) (30). Az érfali lézióban akkumulálódó sejtek megközelítőleg 20%-a T limfocita (31). A szerzett T sejt válasz kialakulásához az antigén prezentáló sejtek az antigént epitópjaira bontják, majd az MHC molekulákon keresztül a T sejt receptornak (TCR) bemutatják, és ezt követően a T sejt stimulációt egy megerősítő, kostimulációs szignál véglegesíti. Az antigén prezentáló sejtek és T-sejtek között zajló interakció meghatározó az ateroszklerózis kialakulásában és progressziójában (32). A plakkokban CD4+ T helper és CD8+ citotoxikus T sejt egyaránt kimutatható. A T-sejtek legtöbbje a αβ+ TCR-ral rendelkező CD4+ Th sejt, kis hányadban azonban γδ+ TCR-t expresszáló T sejtek is jelen vannak (30). A γδ+ T sejtek és egy speciális T sejt alcsoport, az NK és T sejt markerekkel egyaránt rendelkező NKT sejtek a CD1 antigén prezentáló molekula által bemutatott lipid antigénekre reagálnak. Jelentőségük elsősorban a korai „zsírcsíkok” megjelenésében van (33). Citokin profil alapján a CD4+ Th sejtek több alcsoportba oszthatók: gyulladáskeltő citokineket termelő Th1, a gyulladásgátló profillal rendelkező Th2, a TGF-β-t termelő, az orális és nazális toleranciában fontos regulátoros Th3, és az autoimmun T sejteket tartalmazó, gyulladáskeltő IL-17-et termelő Th17 sejtek, mely utóbbiak reciprok fejlődése a regulátoros Treg sejtekkel a közelmúlt egyik legfontosabb immunológiai felfedezése. A Th1 gyulladáskeltő szubpopuláció IL-2, INF-γ, TNF-α és TNF-β termelés révén a sejt-mediált immunitásért felelős. A Th2 sejtek IL-4, IL-5, IL-13 gyulladásgátló citokineket termelnek, és elősegítik a B sejtes ellenanyagválaszt (34). Makrofágok által szekretált IL-12 94
Th1 differenciálódást eredményez, míg IL-10 a Th2 iránynak kedvez (35). Az INF-γ és IL-12 detektálása az érfali léziókban, annak ismeretében, hogy az oxLDL indukálja, míg az IL-10 gátolja a makrofág IL-12 termelését, arra utalhat, hogy ateroszklerózisban a Th1 sejtválasz dominál. A Th1 és Th2 alcsoport citokinek útján reciprok módon befolyásolja egymás működését (36). A Th1 sejtekre jellemző citokinek további makrofág aktivációt és IL-1, TNFα termelést eredményeznek. Az INF-γ foszfolipáz-A2 expressziót serkentő hatással is rendelkezik, mely gyulladásos lipid mediátorok (eikozanoidok, lizofoszfatidilkolin, PAF) keletkezéséhez vezet (37), továbbá, hozzájárul a plakk destabilizálódáshoz. CD4+ T sejtekkel nem rendelkező apoE-/- egerekben szignifikánsan kisebb mértékű ateroszklerotikus léziók alakultak ki (38). CD8+ citotoxikus T sejtek és B sejtek csak alacsony számban találhatóak meg a plakkokban (31). Bár CD8+ T sejtek hiánya a plakkok előfordulását nem befolyásolta ApoE-/CD8-/- egerekben, a CD8+ T sejtek feltehetően hozzájárulnak a kórállapot progressziójához, ha a vaszkuláris simaizom sejtek által prezentált idegen antigénekkel aktiválódnak. Így például vírusfertőzés esetén az intracelluláris antigének citotoxikus T sejteket stimulálhatnak, és segíthetik az érfali lézió formálódását (30). Az aterogenezis folyamán létrejönnek az immunrendszerben gyulladáscsökkentő hatású változások is, melyek kontrollálják a folyamat kialakulását és progresszióját. Egér kísérletes vizsgálatok a CD4+CD25+ reguláló T sejtek (Treg) ateroszklerózist gátló hatását sugallták (39). A Treg sejtek feltehetően IL-10 és TGF-β termelésen keresztül szupprimálják a saját illetve idegen antigénre adott Th1 és Th2 sejtválaszt (39-41). LDLr-/- egerekben a Treg sejt deficiencia fokozott aterogén lézió kialakulással járt, és anti-CD25 antitesttel létrehozott Treg depléció szintén jelentősebb plakk képződést okozott ApoE-/- egerekben (39). CD4+CD25+ Treg sejtek adaptív transzfer útján is csökkentették az ateroszklerózist (40). Azonban a Treg sejt depléció nem befolyásolta a léziók méretét, ha az effektor T sejtek genetikailag érzéketlenné váltak a TGF-β-val szemben. A TGF-β-ra rezisztens T sejtekkel rendelkező ApoE-/- egerekben fokozott az ateroszklerózis súlyossága (42). Mindez azt sugallja, hogy a TGF-β szükséges a Treg sejtek ateroprotektív hatásához. E speciális T sejt csoporton kívül makrofágok, simaizom sejtek is termelnek TGF-β-t, mely a kollagén szintetáz szintézisét stimulálja és fibrogenikus hatású. Ha TGF-β szignál utat neutralizáló ellenanyaggal blokkolták, nagyméretű és igen instabil plakk kifejlődését találták (43). A Th17/Treg egyensúly a gyulladás kontrolljában fontos, és szerepet játszhat a plakk destabilizáció patogenezisében. A szisztémás keringésben a Th17 sejt frekvencia, a Th17függő citokin (IL-17, Il-6 és IL-23), transzkripciós faktor (RORgammat) növekedését, és 95
ezzel egyidejűleg a Treg sejtek számának, citokinjeiknek (IL-10, TGF-β) és transzkripciós faktorának (Foxp3) csökkenését észlelték akut koronária szindrómás betegekben (44). Ateroszklerózisban szenvedő valamint ischaemiás stroke-on átesett betegek szérumában az IL-17 szintje illetve a mononukleáris sejtek IL-17 mRNS expressziója megemelkedik (45,46). Lokálisan a koronária ereket infiltráló T sejtek IL-17 citokint is termelnek, akár IFN-γ citokinnel egyidejűleg. E két molekula szinergista hatással rendelkezik a vaszkuláris simaizom sejtek gyulladásos válaszában (47). IL-17 a CRP indukciójában is fontos (48). Végül megemlítjük, hogy a veleszületett és szerzett immunválasz egymással folyamatosan kapcsolatban lévő módon működik, és effektor molekuláik egymást kölcsönösen erősítik, modulálják, tehát komplex szabályozási és patogenetikus hálózatokról beszélhetünk.
Plakk destabilizáció és trombotikus komplikáció Az ateroszklerózis klinikai manifesztációja, például ischaemiás stroke vagy miokardiális infarktus, legtöbbször a plakk destabilizáció és a lézió felszínén kialakuló trombus következménye. A makrofágok és T sejtek akkumulációja ebben is kulcsfontosságú. A makrofágok képesek mátrix metalloproteázok (MMP) termelésére, melyek lebontják a plakk fibrotikus sapkáját (49). A T sejt és makrofág együttműködés, valamint a lézióban jelenlevő számos citokin (TNF-α, IL-1) fokozza a MMP-k szintézisét, és az anti-koaguláns tulajdonságú endotheliális felszínen pro-koaguláns állapotot teremt (50). INF-γ gátolja a simaizom sejtek proliferációját és a mátrix képződését, ami a plakk destabilizációját eredményezi (49). A lézióban kis számban előforduló hízósejtek granulumaiból felszabaduló proteolítikus enzimek szintén aktiválják a pro-mátrix metalloproteázt (51). In vitro tanulmány azt mutatta, hogy a hízósejt eredetű heparin proteoglikán és kináz gátolja a simaizom sejtek proliferációját, kollagén szintézisét, és módosíthatja a lipoproteineket, citokinjeik pedig a T sejt és makrofág választ befolyásolják (52).
A STROKE-T KÖVETŐ IMMUNOLÓGIAI VÁLTOZÁSOK
Az ischaemiás stroke magas mortalitási rátája, mellyel a harmadik leggyakoribb halálokká vált (53), nemcsak a közvetlen neurológiai deficit következménye. Jól ismert a stroke-ot követő belgyógyászati komplikációk gyakorisága (53,54). Számos eddigi
96
tanulmányból egyértelműen igazolódott, hogy a stroke-ot követő halálozás több mint fele belgyógyászati szövődmény eredménye. A vizsgálatok abban is megegyeztek, hogy a korai post-stroke időszak leggyakoribb komplikációja az infekció, kiemelkedő prevelenciával a pneumónia és húgyúti fertőzés (53-57). Az akut stroke és az infekció között komplex kapcsolat áll fenn: a fertőzés fontos, súlyosbító tényezője a stroke-nak, lehet azonban az ischaemiás történést megelőző állapot is (58). Mindamellett, hogy a fertőzéses szövődmény a mortalitást rendkívül megemeli, akadályozza a megfelelő gyógyulást is, és ezzel rontja a betegek javulását és a funkcionális végállapotot (53,54,62). A stroke-on átesett betegek fogékonyabbak a fertőzésekre. Ennek oka lehet a korai szisztémás immunválasz elégtelensége, mely érinti mind a leukociták, NKsejtek, és T limfociták - beleértve speciális T sejt alcsoportok - funkcióját. Az elmúlt évek kutatásai az immundeficiencia hátterében a központi idegrendszer immundeprimáló hatását valószínűsítik. Lényeges lehet azonban a károsodott agyterületen, lokálisan zajló immunfolyamatok vizsgálatának szeparálása a szisztémás változásoktól: a szisztémás immunválasz az agyi léziót tovább súlyosbíthatja, ugyanakkor az agyi sérülés a szisztémás immunválaszra gyakorolt indirekt hatás révén a post-stroke infekció kialakulását is befolyásolja. A szisztémás immunválasz változása ezzel szemben az infekciókkal szembeni védelemre közvetlenül hat (1. ábra). A következőkben ezért a lokális és szisztémás hatásokat külön elemezzük.
Lokális, szöveti immunreakciók A post-ischaemiás agyszövet - átmeneti ischaemia (TIA) és definitív infarktus (stroke) esetén - különböző gyulladásos folyamatokat aktivál (59,60). A stroke következtében sérült vér-agy gáton keresztül számos immunsejtnek nyílik lehetősége az agyszöveti migrációra (61,62). Az ischaemia és szöveti sérülés kapcsán felszabaduló endogén molekulák Toll-like receptorokat aktiválnak (63). A periférián e receptorokat dendritikus sejtek, makrofágok, B sejtek, míg a központi idegrendszerben az endothel sejtek, mikroglia, asztrocita, oligodendroglia és neuronok is expresszálják (64). A monocita felszíni TLR-4 fokozott expresszióját figyelték meg a kedvezőtlen kimenetelű stroke-n átesett betegpopulációban (65). Az aktiváció citokin (IL-1, IL-6, TNF-α) és kemokin (IL-8, CINC, MCP-1) gének expressziójának fokozódásához vezet; e molekulák neutrophil és makrofág akkumulációban is alapvetőek. A legtöbb gyulladásos reakció citokin-mediált folyamat (66). A citokinek működésébe bizonyos genetikai polimorfizmusok is beleszólnak. A TNF-α allélokat vizsgálva 97
azt találtak, hogy a stroke-t szenvedett betegeknél szignifikánsan alacsonyabb TNF2 allél mutatható ki az egészséges populációhoz viszonyítva. A csökkent TNF2 allél gyakoriság kifejezetten a férfi betegekre volt jellemző lakunáris infarktus kialakulása esetén (67). A percekkel vagy órákkal az inzultus követően megemelkedett TNF-α, IL-1 szintek mellett, vazoaktív faktor (IL-6) produktum és adhéziós molekulák pl. ICAM-1, P-szelektin expressziója fokozódik (68). Az emelkedett post-stroke TNF-α hatására a szolubilis illetve membránhoz kötött VCAM-1, ICAM-1 expresszió megnő az endothel felszínen (69), elősegítve ezzel a leukocita-endothelium interakciót, majd kemokinek közreműködésével a gyulladásos sejtek migrációját és a leukociták aktiválódását (66,70). A citokinek direkt hatásuk révén érfali károsodás, vérzés, lokális ödéma, szöveti nekrózis kialakulásához és sejthalálhoz vezetnek (71). A leukociták infiltrációja az ischaemiás stroke jól ismert morfológiai jellemzője. Állatkísérletes modellek (72), hisztopatológiai vizsgálatok (73) majd klinikai tanulmányok (74) történtek a folyamat megismerése céljából. Hisztopatológiai eredmény alapján a stroke-t követő korai periódus gyulladásos válaszában polimorfonukleáris leukociták vesznek részt. Átlagosan 4-6 nappal az infarktus után mononukleáris sejtek váltják fel a polimorfonukleáris leukocita szubpopulációt (75).
In vitro jelölt leukociták alkalmazásával a klinikai
tanulmányok egyértelműen jelezték a leukocita infiltrációt, mely főszerepet játszik az akut gyulladásos reakcióban (76,77). 99mTc-HMPAO-val jelölt leukocitákat SPECT-tel vizsgálva a leukocita infiltráció dinamikus folyamata öt héten át perzisztált (77). 99mTc-HMPAO-val jelölt szelektív neutrofil sejt beáramlás időbeli eloszlását is analizálták a post-stroke időszakban. Növekvő neutrofil akkumulációt figyeltek meg az első 24 órában, a csúcsérték csökkenése csak a 9. nap után indult el. A leukocita influx mértéke és a betegek funkcionális állapotromlása között korrelációt találtak (78). Állatkísérletekben a neutrofil sejtek 30 perccel a permanens arteria cerebri media elzáródását követően megjelennek, de ekkor még nincs nekrózis (72). A sejtek érpályából történő kilépését három különböző adhéziós molekula család segíti, hasonlóan az ateroszklerózis folyamatához. Első lépésben alacsony affinitású endothel-leukocita kapcsolat, rolling jön létre szelektinek révén, a leukociták mozgása lelassul. Az E-szelektin szintézisét TNF- , IL-1 és ischaemia stimulálja, az endotheliális sejtmembránon csak órákkal a stimuláció után expresszálódik (79). P-szelektin azonban konstitutívan jelen van az endothel és vérlemezke granulumokban, így a membrán felszínén a sejtaktivációt követően azonnal megjelenik. A Pés E-szelektin célsejtjei a leukociták és monociták, melyekkel a membrán glikoproteinekhez 98
kapcsolódó szénhidrát struktúrákkal vagy L-szelektinnel lépnek kapcsolatba. L-szelektin található a limfocitákon, neutrofileken és monociták membránján (80). A P-szelektin szerepét igazolhatja, hogy permanens arteria cerebri media elzáródást követően anti-P-szelektin monoklonális antitest kezelés jelentősen csökkentette a leukocita infiltrációt és az infarktus méretét (81). Miután a rolling lelassította a leukociták mozgását, citokin, kemokin hatásra a felszínükön integrinek aktiválódnak, melyek az endothel Ig-szupercsalád receptoraihoz (ICAM-1/-2, VCAM-1, PECAM-1) kötődnek, és nagy affinitású adhézió jön létre (70,82). ICAM-1 alacsony mértékben állandóan jelen van az endothel sejtek, leukociták, epithel sejtek és fibroblasztok felszínén, ezt citokin stimuláció fokozza. Az ICAM-2 endothelsejt membrán receptor, melynek szintjét citokin stimuláció nem emeli (80). Az adhéziós molekulák felszíni megjelenése fokozódik az ischaemiás károsodás következtében (79,83). A ß2 integrin csak a leukocitákra korlátozódik, expresszióját TNF-α növeli. Az adhézó révén az érfalhoz kapcsolódott sejtek ezután kiáramlanak az agyi parenchimába. Az érintett területre áramló nagyszámú leukocita több mechanizmuson keresztül súlyosbítja a már meglévő károsodást (84). Az érfalhoz kapcsolódott leukociták, extracelluláris mátrix és a vaszkuláris endothelium között kialakult specifikus receptor-ligand kölcsönhatások obstrukciót okoznak a mikrocirkulációban. Ez a jelenség az ú.n. ischaemiás no-reflow phenomen, ami megakadályozza az agyi vérkeringés teljes helyreállását, és növekvő szöveti sérüléshez vezet (85). Emellett a leukocitákból felszabaduló neurotoxikus tulajdonságú gyulladáskeltő citokinek, lizoszómális enzimek további gyulladást okoznak, és a még élő szövetek proteolítikus károsodását eredményezik (86). Magas reaktivitású szabad gyökök képződnek: szuperoxid anion, hidroxil gyök, hidrogén- peroxid és szinglet-oxigén megtámadják a sejtmembrán kettősfoszfolipid rétegét, és elősegítik a sejtek halálát (87). A polimorfonukleáris sejtek mellett makrofágok és limfociták is áramlanak az infarktus zónába. A perifériás vérből származó makrofágok késleltetve, a stroke szubakut fázisában 24-48 óra múlva jelennek meg a sérülés helyén. Intravénás USPIO (ultrasmall superparamagnetic iron oxide, melyet a fagocitáló sejtek bekebeleznek) adását követően MRI vizsgálattal kísérletes modellben és humán tanulmányban is kimutatták a makrofágok jelenlétét (88). Lokálisan, az aktiválódott neutrofilek és makrofágok mieloperoxidáz kiválasztása is detektálható: míg a neutrofil sejtek szekréciója csúcsértékét az 1-3. napon érte el, addig a makrofágoké a 3-7. nap között tetőzött. Ennek mértéke pozitív korrelációt mutatott az infarktus méretével (89).
99
T sejtes aktiváció, majd infiltrációt indul a károsodott agyterületről felszabadult központi idegrendszeri autoantigének, például MOG és MBP hatására. Stroke-ot követően az agyi mikroglia és asztrocita felszínen is antigént bemutató MHC molekula expresszálódik. A limfocita akkumulációnak hasznos és károsító hatása egyaránt ismert. Nazálisan vagy orálisan központi idegrendszeri autoantigénnel tolerancia alakítható ki, gyulladáscsökkentő Th2 (IL4/IL-10) vagy Th3 (TGF-β) válaszreakció generálódik. Az agyban IL-10 deaktiválja a makrofágokat és asztrocitákat, ezzel csökkentve a másodlagosan kialakuló gyulladásos folyamatokat. Továbbá az IL-10 korlátozza a glutamát citotoxikus hatását és gátolja a NF-κβ transzkripciós utat (90). Ennek megfelelően nazális MOG 70%-kal csökkentette az infarktus méretét, és javította az állatok végállapotát. A hatást IL-10-et termelő CD4+ T sejtek mediálják, mivel a toleráns egérből nyert CD4+ Th sejtek másik állatban okozott kísérletes infarktus méretét is redukálják (91). A felszabadult autoantigének reguláló T sejteket indukálnak, melyek immunmoduláló hatást fejtenek ki, és gátolják a Th1 limfocita aktivációt. MBP-vel szenzitivizált állatkísérletben az előidézett infarktus területén olyan limfocita populációt találtak, mely TGF-β termelt. Azon állatokban, melyekben az antigén expozíció hatására tolerancia alakult ki az MBP-vel szemben, az infarktus területe jelentős csökkenést mutatott, mely arra utal, hogy e limfocita csoportok egyfajta „protektív autoimmun” folyamatot irányítanak. Ezzel szemben ahol az MBP-re Th1 sejtválasz alakult ki, ott a neurológiai végállapot kifejezetten rosszabb volt (92). Az immunmoduláló tulajdonságú CD4+CD25+Foxp3+ Treg sejtek depléciója növeli a későbbi agyi károsodást kísérletes agyi ischaemián átesett állatmodellben és rontja a funkcionális kimenetelt. A Treg sejtek hiánya erősíti a lokális, illetve az infiltrálódó gyulladásos sejtek, mint mikrogliák és T sejtek post-stroke aktivációját, melyek termelik a károsító TNF-α és INF-γ elsődleges forrásai. A TNF-α korai és az INF-γ késletett neutralizálásával megelőzhető volt az infarktus növekedése Treg hiányos egerekben is. Ugyanakkor intracerebrális IL-10 szubsztitúció megszüntette a fokozott citokin expressziót a Treg sejt depléció után, és preventív tulajdonságúnak bizonyult a másodlagos infarktus növekedéssel szemben, azonban IL-10 hiányos Treg sejtek adoptív transzfere hatástalan volt. Tehát a Treg sejtek fontos neuroprotektív modulátoroként működnek a post-ischaemiás gyulladásos agyi károsodás kivédésében, ennek esszenciális közvetítő molekulája az IL-10 (93). Kimutatták továbbá a Th17 sejtekre jellemző IL-17 citokin expresszió fokozódását az ischaemiás infarktus területében, melyet T sejtek mellett feltehetően gliasejtek is termelhetnek (94).
100
Más kísérletes stroke modellben azt találták, hogy a CD4+ és CD8+ T sejtek is szerepet játszanak az ischaemiát követő reperfúziós károsodásban, ezáltal hozzájárulnak a gyulladáshoz, trombogenikus változásokhoz, az agyi sérüléshez és a neurológiai károsodáshoz. A folyamatok fő citokinje az INF-γ, de ennek termelői nem elsősorban a limfociták (95).
Szisztémás immunreakciók A post-stroke infekciók szempontjából a legfontosabb immunválasz feltehetően a szisztémás, mivel az infekciókkal szembeni védelmet közvetlen módon befolyásolja (1. ábra). A stroke-t követően nemcsak lokálisan, hanem a szisztémás keringésben is emelkedik a leukociták száma (96). Szignifikáns korrelációt találtak az infarktus mérete, a stroke súlyossága és a perifériás vér fehérvérsejt száma között (97-99). Súlyos stroke esetén sejtszám emelkedés nélkül is fokozott a perifériás leukociták aggregációs készsége (98,99). Az immunsejtek effektív működésében bekövetkező változások jobban jellemezhetőek a funkcionális aktivitásukkal, szemben a számbeli eltérésekkel. Így egy, a klinikánkon folytatott vizsgálatban a leukociták aktivációjára jellemző LAR (leukocita antiszedimentációs ráta) (100) értékeket detektálva mind a TIA (tranziens ischaemiás attak) és definitív stroke csoportban emelkedett leukocita aktivációt találtunk a tünetek megjelenését követő 6 órán belül. Az aktiváció mértéke egyenes arányban állt az ischaemia időtartamával és az infarktus kiterjedésével (S100B), mivel a tünetek megjelenését követő 6 órán belül a LAR-ral jellemzett leukocita aktivitás szignifikánsan magasabb volt a definitív stroke csoportban, ott ahol mindig nekrózis is jelen van, összehasonlítva a TIA-val, melynél az ischaemia átmeneti és szöveti elhalás nincs. Azonban a LAR jellegzetes emelkedése – a leukocita aktiváció elmaradt post-stroke infekciót szenvedett betegeknél. Ez arra utalhat, hogy a leukocita aktiváció zavara post-stroke infekcióra hajlamosít, mivel a fertőzésekkel szembeni védekezés egyik útvonala elégtelen. A LAR emellett prognosztikai értékkel is bírt, az emelkedés hiánya kedvezőtlen kimenetellel járt együtt (101). Az ősi immunrendszer tagjai, a T sejt populáció speciális alcsoportja, a γδ+ T sejtek gyulladáskeltő citokin (INF-γ) termelés és citotoxikus hatásuk mellett az akut ősi és a szerzett immunválasz
közötti
kapcsolatban
fontosak
(102).
A
fertőzések
ellen
védő
immunreakciókban alapvető INF-γ-t termelnek az NKT-szerű (CD3+CD56+) T sejtek és az NK sejtek is. Intézetünk által végzett vizsgálatokban az ősi immunrendszer T limfocitáinak (γδT és NKT-szerű) és az NK sejtek deficiens funkcióját mutattuk ki a stroke hiperakut 101
fázisában sejtszám eltérés nélkül. Az INF-γ intracelluláris termelése csökkent mindhárom vizsgált limfocita szubpopulációban a stroke hiperakut fázisában, azaz a 6 órán belüli mérésnél, de rendeződött a 3. napra. Ezzel korrelációban a sejtek citotoxikus tulajdonságaiban és perforin expressziójában is csökkenést tapasztaltunk a korai fázisban. Tehát az akut ischaemiás stroke jellegzetesen csökkent NK sejt citotoxicitással és mind három limfocita populáció csökkent INF-γ, perforin expressziójával jár együtt, mely fokozott fertőzési hajlamra predisponál. Ugyanakkor a gyulladásgátló Th2 irányú citokinek (IL-4, IL-5, IL-10) koncentrációjában nem volt eltérés (103). Más klinikai tanulmányok, hasonlóan az ősi immunrendszer T limfocitáihoz hasonló akutan jelentkező funkció elégtelenséget, vagy azoktól eltérően számbeli csökkenést találtak. A perifériás a CD4+ Th sejtek száma alacsonyabb, mely legkifejezettebb volt a stroke után 12 órával, a poszt-stroke fertőzésen átesett betegek CD4+ T sejt száma csak késleltetve rendeződött (104). A CD4+ T sejt szám csökkenés illetve a vizeletben mérhető noradrenalin ürítés között összefüggés mutatkozott. Elégtelen celluláris immunválasz jelentősebb mértékű szimpatikus idegrendszeri aktivitással járt együtt. Ezek a változások kifejezettebbek voltak olyan stroke betegeknél, akiknél infekció alakult ki az agyi inzultust követően (105). Az akut stroke-ot követő gyors limfocitaszám csökkenés, a monocita és Th1 sejt diszfunkció mértéke korrelál az infarktus méretével és a betegek funkcionális romlásával. A betegek kórházi felvételkor mért monocita eredetű TNF-α szint és NIHSS skála felmérése prediktív volt a post-stroke fertőzés kialakulására (106). Az alacsony B sejt szint már a kórházi felvétel napján szembetűnő volt, míg a reguláló T sejtek (Treg) száma a 2. naptól mutatott szignifikáns csökkenést. Post-stroke infekciót szenvedett betegeknél a CD4+ Th és a CD8+ citotoxikus T sejtszám
jelentősebb
csökkenést
mutatott
összehasonlítva
a
fertőzéstől
mentes
betegcsoporttal. Az NK-sejtek számában adatainkhoz hasonlóan nem találtak változást. A csökkent limfocita szám szorosan korrelált az emelkedett apoptózis mértékkel. Összefüggés jelentkezett a csökkent keringő B sejt szint és a kedvezőtlenebb klinikai kimenetel között is az utánkövetés során. Az elégtelen celluláris immunválasz tehát jellemző markere az agyi károsodásnak, növeli az infekció kialakulás esélyét, és korrelációt mutat az erős hormonális stressz válasszal. A csökkent humorális válasz pedig prediktív értékű lehet a hosszú távú kimenetelre (107). Az ősi és adaptív immunrendszer limfocitáinak korai funkcionális károsodása
vagy/és
immundepressziónak,
számbeli és
csökkenése
hozzájárulhat
a
kialakulásához (103-106).
102
tehát
része
post-stroke
lehet fertőzéses
a
stroke
követő
szövődményének
A sejtes immunválasszal egyidőben humorális változások is zajlanak. Az akut fázis reakció során akut fázis fehérjék termelődnek (108,109). A CRP, szérum amiloid protein, proteázinhibitor, fibrinogén plazmaszint gyors emelkedése tapasztalható elsősorban IL-1, IL-6 és TNF-α hatására (108,110), mely csak fokozatosan normalizálódik a stroke szubakut fázisában (111). A CRP (hsCRP) az egyik legmegbízhatóbb biomarkere a stroke hátterében lévő gyulladásos folyamatoknak és az ateroszklerózisnak (112). Emellett, primeren a stroke is emelkedett CRP szintet okozhat (108,113). A CRP a nem-specifikus, ősi immunrendszer effektora, mely képes klasszikus úton aktiválni a komplement rendszert elősegítve ezzel a fagocitózist (114). Patkányokon folytatott kísérletben az a. cerebri media elzárása után 5 perccel, majd 24 és 48 óra elteltével adagolt humán C-reaktív protein hatására az infarktus mérete 72 óra múlva szignifikánsan nagyobb volt (115). Klinikai vizsgálatunkban a hsCRP bazális értéke vagy korai, a tünetek megindulását követő 6 órán belüli emelkedése prediktív volt a kedvezőtlen kimenetelre és a súlyos tünetekre nézve, függetlenül a post-stroke infekció kialakulásától. Korai emelkedés szintén korrelációt mutatott az infarktus kiterjedésével. Ez az összefüggés azt is demonstrálja, hogy a szöveti károsodás mérete jelentősen befolyásolja az akut fázis reakció mértékét. Késői szignifikáns hsCRP emelkedés tapasztaltunk abban a beteg csoportban, amelyiknél csökkent leukocita aktivációt mértünk. Ezekben az esetekben nagyobb arányban alakult ki infekció, tehát a késői hsCRP emelkedés a post-stroke infekció szubklinikus tünete lehetett (29). CRP és fehérvérsejtszám meghatározás segítségével összefüggést találtak a stroke lateralizációja és a betegek immunregulációja között, miszerint a bal lebenyi infarktust szignifikánsan magasabb CRP és fehérvérsejtszám jellemzi. Az oldaliság direkt kockázati faktor lehet az infekció vagy az immundeficit kialakulásának (116). Közel 337 beteg adatainak feldolgozásával azt az eredményt kapták, hogy a jobb hemiszfériumot érintő infarktus prognózisa kedvezőtlenebb, és a 10 éves nyomonkövetés során ebben a csoportban magasabb volt a mortalitási ráta (117). Az IL-6 kis glikoprotein, melynek legfőbb forrása az aktivált perifériás monociták és leukociták (118). Felszabadulása adhéziós molekulák kifejeződését, leukociták aktivációját és protrombotikus állapotot idéz elő az endothelium felszínén (119). Az IL-6 pleiotróp hatásai között fontos az akut fázis reakció szabályozása (120), és a hipotalamusz set point érték emelése, mely láz kialakulásához vezet. A májban fokozza a CRP, fibrinogén és egyéb akut fázis proteinek termelődését, és aktiválja a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyt. A stroke-ot emelkedett plazma IL-6 jellemzi, az infekciót szenvedett betegeknél szignifikánsan magasabb IL-6 mérhető az infekciómentes betegekhez képest (105). 103
Az akut ischaemiás stroke-ban megfigyelhető komplement rendszer aktiváció szerepet játszik az agyi sérülés kialakulásában. Aktív termékek (C5b-9 és C4d) plazmaszintje szignifikáns emelkedést mutatott a stroke-s beteg csoportban. Pozitív korrelációt találtak a C5b-9 koncentráció és a stroke klinikai súlyossága, valamint a neurológiai deficit között. A komplement rendszer aktív produktumainak mérése alkalmas lehet prognózisbecslésre (121). Hasonló folyamatok zajlanak bakteriális, virális infekció és egyéb szöveti sérülések, például miokardiális infarktus kapcsán (111). A fibrinogén termelődés fokozódása a vörösvértestek összecsapzódásához vezet, aminek eredménye a gyorsult eritrocita süllyedés. A klinikai tanulmányok adatai szerint a stroke-ot gyakran kíséri a testhőmérséklet emelkedése. Ennek magyarázata gyakran a stroke-kal kombinálódó fertőzéses állapot (122). Önmagában a fertőzés nem minden esetben magyarázza azonban a láz okát, mert a testhőmérséklet független és szignifikáns összefüggést mutat a stroke kezdeti súlyosságával, a lézió méretével, a halálozással és a túlélők végállapotával (123). Ez ismét toxikus faktorok, szisztémás citokinek hatását tükrözheti.
A stroke indukálta immunszuppresszió A stroke befolyásolja az immunrendszer és az idegrendszer között fennálló kiegyensúlyozott működést, a neuroimmun modulációt. Egyre több mechanizmust kerül felismerésre, melyek az agy-immunrendszer interakció kiemelkedő szerepét sugallják a stroke-os betegek klinikai kimenetelében (2. ábra). A stroke-t követően kialakuló immundepresszió növeli a legjelentősebb szövődmény, az infekció kialakulásának valószínűségét. Az immunszuppresszált állapotnak azonban előnyös hatása is van, például gátolja a súlyos autoaggresszív folyamatok beindulását a károsodott agy területéből felszabaduló központi idegrendszer-specifikus antigénekkel szemben. Ezt a jelenséget az angol irodalom CIDS-nek (CNS-injury-induced immundepression) nevezi. A központi idegrendszer és az immunrendszer között kétirányú kommunikáció létezik (124-126). A központi idegrendszer komplex humorális és neuronális utakon keresztül modulálja az immunrendszer működését, mely visszahat az agyi funkciókra. Idetartozik a hipotalamusz-hipofizis-mellékvese
tengely
(HPA-tengely),
a
n.
vagus
közvetítette
„gyulladásos reflex”, a kolinergrendszer és a szimpatikus idegrendszer (124-128). A stroke következtében felborul az addig jól működő egyensúly a két rendszer között. Sérülés hatására keletkező citokinek (IL-1, IL-6, TNF-α) speciális neuronokat stimulálnak a hipotalamusz paraventrikuláris magjaiban (PVN). A stimulus kortikotropinreleasing faktor (CRF) termelődéshez vezet, melyen keresztül a PVN neuronok szabályozzák 104
a HPA-tengelyt, a szimpatikus idegrendszert és az agytörzsbe leszálló pályákon át a kolinerg idegrendszert (2. ábra).
A HPA-tengely Ismert a HPA-tengely korai aktivitás fokozódása stroke-t követően (129,130). A kortizol szekréciója ACTH szabályozás alatt áll, ischaemiás stroke-t szenvedett betegeknél azonban azt találták, hogy a kortizol szint nem a szérum ACTH, hanem az IL-6 szinttel mutat szignifikáns korrelációt. A citokin felszabadulás fontos reguláló hatással bír a HPA-tengelyre ebben a kórállapotban (129,130). A kortikoszteroidok immunszuppreszív hatással
rendelkeznek:
csökkentik
a
gyulladáskeltő citokinek (IL-1, IL-12, TNF-α), kemokinek termelését, és emelhetik a gyulladáscsökkentő hatású citokinek (IL-10, TGF-β) szekrécióját. Ezzel befolyásolják a T sejtes immunválaszt: a Th1 irányú sejt differenciálódást csökkentik, segítik viszont a Th2 típusú változásokat (131,132). Erős proliferációgátló hatásúak, elősegítik különböző immunsejtek apoptózisát, és csökkentik az antigén bemutatás mértékét is (124-126). A HPAtengely blokkolása révén megelőzhető a post-stroke időszakot jellemző limfocita apoptózis, limfopénia és a monociták deaktiválódása (133). Negyvennégy (+/-21) hónapig folytatott követéses tanulmányban magasabb szérum kortizol szintet mértek azoknál agyi infarktust szenvedett betegeknél, akik a vizsgálat során elhunytak szemben a túlélő populációval (134). Emelkedett kortizol szérum koncetráció jellemző lehet a post-stroke infekció kialakulására is (65).
A paraszimpatikus idegrendszer Az idegrendszer és az immunrendszer kétirányú kapcsolatában szerepet játszik a kolinerg gyulladás gátló útvonal is. Az agyi inzultus hatására aktiválódott vagus neuronokból acetilkolin szabadul fel. Az acetilkolin specifikus nikotin receptorokhoz kötődve csökkenti az aktivált makrofágok gyulladáskeltő citokin termelését, de a gyulladáscsökkentő hatásúakat nem befolyásolja (135). Traumás agysérülés kapcsán már igazolódtak a fokozott vagus tónus és a kolinerg gyulladáscsökkentő, immunrendszert bénító hatások. Ez fokozott fertőzési hajlamot okoz (136).
A szimpatikus idegrendszer A limfoid szervek jelentős szimpatikus beidegzése és az immunsejteken jelenlévő βadrenerg receptorok jelzik a szimpatikus aktivitás immunrendszert szabályozó funkcióját. A 105
szimpatikus idegrendszer aktivációja katekolamin felszabadulást okoz a szimpatikus végkészülékekből és a mellékvese velőből. Az adrenalin és noradrenalin (NA) akut hatása a limfocita és granulocita szám emelkedése a marginális pool mozgósítása révén. Ezzel szemben elhúzódó hatásuk a limfocita szám csökkenéséhez vezet. Adrenalin és NA gátolja az antigén prezentáló sejtek és Th1 sejtek gyulladáskeltő (IL-12, TNF-α, INF-γ) citokin termelését, és elősegíti a gyulladásgátló (IL-10, TGF-β) útvonalat, azaz a Th2 immunválaszt (134). Ennek hátterében a T sejt altípusok eltérő β2-adrenerg receptor expressziója áll: míg a Th1-sejtek felszínén megtalálhatóak, addig a Th2-sejteken nem fejeződnek ki (137). Ezen hatáson alapulva az endogén katekolaminok képesek szelektíven gyengíteni a gyulladáskeltő Th1 sejtválaszt és a celluláris immunitást, ezzel párhuzamosan pedig dominánssá válik a gyulladáscsökkentő Th2 és humorális immunválasz. Továbbá, a noradrenalin az NK sejtek β2-adrenerg receptor stimulációja által az NK sejtek citotoxikus hatását több szinten is csökkenheti: módosítja az NK sejt receptor és célsejtje közötti kötődést, blokkolja az NK sejt éréséhez szükséges citokineket, és a célsejt-indukált citotoxikus reakciókat (138,139). Katekolamin hatásra a makrofágok fagocita funkciója, gyulladáskeltő citokin termelése és MHC II expressziója csökken, IL-10 elválasztása fokozódik (140). Katekolamin gátlás alá kerül a neutrofil sejtek fagocita funkciója és lizoszómális enzim kibocsátása is. A neutrofil sejtek szuperoxid termelése és szabad oxigén gyökök képzése fontos a mikrobák elleni küzdelemben, a β-adrenerg receptorok révén azonban a szuperoxid termelése jelentősen mérséklődik (141). Stroke modellben a lép és tímusz szövetében atrófiát, csökkent T sejt proliferációt és fokozott apoptózis jeleit mutatták ki a stroke-ot követően 96 órán belül (142). Egér kísérletes modellben stroke jelentős limfocita apoptózist, Th2 citokin eltolódást valamint csökkent Tsejt és NK-sejt INF-γ termelést okozott, és a stroke-t követő harmadik napra minden állatban spontán bakterémia alakult ki. A bakteriális fertőzés azonban kivédhető volt a szimpatikus idegrendszer blokkolása révén: β-adrenerg receptor blokkoló propanolol drasztikusan csökkentette a stroke mortalitását, ezzel szemben a hipotalamusz-hipofizis-mellékvese tengely gátlása nem hozott sikeres eredményt. Tehát a katekolamin mediált elégtelen korai limfocita és NK-sejt aktiváció meghatározó jellemzője a deficiens antibakteriális immunválasznak (134).
TERÁPIÁS MEGFONTOLÁSOK
106
A kezelés szempontjából két fő útvonalon folynak a kutatások. Egyik oldalról a stroke-ot követő immmunfolyamatok befolyásolása valamely immunmoduláló terápia révén, a másik lehetséges mód az infekció elleni küzdelem, mellyel jelentős mértékben lehetne javítani a betegek túlélésén és a funkcionális kimenetelen. CIDS kapcsán is fontos szempont, hogy az immunszuprimáló hatás nemcsak a post-stroke infekció kialakulásáért lehet felelős, hanem védelmet nyújt a károsodott vér-agy gáton át a keringésbe került, addig az immunrendszer számára „láthatatlan” agyi epitopok elleni immunfolyamatoktól, egy esetlegesen kialakuló autoimmun betegségtől és egy túlzott mértékű gyulladásos válasz reakciótól, ami SIRS (systemic inflammatory response syndrome) vagy MOF (multiple organ failure) kialakuláshoz vezethetne (127). Egy optimális immunmoduláló kezelés kidolgozásához elengedhetetlen a stroke hátterében zajló immunfolyamatok pontos megismerése. Szintén fontos szempont, hogy a betegek kezelése megfelelő stroke központokban, stroke osztályon történjen. Multicentrikus vizsgálat bizonyítja, hogy stroke osztályon alacsonyabb a betegek halálozási aránya és jobb a betegek végkimenetele (143). Különböző állat modellek alapján az IL-1-nek tulajdonítanak jelentős szerepet a neuronális károsodásban. Randomizált, kettős-vak, placebo-kontrolált vizsgálatban az IL-1 receptor antagonista hatását tanulmányozták akut stroke-os betegeknél. A vizsgálat eredménye szerint IL-1 blokkolása neuroprotektív hatásúnak bizonyult, a kezelés kortikális infarktus szenvedett betegeknél jobb végkimenetelt eredményezett (144). Mivel az infekció, főképp a pneumónia a stroke indukálta immundepresszió legjelentősebb következményének és az immunmoduláló terápia egyelőre kevés járható utat eredményezett a klinikai gyakorlatban, ezért a preventív antibiotikum tűnik a legbiztatóbbnak a betegség kimenetelének javításában. A. cerebri media elzáródását követően állatkísérletes modellben azonnal vagy 12 órán belül adagolt profilaktikus moxifloxacin jelentősen csökkentette a bakteriális fertőzés kialakulását, a mortalitást, és javította a neurológiai kimenetelt (145). Az elmúlt években három nagy, randomizált, kontrollált vizsgálat folyt a stroke-ot követő preventív antibiotikus terápia lehetőségeiről (1. táblázat). Az Early Systemic Prophilaxis of Infection After Stroke (ESPIAS) randomizált, placebo-kontrollált, kettősvak, monocentrikus vizsgálatban a levofloxacin hatását tanulmányozták. Százharminchat ischaemiás és vérzéses stroke-on átesett betegnél 24 órán belül, majd 3 napig folytatva naponta 500 mg levofloxacin adása történt. A vizsgálatot idő előtt leállították, mert a levofloxacinnal nem sikerült kivédeni a fertőzést vagy javítani a végállapoton, sőt nem 107
szignifikáns mortalitás növekedést mutattak ki az antibiotikummal kezelt csoportban (146). Egy másik, fluorokinolonnal folytatott randomizált, placebo-kontrollált, kettős vak, multicentrikus vizsgálatban (IIb fázis) a Preventive Antibacterial THERapy in acute Ischemic Stroke (PANTHERIS) tanulmányban 80 súlyos, lakunáris ischaemiás infarktuson átesett beteg vett részt. A páciensek a stroke után 36 órán belül moxifloxacin terápiában részesültek, majd 5 napon keresztül folyt a kezelés naponta 400 mg dózissal. Moxifloxacin szignifikánsan (41.9 vs. 17.1 %) csökkentette az infekció kialakulását, de a túlélést és a neurológiai prognózist nem befolyásolta (147). A harmadik, randomizált, kontrollált The Mannheim Infection in Stroke Study (MISS) vizsgálatba 60 ischaemiás stroke-ot szenvedett, súlyos, ágyhoz kötött beteget vontak be. A tanulmányban résztvevők 4 napon keresztül tartó preventív mezlocillin sulbaktám kombinációban részesültek az infarktust követő 24 órán belüli kezdettel. A mezlocillin sulbaktám együttes adása szignifikánsan csökkentette a fertőzés kialakulását és javította a betegek végállapotát (148). Bár az adatok bíztatóak, további vizsgálatok szükségesek a legmegfelelőbb antibiotikum, valamint az optimális betegcsoport megválasztásához, hogy a preventív kezelés előnyei maximálisan érvényesülhessenek.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A munkát az OTKA T049463, ETT 50053-2006 és az MTA Bolyai Janos Alapítványa (mind Illés Zsoltnak) támogatta.
IRODALOMJEGYZÉK
1. Sudlow CLM, Warlow CP. Comparable studies of incidence of stroke and its pathological types: results from an international collaboration. International Stroke Incidence Collaboration. Stroke 1997;28:491-499. 2. Mohr JP, Albers GW, Amarenco P, Babikian VL, Biller J, Brey RL, et al. Etiology of stroke. Stroke 1997;28:1501-1506. 3. Stoll G, Bendszus M. Inflammation and atherosclerosis: novel insights into plaque formation and destabilization. Stroke 2006;37:1923-1932. 4. Feher G, Illes Z. Gene patent sin the primary prevention of vascular diseases. Recent Pat
DNA Gene Seg 2008;2:164-171.
108
5. Kerenyi L, Mihalka L, Csiba L, Bacso H, Bereczki D. Role of hyperlipidemia in
atherosclerotic plaque formation in the internal carotid artery. J Clin Ultrasound 2006;34:283288. 6. Witztum JL, Steinberg D. The oxidative modification hypothesis of atherosclerosis: does it hold for humans? Trend Cardiovasc Med 2001;11:93-102. 7. Spence JD, Norris J. Infection, inflammation and atherosclerosis. Stroke 2003;34:333-334. 8. Kónya J, Molnár S, Magyar MT, Szekeres CC, Kerényi L, Csiba L. Severity of carotid
atherosclerosis unrelated to Clamydia pneumoniae infection in acute ischemic stroke patients: a clinicopathological study. Cerebrovasc Dis 2008;25:170-175. 9. Holloway JW, Yang IA, Ye S. Variation in the toll-like receptor 4 gene and suspectibility to myocardial infarction. Pharmacogenet Genomics 2005;15:15-21. 10. Xu HX, Shah PK, Faure E, Thomas L, Fishbein MC, Luthringer D, et al. Toll-like receptor-4 is expressed by macrophages in murine and human lipid-rich atherosclerotic plaques and upregulated by oxidized LDL. Circulation 2001;104:3103-3108. 11. Mullick AE, Tobias PS, Curtiss LK. Modulation of atherosclerosis in mice by Toll-like receptor 2. J Clin Invest 2005;115:3149-3156. 12. Labrum R, Bevan S, Sitzer M, Lorenz M, Markus HS. Toll receptor polymorphisms and carotid artery intima-media thickness. Stroke 2007; 38:1179-1184. 13. Akira S, Takeda K, Kaisho T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat Immunol 2001;2:675-680. 14. Galkina E, Ley K. Vascular adhesion molecules in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007;27:2292-2301. 15. Charo IF, Taubman MB. Chemokines in the pathogenesis of vascular disease. Circ Res 2004;95:858-866. 16. Charo IF, Ransohoff RM. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med 2006;354:610-621 17. Walpola PL, Gotlieb AI, Cybulsky MI, Langille BL. Expression of ICAM-1 and VCAM-1 and monocyte adherence in arteries exposed to altered shear stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995;15:2-10 18. Hemler ME. VLA proteins in the integrin family: structures, functions, and their role on leukocytes. Annu Rev Immunol 1990;8:365-400 19. Qiao JH, Tripathi J, Mishra NK, Cai Y, Tripathi S, Wang XP, et al. Role of macrophage colonystimulating factor in atherosclerosis: studies of ostoepetrotic mice. Am J Pathol 1997;150:1687-1699 20. Greaves DR, Gordon S. The macrophage scavenger receptor at 30 years of age- current knowledge and future challenges. J Lipid Res. 2008 dec.11 (in press). 21. Brown MS, Goldstein JL. Atherosclerosis: scavenging for receptors. Nature 1990; 343: 508–509
109
22. Lijnen HR. Metalloproteinases in development and progression of vascular disease. Pathophysiol Haemost Thromb 2003 Sep-2004 Dec;33:275-281. 23. Elhage R, Jawien J, Rudling M, Ljunggren HG, Takeda K, Akira S, et al. Reduced atherosclerosis in interleukin-18 in deficient apolipoprotein E-knockout mice. Cardiovasc Res 2003;59:234-240. 24. Tenger C, Sundborger A, Jawien J, Zhou X. IL-18 accelerates atherosclerosis accompanied by elevation of INF-gamma and CXCL16 expression independently of T cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25:791-796. 25. Vlaicu R, Niculescu F, Rus HG, Cristea A. Immunohistochemical localization of the terminal C5b9 complement complex in human aortic fibrous plaque. Atherosclerosis 1985;57:163–177. 26. Volanakis JE. Human C-reactive protein: Expression, structure, and function. Mol Immunol 2001;38:189–197 27. Bhakdi S, Torzewski M, Klouche M, Hemmes M. Complement and atherogenesis: binding of CRP to degraded, nonoxidized LDL enhances complement activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19:2348–2354 28. Schillinger M, Exner M, Mlekusch W, Sabeti S, Amighi J, Nikowitsch R, et al. Inflammation and carotid artery-risk for atherosclerosis study (ICARAS). Circulation 2005;111:2203-2209. 29. Molnar T, Papp V, Szereday L, Pusch G, Szapary L, Bogar L, Illes Z. Relationship
between C-reactive protein and early activation of leukocytes indicated by leukocyte antisedimentation rate (LAR) in patients with acute cerebrovascular events. Clin Hemorheol Microcirc (in press). 30. Robertson AKL, Hansson GK. T cells in atherogenesis. For better or for worse? Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006;26:2421-2432. 31. Jonasson L. Regional accumulations of T cells, macrophages and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Arteriosclerosis 1986;6:131-138 32. Galkina E, Kadl A, Sanders J, Varughese D, Sarembock IJ, Ley K. Lymphocyte recruiment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. JExp Med 2006;203:1273-1282 33. Tupin E, Nicoletti A, Elhage R, Rudling M, Ljunggren HG, Hansson GK, et al. CD1d-dependent activation of NKT cells aggravates atherosclerosis. J Exp Med 2004;199:417-422. 34. O’Garra A, Arai N. The molecular basis of T helper 1 and T helper 2 cell differentiation. Trends Cell Bio 2000;10:542-550. 35. Abbas AK, Murphy KM, Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 1996;383:787-793. 36. Frostegǻrd I, Ulfgren AK, Nyberg P, Hedin U, Swedenborg, Andersson U, et al. Cytokine expression in advenced human atherosclerotic plaques: dominance of pro-inflammatory (Th1) and macrophage-stimulating cytokines. Atherosclerosis 1999:145:33-43
110
37. Peilot H, Rosengren B, Bondjers G, Hurt-Camejo E. Interferon-γ induces secretory group IIA phospholipase A2 in human arterial smooth muscle cells: involvement of cell differentation, STAT-3 activation, and modulation by other cytokines. J Bio Chem 2000;275:22895-22904. 38. Zhou X, Nicoletti A, Elhage R, Hansson GK. Transfer of CD4+ T cells aggravates atherosclerosis in immunodeficient apolipoprotein E knockout mice. Circulation 2000;102:2919-2922. 39. Ait-Oufella H, Salomon BL, Potteaux S, Robertson AK, Gourdy P, Zoll J, et al. Natural
regulatory T cells control the development of atherosclerosis in mice. Nat Med 2006;12:178 – 180. 40. Mallat Z, Ait-Oufella H, Tedgui A. Regulatory T-cell immunity in atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med 2007;17:13-118. 41. Scheffold A, Murphy KM, Höfer T. Competition for citokines: T(reg) cells take all. Nat Immunol 2007;8:1285-1287. 42. Robertson AK, Rudling M, Zhou X, Gorelik L, Flavell RA, Hansson GK. Disruption of
TGF-beta signaling in T cells accelerates atherosclerosis. J Clin Invest 2003;112:1342-1350. 43. Mallat Z, Gojova A, Marchiol-Fournigault C, Esposito B, Kamaté C, Merval ,et al. Inhibition of transforming growth factor-β signaling accelerates atherosclerosis and induces an unstable plaque phenotype in mice. Circ Res 2001;89:930-934. 44. Cheng X, Yu X, Ding Yj, Fu QQ, Xie JJ, Tang TT et al. The Th17/Treg imbalance in
patients with acute coronary syndrome. Clin Immunol 2008;127:89-97. 45. Cagnin S, Biscuola M, Patuzzo C, Trabetti E, Pasquali A, Laveder P, et al.
Reconstruction and functional analysis o faltered molecular pathways in human atherosclerotic arteries. BMC Genomics 2009;10:13. 46. Kostulas N, Pelidou SH, Kivisakk P, Kostulas V, Link H. Increased IL-1beta, IL-8 and IL-
17 mRNA expression in blood mononuclear cells observed in a prospective ischemic stroke study. Stroke 1999;30:2174-2179. 47. Eid RE, Rao DA, Zhou J, Lo SF, Ranjbaran H, Gallo A, et al. Interleukin-17 and
interferon-gamma are produced concomittantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergestically on vascular smooth muscle cells. Circulation 2009;119:1424-1432. 48. Patel DN, King CA, Bailey SR. Holt JW, Venkatachalam K, Ageawal A, et al. Interleukin-
17 stimulates C-reactive protein expression in hepatocytes and smooth muscle cells via p38 MAPK and ERK1/2-dependent NF-kappaB and C/EBPbeta activation. J Biol Chem 2007;282:27229-27238. 49. Fan J, Watanabe T. Inflammatory reactions in the pathogenesis of atherosclerosis. Atheroscler Thromb 2003;10:63-71.
111
50. DeGraba TJ. Immunogenetic susceptibility of atherosclerotic stroke: Implications on current and the future treatment of vascular inflammation. Stroke 2004;35:2712-2719. 51. Johnson JL, Jackson CL, Angelini GD, Gerge SJ. Activation of matrix-degrading metalloprotenases by mast cell proteasis in atherosclerotic plaques. Atheroscler Tromb Vasc Biol 1998;18:1707-1715. 52. Lindstedt KA, Kokkonen JO, Kovanen PT. Soluble heparin proteoglycans released from stimulated mast cells induce uptake of low density lipoproteins by macrophages via scavenger receptor-mediated phagocytosis. J Lipid Res 1992;33:65-75. 53. Johnston KC, Li JY, Lyden PD, Hanson SK, Feasby TE, Adams RJ, et al. Medical and neurological complications of ischemic stroke: experience from the RANTTAS trial. RANTTAS investigators. Stroke 1998;29:447-453. 54. Langhorne P, Stott DJ, Robertson L, MacDonald J, Jones L, McAlpine C, et al. Medical complications after stroke:a multicenter study. Stroke 2000;31:1223-1229. 55. Davenport RJ, Dennis MS, Wellwood I, Warlow CP. Complications after acute stroke. Stroke 1996;27:415-420. 56. Grau AJ, Buggle F, Schnitzler P, Spiel M, Lichy C, Hacke W. Fever and infection early after ischemic stroke. J Neurol Sci 1999;171:115-120 . 57. Vargas M, Horcajada JP, Obach V, Revilla M, Cervera A, Torres F, et al. Clinical consequences of infection in patients with acute stroke. Is it prime time for further antibiotic trials? Stroke 2006;37:461-465. 58. Emsley HCA, Hopkins SJ. Acute ischemic stroke and infection: recent and emerging concepts. Lancet Neurology 2008;7:341–353. 59. Ishibashi N, Prokopenko O, Reuhl RK, Mirochnitchenko O. Inflammatory response and glutathione peroxidase in a model of stroke. J Immunol 2002;168:1926-1933. 60. Ross AM, Hurn P, Perrin N, Wood L, Carlini W, Potempa K. Evidence of the peripheral inflammatory response in patients with transient ischemic attack. J Stroke Cerebrovasc Dis 2007;16:203-207. 61. Barone CF, Kilgore SK. Role of inflammation and cellular stress in brain injury and central nervous system diseases. Clin Neurosci Res 2006;6:329-356. 62. Becker K. Innate and adaptive immune responses in CNS disease. Clin Neurosci Res 2006;6:227236. 63. Ziegler G, Harhausen D, Schepers C, Hoffmann O, Röhr C, Prinz V, et al. TLR2 has a detrimental role in mouse transient focal cerebral ischemia. Biochem Biophys Res Commun 2007;359:574-579. 64. Bsibsi M, Malik R, Gveric D, van Noort JM. Broad expression of toll-like receptors in the human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol 2002;10:1013-1021. 65. Urra X, Cervera A, Obach V, Climent N, Planas AM, Chamorro A. Monocytes are major
players in the prognosis and risk of infection after acute stroke. Stroke 2009;jan.22. 112
66. Vila N, Castillo J, Dávalos A, Chamorro A. Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke. Stroke 2000;31:2325-2329. 67. Harcos P, Laki J, Kiszel P, Széplaki Z, Szolnoki Z, Kovács M, et al. Decreased frequecy of
the TNF2 allele of TNF-α-308 promoter polymorphism in associated with lacunar infarction. Cytokine 2006;33:100-105. 68. Nagy Z, Simon L, Bori Z. Regulatory mechanisms in focal cerebral ischemia. New
possibilities in neuroprotective therapy. Ideggyogy Sz. 2002;55:73-85. 69. Vastag M, Skopál J, Voko Z, Csonka E, Nagy Z. Expression of membrane-bound and
soluble cell adhesion molecules by human brain microvessel endothelial cells. Microvasc Res. 1999;57:52-60. 70. delZoppo G, Ginis I, Hallenbeck JM, Iadecalo C, Wang X, Feuerstein G. Inflammation and stroke: putative role for cytokines, adhesion molecules and iNOS in brain response to ischemia. Brain Pathol 2000;10:95-112. 71. Hallenbeck JM. The many faces of tumor necrosis factor in stroke. Nat Med 2002;8:1363-1368. 72. Huang J, Upadhyay UM, Tamargo JR. Inflammation in stroke and focal cerebral ischemia. Surg Neurol 2006;66:232-245. 73. Alcalà H, Gado M, Torack RM. The effect of size, histologic elements and water content on the visualization of cerebral infarcts. Arch Neurol 1978;35:1-7. 74. Kochanek PM, Hallenbeck JM. Polymorphonuclear leukocytes and monocytes/macrophages in the pathogenesis of cerebral ischemia and stroke. Stroke 1992;23:1367-1379. 75. Brierley JB, Graham DI. Hypoxia and vascular disorders of the central nervous system, in Damas JH, Corsellis JAN, Duchen LW (eds). Greenfield's Neuropathology London, Edward Arnold Publishers, Ltd, 1984, pp 125-207. 76. Pozzilli C, Lenzi GL, Argentino C, Carolei A, Rasura M, Signore A, et al.. Imaging of leukocytic infiltration in human cerebral infarcts. Stroke 1985;16:251-255. 77. Wang PY, Kao CH, Mui MY, Wang SJ. Leukocyte Infiltration in Acute Hemispheric Ischemic Stroke. Stroke 1993;24:236-240. 78. Akopov SE, Simonian NA, Grigorian GS. Dynamics of polymorphonuclear leukocyte accumulation in acute cerebral infarction and their correlation with brain tissue damage. Stroke 1996;27:1739-1743. 79. Stanimirovic DB, Wong J, Shapiro A, Durkin JP. Increase in surface expression of ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin in human cerebromicrovascular endothelial cells subjected to ischemia-like insults. Acta Neurochir Suppl. 1997;70:12-6. 80. Carlos TM, Harlam JM. Leukocyte-endothelial adhesion molecules. Blood 1994;84:2068-2101.
113
81. Suzuki H, Abe K, Tojo SJ, Kitagawa H, Kimura K, Mizugaki M, et al. Reduction of ischemic brain injury by anti-P-selectin monoclonal antibody after permanent middle cerebral artery occlusion in rat. Neurol Res 1999;3:269-76. 82. Kubes P, Ward PA. Leukocyte recruitment and the acute inflammatory response. Brain Pathol 2000;10:127-135. 83. Wang X, Feuerstein GZ. Induced expression of adhesion molecules following focal brain ischemia. J Neurotrauma 1995;12:825-32. 84. Hallenbeck JM, Dutka AJ, Tanishima T, Kochanek PM, Kumaroo KK, Thompson CB, et al. Polymorphonuclear leukocyte accumulation in brain region with low blood flow during the early postischemic period. Stroke 1986;17:246-253. 85. Schmid-Schönbein GW. Capillary plugging by granulocytes and the no-reflow phenomenon in the microcirculation. Fed Proc 1987;46:2397-2401. 86. Li HL, Kostulas N, Huang YM, Xiaoa BG, van der Meide P, Kostulas V, et al. IL-17 and IFN-_ mRNA expression is increased in the brain and systemically after permanent middle cerebral artery occlusion in the rat. J. Neuroimmunol. 2001;116:5. 87. Fridovich I. The biology of oxygen radicals. Science 1978;201:875-880. 88. Jander S, Schroeter M, Saleh A. Imaging Inflammation in Acute Brain Ischemia. Stroke. 2007;38[part 2]:642-645. 89. Breckwoldta MO, Chena JW, Stangenbergb L, Aikawa E, Rodriquez E, Qiu S, et al. Tracking the inflammatory response in stroke in vivo by sensing the enzyme myeloperoxidase. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:18584-18589. 90. Bachis A, Colangelo AM, Vicini S, Doe PP, De Bernadi MA, Brooker G, et al. Interleukin-10 prevents glutamate-mediated cerebellar granule cell death by blocking caspase-3-like activity. J Neurosci. 2001;21:3104-3112. 91. Frenkel D, Huang Z, Maron R, Koldzic DN, Moskowitz MA, Weiner HL. Neuroprotection by IL10-producing MOG CD4+ T cells following ischemic stroke. J Neurol Sci 2005;233:125-132. 92. Gee JM, Kalil A, Shea C, Becker KJ. Lymphocytes. Potential mediators of postischemic injury and neuroprotection. Stroke 2007;38(part 2):783-788. 93. Liesz A, Suri-Payer E, Veltkamp C, Doerr H, Sommer C, Rivest S, et al. Regulatory T cells
are key cerebroprotective immunomodulators in acute experimental stroke. Nat Med 2009;15:192-199. 94. Li GZ, Zhong D, Yang LM, Sun B, Zhong ZH, Yin YH et al. Expression of interleukin-17
in ischemic brain tissue. Scand J Immunol 2005;62:481-486. 95. Yilmaz G, Arumugam TV, Stokes KY, Granger DN. Role of T lymphocytes and interferon –γ in ischemic stroke. Circulation 2006;113:2105-2112.
114
96. Kammersgaard LP, Jørgensen HS, Nakayama H, Reith J, Raaschou HO, Olsen TS. Leukocytosis in acute stroke: relation to initial stroke severity, infarct size, and outcome: the Copenhagen stroke study. J Stroke Cerebrovasc Dis 1999;8:259-263. 97. Audebert HJ, Rott MM, Eck T, Habert RL. Systemic inflammatory response depends on initial stroke severity but is attenuated by succesful thrombolysis. Stroke 2004;35:2128-2133. 98. Silvestrini M, Pietroiusti A, Elio T, Franceschelli L, Piccolo P, Magrini A, et al. Leukocyte count and aggregation during the evolution of cerebral ischemic injury. Cerebrovasc Dis 1998;8:305.309. 99. Violi F, Rasura M, Alessandri C, Intiso D, Germani M, Servi M, et al. Leukocyte response in patients suffering from acute stroke. Stroke 1988;19:1283-1284. 100. Bogar L, Molnar Z, Kenyeres P, Tarsoly P. Sedimentation characteristics of leukocytes can predict bacteraemia in critical care patient. J Clin Pathol 2006;59:523-525 101. Molnar T, Peterfalvi A, Szereday L, Pusch G, Szapary L, Komoly S, Bogar L, Illes Zl. Deficient leucocyte antisedimentation is related to post-stroke infections and outcome. J Clin Pathol 2008;61:1209-1213. 102. De Rosa CS, Andrus JP, Perfetto SP, Mantovani JJ, Herzenberg LA, Herzenberg LA, et
al. Ontogeny of γδT cells in humans. J Immunol. 2004;172:1637-1645. 103. Peterfalvi A, Molnar T, Pusch G, Szereday L, Illes Z. Impaired function of innate T lymphocytes and NK cells in the acute phase of ischemic stroke. Stroke 2008 104. Vogelgesang, A, Grunwald U, Langner S, Jack R, Bröker BM, Kessler C, et al. Analysis of Lymphocyte Subsets in Patients With Stroke and Their Influence on Infection After Stroke. Stroke 2008;39:237-241. 105. Klehmet J, Harms H, Richter M, Prass K, Volk HP, Dirnalg U, et al. Stroke-induced immunodepression and post-stroke infection: lessons from the preventive antibacterial therapy in stroke trial. Neuroscience 2009;158:1184-1193. 106. Haeusler KG, Schmidt WU, Föhring F, Meisel C, Helms T, Jungehulsing GJ, et al. Cellular immunodepression preceding infectious complications after acute ischemic stroke in humans. Cerebrovasc Dis 2008;25:50-58. 107. Urra X, Cervera Á, Villamor N, Planas AM, Chamorro A. Harms and benefits of lymphocyte subpopulations in patients with acute stroke. Neuroscience 2009;158:1174-1183. 108. Cohen J, Brun-Brussion C, Torres A, Jorgensen J. Diagnosis of infection in sepsis: an evidence-
based review. Crit Care Med 2004;32:S466-494. 109. Smith CJ, Emsley HC, Vail A, Georgiou RF, Rothwell NJ, Tyrrell PJ, et al. Variability of the systemic acute phase response after ischemic stroke. J Neurol Sci. 2006;251:77-81. 110. Turaj W, Slowik A, Dziedzic T, Pulyk R, Adamski M, Strojny J, et al. Increased plasma fibrinogen predicts one-year mortality in patients with acut ischemic stroke. J Neurol Sci 2006;246:13-19. 111. Marquardt L, Ruf A, Mansmann U, Winter R, Buggle F, Kallenberg K, et al.. Inflammatory response after acute ischemic stroke. J Neurol Sci 2005;236:65-71.
115
112. Sun H, Koike T, Ichikawa T, Hatakeyama K, Shiomi M, Zhang B, et al. C-reactive protein in atherosclerotic lesions: its origin and pathophysiological significance. Am J Pathol 2005;167:11391148. 113. Christensen H, Boysen G. C-reactive protein and white blood cell count increases in the first 24 hours after acute stroke. Cerebrovascular Diseases 2004;18:214-219. 114. Mortensen RF. C-reactive protein, inflammation and innate immunity. Immunology Research 2001;24:163-176. 115. Gill R, Kemp JA, Sabin C, Pepys MB. Human C-reactive protein increases cerebral infarct size after middle cerebral artery occlusion in adult rats. J Cereb Blood Flow Metab 2004;24:1214-1218. 116. Koch HJ, Uyanik G, Bogdahn U, Ickenstein GW. Relation between laterality and immune
response after acute cerebral ischemia. Neuroimmunomodulation. 2006;13:8-12. 117. Aszalos Zs, Barsi P, Vitrai J, Nagy Z. Lateralization as a factor in the prognosis of middle
cerebral artery territorial infarct. Eur Neurol 2002;48:141-145. 118. Ferrarese C, Mascarucci P, Zoia C, et al. Increased cytokine release from peripheral blood cells after acute stroke. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 1999;19:1004-1009. 119. Vila N, Castillo J, Dávalos A, Chamorro A. Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke. Stroke 2000;31:2325-2329. 120. Kim JS, Yoon SS, Kim YH, Ryu JS. Serial Measurement of interleukin-6, transforming growth factor-ß, and S-100 protein in patients with acute stroke. Stroke 1996;27:1553-1557. 121. Széplaki G, Szegedi R, Hirschberg K, Gombos T, Varga L, Karádi I, et al. Strong
complement activation after acute ischemic stroke is associated with unfavorable outcomes. Atherosclerosis. 2008.aug. (in press). 122. Grau AJ, Buggle F, Schnitzler P, Spiel M, Lichy C, Hacke W. Fever and infection early after ischemic stroke. J Neurol Sci 1999;171:115-120. 123. Reith J, Jørgensen HS, Pedersen PM, Nakayama H, Raaschou HO, Jeppensen LL, et al. Body temperature in acute stroke: relation to stroke severity, infarct size, mortality and outcome. Lancet 1996;347:422-425. 124. Falus A, és Illés Z. Az immun és a neuroendokrin rendszerek kapcsolata. In: Az immunológia alapjai. Ed: Falus András, Buzás Edit, Rajnavölgyi Éva, 2007. Semmelweis Kiadó, p161-169 125. Illés Z. Immunológiai alapfogalmak. In: Sclerosis multiplex és autoimmunitás az ezredfordulón. 2003. Pécs, Neurológiai Klinika, p15-39. 126. Csépány T, és Illés Z. A neuroimmunológia és az autoimmunitás alapjai. In: Klinikai neuroimmunológia. 2005, Debrecen-Pécs, Matyus-BENTEN, p19-50. 127. Meisel A, Meisel C. Stroke-induced immundepression: consequences, mechanisms and therapeutic implications. Future Neurol 2008;3:551:563.
116
128. Chamorro A, Urra X, Planas AM. Infection after acute ischemic stroke. A manifestation of braininduced immunodepression. Stroke 2007;38:1097-1103. 129. Jonhansson A, Olsson T, Carlberg B, Karlsson K, Fagerlund M. Hypercortisolism after
stroke—partly cytokine mediated? J Neurol Sci 1997;147: 43-47. 130. Szczudlik A, Dziedzic T, Bartus S, Slowik A, Kieltyka A. Serum interleukin-6 predicts
cortisol release in acute stroke patients. J Endocrinol Invest 2004;27:37-41. 131. Elenkov IJ, Papanicolaou DA, Wilder RL, Chrousos GP. Modulatory effects of glucocorticoids and catecholamines on human interleukin-12 and interleukin-10 production: clinical implications. Proc Assoc Am Physicians 1996;108:374-381. 132. DeKruyff RH, Fang Y, Umetsu DT. Corticosteroids enhance the capacity of macrophages to induce Th2 cytokine synthesis in CD4+ lymphocytes by inhibiting IL-12 production. J Immunol 1998;160:2231-2237. 133. Prass K, Meisel C, Höflich C, Braun J, Halle E, Wolf T, et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. J Exp Med 2003;198:725-736. 134. Anne M, Juha K, Timo M, Mikko T, Olli V, Kyösti S, et al. Neurohormonal activation in
ischemic stroke. Effect of acute phase disturbances on long-term mortality. Curr Neurovasc Res 2007;4:170-175. 135. Pavlov A, Wang H, Czura CJ, Friedman SG, Tracey KJ. The cholinergic anti-inflammatory pathway: A missing link in neuroimmunomodulation. Mol Med 2003;9:125–134. 136. Kox M, Pompe JC, Pickkers P, Hoedemaekers CW, van Vugt AB, van der Hoeven JG. Increased vagal tone accounts for the observed immune paralysis in patients with traumatic brain injury. Neurology 2008;70:480-485. 137. Sanders VM, Baker RA, Ramer-Quinn DS, Kasprowicz DJ, Fuchs BA, Street NE. Differential expression of the beta2-adrenergic receptor by Th1 and Th2 clones: implications for cytokine production and B cell help. J Immunol 1997;158:4200-4210. 138. Gan X, Zhang L, Solomon GF, Bonavida B. Mechanism of norepinephrine-mediated inhibition of human NK cytotoxic functions: inhibition of cytokine secretion, target binding, and programming for cytotoxicity. Brain Behav Immun 2002;16:227-246. 139. Takamoto T, Hori Y, Koga Y, Yoshima H, Hara A, Yokoyama MM. Norepinephrine Inhibits Human Natural Killer Cell Activity in Vitro. Int J Neurosci 1991;58:127-131. 140. Elenkov IJ, Papanicolaou DA, Wilder RL, Chrousos GP. Modulatory effects of glucocorticoids and catecholamines on human interleukin-12 and interleukin-10 production: clinical implications. Proc Assoc Am Physicians. 1996;108:374-381. 141. Gibson-Berry KL, Whitin JC, Cohen HJ. Modulation of the respiratory burst in human
neutrophils by isoproterenol and dibutyryl cyclic AMP. J Neuroimmunol 1993;43:59-68.
117
142. Offner H, Subramanian S, Parker SM, Wang C, Afentoulis ME, Lewis A, et al. Splenic
atrophy in experimental stroke is accompanied by increased regulatory T cells and circulating macrophages. J Immunol 2006;176:6523-6531. 143. Ováry C, Szegedi N, May Z, Gubucz I, Nagy Z. Comparison of stroke ward care versus
mobile stroke teams in the Hungarian database project. Eur J Neurol 2007;14:757-761. 144. Aktas O, Ullrich O, Infante-Duarte C, Nitsch R, Zipp F. Neuronal damage in brain inflammation. Arch Neurol 2007;64:185-189. 145. Meisel C, Prass K, Braun J, Victorov I, Wolf T, Megow D, et al. Preventive antibacterial treatment improves the general medical and neurological outcome in a mouse model of stroke. Stroke 2004;35:2-6. 146. Chamarro A, Horcajada JP, Obach V, Vargas M, Revilla M, Torres F, et al. The Early Systemic Prophilaxis of Infection After Stroke Study: a randomized clinical trial. Stroke 2005;36:1495-1500. 147. Harms H, Prass K, Meisel C, Klehmet J, Rogge W, Drenckhahn C, et al. Preventive Antibacterial Therapy in acute Ischemic Stroke:a randomized controlled trial. PLoS ONE 2008;3:e2158. 148. Scharz S, Al-Shajlawi F, Sick C, Meairs S, Hennerici MG. Effects of prophylactic antibiotic therapy with mezlocillin plus sulbactam on the incidence and height of fever after severe acute ischemic stroke. The Mannheim Infection in Stroke Study (MISS). Stroke 2008;39:1220-1227.
118
1. ábra. A stroke-hoz kapcsolódó immunváltozások összefoglálása (stroke-t megelőző, stroke-t követő lokális és szisztémás változások)
Stroke megelőzően
Stroke követően
Endogén/exogén antigének
Lokális BBB sérülés
TLR-2, -4
TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8
Endothel
Autoantigén felszabadulás Makrofág akkumuláció
Simaizom sejt
Adhézios Proliferáció molekulák Citokinek Citokinek Kemokinek
No-reflow fenomen Protektív autoimmun reakció
Monocita M-CSF beáramlás
IL-18, IL-12 APC --T sejt
Makrofágok Szisztémás változás
Habos-sejtek
Apoptózis Limfopénia
Th1 sejt válasz Citokinek
csökkent CD4+ Th sejtszám Csökkent CD8+ T sejt
TGF-β, T (reg) sejtek
IL-10
Szabad gyökök, gyulladáskeltő anyagok
Másodlagos agyi károsodás
INF-γ
IL-2, INF-γ
Leukocita akkumuláció
T (reg) sejt aktiváció
Akut fázis reakció fokozódik, Komplementrendszer aktiváció Leukocita szám és aktiváció fokozódás elmaradása
Csökkent B sejtszám
Mátrix metalloproteáz hízósejtek Plakk destabilizáció
Csökkent NKT, NK, γδT sejt funkció: INF-γ termelés, citotoxikus hatás
Elégtelen celluláris immunválasz
Fokozott infekciós kockázat
A stroke-t megelőzően az ateroszkerotikus plakk kialakulása, majd destabilizációja zajlik, mely az agyi vérellátás csökkenését eredményezheti. Majd ennek hatására lokálisan leukocita és makrofág akkumuláció történik. Ez szabadgyökök, különböző enzimek és a reperfúzió gátlásán keresztül másodlagos agyi károsodáshoz vezethet. A felszabaduló agyi antigének pedig protektív autoimmun folyamatot generálnak. Szisztémás változás a post-stroke infeció kialakulása tekintetében egyre hangsúlyozottabb. Immunrendszeri deficit alakul ki, mely érinti a limfocitákat. Ha a leukocita aktiváció emelkedése elmarad, a csökkent celluláris
119
válaszreakció
fokozott
infekciós
kockázathoz
komplementrendszeri aktiváció alakul ki.
120
vezet.
Akut
fázis
reakció
és
2. ábra. A stroke indukálta immundepresszió mechanizmusa
Agyi károsodás
IL-6, IL-1, TNF-α
Katekolaminok, glukokortikoidok, acetilkolin
NK-sejt
Neutrofil
Th1-sejt
Th2-sejt
INF-γ Citotoxikus hatás
Fagocitózis Szabad gyök képzés
IL-4
Celluláris válasz
Humorális válasz
Immunszuppreszió
Makrófág
Limfoid szövet
Fagocitózis MHC II expresszió Gyulladáskeltő citokin IL-10
Atrófia Apoptózis Profileráció
Fertőzési hajlam
A stroke-t követő citokinek felszabadulás révén aktiválódik a hipotalamusz-hipofízismellékvese tengely, szimpatikus- és kolinerg idegrendszer. E a rendszerek katekolamin, glukokortikoid, acetilkolin közvetítéssel csökkentik az ősi és a szerzett immunválasz effektívitását. A létrejött immunszuppreszív állapot fokozza fertőzési hajlamot, de szerepet játszhat a kóros autoimmunitás megelőzésében.
121
1. táblázat. A profilaktikus antibiotikum terápia hatásait tanulmányozó vizsgálatok összehasonlítása
ESPIAS (146)
PANTHERIS (147)
MISS (148)
Monocentrikus, randomizált, Multicentrikus, randomizált, placebo-kontrolált, placebo-kontrolált, kettősvak kettősvak
Monocentrikus, randomizált, nyílt-kontrolált
Levofloxacin
Moxifloxacin
Mezlocillin/szulbaktám
Dózis
i.v. 500 mg
i.v. 400 mg
i.v. 3x2 g/1 g
Terápia kezdete
24 órán belül
36 órán belül
24 órán belül
Terápia időtartama
3 nap
5 nap
4 nap
Ischaemiás és vérzéses stroke
Non-lacunaris ischaemiás stroke az ACM területén
Ischaemiás stroke
NIHSS ≥ 5
NIHSS > 11
mRS > 3 (ágyhoz kötött)
Vizsgálat jellemzői Alkalmazott terápia Antibiotikum
Stroke Típus
Súlyosság Összes beteg
Eredmények Infekció
Profilaktikus antibiotikum N = 67
Placebo
30%
33%
Pneumónia(%) UTI(%)
N = 69
Profilaktikus antibiotikum N = 40
Placebo N = 40
Profilaktikus Hagyományos antibiotikum kezelés N = 30 N = 30
17.1%
41.9%
50%
90%
19.8%
8.6%
25.8 %
16.6%
23.3%
11%
8.6%
16.1%
26.6%
60%
CRP
Nincs szignifikáns különbség
Szignifikáns csökkenés profilaktikus AB hatásra
Nincs szignifikáns különbség
Láz
Nincs szignifikáns különbség
Nincs szignifikáns különbség
Csökkent profilaktikus AB hatásra
Csökkent profilaktikus AB hatásra
Nincs szignifikáns különbség
Javult profilaktikus AB hatásra
Neurológiai kimenetel Mortalitás (%)
24%
13%
8.3%
122
10%
3.3%
10%
ESPIAS: Early Systemic Prophylaxis of Infection After Stroke; PANTHERIS: Preventive anti-infective therapy in acute Ischemic Stroke; MISS: Mannheim Infection in Stroke Study; NIHSS: NIH stroke skála; mRS: módosított Rankin Skála; CRP: C-reaktív protein; AB: antibiotikum; UTI: alsó húgyuti infekció.
123
Paper 5 Dipyridamol-teszt az agyi keringészavarok korai felismerésében? Molnár Tihamér dr., Zámbó Katalin dr.1, Schmidt Erzsébet dr.1 és Tekeres Miklós dr. Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvosi Kar, Aneszteziológiai és Intenzív Terápiás Intézet (mb. intézetvezetõ: Bogár Lajos dr.) Központi Klinikai Radioizotóp Labor (intézetvezetõ: Zámbó Katalin dr.)1
A tranziens ischaemiás attakok felismerése
Dipyridamole stress test in the early
javarészben a beteg elmondása alapján
evaluation of cerebral circulatory
történik, hiszen a tünetek gyakran rövid ideig
disorders?
tartanak. Korunk egyik progresszíven fejlõdõ The diagnosis of transient ischaemic attack
diszciplínája, a nukleáris medicina gyakorlói
(TIA) is mainly based on the clinical
eredményes kísérletet tettek a múló jellegû
symptoms presented by the patient.
agyi ischaemia egyes fotonemissziós
Professionals in nuclear medicine have
tomográfia (SPECT) által történõ detektálására, sõt a vizsgálat érzékenységének
made a successful attempt to detect TIA by single photon emission tomography
fokozására provokációs eljárást dolgoztak ki.
(SPECT) imaging. Improved sensitivity of
Az intézetükben végzett kardiológiai
the examination using stress test (e. g.
indikációjú dipyridamol (DPD)-teszttel
acetazolamide) is well known in the
kombinált szívizomperfúziós SPECT-
literature. The dipyridamole stress test
vizsgálatok (n = 100) során a betegek 23%-
combined with SPECT imaging was
ában (n = 23) változatos lokalizációjú,
regularly performed in patients (n = 100)
átmeneti neurológiai tüneteket (TIA)
with ischaemic heart disease. After
észleltek. Ezen gyakoriság jelentõsebb, mint
injecting dipyridamole intravenously it
az irodalomban eddig közölt adatok (1,22/10 000). A „TIA-pozitív” betegeket ezért további
found various forms of transient neurological deficits in 23% of the patients
vizsgálatoknak vetették alá oly módon, hogy
with considerably higher incidence
a DPD-terhelést agyi SPECT-vizsgálattal
reported previously in the literature
kombinálták. Munkájuk célja a DPD-terhelés során jelentkezõ átmeneti neurológiai tünetek
(1.22/10,000). The so called „TIA positive” patients were examined further
és a kimutatható agyi vérátáramlás-eltérések
124
közötti összefüggés tanulmányozása.
using the combination of dipyridamole
Kiemelik, hogy valamennyi TIA-pozitív
stress test and brain SPECT imaging. The
betegnél, az agyi SPECT is pozitívnak
aim of this study was to analyse the
bizonyult, közöttük a topográfiai egybeesés
relationship between transient neurological
jónak mondható. Arra hívják fel a figyelmet,
symptoms provoked by DPD test and the
hogy a dipyridamol-teszt múló jellegû agyi
change in regional cerebral blood flow
ischaemiát válthat ki, ezért agyi SPECT-
indicated by brain SPECT imaging. It is
vizsgálattal kombinálva szerephez juthat a
emphasized, that perfusion abnormalities
neurológiai diagnosztikumban, ill. a gutaütés
revealed by brain SPECT were
(stroke) megelõzésében.
topographically consistent with the neurological deficits. In this article the
Kulcsszavak: tranziens ischaemiás attak,
attention was drawn to advantages of this
dipyridamol stressz teszt, agyi vérátáramlás,
test which may be suitable to provoke TIA
SPECT
safely. Combined with brain SPECT it may have an important role in the neurologic diagnostic procedures and in the prevention of stroke. Key words: transient ischaemic attack, dipyridamole stress test, brain SPECT, rCBF
Rövidítések: DPD = dipyridamol; HMPAO = hexametil-propilénamin-oxim; MIBI = metoxi-izobutil-izonitril-réz-tetrafluoroborát; MRI = magnetic resonance imaging; MRA = magnetic resonance angiography; SPECT = single photon emission computed tomography; TIA = transient ischaemic attack; VB = vertebrobasilaris A
dipyridamol
(DPD)-teszt
mint
provokációs
eljárás,
ill.
annak
kombinációja
izotópdiagnosztikai módszerrel (SPECT = „single photon emission computed tomography”) régóta használatos, jól bevált diagnosztikai lehetõség a kardiológiai gyakorlatban (6). Elsõsorban a járószalagos terhelésre alkalmatlan betegcsoportban, az ischaemiás szívbetegség diagnózisának megerõsítésében, a további terápiás lehetõségek eldöntésében, illetve myocardialis infarctus után a terhelhetõség követésében bizonyult hasznosnak. A módszer
125
viszonylag egyszerû, nem túl költséges, bár coronariaõrzõ háttér szükséges hozzá. Biztonságosságáról számos tanulmány tanúskodik (7, 9, 11). Intézetünkben évek óta része a rutin-klinikai diagnosztikának. Megfigyeltük, hogy a kardiológiai indikációval DPD-terhelésre kerülõ betegek egy bizonyos részében a gyógyszer beadását követõen változatos lokalizációjú neurológiai tünetek jelentkeznek (9), melyek a gyógyszerhatás lecsengésével párhuzamosan (max. 6 órán belül) spontán regrediálnak. Korábban a jelenség neurológiai szempontból való észlelése szakember hiányában nem volt lehetséges. Tekintettel a DPD vasodilatatív hatására – mely nyilván nem korlátozódhat szelektíven a koszorúerekre – feltételeztük, hogy valamilyen steal-szerû hatás érvényesülhet a cerebralis vazoregulációban (8). Tanulmányunkban a következõ kérdésekre kerestük a választ: 1. Van-e különbség a „TIA-pozitív”, illetve „TIA-negatív” betegcsoport hemodinamikai válaszaiban a DPD-terhelés alatt? 2. Provokálható-e DPD-vel regionális agyi ischaemia és ha igen, verifikálható-e SPECTvizsgálattal? 3. Alkalmas-e a DPD-teszt végzése szubklinikus agyi keringészavarok kimutatására? 4. Van-e összefüggés a betegek kardiális panaszai, ill. rejtett agyi ischaemiás zavarok között? Végül megkíséreljük a válaszadást a címben feltett kérdésre, megemlítve, hogy a SPECT mint vizsgálóeljárás a 80-as évektõl egyre szélesebb körben használatos a neurológiai diagnosztikában (1, 3, 4). TIA esetén az érzékenység fokozására acetazolamid (5) használatos, ill. carotisstenosios betegeken DPD provokációs teszttel már próbálkoztak – egy kis esetszámú elõtanulmányban – az agyi vérátfolyás rezervkapacitásának megítélésére (15). Vizsgálati anyag, módszer A tanulmány protokollját a régió etikai bizottsága jóváhagyta. Vizsgálatainkat 1999. április 1. és szeptember 30. között szívizomperfúziós SPECT-vizsgálatra elõjegyzett betegek között végeztük a Pécsi Tudományegyetem Aneszteziológiai és Intenzív Terápiás Intézetben a Központi Klinikai Radioizotóp Laboratórium segítségével. Vizsgálatunkba – életkorra és nemre való tekintet nélkül, elõzetes betegtájékoztatás és önkéntes, írásos beleegyezés után – bevontuk mindazokat a betegeket, akiknél a DPD-terhelés során a beteg neurológiai 126
eseményre utaló panaszt jelzett és fizikális vizsgálattal organikus neurológiai kórjeleket észleltünk. Az elõzményben szereplõ definitív agyi stroke, ill. a DPD-terhelést megelõzõen felvett neurológiai status alapján arra való gyanú kizárást jelentett a tanulmányból. Segítette munkánkat egy erre a célra összeállított kérdõív, melyen neurológiai szempontból releváns anamnesztikus adatokra, ill. rizikófaktorokra kérdeztünk rá (kitöltése önkéntes volt). A szelektált betegeket visszahívtuk ismételt DPD-teszt, illetve azt követõ agyi SPECT-vizsgálat céljából(1.ábra).
1. ábra: Vizsgálati algoritmus
DPD-teszt-protokoll: A betegeket fekvõ testhelyzetben véna kanülálást követõen, 0,56 mg/ttkg dipyridamol (Persantin, Boehringer-Ingelheim)-dózissal infundáltuk egyenletesen 4 percig. A teszt elõtt betegágy melletti neurológiai vizsgálat, nyugalmi EKG-, pulzus- és vérnyomás-ellenõrzés történt. 160/100 Hgmm vérnyomás felett a tesztet nem végeztük el, amíg azt nem sikerült normalizálni (erre iv. adott Ebrantylt használtunk). A DPD beadása alatt percenként történt pulzus- és vérnyomáskontroll. A betegek EKG-monitorizálása folyamatos volt, ezt a gyógyszeradás után is legalább 10 percig végeztük. A DPD-adást követõen, a csukott szemû beteg keringésébe 740 MBq
99 m
Tc-HM-PAO (hexametil-propilénamin-oxim)
radiofarmakont (10) juttattunk iv., majd ismételt neurológiai vizsgálat következett. A panaszok többségében a gyógyszerbeadás 3–4. percében jelentkeztek, intenzitásuk átmenetileg erõsödött, ekkor végeztük a fizikális neurológiai vizsgálatot. Ez a megfigyelés 127
összhangban áll azzal az ismerettel, hogy a dipyridamol az iv. beadást követõ 7–9. percben fejti ki maximális vasodilatatiós hatását (14). Az is közismert, hogy iv. adott aminophyllinnel antagonizálható a nemkívánt DPD-hatás. Ha antagonizálás szükséges – melyre tanulmányunk során egyszer sem került sor – figyelembe kell venni, hogy az aminophyllin plazmafelezési ideje rövidebb, mint a dipyridamolé. Kb. 10–15 perc elteltével valamennyi beteg a panaszok enyhülésérõl számolt be, ekkor került sor a SPECT-vizsgálatra. Hazabocsátásuk elõtt valamennyi
betegnél
ismételt
ideggyógyászati
vizsgálattal
gyõzõdtünk
meg
a
tünetmentességrõl. A leghosszabb észlelési idõ 6 óra volt. Minden beteget negatív neurológiai statusszal bocsátottunk haza. SPECT-protokoll: Multispect II, Siemens készülékkel SPECT-felvételt készítettünk 2 detektor aktíválásával, „ultra high resolution” kollimátorral, 360°-os körülfordulással, 60 lépéssel, lépésenként 30 000 ms-os idõ-elõválasztással. A rekonstrukciónál Chang-féle attenuáció korrekciót és Butterworth-filtert alkalmaztunk. A transversalis, sagittalis és coronalis metszetsoron a kiértékelés vizuálisan történt, egyrészt az interhemisphaerialis különbségeket figyelembevéve, másrészt a terheléses felvételeket a nyugalmihoz hasonlítva, két független értékelõ konszenzusa alapján. A pozitív – tehát igazolt perfúziós defektussal bíró – betegeket (n = 18), egy hét múlva nyugalmi agyi SPECT-vizsgálatnak vetettük alá. Ekkor oztályoztuk a betegeket annak alapján, hogy a cerebralis perfúziós deficit eltûnt, csökkent vagy megmaradt (teljes regresszió = TR, részleges regresszió = RR, perzisztáló góc = P). Vizsgálati algoritmusunk mutatja, hogy ez utóbbiak között átfedés lehetséges (1. ábra). A klinikai jelek lokalizációs értéke és a SPECT által igazolt góc(ok) topográfiája közötti összefüggést szubjektív skála segítségével értékeltük (kiváló/jó/közepes/rossz korreláció). Kritériumok: Kiváló = például jobb féltekei szenzoros tünetek és az identikus félteke szenzoros kéreg reprezentációjának megfelelõen csökkent aktivitású terület a SPECT-en. Jó = például jobb féltekei szenzomotoros tünetek és mindkét féltekében parietalisan hipoaktív gócok a SPECT-en (ebben az esetben az ellenoldali parietalis góc klinikailag „néma” maradt). Közepes = például bal féltekei szenzomotoros tünetek és többgócú perfúziós zavarra utaló hipoaktív területek mindkét hemisphaeriumban (a tünetekért felelõssé tehetõ góc nem markánsabb a többinél). Rossz = például jobb féltekei szenzomotoros tünetek és bal parietalis régióban csökkent aktivitású terület a SPECTfelvételen.
128
Statisztikailag a két post hoc (TIA-pozitív és TIA-negatív) betegcsoport közötti különbséget Student t-próbával, ill. c2 próbával elemeztük. Az adatokat mint átlag és 95% konfidenciaintervallum jelöltük. Szignifikánsnak a p < 0,05 eredményt tekintettük. Eredmények Öt hónap alatt 100 beteg került kardiológiai indikációval „DPD imaging” vizsgálatra. A demográfiai adatokat az 1. táblázatban foglaltuk össze. A vizsgálat közben 23 betegben jelentkezett TIA. Ebbõl 18 beteg neurológiai irányú továbbvizsgálása történt meg. Egy beteg nem egyezett bele a tanulmányban való részvételbe, egy beteg a vizsgálatok egy késõbbi idõpontban való elvégzését kérte, egy beteget a nehéz mobilizálási körülményekre tekintettel (mindkét oldali alsó végtag amputált) kontrollvizsgálatra nem hívtunk be, 2 beteg koronarográfiára kapott elõjegyzést, így vizsgálatukra késõbb kerül sor. Összehasonlítottuk a „TIA-pozitív” (n = 23), ill. „TIA-negatív” (n = 77) betegcsoportokban a DPD-terhelés során bekövetkezett hemodinamikai változásokat (1. táblázat). Megvizsgáltuk, hogy volt-e különbség az elõzményben szereplõ hypertonia (mint rizikófaktor), a terhelés alatt fellépõ angina pectoris, ill. a szívizomperfúziós SPECT eredménye alapján a két betegcsoport között (2. táblázat), de szignifikáns különbséget egyik esetben sem találtunk. A 3. táblázatban azon eseteink részletes összefoglalása található, akiknél az agyi SPECT-vizsgálat megtörtént. Ezek közül klinikai érdekessége miatt két esetet emelünk ki. A 4-es betegben a két alkalommal elvégzett DPD-terhelés kapcsán más-más féltekei tünetegyüttes volt észlelhetõ, ennek hátterében a SPECT diffúz, egyenetlen perfúzió mellett igazolta a féltekék között „vándorló” tranziens ischaemiás gócot. A 17. beteg esetében kifejezett forgó jellegû szédülés jelentkezett a terhelés alatt, azonban organikus góctünetet nem találtunk, a SPECT viszont múló jellegû aktivitáscsökkenést igazolt a leírt agyi régiókban. Bemutatunk egy példát a teljes regresszióra (2. ábra), valamint a részleges regresszióra, ill. a perzisztáló gócokra (3. ábra).
129
2. ábra: E. J. 51 éves nõbeteg, a dipyridamol beadása során bal karja zsibbadt, fizikális vizsgálattal bal oldali faciobarachialis hypalgesiát, ugyanitt élénkebb ínreflexeket, jelzett dysmetriát ill. Barrehelyzetben pronatiót észleltünk Bal oldali két oszlop terhelést követõen, jobb oldali két oszlop nyugalomban készített transversalis, sagittalis és coronalis síkú (egymás alatt) SPECTfelvételek. Látható a panaszokért felelõs jobb
130
parietalis góc (csökkent aktivitású terület) ill. annak regressziója a kontroll nyugalmi felvételeken. A betegnél koponya MRI ill. MRA történt negatív eredménnyel 3. ábra: K. K. 42 éves nõbeteg, DPD-terhelése során jobb oldali hemihypalgesiát, ugyanitt latens paresist ill. reflexakcentuáltságot észleltünk jelzett dysmetria és dysdiadochokines is mellett A bal oldali két oszlopban jól látható a többszörös lokalizációjú perfúziós zavar a bal oldali hemisphaeriumba n terhelés után, a
131
jobb oldali két oszlopban pedig azok részleges regressziója ill. a frontalis góc perzisztálása figyelhetõ meg nyugalomban Megbeszélés Tanulmányunkból kiderül, hogy kardiológiai indikációval DPD-terheléses SPECT-vizsgálatra elõjegyzett (korábban ideggyógyászati kezelés alatt nem állt) betegeknek csaknem egynegyedében múló jellegû neurológiai kórjeleket lehet észlelni. A jelenség, mint a dipyridamol adása során jelentkezõ egyik mellékhatás, korábban is ismert volt és egy, a DPDteszt biztonságosságát vizsgáló nagy esetszámú, multicentrikus vizsgálatban rendkívül alacsony incidenciával (1,22/10 000) közlésre is került (9). Ennek a látszólagos ellentmondásnak a feloldásához meg kell említenünk, hogy a fenti tanulmányban csak a motoros deficittel, ill. beszédzavarral járó TIA-eseteket regisztrálták, míg tanulmányunkban részletes neurológiai vizsgálaton estek át a betegek. Megállapítható, hogy tartós neurológiai tünetegyüttes (completed stroke) sohasem maradt vissza, erre vonatkozóan az irodalomban is csak anekdotikus utalások vannak, elsõsorban primer cerebrovascularis, ill. többszörös rizikófaktorral rendelkezõ betegek DPD-terhelése esetében (13). Javasolható tehát, az ilyen jellegû vizsgálatra kerülõ betegek elõzetes kikérdezése a neurológiai anamnézist, ill. releváns panaszokat illetõen. A 4. táblázatból kitûnik, hogy valamennyi tovább vizsgált TIA-pozitív betegen, a terhelés után végzett agyi SPECT is pozitív eredményt mutatott (szenzitivitás = 100%). A módszer specificitása ugyanakkor nem adható meg, mert a TIA-negatív csoport agyi SPECT-vizsgálata nem történt meg, ez további feldolgozást igényel. A perfúziós defektusok 7 esetben kiváló, 6 esetben jó egyezést mutattak a kórjelek alapján várt agyi lokalizációval, egy esetben azonban ellenoldali gócokat igazolt a SPECT, mint azt a fizikális vizsgálat alapján vártuk volna. A „de novo” góc olyan perfúziós defektus megjelenését jelenti a nyugalmi vizsgálat során, mely a terhelést követõ agyi SPECT-en nem volt látható. Érdekes, hogy kizárólag olyan betegeken sikerült kimutatni, akiknél eleve többgócú léziót tételeztünk fel a fizikális vizsgálat alapján, és amelyet a terheléses agyi SPECT által igazolt multiplex
132
lokalizációjú, csökkent aktivitású gócok is megerõsítettek. Fontos, hogy a nyugalmi SPECT számos esetben teljes regressziót, azaz a perfúziós defektus(ok) eltûnését igazolta, ami azt jelenti, hogy csak provokációval lehetett regionális agyi ischaemiát kiváltani, míg a nyugalomban is perzisztáló „góc”, negatív neurológiai status mellett szubklinikus léziót jelzett. A terhelés után végzett agyi SPECT segítségével gyakorlatilag minden esetben detektálni lehetett a klinikai tünetekért felelõs perfúziós defektusokat, sõt ezek jó korrelációt mutattak a klinikum- mal (kórjelek alapján feltételezett lokalizációval). Irodalmi adatok szerint önmagában a SPECT-vizsgálat hatékonysága a múló jellegû, ischaemiás eredetû neurológiai tünetegyüttes esetén rendkívül idõfüggõ, hiszen a TIA-t „nehéz” a vizsgálat idõpontjára idõzíteni. A SPECT találati aránya az irodalom szerint csak az elsõ napon számottevõ (kb. 60%) és az eltelt idõvel párhuzamosan csökken (1). A vizsgálat szenzitivitásának növelése céljából provokációs eljárásokkal (például acetazolamid adásával) már próbálkoztak (2, 5, 12), sõt egy alkalommal dipyridamolt is használtak stresszor ágensként súlyos carotisstenosisos betegekben, az agyi vérátáramlás rezervkapacitásának felmérésére (15). Dolgozatunkban igyekeztünk rávilágítani, hogy a dipyridamol-teszt alkalmas lehet a fenti idõfaktor kiküszöbölésére. A bevezetésben feltett kérdésekre válaszolva megállapítható, hogy: 1. A „TIA-pozitív”, illetve „TIA-negatív” betegcsoport között a DPD-re adott hemodinamikai válaszreakció tekintetében nincs szignifikáns különbség. 2. A dipyridamol (Persantin, Ingelheim Boehringer) alkalmas regionális agyi ischaemia kiváltására, mely minden esetben átmenetinek bizonyult. 3. Különösen hasznos lehet a vizsgálat a szubklinikus agyi keringészavarok diagnosztikájában. 4. Az, hogy van-e összefüggés a betegek kardiális panaszai, illetve rejtett agyi ischaemiás zavarok között, még további elemzéseket igényel. Összefoglalva, a DPD-teszttel kombinált agyi SPECT fontos szerepet kaphat az agyérbetegségek korai felismerésében, ill. a stroke prevenciójában, ezenkívül egyéb rizikófaktorok utáni kutatásra is ösztönzi a vizsgálatot végzõ orvost. Köszönetnyilvánítás: A szerzõk megköszönik Sárosi István dr., Mühl Diána dr. és Erményi Ágota dr. segítségét a klinikai munkában, valamint Molnár Zsolt dr. tanácsait a statisztikai feldolgozásban.
133
IRODALOM: 1. Assessment of brain SPECT (Report of the Therapeutics and Technology Assessment Subcommittee of the American Academy of Neurology). Neurol., 1996, 46, 278–285. 2. Barzó P., Pávics L., Borda L. és mtsai: Az agyi rezisztenciaerek rezervkapacitásának meghatározása acetazolamid teszt során végzett transcranialis Doppler és SPECTvizsgálattal. Orv. Hetil., 1992, 133, 2347–2355. 3. Bogousslavsky, J., Delaloye-Bischof, A., Regli, F. és mtsai: Prolonged hypoperfusion and early stroke after transient ischaemic attack. Stroke, 1990, 21, 40–46. 4. Borbély K.: Az emissziós komputertomográfia (SPECT, PET) szerepe a strokebetegek ellátásában. Agyérbetegségek, 1998, 3, 3–8. 5. Chollet, F., Celsis, P., Clanet, M. és mtsai: SPECT study of cerebral blood flow reactivity after acetazolamide in patients with transient ischaemic attacks. Stroke, 1989, 20, 458–464. 6. Depuey, E. G., Rozanski, A.: Pharmacological and other nonexercise alternatives to exercise testing to evaluate myocardial perfusion and left ventricular function with radionuclides. Semin. Nucl. Med., 1991, 21, 92–102. 7. Grosse-Heitmeyer, W., Bramann, H. U. és mtsai: How dangerous is the dipyridamole test? Z. Kardiol., 1983, 72, 340–345. 8. Hartmann, A.: Prolonged disturbances of regional cerebral blood flow in transient ischaemic attacks. Stroke, 1985, 16, 932–939. 9. Lette, J., Tatum, J. L., Fraser, S. és mtsai: Safety of dipyridamole testing in 73.806 patients: the Multicenter Dipyridamole Safety Study. J. Nucl. Cardiol., 1995, 2, 3–17. 10. Neirinckx, R. D., Canning, L. R., Piper, I. M. és mtsai: Technetium-99m d,1–HMPAO: a new radiopharmaceutical for SPECT imaging of regional cerebral blood perfusion. J. Nucl. Med., 1987, 28, 191–202. 11. Ranhosky, A., Kemthorne-Rawson, J. és mtsai: The safety of intravenous dipyridamole thallium myocardial perfusion imaging. Circul., 1990, 81, 1205–1209. 12. Pávics L., Ambrus E., Katona É. és mtsai: Acetazolamid provokációval kombinált vérátfolyás vizsgálatok lehetõségei az ischaemiás cerebrovascularis betegségek diagnosztikájában. Orv. Hetil., 1992, 133, 2495. 13. Whiting, J. H. J. R., Datz, F. L., Gabor, F. V. és mtsai: Cerebrovascular accident associated with dipyridamole thallium-201 myocardial imaging: case report. J. Nucl. Med., 1993, 34, 128–130.
134
14. Whiting, J., Datz, F. Jr., Gabor, F. és mtsai: Dipyridamole testing in cerebrovascular patients (letter). J. Nucl. Med., 1993, 34, 1389–1390. 15. Hwang, T. L., Saenz, A., Farrell, J. J. és mtsai: Brain SPECT with dipyridamole stress to evaluate cerebral blood flow reserve in carotid artery disease. J. Nucl. Med., 1996, 37, 1595–1599.
135
1. táblázat: Demografiai adatok ill. hemodinamikai változások a TIA-pozitív ill. TIA-negatív betgcsoportok tekintetében
Életkor (év)
TIA-
TIA-
pozitív
negatív
n=23
n=77
53
53 (51-55)
0,935
9/14
43/34
0,234*
79 (74-
81 (77-84)
0,591
-2,0 (-6-2)
0,475
16 (14-18)
0,360
p
(50/57) Nem (F/N) Testömeg (kg)
84) dRRsyst. (Hgmm)
1,7 (-811)
dpulzus (/perc)
18 (1422)
Az
adatokat
mint
összehasonlításra dRR
syst.
=
átlag
Student systolés
(95%) t-próbát
konfidencia-intervallum) illetve*
nyomásértékben
chi-négyzet
bekövetkezett
próbát
változás
dpulzus=a szívfrekvenciában bekövetkezett változás a terhelés alatt.
136
ábrázoltuk.
a
Statisztikai
alkalmaztunk. terhelés
alatt;
2. táblázat: A TIA-pozitív ill. -negatív betegcsoportok összehasonlítása az elõzményben szereplõ hypertonia, a DPD-terhelés alatt jelentkezõ angina pectoris ill. a szívizomperfúziós SPECT eredménye alapján TIA-
TIA-
pozitív
negatív
n=23
n=77
6
18
0,786
Hypertonia
15
57
0,435
99m
13
49
0,626
valamennyi
esetben
Angina pectoris
A 99m
Tc-MIBISPECT-pozitivitás* statisztikai
elemzés
p
chi-négyzet
próbával
végeztük.
Tc-MIBI = a myocardium-perfúzió vizsgálatára használatos radiofarmakon (MIBI =
metoxiizobutil-izonitril-réz-tetrafluoroborát); * : a vizsgálat a szívben tranziens ischaemiát igazolt
137
3. táblázat: A klinikum alapján feltételezett lokalizáció, az agyi SPECT-eredmények, valamint a közöttük lévõ „korreláció” részletes bemutatása (n = 18)
Nem 1.
N
Lokalizáció
Terheléses agyi
(kórjel)
SPECT
VB (jobb) + bal Többgócú mko.-i
3.
4.
N
N
F
„Korreláció”
Változatlan
Közepes
VB (bal) + jobb Többgócú bal
Frontoparietalis eltûnt,
Gyenge
féltekei
féltekei
parietalis megmaradt
Jobb parietalis,
Teljes regresszió
Kiváló
Kiváló
féltekei 2.
Nyugalmi agyi SPECT
VB + jobb
féltekei
féltekei
temporalis góc
*1. vizsgálat:
Diff. egyenetlen
Változatlan + tranziens
VB + jobb
perfúzió + jobb
ischaemiás góc bal
féltekei 2.
parietalis góc
frontotemporalisan
vizsgálat: VB + bal féltekei 5.
N
Bal féltekei
Többgócú perfúziós Teljes regresszió
Kiváló
zavar a bal féltekében 6.
F
Jobb féltekei
Nem történt
Atrophia cerebri. Mko. frontoparietalis, jobb occipitalis gócok
7.
N
Jobb féltekei
Jobb féltekei
Teljes regresszió
Kiváló
Kiváló
frontalis, ill. frontoparietalis góc 8.
F
VB + jobb
Jobb parietalis, ill.
Változatlan parietalis góc +
féltekei
frontoparietalis góc
regresszió
9.
N
Jobb féltekei
Bal parietalis góc
Teljes regresszió
10.
N
VB + bal
Bal frontoparietalis
Regresszió
féltekei
és jobb parietalis góc
138
Rossz Jó
11.
N
VB + jobb
Mko.-i
féltekei
parietooccipitalis,
Teljes regresszió
Jó
Teljes regresszió + „de
Jó
bal parietalis góc 12. *N
1. terhelés:
Kis perfúziós zavar
jobb féltekei 2. mko. féltekében
novo” bal parietalis góc
terhelés: VB + bal féltekei 13.
N
VB + jobb
Jobb parietalis és
Regresszió + jobb parietalis
féltekei
cerebellaris (bal
góc perzisztál
Kiváló
occipitalis) gócok 14.
15.
N
F
Jobb féltekei
Jobb féltekei
Jobb parietalis, ill.
Jobb parietalis góc
Kiváló
occipitalis góc
perzisztál
Diffúz perfúziós
Teljes regresszió
Jó
Regresszió
Jó
zavar + mko. parietalis góc 16.
N
VB + jobb
Jobb frontalis,
féltekei
parietalis, bal frontotemp., occipit.
17.
18.
F
N
Neg. status
Bal frontoparietalis, Teljes regresszió
(vertigo)
mko.-i parietalis góc
Jobb féltekei
Mko.-i parietalis, bal Regresszió
Jó
frontoparietalis góc *1. 2. Dõlt
vizsgálat: vizsgálat: betûvel
a
kardiológiai a
2. írt
indikációjú
(agyi) eset:
DPD-terhelés
DPD-terhelés
csak
nyugalmi
során
során
észlelt észlelt
SPECT-vizsgálat
kórjelek. kórjelek. történt.
N = nõ; F = férfi; VB = vertebrobasilaris területi keringészavarra utaló kórjelek; Korreláció = a klinikai kép alapján feltételezett góc és az agyi SPECT-vizsgálattal igazolt hypoperfundált terület(ek) közötti találati pontosság
139
4. táblázat: A SPECT által igazolt gócok dinamikája a klinikai kép tükrében
Vertebro-basilaris
TIA
Terheléses SPECT
Találati
Nyugalmi
n=23
(vizsgálatok száma)
pontosság
SPECT
2
Nem történt
9
6 pozitív (6)
Nem történt
(VB) Tisztán féltekei
3 kiváló
1 perzisztál
2 jó
5 regresszió
1 rossz
1 multiplex góc(*7)
VB-féltekei
8
8 pozitív (8)
3 kiváló
4 regresszió
3 jó
3 regresszió+perzisztáló
2 közepes góc 1 perzisztál Multiplex
3
2 pozitív (2)
1 kiváló
1 perzisztál+de novo góc
1 jó
1 regresszió+de novo góc
Nem
1
1 pozitív (1)
1 teljes regresszió
azonosítható** Rövídítések: lásd elõzõ táblázatnál. * Egy betegnél csak nyugalmi agyi SPECT történt, ezért itt 7 vizsgálatra történik utalás. ** Fizikális vizsgálattal kórjelet nem észleltünk, azonban kifejezett forgó jellegû vertigo jelentkezett DPD-terhelés alatt
140
Paper 6
“Cerebrovascular stressing”: drug-induced S100B elevation and transient neurological signs predict ischemic cerebrovascular events Tihamer Molnar 1, Zsuzsanna Szabo2, Erzsebet Schmidt2, Eva Barta3, Katalin Zambo2, Zsolt Illes4 1
Department of Anaesthesiology and Intensive Therapy, University of Pecs, Faculty of Medicine, Hungary
2
Department of Nuclear Medicine, University of Pecs, Faculty of Medicine, Hungary
3
Department of Internal Medicine, University of Pecs, Faculty of Medicine, Hungary 4
Department of Neurology, University of Pecs, Faculty of Medicine, Hungary
ABSTRACT Objective: Examination of brain derived biomarkers in sera of patients with coronary artery disease (CAD) and transient neurological signs (TNS) induced by intravenous dipyridamole (DP) stress test, and examination of their predictive value for brain ischemic events within 7 years. Methods: A total of 49 consecutive patients with coronary heart disease were examined by DP myocardial perfusion imaging according to international protocol. Neurological status was checked by a certified neurologist. Basal high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP) was measured prior to the test. Neuron specific enolase (NSE) and S100B were measured serially before, and in 15 and 60 minute intervals after DP infusion. Results: Elevated S100B or transient neurological deficit were observed in 17 patients: fourteen patients had TNS disappearing spontaneously within a few minutes; S100B was elevated in 12 patients at one hour after DP stress; and TNS was accompanied by significant elevation of S100B in 9 patients. Over the course of a 7-year follow-up, cerebral ischemic events (TIA and stroke) were significantly associated with DP-induced TNS and S100B measured at 1 hour
141
post-stress. Conclusion: DP-induced S100B release and reversible neurological deficits may predict ischemic cerebrovascular events in patients with CAD. By analogy to DP stress in cardiology, such “cerebrovascular stress test” may identify patients with subclinical cerebrovascular disorders and high risk for manifest cerebrovascular events. INTRODUCTION Dipyridamole (DP), a pharmacological stressor, has been used for decades as an alternative to exercise testing to identify patients with coronary artery disease (CAD) [1]. As a side effect of the drug, incidental harmful effect of intravenous DP on cerebral perfusion has been documented in several studies. These accidents were attributed to regional cerebral perfusion changes due to intracranial vascular “steal” phenomenon caused by its vasodilator action [2-4]. In addition, TIA was reported after oral administration of DP plus acetyl salicylic acid (ASA) combination [5]. DP blocks the reabsorption and metabolism of adenosine resulting in an increase in the concentration of circulating adenosine, which may explain the “desired” effect of coronary hyperemia but also the “undesired” side-effect on cerebral blood vessels; in healthy volunteers, DP stress changed regional cerebral blood flow in the thalamus and prefrontal cortex [6]. It was also claimed that DP decreased CBF due to a decrease in PaCO2 caused by adenosine-induced hyperventilation [7]. Single-photon emission computed tomography (99mTc-HMPAO SPECT) demonstrated increased side-to-side asymmetry in occlusive carotid artery disease after intravenous DP or adenosine administration, claiming their usefulness for estimation of cerebral perfusion reserve [8,9]. We hypothesized that by the analogy of stressing patients with coronary artery diseases, DP stress test can be considered as an opportunity to examine subclinical cerebrovascular disease. In addition to transient neurological signs induced by intravenous DP, investigation of brain specific biomarkers in sera could stratify and complete clinical
142
findings. Several biomarkers in sera are associated with brain ischemic events. S100B, an astroglial protein, is elevated in the peripheral blood in patients with stroke and its peak concentration around day 3 after stroke correlates with the volume of brain lesions and clinical outcome [10]. Due to impairment of the blood brain barrier, however, an increase of S100 protein in the sera can be detected much earlier, within hours after the insult [11]. NSE, an enzyme localized to neurons and axonal processes, is released into the blood and cerebrospinal fluid at the time of neural injury [12, 13]. High-sensitivity C-reactive protein (hsCRP) can be an indicator of atherothrombosis and an independent predictor of increased cardiovascular risk [14,15]. In summary, the aim of this prospective study was (i) to determine whether DP-stress has any impact on biomarkers (S100B, NSE, hsCRP) (ii) the frequency of transient neurological signs (TNS) during DP-stress, and (iii) to examine the role of induced biomarkers and TNS in predicting manifest cerebrovascular events. MATERIALS AND METHODS The study protocol was approved by the local ethics committee. Altogether, 49 consecutive patients with CAD (mean age: 55 years; age range: 35-74; sex: 26 female, 23 male) were recruited for this study (Table 1). These patients were referred for DP myocardial perfusion imaging (Technetium-99m-methoxy-isobutyl-isonitrile (MIBI) Myocardial SPECT) indicated by cardiologists at the Department of Anaesthesiology and Intensive Care, University of Pecs, Hungary. Dipyridamole stress test. DP, at a dose of 0.56 mg/kg, was infused in a neutral environment over 4 minutes with the patient in supine position. Heart rate, blood pressure and 12-lead electrocardiogram (ECG) were recorded before and after DP infusion for a total of 10 minutes. In addition, three electrocardiograph leads were monitored continuously. In case of
143
potentially serious complication due to DP administration, the staff was prepared for possible antagonization by aminophyllin, but in this study it was not necessary. Before the test, each patient was asked to complete a questionnaire about his/her medical history concerning the neurologically relevant events. Neurological status was checked by a certified neurologist. Exclusion criteria were TIA, any type of stroke, recurrent headaches including migraine, or disorders that mimic TIA (epileptic seizures, syncope etc.) in the previous history. After injecting the radiopharmaceutical (MIBI), patients were questioned about their symptoms and examined again by a neurologist. Based on the presence of clinical symptoms and signs induced by DP, patients were categorized into a TNS positive (n=14) and negative group (n=35). In patients, who developed TNS during DP stress, neuroimaging (CT or MRI) was performed to exclude intracranial pathology. Patients were reassessed by a neurologist before discharge from the department. Biomarkers. Basal high-sensitivity CRP (hsCRP) was measured prior to the test. S100B and NSE were serially measured before the test (T0), after 15 minutes (T15) and 60 minutes (T60). Serum hsCRP was measured by automated fluorescence immunoassay (BRAHMS Kryptor, Germany), S100B by automated electrochemiluminescence immunoassay (LIAmat® Sangtec®100; Byk-Sangtec, Sweden) and serum NSE by chemiluminescent immunoassay (LIA-mat® NSE Prolifigen; Byk-Sangtec, Germany). S100B and hsCRP levels were compared to biomarker data obtained from 34 healthy controls and 49 patients with spontaneous ischemic events (38 patients with acute ischemic stroke, 11 patients with TIA). Audit of cerebrovascular events during the follow-up. Seven years after DP stress, all recruited patients were asked to complete a questionnaire concerning symptoms of reTIA/stroke, potential risk factors (smoking, diabetes mellitus, hypertension and obesity) and hospitalization due to both cardio- and cerebrovascular disease.
144
Statistical analysis. Statistical calculation was performed using the SPSS 16.0 package.
2
test, multiple logistic regression analysis, ROC analysis and Mann-Whitney U test
were used and data were presented as mean, 95% confidence intervals and median, interquartile ranges (IQR). RESULTS Demographic, co-morbidities and baseline biomarker data of patients are summarized in Table 1. Induced transient neurological signs and biomarkers (S100B, NSE, hsCRP) Out of 49 patients, TNS was observed in 14 (28.6%) during DP stress. Systemic and neurological symptoms (e.g. nausea, dizziness, numbness, muscle weakness) occurred within 3-4 minutes after injecting DP and disappeared spontaneously within 15 minutes (Table 2). Additionally, all patients had pulsating headache starting immediately after injecting DP and disappearing within 7-15 minutes except one patient. The headache did not fulfill criteria of migraine according to IHS [16]. The longest observation (4 hours) was due to scabbing headache in a single patient. No permanent neurological deficit was observed and no specific pathology was revealed by neuroimaging. Altogether, transient neurological deficit and/or elevation of S100B was detected in 17 out of 49 patients (34.6%) (Table 2). Serum S100B level was significantly higher 60 minutes after stressing in patients with TNS (n=14) compared to patients without TNS (n=35) (median:0.15, IQR: 0.04-0.25 vs. 0.03, 0-0.10, p<0.01, respectively) (Figure 1A). This difference was attributed to elevation of S100B in nine patients with TNS (9 out 14, 64%) in contrast to elevation of S100B only in 3 patients without TNS (3 out of 35, 0.8%) (Table 2). No difference was detected 15 minutes after DP stress. Receiver operating characteristics (ROC) analysis of the 49 patients indicated susceptibility to drug induced TNS if release of S100B at 60 minutes was higher than 0.12 ng/ml (sensitivity: 65%, specificity: 89%, AUC:0.756, p<0.01). Such an elevation in S100B
145
in sera at 60 minutes (>0.12 ng/ml) after DP stress was found altogether in 12 CAD patients out of 49 (24.4%). Elevation of S100B in combination with DP-induced TNS occurred in 9 out of the 49 patients (18.4%) (Table 2). S100B levels in DP-induced TNS (n=14) were also compared to S100B in spontaneous TIA (n=11) and acute ischemic stroke (n=34). S100B was measured at 60 minutes in CAD patients and 2-6 hours after onset of symptoms in TIA and stroke. Median S100B levels were similar in patients with DP-induced TNS, spontaneous TIA and stroke, but differed from patients in whom DP-stress did not provoke TNS (Figure 1A). In contrast to S100B, serum hsCRP and NSE levels, assessed at early time intervals after DP-stress (15 and 60 min), were not different between CAD patients, who developed TNS or remained asymptomatic. In addition, hsCRP levels even in patients with DP-induced TNS were similar to healthy controls, while basal hsCRP was elevated in patients with spontaneous TIA and stroke (Figure 1B). Seven years follow-up A total of 42 questionnaires were returned. Six patients died and no detailed information were available in five cases. Therefore, 37 completed reports were analyzed. Manifest ischemic events occurred in 48% of patients (TIA: 15/37, stroke: 3/37) in seven years. One reported death was due to post-stroke complications. All ischemic events (TIA and stroke, n=18) and TIA (n=15) were more common among patients with DP induced elevation of S100B measured at T60 seven years earlier (chisquare test p<0.01; Mantel-Haenszel OR:10.0, 95%CI: 2.3-42.8, p<0.01 and chi-square test p<0.01; Mantel-Haenszel OR: 10, 95%CI: 2.1-47.0, p<0.01, respectively) (Table 3). Receiver operating characteristics (ROC) analysis of DP induced release of S100B≥0.11ng/ml at 60 minutes in 49 patients with CAD predicted all cerebrovascular ischemic events (TIA or stroke) with a sensitivity of 70.6% and specificity of 83.3% (AUC:0.781, p<0.01). When
146
adjusted for age, gender and comorbidities in a multivariate analysis (Table 1), S100B above the cut-off value indicated 70-times increased risk for manifest ischemic cerebrovascular events within 7 years (Table 4). All ischemic events (TIA and stroke, n=18) and TIA (n=15) were more common among patients with DP-induced TNS seven years earlier (chi-square test p<0.05, MantelHaenszel OR:4.0, 95%CI: 0.9-16.5, p=0.05, and chi-square test p<0.05, Mantel-Haenszel OR: 4.4, 95%CI: 1.1-18.6, p<0.05, respectively) (Table 3). However, when adjusted for age, gender and comorbidities in a multivariate analysis (Table 1), patients with DP-induced TNS did not experience a significantly increased risk for cerebrovascular events within 7 years (Table 4). Abnormal serum levels of biomarkers or presence of drug-induced TNS seven years earlier were not more frequent among patients who died during follow-up. In addition, there was no significant correlation between the manifest coronary artery disease (CAD) revealed by Tc-99m-MIBI myocardial SPECT and DP-induced TNS. CAD and new cerebrovascular events in 7-year follow-up were not associated either. DISCUSSION Dipyridamole (DP), a pharmacological stressor, has been used to identify patients with coronary artery disease (CAD) [1]. Applying the same analogy as “cerebrovascular stressing”, we examined its role in identifying subclinical cerebrovascular disorders in manifest cardiac patients by detecting transient neurological signs and biomarkers in sera, as well as their predictive role in upcoming brain ischemic events. The median value of serum S100B measured 1 hour after DP-stress in CAD patients was similar to stroke/spontaneous TIA if the patients had transient neurological signs after stressing. In patients, who did not develop neurological signs after DP stress, however, the S100B levels were significantly lower. These data indicate that S100B release was related to
147
transient neurological deficits. Thus, an increase in serum concentration (above 0.04 ng/ml) one hour after DP-stress predicted transient neurological signs. Previously, the appearance of astroglia specific S100B in the systemic circulation was exclusively thought as a result of definitive brain tissue damage (e.g. stroke). Recently, impairment of the BBB per se was also described as the potential source of S100 protein [11]. Additionally, in vitro studies have shown that it can be released from astroglial cells by a number of stimuli: by activation of A1 adenosine or mGlu3 metabotropic glutamate receptors [17], stimulation of astroglial 5-HT1A receptors and by adrenocorticotropic hormone (ACTH) and corticotrophin-like intermediatelobe peptide [18]. As DP is a potent inhibitor of the reabsorption and metabolism of adenosine resulting in a significant increase in adenosine serum concentration, the combined effect of S100B release by activation of A1 adenosine receptors and the transient BBB dysfunction both induced by DP may explain the rapid elevation of S100B in the sera. Indeed, secretion of S100B protein exhibited rapid kinetics, peaking after 1 hour of drug treatment [17]. As the half-life of DP is approximately 1 hour, it partly explains that elevation of S100B appears 60 minutes after DP injection, while symptoms and signs appear much earlier. In contrast to S100B, the basal serum level of hsCRP was not related to the clinical effect of DP, although it is a good predictor of manifest stroke/TIA [19]. In this regard, induced and spontaneous TIA were similar, since basal serum level of hsCRP was not elevated in either, in contrast to stroke [14,20]. DP stress had no effect on the serum concentration of NSE either, presumably due to lack of definitive brain tissue injury indicated by neuroimaging as well. Besides measuring S100B in sera, DP-induced neurological symptoms/signs were systematically evaluated by a neurologist. The phenomenon of DP-induced neurological signs was previously reported as a side effect of the drug in a multi-center study about the safety of DP testing [3], but the reported incidence was considerably lower compared to our study. The discrepancy may be related that in our study a certified neurologist examined the patients and
148
the study was designed to focus on TNS. Based on the high incidence of DP-induced headache accompanied with TNS, the possibility of migraine with aura provoked by DP can not be excluded, although symptoms of the short-lasting headache did not fulfill criteria of migraine [16]. In addition, none of the patients had previously experienced migraine. Nevertheless, the inflammatory process of migraine may carry the potential to disrupt the vascular endothelial function, structure and cerebral blood flow predisposing patients to the development of atherosclerosis and vascular disease [21,22]. Recently, elevated S100B representing a prolonged failure of BBB in migraine and decreased NSE levels excluding neuronal cell injury were also found in serum of migraineurs. In addition, the concentration of S100B in sera was similar in our patients with DP-induced short-lasting headache/TNS and in patients with migraine [23]. Next, we investigated the association between peak S100B level and the risk of future cerebrovascular events in patients with TNS provoked by DP. We found that both elevation of S100B and TNS were more common among patients who experienced manifest stroke/TIA within seven years (75% and 67 %, respectively, in seven years). However, in multivariate analysis, only DP-induced elevation of S100B was a good independent predictor of stroke and TIA after adjusting for confounding factors: the risk of such events within seven years was 70-times higher in these patients. In this regard, DP-stress may be similarly effective in selecting patients with high-risk for cerebrovascular as well as cardiovascular diseases on the long-term [24]. As the DP stress test is basically performed by cardiologists, TNS are often unrecognized. Therefore, measurement of S100B in addition to clinical findings can be a surrogate marker and can stratify patients with high risk of vascular events, who could benefit most of early preventive therapy. Such an exact laboratory test could be especially important if the stress test is performed by medics not specialized in neurology and thus minor neurological symptoms and signs may escape their attention. Acetazolamide has been used to
149
increase the sensitivity of brain SPECT after TIA [25]. However, DP stress was found superior compared to acetazolamide in assessing cerebral blood flow reserve in patients with severe carotid artery stenosis [9]. DP stress combined with S100B measurement can be an alternative to acetazolamide and has the advantage that SPECT may not be required. Although the role of adenosine in eliciting anginal pain by stimulation of A1 adenosine receptors has been suggested and related to neural activation of the thalamus and prefrontal cortex [6], we found neither association between angina pectoris and TNS, nor to change of S100B in the serum during DP stress. Our finding, that manifest CAD revealed by positive myocardium perfusion imaging was not associated with clinical signs of DP-induced TNS nor with elevation of S100B, may suggest different pathological process of atherogenesis affecting coronary arteries and cerebral vessels. Distinct pathways of atherothrombosis seem to develop at different sites of the vascular system (brain, heart, and peripheral circulation) [26,27]. Finally, we emphasize that, in our study, DP-stress did not induce permanent neurological deficit (definitive stroke). The few sporadic published cases with stroke were associated with primary cerebrovascular disorders and/or multiple risk factors [28,29]. Therefore, taking thorough medical and neurological history is recommended prior to this test. In summary, our data indicate that S100B measurement combined with DP stress might be a diagnostic test in the early recognition of cerebral circulatory disorders, stroke prevention and in the preoperative assessment of patients scheduled for cardiac surgery. Another prospective study may be warranted to confirm our findings in larger number of patients.
ACKNOWLEDGEMENTS AND FUNDING
We kindly thank Felicia Berkun for reviewing our manuscript. This study was supported by grants from the Hungarian Research Fund OTKA K 77892 and ETT 50053-2006 to Z. Illes.
150
We declare that none of the co-authors has any competing interests with regard to the manuscript. REFERENCES [1] Depuey EG, Rozanski A. Pharmacological and other nonexercise alternatives to exercise testing to evaluate myocardial perfusion and left ventricular function with radionuclides. Semin Nucl Med 1991;21:92-102. [2] Grosse-Heitmeyer W, Bramann HU, Görtz P, et al. How dangerous is the dipyridamole test? Z Kardiol 1983;72:340-5. [3] Lette J, Tatum JL, Fraser S, et al. Safety of dipyridamole testing in 73.806 patients: the Multicenter Dipyridamole Safety Study. J Nucl Cardiol 1995;2:3-17. [4] Ranhosky A, Kempthorne-Rawson J. The safety of intravenous dipyridamole thallium myocardial perfusion imaging. Intravenous Dipyridamole Thallium Imaging Study Group. Circulation 1990;81:1205-9. [5] Siegel AM, Sandor P, Kollias SS, et al. Transient ischemic attacks after dipyridamoleaspirin therapy. J Neurol 2000;247:807–8. [6] Ito H, Yokoyama I, Tamura Y, et al. Regional changes in human cerebral blood flow during dipyridamole stress: neural activation in the thalamus and prefrontal cortex. NeuroImage 2002; 16,788-93. [7] Ito H, Kinoshita T, Tamura Y, et al. Effect of Intravenous Dipyridamole on Cerebral Blood Flow in Humans : A PET study. Stroke 1999;30:1616-20. [8] Soricelli A, Postiglione A, Cuocolo A, et al. Effect of adenosine on cerebral blood flow as evaluated by single-photon emission computed tomography in normal subjects and in patients with occlusive carotid disease: a comparison with acetazolamide. Stroke 1995;26:1572–6. [9] Hwang TL, Saenz A, Farrell JJ, et al. Brain SPECT with dipyridamole stress to evaluate cerebral blood flow reserve in carotid artery disease. J Nucl Med 1996;37:1595–9.
151
[10] Foerch C, Singer OC, Neumann-Haefelin T, et al. Evaluation of serum S100B as a surrogate marker for long-term outcome and infarct volume in acute middle cerebral artery infarction. Arch Neurol 2005;62:1130-4. [11] Kapural M, Krizanac-Bengez Lj, Barnett G, et al. Serum S100β as a possible marker of blood-brain barrier disruption. Brain Research 2002;940:102-4. [12] Barone FC, Clark RK, Price JP et al. NSE increases in cerebral and systemic circulation following focal ischemia. Brain Res 1993;623:77–82. [13] Missler U, Wiesmann M, Friedrich C, et al. S-100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarction volume and prognosis in acute ischemic stroke. Stroke 1997;28:1956-60. [14] Di Napoli M, Papa F, Bocola V. C-reactive protein in ischemic stroke. Stroke 2001;32:917-24. [15] Di Napoli M, Papa F, Bocola V. Prognostic influence of increased C-reactive protein and fibrinogen n levels in ischemic stroke. Stroke 2001;32:133-8. [16] Lipton RB, Bigal ME, Steiner TJ, Silberstein SD, Olesen J. Classification of primary headaches. Neurology 2004;63:427-35. [17] Ciccarelli R, Di Iorio P, Bruno V, et al. Activation of A(1) adenosine or mGlu3 metabotropic glutamate receptors enhances the release of nerve growth factor and S100β protein from cultured astrocytes. Glia 1999;27:275-81. [18] Whitaker-Azmitia PM, Murphy R, Azmitia EC. Stimulation of astroglial 5-HT1A receptors releases the serotoninergic growth factor, protein S-100 and alters astroglial morphology. Brain Res 1990;528:155-8. [19] Rost NS, Wolf PA, Kase CS, et al. Plasma Concentration of C-Reactive Protein and Risk of Ischemic Stroke and Transient Ischemic Attack. The Framingham Study, Stroke 2001;32:2575-9.
152
[20] Molnar T, Papp V, Szereday L, et al. Relationship between C-reactive protein and early activation of leukocytes indicated by leukocyte antisedimentation rate (LAR) in patients with acute cerebrovascular events. Clin Hemorheol and Microcirc 2009, in press [21] Kurth T, Schürks M, Logroscino G et al. Migraine, vascular risk, and cardiovascular events in women: prospective cohort study. BMJ 2008;337:a636. [22] Sherifa AH. The vascular risk associations with migraine: Relation to migraine susceptibility and progression. Atherosclerosis 2009;205:15-22. [23] Teepker M, Munk K, Mylius V, et al. Serum Concentrations of S100b and NSE in migraine. Headache 2009;49:245-52. [24] Ho KT, Miller TD, Christian TF, Hodge DO, Gibbons RJ. Prediction of severe coronary artery disease and long-term outcome in patients undergoing vasodilator SPECT. J Nucl Cardiol 2001;8:438-44. [25] Chollet F, Celsis P, Clanet M, et al. SPECT study of cerebral blood flow reactivity after acetazolamide in patients with transient ischaemic attacks. Stroke 1989;20:458-464. [26] Hansson GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med 2005;352:1685–95. [27] Napoli C, Lerman OL, de Nigris F et al. Rethinking Primary Prevention of Atherosclerosis-Related Diseases. Circulation 2006;114:2517-27. [28] Whiting JH Jr, Datz FL, Gabor FV, et al. Dipyridamole Testing in Cerebrovascular Patients (letter). J Nucl Med 1993;34:1389-90. [29] Whiting JH Jr, Datz FL, Gabor FV, et al. Cerebrovascular accident associated with dipyridamole thallium-201 myocardial imaging: case report. J Nucl Med 1993;34:128-30.
153
Table 1 Demographic and baseline biomarker data in stroke, TIA and CAD patients with or without DP-induced transient neurological signs (TNS) Stroke
TIA
CAD
CAD
Healthy
with TNS
without TNS
controls
n=38
n=11
n=14
n=35
n=34
70 (67-74)
59 (49-68)
55 (51-60)
55 (52-58)
58 (55-61)
18/20
7/4
3/11
21/14
23/11
Smoking
6 (16%)
3 (27%)
2 (14%)
7 (20%)
0
Hypertension
24 (63%)
7 (63%)
12 (86%)
25 (71%)
0
Hyperlipidemia
10 (26%)
2 (18%)
6 (43%)
14 (40%)
0
Diabetes
7 (18%)
2 (18%)
1 (7%)
8 (22%)
0
1.7 (0.5-5.3)
1.4 (0.7-3.2)
2.6 (1.1-3.3) NA
Age (yrs) Gender (M/F)
hsCRP S100B
NSE
4.4 (2.8-8.8) 3.5 (1.9-5.2) 0.10
0.10
0.07
0.04
(0.06-0 .22)
(0.06-0.14)
(0.03-0.08)
(0-0.09)
NA
NA
10.4 (7.5-22.3)
11.4 (5.9-28)
NA
TIA: transient ischemic attack, CAD: coronary artery disease, TNS: transient neurological signs hsCRP: high-sensitivity C-reactive protein, NA: not applicable, NSE: neuron specific enolase Except age (Student-t probe, mean and 95% confidence interval) and gender ( 2 test), statistical analysis was performed by Mann-Withney U test (median, interquartile range).
154
Table 2 Patients with coronary artery disease stressed by dipyridamole (DP) resulting in transient neurological signs (TNS) and/or elevated S100B levels Patient
TNS provoked by DP stress
(age, y)
S100B ng/ml baseline
at T60
0.0
0.0
Transient neurological signs (TNS) only 1 (72)
rotatory nytagmus, hypalgesia and dysmetria (right side)
2 (59)
hypalgesia, reflex asymmetry (right side)
0.0
0.06
3 (48)
hypalgesia, positive pronation test (right side)
0.07
0.02
4 (57)
dysmetria (left side)
0.0
0.04
5 (50)
hypalgesia (left side)
0.03
0.03
Elevated S100B only (>0.12 ng/ml) 6 (48)
no symptoms/signs
0.01
0.65
7 (70)
no symptoms/signs
0.08
0.15
8 (69)
no symptoms/signs
0.03
0.47
TNS and S100B elevation (>0.12 ng/ml) 9 (54)
hypalgesia, positive pronation test (left side)
0.05
0.14
10 (55)
hypalgesia (left side)
0.07
0.41
11 (57)
positive pronation test, hypalgesia (bilateral)
0.08
0.25
12 (52)
nystagmus, vertigo, left facial and contralateral
0.07
0.16
brachial hypalgesia 13 (65)
positive pronation test, hypalgesia (right side)
0.10
0.26
14 (45)
positive pronation test, hypalgesia (bilateral)
0.08
0.42
15 (50)
hypalgaesia, positive pronation test (right side)
0.08
0.19
155
16 (53)
hypalgaesia (right side)
0.04
0.20
17 (60)
positive pronation test, hypalgesia (bilateral)
0.0
0.13
TNS: transient neurological signs, DP: dipyridamole Table 3 Frequency of new ischemic events (TIA or stroke) within 7 years in patients with DPinduced S100B elevation and transient neurological signs (TNS)
DP-induced TNS
Follow-up data available
TIA or stroke in 7 years, %
p
12
67%
0.05
30
33%
NS
16
75%
0.001
26
23%
NS
(n=14) No TNS (n=35) S100B>0.11 ng/ml at T60 (n=16) S100B<0.11 ng/ml at T60 (n=33)
DP-induced TNS: dipyridamole induced transient neurological signs, S100B at T60: S100B protein measured 60 minutes after dipyridamole stress, NS: not significant Statistical analysis was performed by chi-square test.
156
Table 4 Clinical and biomarker data predicting ischemic cerebrovascular events within 7 years
DP-induced TNS (n=14)
OR (95% CI)
p
0.6 (0.07-6.5)
0.725
70.1 (1.5-3372)
0.03
No TNS (n=35) S100B>0.11 ng/ml at T60 (n=16) S100B<0.11 ng/ml at T60 (n=33)
OR: odds ratio, 95% CI: 95% confidence interval, DP-induced TNS: dipyridamole induced transient neurological signs, S100B at T60: S100B protein measured 60 minutes after dipyridamole stress Statistical analysis was performed by multiple logistic regression analysis, adjusted for comorbidities and confounding factors
157
FIGURE LEGENDS
Figure 1 Biomarkers in acute cerebrovascular events and during DP-induced transient neurological signs (TNS) A. Comparison of peak S100B in acute cerebrovasculare events (stroke, TIA) and coronary artery disease (CAD) with and without dipyridamole (DP) induced TNS. The box-plot diagram demonstrates the comparison of peak serum S100B in the early phase (in 26 hours after onset) of stroke, spontaneous TIA and coronary artery disease (CAD) with and without dipyridamole (DP) induced TNS (1 hour after stress). (Mann-Whitney U test, median, interquartile ranges). B. Comparison of basal hsCRP in acute cerebrovasculare events (stroke, TIA) and coronary artery disease (CAD) with and without dipyridamole (DP) induced TNS. The box-plot diagram demonstrates the comparison of basal high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP) on admission of patients with either stroke or TIA and prior to DP test in coronary artery disease (CAD) with and without dipyridamole (DP) induced TNS. (Mann-Whitney U test, median, interquartile ranges).
158
A
0.6
p<0.001
S100B (ng/ml)
p=0.009
0.4
p=0.005
0.2
0 stroke TIA
B
20
CAD TNS
CAD
p<0.001
hsCRP (mg/l)
p=0.002
p=0.049 10
0 stroke TIA
CAD TNS
159
CAD
Paper 7 Increased levels of baseline biomarkers reflecting platelet and endothelial activation predict early cognitive dysfunction after lung surgery Tihamer Molnar1, Laszlo Jakab2, Laszlo Palinkas3, Tamas F. Molnar2, Lajos Bogar1, Zsolt Illes4 1
Department of Anaesthesiology and Intensive Care, University of Pecs, Pecs, Hungary 2 3
Department of Surgery, University of Pecs, Pecs, Hungary
Department of Immunology and Biotechnology, University of Pecs, Pecs, Hungary 4
Department of Neurology, University of Pecs, Pecs, Hungary
EDITOR: The reported high incidence of short term postoperative cognitive dysfunction (POCD) (33-83%) after cardiac surgery is mainly related to cardio-pulmonary bypass resulting in a significant impact on postoperative care, prolonged hospitalization and high costs [1]. Offpump coronary artery bypass graft (CABG) surgery reduces the inflammatory response and the perioperative release of neuronal damage markers [1]. POCD is also frequent and potentially serious after elective lung surgery, where deleterious effect of pump is excluded [2]. The goal of this study was to examine biomarkers reflecting immuno-endothelial dysfunctions, which could be related to ischemia and neurocognitive alterations, in the early recognition of POCD after lung surgery: soluble P-selectin (sP-selectin), soluble vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), soluble CD40 ligand (sCD40L), tissue plasminogen activator (tPA), interleukin-6 (IL-6), interleukin8 (IL-8) (all with Human Cardiovascular 6plex - FlowCytomix Multiplex, BenderMed Systems, Vienna, Austria), S100B (LIA-mat Sangtec 100, Sangtec Medical, Bromma, Sweden) and high-sensitivity C-reactive protein (hsCRP) (BRAHMS Kryptor, Hennigsdorf, Germany). Ethics Committee approval was obtained and all patients gave written informed consent. We investigated 35 patients (mean age: 60±11 yr, 27 male) with non-small cell lung cancer (NSCLC), who underwent elective lung surgery (22 lobectomy, 5 pneumonectomy, 8 sublobar resection). All patients received combined intraoperative thoracic epidural/general anesthesia and epidural plus intravenous opioid analgesia postoperatively. Inclusion criteria were age above 18 yr, ASA physical status I-III. Exclusion criteria were any neuro-psychiatric event in the past medical history, pre-existing cognitive dysfunction (defined as MMSE score
160
below 24), and certain types of neoplasm resulting per se elevation in serum level of S100B (e.g. malignant melanoma). None of the recruited patients were treated with neuro-psychiatric drugs
prior
to
surgery
(benzodiazepines,
antidepressants,
antipsychotics).
Serum
concentrations of sP-selectin, sVCAM-1, MCP-1, sCD40L, tPA, IL-6, IL-8, S100B, and hsCRP were measured preoperatively and on the second postoperative day (48 hours); hsCRP was also measured 72 hours after surgery. Early neurocognitive deficit was assessed on admission as baseline mini-mental status examination (MMSE0) and on the second postoperative day (MMSE48). POCD was defined as a decrease in MMSE score >3 points from baseline [3]. Nine patients had POCD within 48 hours (25.7 %). Demographic data (age, gender or alcohol abuse in the history) or surgical procedures (type of resection, duration of surgery) were not different comparing patients with or without postoperative POCD. Baseline scores of MMSE showed no significant difference in patients with or without POCD, however MMSE48 was significantly lower in patients with POCD (mean: 23.3, 95% CI: 21.6-25.0 vs. 27.8, 27.2-28.4, p<0.001). Similarly, the decline (%) between MMSE0 and MMSE48 was significantly higher in the POCD group (mean: 14.7, 95% CI: 11.9-17.5 vs. 3.2, 1.9-4.5, p<0.001 independent sample t-test). Biomarkers of platelet activation: Soluble CD40L can be released on platelet activation [4]. Levels of sCD40L were significantly elevated in patients with POCD both preand postoperatively (p=0.007, p=0.010 respectively, Mann-Whitney U test). Concentration of sP-selectin measured preoperatively was significantly higher in patients with POCD (p=0.017) and remained significantly higher (p=0.016) on the second postoperative day. These data indicate increased platelet activation prior to surgery resulting in recruitment of leukocytes in patients with POCD. In addition, activation of platelets was permanent in these patients indicated by elevation of both sCD40L and sP-selectin pre- and post-operatively, presumably due to extended tissue damage related to surgery. Biomarkers of endothelium activation: The adhesin sVCAM-1 measured preoperatively was significantly higher (p=0.034) in patients with POCD indicating an increased endothelial activation prior to surgery resulting in recruitment of leukocytes. Similarly, MCP-1 was significantly higher both pre- and postoperatively (p=0.008, p=0.012 respectively, Mann-Whitney U test) in patients with POCD reflecting the activation of its potential source (eg. endothelium, monocytes). MCP-1 modulates the expression of endothelial adhesion molecules and leukocyte integrins as well as cytokine production during CNS inflammation. Moreover, MCP-1 regulates brain endothelial permeability by altering tight junction (TJ) proteins [5]. Indeed, we found a significant positive correlation between 161
MCP-1 and S100B protein in patients with POCD 48 hours postoperatively (Spearman correlation coefficient: 0.717, p=0.030) indicating that MCP-1 may also be responsible for opening the blood-brain barrier in these patients. Acute phase reactants: Plasma IL-6 levels were not different in patients with or without POCD. Postoperative fever reflecting SIRS was not associated with POCD either. Similarly, preoperatively elevated plasma hsCRP did not predict POCD after lung surgery in this cohort. There was no correlation between plasma hsCRP and IL-6 levels at any time point in this cohort, although CRP was previously reported to be induced by IL-6 [6]. In summary, we show that molecules reflecting platelet and endothelium activation (sCD40L, sP-selectin, sVCAM-1, MCP-1) were increased preoperatively in patients developing POCD and remained elevated at least for 48 hours after lung surgery. We may hypothesize that the endothelium and platelets are more sensitive to immunological responses against tumors in a subpopulation of patients and become activated. Such pre-operative activation of platelets and endothelium can result in an increased activation/transmigration of leukocytes, disruption of blood-brain barrier and can also participate in brain ischemia resulting in POCD [7]. In addition, these molecules may be used as potential biomarkers predicting susceptibility for POCD before major surgeries. Patients known to be at such an increased risk preoperatively may benefit from closer monitoring and earlier medical intervention or being offered non-surgical oncological treatment if the operative risk is considered to be unacceptable.
ACKNOWLEDGEMENT This study was supported by a grant from the Hungarian Research Fund (ETT 50053-2006) and the Bolyai Janos Foundation of the Hungarian Academy of Sciences to Z. Illes. COMPETING INTERESTS STATEMENT The authors declare that they have no competing financial interests.
REFERENCES: 1. Mazzone A, Gianetti J, Picano E et al. Correlation between inflammatory response and markers of neuronal damage in coronary revascularization with and without cardiopulmonary bypass. Perfusion 2003; 18: 3-8. 2. Marcantonio ER, Goldman L, Mangione CM et al. A clinical prediction rule for delirium after elective non-cardiac surgery. JAMA 1994; 271: 134–139.
162
3. Hong SW, Shim JK, Choi YS et al. Prediction of cognitive dysfunction and patients’ outcome following valvular heart surgery and the role of cerebral oximetry. Eur J Cardiothorac Surg 2008; 33: 560-565. 4. Heeschen C, Dimmeler S, Hamm CW et al. Soluble CD40 Ligand in Acute Coronary Syndromes. N Engl J Med 2003; 348: 2575-2577. 5. Stamatovic SM, Shakui P, Keep RF et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability. J Cereb Blood Flow Metab 2005; 25: 593-606. 6. Pepys M, Hirschfield MG. C-reactive protein: a critical update. Clin Invest 2003; 111: 1805-1812. 7. Rasmussen LS, Moller JT. Central nervous system dysfunction after anesthesia in the geriatric patient. Anesthesiol Clin North Am 2000; 18, 59-70.
163
Table. Investigated biomarkers in patients with POCD BIOMARKER
WITHOUT POCD
WITH POCD
p
S100B0 (ng/ml)
0.24 (0.10-0.33)
0.15 (0.12-0.19)
0.542
S100B48
0.35 (0.12-0.52)
0.39 (0.10-0.56)
0.931
CD40L0 (pg/ml)
6338 (482-15354)
16897 (13631-19711)
0.007
CD40L48
1469 (672-3524)
10054 (4332-14971)
0.010
sP-selectin0 (ng/ml)
115 (52-995)
1498 (738-1889)
0.017
sP-selectin48
93 (51-731)
1194 (757-1654)
0.016
t-PA0 (pg/ml)
3129 (1904-4389)
3602 (2869-4521)
0.275
t-PA48
4334 (2717-5602)
3689 (3230-5359)
0.701
sV-CAM10 (ng/ml)
300 (84-979)
953 (804-1110)
0.034
sV-CAM148
482 (87-1004)
853 (780-1030)
0.069
IL-60 (pg/ml)
0
0 (0-3.12)
0.229
IL-648
17.5 (1.75-54.0)
20.1 (0-31.1)
0.502
IL-80 (pg/ml)
54.0 (6.4-101.2)
12.5 (0-30.0)
0.143
IL-848
45.8 (2.8-92.2)
3.6 (0-16.5)
0.102
MCP-10 (pg/ml)
203.1 (109.9-490.9)
571.6 (542.6-708.2)
0.008
MCP-148
349.2 (125.2-577.8)
563.4 (517.7-770.1)
0.012
hsCRP0 (mg/L)
1.5 (1.3-9.9)
7.8 (1.4-38.2)
0.283
hsCRP48
5.1 (1.1-11.5)
13.1 (2.9-36.4)
0.233
hsCRP72
216.2 (176.1-219.1)
128.3 (101.4-184.9)
0.655
Data are shown at baseline before surgery („0”) and 48 hours after surgery („48”). POCD: postoperative cognitive dysfunction, sCD40L: soluble CD40 ligand, sP-selectin: soluble P-selectin, t-PA: tissue plasminogen activator, sVCAM-1: soluble vascular cell adhesion molecule, MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1, IL-6: interleukin-6, IL-8: interleukin-8, hsCRP: high-sensitivity C-reactive protein. Mann-Whitney U test: median, interquartil range (25-75 percentiles)
164
Paper 8
A szérum S100β és procalcitonin szint prognosztikai jelentősége újraélesztett betegeknél Prognostic role of serum S100β and procalcitonin in patients after cardio-pulmonary resuscitation Molnár T., Kőszegi T.1, Szakmány T. és Bogár L. Aneszteziológiai és Intenzív Terápiás Intézet, Klinikai Kémiai Intézet 1 Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Pécs
Bevezetés: Reanimáción átesett betegekben az S100ß prediktív értéke a neurológiai prognózis tekintetében az irodalomban már jól dokumentált. A procalcitonin (PCT) nem gyulladással, hanem agyi sejtsérüléssel összefüggő változása azonban új lehetőségekkel kecsegtet. Vizsgálatainkkal összefüggéseket kerestünk a szérum S100ß és PCT értékek és a sikeres újraélesztésen átesett betegek túlélése között. Betegek, módszer: Tanulmányunkba cardiopulmonalis reszuszcitáción átesett betegeket vontunk
be,
akik
rutin
posztreszuszcitációs
kezelésben
részesültek.
Neurológiai
státuszfelmérés ill. sorozatos vérmintavétel történt a betegek intenzív osztályos felvételekor (t0 ), 24 óra (t
24h)
ill. 72 óra múlva (t 72h ). Centrifugálás után a savókat fagyasztva tároltuk,
majd később S100ß és PCT méréseket végeztünk. Statisztikai analízishez Mann-Whitney Utesztet és Spearman-féle korrelációs analízist használtunk. Adatainkat, mint medián (interkvartilis-tartomány) közöljük. Eredmények: Vizsgálatainkba 20 beteget [9 túlélő (T), 11 nem-túlélő (NT)] vontunk be (életkor: 61 (43-73) év), akik „lege artis” cardiopulmonalis reanimáción estek át. Osztályos felvételkor GCS≤8 volt minden esetben. A szérum S100 β értékek a felvételkor következők voltak: T=1,19 (0,54-2,18); NT=3,97 (0,41-8,04) p=0,06. A szérum PCT szintek az ITO felvételkor: T=0,15 (0,08-16,37); NT=0,1 (0,09-6,41) p=0,71. Szignifikáns negatív korrelációt találtunk a t 24 időpontban vett szérum PCT értékek és az anoxia idő között, r=-0,80, p<0,01. Megbeszélés: A reanimáción átesett betegeknél nem találtunk szignifikáns különbséget a túlélők és nem-túlélők között a szérum S100β és PCT értékek tekintetében. Annak eldöntésére, hogy az általunk vizsgált markereknek, milyen prognosztikai jelentősége van a reanimációt követően, a tanulmány befejezésére van szükség a tervezett esetszámon. Kulcsszavak: S100β, procalcitonin, cardio-pulmonalis reanimáció
165
Introduction: The prognostic value of
S100β considering the neurological outcome in
patients after cardio-pulmonary resuscitation (CPR) is already well documented. The nonSIRS related changes in PCT levels indicating brain cell damage can provide new possibilities. The aim of this pilot study was to reveal any difference between survivals and non-survivals in serum S100β and PCT levels after CPR. Method: Both in and out-of-hospital resuscitated patients were included into the study. CPR and postresuscitation treatment were carried out according to the ERC ALS protocol. Physical neurological examination was performed and a series of blood samples were taken on admission to the ICU (t 0), after 24 hrs (t 24) and 72 hrs (t 72), respectively. After separation in the centrifuge the plasma was stored frozen and later S100β and PCT measurements were performed. For statistical analysis Mann-Whitney U test and Spearman’s rho test were used. Data are presented as median and (interquartile range). Results: 20 patients (9 survivors: T, 11 non-survivers: NT) of the age 61 (43-73) years were examined. On admission to the ICU each patient had a GCS less than 8. The serum S100β level (in ng/ml) was 1.19(0.54-2.18) in survivals (T) and 3.97 (0.41-8.04) in non-survivals (NT) at t0 (p=0.06), the PCT serum level (in ng/ml) was 0.15 (0.08-16.37) in survivers (T) and 0.1 (0.09-6.41) in non-survivers (NT) at t0 (p=0.71). Significant negative correlation was found between the PCT levels measured at t 24 and the time of anoxia, r=-0.80, p<0.01. Conclusion: Comparing the two groups ( survivors vs. non-survivers), significant difference was not found between them, neither in the S100β levels, nor in the PCT levels at t0 . To decide whether these biomarkers have any impact on the prognosis of patients after CPR, we have to expand the study on larger numbers of patients. Key words: S100β, procalcitonin, cardio-pulmonary resuscitation
Bevezetés A cardio-pulmonalis resuscitatio (CPR) végső sikerét a neurológiai funkciók visszatérése határozza meg (1). A keringés nélküli állapot, globális agyi hypoxiát eredményez, mely előre fel nem mérhető központi idegrendszeri Következményei
az
enyhe
neuro-psychiátriai
zavaroktól,
a
sejtsérülést okoz. súlyos
irreverzibilis
agykárosodásig (agyhalál) terjedhet. Az irreverzibilitás kimondása, a post-resuscitatios kezelési stratégia megválasztásában döntő lehet, azonban számos etikai kérdést (2) is felvet. Míg a túl pesszimista prognózis az életmentő/támogató beavatkozásoktól fosztaná meg a betegeket, addig a túl optimista jóslatok fölösleges és drága terápiás lépések indikációját eredményeznék (3). Ezért az agyi sejtsérülés mértékének korai becslésére alkalmas 166
módszereket kerestek (kiváltott válasz, képalkotó diagnosztika és biokémiai markerek)(4, 5, 6, 7), melyek még comatosus ill. szedált betegen is elvégezhetőek. A felsoroltak közül az első ma még nehezen hozzáférhető intenzív osztályokon és nagy szakértelmet kíván, a második mivel morfológiai eltéréseket képes csak verifikálni, ezért korlátozott értékű és csak pillanatnyi információt ad, ráadásul mindig beteg-transzporttal jár, ami felesleges rizikót is jelenthet. Ellenben a biokémiai markerek vizsgálata egyszerűen elvégezhető, az amúgy is levett vérmintákból. Ha kellő specificitással és szenzitivitással rendelkező marker mérésére képesek vagyunk, akkor viszonylag egyszerűen és olcsón jutunk információhoz, különösen tekintettel a dinamikára, amennyiben sorozat mintavétel történik. Ez utóbbi kritériumoknak megfelel az S100ß protein (8), melynek irodalma az utóbbi években dinamikusan növekszik. Jellemzői: astroglia specifikus, liquorból és szérumból meghatározható (LIASON Sangtec 100), rövid felezési idejű Ca-kötő protein.
Számos
tanulmány igazolta specificitását globalis agyi hypoxia esetén (9,10,11). Egy friss tanulmány pedig az S100 proteint, mint a vér-agy gát (VAG) sérülés érzékeny markerét referálja (12), melynek megjelenése a szisztémás keringésben nem feltétlenül jelent definitív központi idegrendszeri sejtsérülést. Ez utóbbi hipotézist saját kutatásunk is alátámasztja, mert humán vonatkozásban sikerült bizonyítani, hogy gyógyszer indukálta TIA-ban is van S100ß emelkedés a szérumban, itt pedig biztosan nincs agyi sejtsérülés. A másik általunk vizsgált biokémiai marker, a szérum procalcitonin (PCT), mely nagy specificitással jelzi a szisztémás bakteriális fertőzést, valamint megfelelő indikátora a szepszis és a többszervi elégtelenség súlyosságának (13, 14, 15). Mind differenciáldiagnosztikai, mind a monitorozás, mind pedig a prognózis szempontjából jelentős, klinikai haszna jól dokumentált. Szérumszintjének emelkedése nem gyulladásos okból, például központi idegrendszeri sejtsérülés alkalmából, viszonylag új lehetőségekkel kecsegtet (16). Az ún. poszt-reszuszcitációs betegségben ismeretes a plazma citokinek szintjének változása (17). Ezek közül némelyikről tudjuk, hogy PCT szintézist indukál (in vitro és in vivo: TNFα, IL-2, in vitro: IL-6, IL-1ß).
Módszer Vizsgálatainkat az érvényes etikai bizottsági engedély beszerzése után a Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Karának Aneszteziológiai és Intenzív Terápiás Intézetében végeztük. Tanulmányunkba mindazokat a kórházban vagy kórházon kívül sikeresen újraélesztett betegeket bevontuk, akiknél bizonyíthatóan keringés nélküli állapot (asystolia, kamrafibrilláció vagy elektro-mechanikus disszociáció) állt fenn. A 167
reanimációról jegyzőkönyv készült, melyben a keringésleállás, az újraélesztés megkezdésének és a spontán keringés visszatérésének idejét, valamint a betegadatokat és a gyógyszerelést rögzítettük írásban. A betegek hozzátartozóit a tanulmánnyal kapcsolatos tudnivalókról tájékoztattuk. A betegek postreszuszcitációs kezelésének sarokköve a megfelelő perfúziós nyomás fenntartása és az adekvát oxigenizáció biztosítása volt. Amennyiben bakteriális gyulladás verifikálható volt, abban az esetben a beteget a tanulmányból kizártuk. Neurológiai státusz felmérés ill. sorozatos vérmintavétel történt a betegek intenzív osztályos felvételekor (t0 ), 24 óra (t
24h)
ill. 72 óra múlva (t
72h
). Centrifugálás után a savókat fagyasztva tároltuk, majd
később S100ß és PCT méréseket végeztünk. Statisztikai analízishez Mann-Whitney U- tesztet és Spearman-féle korrelációs analízist használtunk. Adatainkat, mint medián (interkvartilistartomány) közöljük. A statisztikai analízist az SPSS 11.5 for Windows (SPSS Inc., Illinois, USA) programmal végeztük.
Eredmények Vizsgálatainkba 20 beteget [9 túlélő (T), 11 nem-túlélő (NT)] vontunk be (életkor: 61 (43-73) év), akik „lege artis” cardiopulmonalis reanimáción estek át. Osztályos felvételkor GCS≤8 volt minden esetben. A szérum S100 β értékek a felvételkor következők voltak: T=1,19 (0,54-2,18); NT=3,97 (0,41-8,04) p=0,06. (1. ábra) A szérum PCT szintek az ITO felvételkor: T=0,15 (0,08-16,37); NT=0,1 (0,09-6,41) p=0,71. A reanimációkor ismerten szeptikus sokkban szenvedő betegeket, akinél a PCT szint alapesetben magas volt kizártuk a további korrelációs számításokból. Megvizsgáltuk, hogy van-e összefüggés az anoxia, a spontán keringés visszatérésének ideje és az általunk vizsgált biokémiai paraméterek szintje között. Adatainkat így elemezve azt találtuk, hogy a 24. órában mért PCT szint és az anoxia ideje között szignifikáns negatív korreláció állt fenn r= -0,800, p=0,005 (2. ábra).
Következtetések A reanimáción átesett betegeknél nem találtunk szignifikáns különbséget a 24 órát túlélők és nem-túlélők között a szérum S100β és PCT értékek tekintetében. Az irodalmi adatokkal összhangban azonban azt találtuk, hogy a nem-túlélő csoportban magasabb az S100β szintje közvetlenül a reanimációt követően. A kis esetszám miatt szignifikáns különbséget kimutatni még nem tudtunk, azonban a tendencia már észlelhető (16). Érdekes észlelésünk, hogy a reanimációt követő 24. órában mért szérum PCT szint és az anoxia ideje között szignifikáns negatív korreláció áll fenn. Tudomásunk szerint erre vonatkozóan irodalmi 168
adat nem áll rendelkezésre, azonban feltételezhető, hogy az akut fázis fehérje tulajdonságainak megfelelően, ennél a betegcsoportnál is a korábban leírt kinetikát mutatja, azaz az inzultust követő 24. órában éri el csúcspontját a szérumban (18). Mivel a PCT termelődése több foszforilációs kaszkádon keresztül történő energiaigényes folyamat, feltételezhető, hogy a hosszabb anoxia idő az ATP raktárak depléciója révén csökkentheti ezen fehérjék képződését is. Természetesen a pontos molekuláris mechanizmusok megismeréséhez további vizsgálatok szükségesek. Meg kell említenünk azonban, hogy a kis mintaméret miatt, sem a 48 órás, sem a 72 órás adatokat még nem elemeztük ill. a hosszútávú túlélés és a reziduális neurológiai károsodás (Glasgow Outcome Score, GOS) tekintetében is további adatgyűjtés szükséges. Annak eldöntésére, hogy az általunk vizsgált markereknek, milyen prognosztikai jelentősége van a reanimációt követően, a tanulmány befejezésére van szükség a tervezett esetszámon.
Irodalom: 1. Grubb N.R.: Managing out-of-hospital cardiac arrest survivors: 1.Neurological perspective. Heart, 2001, 85(1):6-8 2. Martens P. és mtsai.: Limitation of life support after resuscitation from cardiac arrest: practice in Belgium and Austria. Resuscitation. 1997, 35:123-128 3. Jacobs P., Noseworthy TW. és mtsai: National estimates of intensive care utilization and costs: Canada and the United States. Crit Care Med., 1990, 18:1282-1286. 4. Levy DE és mtsai:: Prognosis in nontraumatic coma. Ann Intern Med.1981, 94:293-301. 5. Longstreth WT Jr. és mtsai: Prediction of awakening after out-of-hospital cardiac arrest. N Engl J Med. 1983, 308:1378-1382 6. Levy DE és mtsai: Predicting outcome from hypoxic-ischemic coma. JAMA. 1985, 253:1420-1426 7. Fogel W és mtsai: Serum neuron specific enolase as early predictor of outcome after cardiac arrest. Crit Care Med 1997, 25:1133-8 8. Rosen H és mtsai: Increased serum levels of the S-100 protein are associated with hypoxic brain damage after cardiac arrest. Stroke 1998, 29:473-7 9. Martens P, Raabe A, Johnsson P. és mtsai: Serum S100 and neuron specific enolase for prediction of regaining consciousness after global cerebral ischemia. Stroke 1998, 29:2363-6. 10. Rosen H, Rosengren L, Herlitz J. és mtsai: Increased serum levels of the S100 protein associated with hypoxic brain damage after cardiac arrest. Stroke 1998, 29:473-7. 169
11. Böttiger BW, Möbes S, Glatzer R, és mtsai: Astroglia protein S100 is an early and sensitive marker of hypoxic brain damage and outcome after cardiac arrest in humans. Circulation 2001, 103:2694-8. 12. Kapural M, Krizanac-Bengez L, Barnett G és mtsai: Serum S-100B as a possible marker of blood-brain barrier disruption. Brain Research , 2002, 940:102-104. 13. Assicot M, Gendrel D, Carsin H és mtsai: High serum procalcitonin concentration in patients with sepsis and infection. Lancet 1993, 341: 515-8 14. Karzai W, Oberhoffer M, Meier-Hellmann A és mtsai: Procalcitonin – a new indicator for the systemic response to severe infections. Infection 1997, 25:329-34 15. Oberhoffer M, Karzai W, Meier-Hellmann A és mtsai: Sensitivity and specificity of various markers of inflammation for the prediction of TNFα and IL-6 in patients with sepsis. Crit Care Med 1992, 27:1814-18 16. Fries M, Kunz D, Gressner A és mtsai: Procalcitonin serum levels after out-of-hospital cardia arrest. Resuscitation 2003, 59:105-9 17. Adrie C, Adib-Conquy M, Laurent I, ás mtsai: Successful cardiopulmonary resuscitation after cardia arrest as a sepsis-like syndrome. Circulation 2002, 106:562-8 18. Molnar Zs, Szakmany T, Koszegi T,és mtsai: Microalbuminuria and serum procalcitonin levels following oesophagectomies Eur J Anaesth 2000; 17:464-465
170
S100 béta (ng/ml)
15
10
5
0 Nem-túlélők
Túlélők
1.ábra. Szérum S100β értékek a t 0 időpontban a két betegcsoportban. (medián, interkvartilis értékek és tartomány) 70
60
PCT (ng/ml)
50
40
30
20
10
0 0
2
4
6
8
10
12
Anoxia ideje (perc)
2.ábra. A szérum PCT értékek a t
24
időpontban, az anoxia idejének függvényében. (lineáris
regresszió és 95%-os konfidenciatartomány)
171
Paper 9
NT- proBNP: a szeptikus komplikáció korai markere újraélesztett betegekben NT-proBNP as early marker of septic complications in patients after cardio-pulmonary resuscitation Molnár T1, Kőszegi T2, Bogár L1, Szakmány T3 Aneszteziológiai és Intenzív Terápiás Intézet1, Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Pécs Labormedicina Intézet2, Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Pécs Royal Glamorgan Hospital/Prince Charles Hospital, Bristol, UK3 Első (levelező) szerző: Dr. Molnár Tihamér Aneszteziológiai és Intenzív Terápiás Intézet Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar Tel.: +36 72 536 440, Fax.: +36 72 536 441, E-mail:
[email protected] Cím: 7624, Pécs, Ifjuság u.13. Szerzők: Dr. Kőszegi Tamás, Ph.D. Labormedicina Intézet Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar Dr. Bogár Lajos, Ph.D. Aneszteziológiai és Intenzív Terápiás Intézet Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar Dr. Szakmány Tamás, Ph.D. Consultant in Anaesthesia and Intensive Care Cwm Taf NHS Trust, Royal Glamorgan Hospital/Prince Charles Hospital, UK
Összefoglalás: Kritikus állapotú betegekben a nátriuretikus peptid a kardiális diszfunkció és a halálozás prediktora. Cardio-pulmonális reszuszcitációt követően a szeptikus jelek monitorozása
a
globális
agyi
hypoxia
indukálta
immunológiai
alterációk
miatt
differenciáldiagnosztikai problémát vet fel. Tanulmányunkban a nátriuretikus peptid Nterminális
prohormonja
(NT-proBNP) és
a
172
procalcitonin
(PCT)
szérumszintjének
összefüggéseit vizsgáltuk sikeres, kórházon belüli újraélesztést követően a szeptikus komplikációk szempontjából. Módszer: Összesen 35 beteget vontunk be a prospektív leíró tanulmányunkba. Valamennyien a sikeres újraélesztés után intenzív osztályra kerültek. A szepszist az ACCP/SCCM konszenzuskonferencia kritériumai alapján diagnosztizáltuk. Sorozatos PCT- és NT-proBNP-mérések az intenzív osztályos felvételkor (T0), 24 (T24) illetve 72 óra múlva (T72) történtek. Eredmények: A keringésmegállás megoszlása: 25 asystolia/pulzus nélküli elektromos tevékenység (ASYS/PEA) és 10 kamrafibrilláció (VF). Az ASYS/PEA csoportban 7 esetben alakult ki szeptikus (S) komplikáció. A szeptikus betegekben mind a PCT, mind az NT-proBNP szérumszintje szignifikáns magasabb volt a T0 időpontban, de a két marker között szignifikáns korrelációt nem találtunk. Habár az NTproBNP szérumszintje a VF csoportban magasabb volt mint a nemzetközi irodalomban megadott normál tartomány, az ASYS/PEA alcsoportokban (S, NS) mért értéktől nem különbözött szignifikáns mértékben. A magas 72 órán belüli mortalitás (összmortalitás: 22/35, ASYS/PEA: 20/25, VF: 2/10) miatt a 24 ill. 72 órás biomarker értékek nem voltak összehasonlíthatók az egyes alcsoportokban. Következtetés: Reanimált betegekben az NTproBNP emelkedése összefügg a kezdeti ritmussal (PEA/VF). A VF csoportban az emelkedett NT-proBNP-szint a kamrafibrillációt általában megelőző súlyos szívizom-iszkémiával magyarázható, míg a szeptikus csoportban az NT-proBNP a procalcitoninhoz hasonlóan viselkedett. Kulcsszavak: asystolia, pulzus nélküli elektromos aktivitás, kamrafibrilláció, szepszis, procalcitonin, NT- proBNP Importance of NT-proBNP in patients after cardio-pulmonary resuscitation Aim: Increased plasma levels of natriuretic peptide hormones have been identified as predictors of cardiac dysfunction and death in many critical care settings. To date no studies were addressed to investigate the relationship between N-terminal prohormone of brain derived natriuretic protein (NT-proBNP) and procalcitonin (PCT) in the serum of patients sucessfuly resuscitated after in-hospital cardiac arrest with or without concomitant infection or sepsis. Materials and methods: A total of 35 patients suffering from cardiac arrest were selected for this study. All patients were resuscitated according to the 2002 guidline of the European Resuscitation Council and thereafter admitted to our ICU. Patients with sepsis were selected based on the criteria of the ACCP/SCCM consensus conference. PCT and NTproBNP were measured on admission (T0), at 24 hrs (T24) and 72 hrs (T72). Mann-Whitney U test and chi-squar test were used for statistical analysis. Results: Thirty-five patients were included into the study. Twenty-five patients suffered from asystole/pulseless electrical activity (ASYS/PEA) and 10 from ventricular fibrillation (VF). In the ASYS/PEA group 7 173
pateints were septic and 18 non-septic. Among these patients we found significant differences between both the PCT and NT-proBNP serum levels on admission to ICU (T0). Although the NT-proBNP was elevated in the serum of patients with VF compared to the normal range however this elevation was not significant compared to septic or non-septic subgroup of ASYS/PEA patients, either. Conclusions: Our results showed that the increase of NT-proBNP is dependent on the initial rythm in patients after cardio-pulmonary resuscitation. The elevated NT-proBNP level in the serum of patients after VF is not a surprise as severe ischemia is nearly always existing prior to VF. However, in septic patients the post-CPR serum level of NT-proBNP behaves like the inflammatory markers such as PCT. Key words: asystole, pulseless electrical activity, ventricular fibrillation, sepsis, procalcitonin, NT- proBNP Bevezetés A kórházban reanimált betegek prognózisa az újabb ajánlások ellenére nagyon kedvezőtlen. A poszt-reszuszcitációs fázisban az egész szervezetet az iszkémia/reperfúzió szindróma sújtja, mely durva változásokat hoz létre a szervezet immunrendszerében ill. aspecifikus gyulladásos válaszreakciót indít el. Ezek együttes következménye a potenciálisan életveszélyes infekciós szövődmények (1). A szisztémás gyulladásos válaszreakció (SIRS) korai felismerésének jelentősége a súlyos infekciók megelőzésében bizonyított. Az utóbbi években a calcitonin hormon prekurzor molekulája, a procalcitonin (PCT) lett a súlyos infekciók illetve a szeptikus állapot korai felismerésének egy szenzitív biomarkere (2). Kórházon kívüli újraélesztetteket vizsgálva azt találták, hogy a
nem agyi eredetű PCT
ugyanolyan érzékeny volt a neurológiai kimenetel szempontjából, mint az agyi eredetű (astroglia specifikus) S100B protein (3). Fenti adatok alapján a PCT a hypoxiás agykárosodás komplementer markereként használható, mely az agy oxigénhiányos állapotát indirekt módon tükrözi (3). Habár a PCT jobb diagnosztikus értéke a C-reaktív proteinnel szemben szintén bizonyítást nyert a CPR után kialakuló „ventilator associated pneumonia” (VAP) korai felismerésében (4), a szöveti hypoxia okozta SIRS illetve az infekciós komplikációk elkülönítése
érdekében
fokozott
igény
mutatkozik
új
biomarkerek
iránt.
Ezért
tanulmányunkban az agyi eredetű natriureticus peptid prohormonjának (proBNP), Nterminalis szakaszát (NT-proBNP) mértük és hasonlítottuk össze a PCT-vel, sikeres kórházi reanimációt követően. A natriureticus peptidek fontos szerepet játszanak a kardiovaszkuláris homeosztázis fenntartásában és a folyadékháztartás szabályozásában. Különböző etiológiájú kardiális diszfunkció (pangásos szívelégtelenség, miokardiális infarktus, szeptikus sokk) és a fokozott 174
kardiovaszkuláris mortalitás előrejelzésére alkalmasnak találták az emelkedett natriureticus peptidszintet (5-7). A proBNP, a falfeszülés függvényében, a kamrai myocyták által termelődő hormon (8). A keringésben a biológiailag aktív hormon leválasztást nyer a prohormon N-terminális szakaszáról, amit NT-proBNP néven tart számon a nemzetközi irodalom. Élettani szerepe a natriuresis, diuresis, vasodilatáció és aldoszteron antagonista hatás, ezenfelül pedig gátolja az endothelintermelődést, és az érfalban a simaizom proliferációját (9). Irodalmi adatok szerint, szívelégtelenségben a BNP- illetve NT-proBNPvel vezérelt terápia csökkentette a kardiális események számát és a mortalitást (10, 11). Újabb tanulmányok szerint az NT-proBNP korai prognosztikai markere a szívelégtelenségnek szeptikus sokkban (7). Ezért, a fenti marker vizsgálata érdeklődésre tarthat számot a sikeresen újraélesztett betegek szeptikus szövődményeinek monitorozásában. Ismereteink szerint eddig nem vizsgálták az NT-proBNP és PCT közötti kapcsolatot kórházban sikeresen újraélesztett szeptikus és nem szeptikus betegek összehasonlításában.
Anyag és módszer A tanulmány érvényes Etikai Bizottsági engedély birtokában zajlott. Amikor lehetséges volt a reanimáción átesett személy közeli hozzátartozójától írásbeli hozzájárulást kértünk. Összesen 35, kórházban újraélesztett beteget vontunk be a tanulmányba. Minden betegen az Európai Reszuszcitációs Társaság érvényben lévő reszuszcitációs algoritmusa alapján végeztük az újraélesztést, majd a spontán keringés visszatérését követően a Pécsi Tudományegyetem multidiszciplináris intenzív osztályára került felvételre. Kizárási kritériumokat képeztek az NT-proBNP szérumszintjét befolyásoló kórállapotok: kardiális betegség
(krónikus
szívelégtelenség,
bal
kamrai
ejekciós
frakció<45%,
súlyos
billentyűbetegségek, COPD) és veseelégtelenség (szérumcreatinin>120 µmol/l). A szeptikus betegek szelekciója az American College of Chest Physicians/Society of Critical
Care
Medicine
(ACCP/SCCM)
konszenzuskonferencia
definíciójának
figyelembevételével történt (12), az intenzív osztályon naponta kétszer folytatott vizit alkalmával szerzett adatok (SIRS és infekciós klinikai jelek) figyelembevételével. Valamennyi betegnél rögzítésre kerültek a demográfiai (életkor, nem) és klinikai adatok (keringés összeomlás típusa, Glasgow Coma Scale, APACHE II pontszám, mortalitás). Biomarker meghatározás: Sorozatos PCT és NT-proBNP meghatározás történt az intenzív osztályos felvételkor (T0), 24 óra (T24) és 72 óra múlva (T72). A vérminta levétele perifériás vérből történt, majd centrifugálás után (3000xg, 10 perc), a felülúszót lefagyasztottuk és -80°C –on tároltuk feldolgozásig. A szérum PCT-szint (ng/ml) mérése 175
automatizált fluoreszcens immunoassay technikával (BRAHMS Kryptor, Germany), az NTproBNP
szint
(ng/ml)
mérése
automatizált
elektrokemilumineszcens
immunoassay
technikával (ROCHE Elecsys, Switzerland) történt. Statisztikai analízis: SPSS 11.0 software csomag segítségével ANOVA, Mann-Whitney U tesztet és chi-négyzet próbát végeztünk. Az adatok normál eloszlásának vizsgálata Kolmogorow-Smirnoff-teszttel történt. Az adatokat, mint medián és interkvartilis tartomány ábrázoltuk.
Eredmények A demográfiai adatokat az 1. táblázatban tüntettük fel. Összesen 35 beteget vontunk be a tanulmányba. A kezdeti ritmus alapján 25 betegben asystolia/pulzus nélküli elektromos aktivitás (ASYS/PEA) és 10 betegben kamrafibrilláció (VF) alakult ki. A korai, 72 órás mortalitás az ASYS/PEA csoportban 20/25, míg a VF csoportban 2/10 volt (p<0,01). A demográfiai és klinikai adatok közül az ASYS/PEA csoportban mért szignifikánsan magasabb APACHE II pontszám (p<0,05) emelendő ki, egyéb paraméterek tekintetében szignifikáns különbséget a két csoport között nem találtunk (1. táblázat). A „periarrest” adatok közül, az anoxia idő és a T0 illetve T24 időpontokban mért PCT között szignifikáns negatív korrelációt találtunk (Spearman korrelációs koefficiens, SKK: 0,398, p=0,02 illetve -0,653, p=0,002), melyet korábbi tanulmányunk is alátámaszt (13). A spontán keringés visszatérési idő (ROSC) és az anoxia idő, valamint az újraélesztés során beadott epinephrin mennyisége között erős pozitív korrelációt (SKK: 0,464, p=0,005 illetve 0,666, p<0,001), míg az ROSC és a T0 időpontban mért NT-proBNP között szignifikáns negatív korrelációt (SKK: -0,396, p=0,025) találtunk. Ez utóbbi a nem túlélők között (22/35) még szignifikánsabb összefüggést mutatott (SKK: -0,632, p=0,003) Az ASYS/PEA csoportban az alcsoportok megoszlása: 7 szeptikus és 18 nemszeptikus beteg. A 7 szeptikus beteg szérumában szignifikánsan magasabb PCT-szinteket (medián: 11,1, interkvartilis tartomány, IQR: 7,6-18,1 vs. 0,3, 0,1-4,5; p=0,002) és NTproBNP szinteket (medián:19,5, IQR:10,9-31,1 vs. medián:2,7, IQR: 1,3-9,4; p=0,008) mértünk az intenzív osztályra történő felvételkor (1. és 2. ábra). Azonban a T0 időpontban a PCT és az NT-proBNP között szignifikáns korrelációt nem találtunk. A VF csoportban szeptikus szövődmény nem fordult elő. Ennek megfelelően, a felvételkori PCT szignifikánsan alacsonyabb volt a VF csoportban, összehasonlítva a szeptikus ASYS/PEA csoporttal (medián: 0,1, IQR: 0,1-0,2 vs. medián:11,1, IQR:7,6- 18,1; p=0,03). Végül a 3 vizsgált csoportban (VF, ASYS/PEA-S, ASYS/PEA-NS) az NT- proBNP176
szinteket a T0 időpontban összehasonlítva azt találtuk, hogy bár a VF csoport NT-proBNP medianja (8,5 ng/ml) az irodalom által megadott normál tartományhoz (férfiak: <0,10 ng/ml, nők: <0,15 ng/ml) képest jelentős emelkedést mutatott, azonban szignifikáns módon nem különbözött sem a „S” (medián: 19,50 ng/ml), sem a „NS” (medián: 2,78 ng/ml) ASYS/PEA alcsoportoktól (2. ábra). A vizsgált biomarkerek szérumszintje a T24 és T72 időpontokban hasonló kinetikát mutatott (valamennyi emelkedett), azonban a 72 órán belüli magas mortalitás miatt a rendelkezésre álló adatok statisztikailag nem voltak összehasonlíthatóak.
Megbeszélés Tanulmányunkban az újraélesztéssel kapcsolatos mechanikus, metabolikus inzultus és a szív endokrin funkcióját jellemző BNP hormon elválasztás között negatív kapcsolatot találtunk az összes beteg adatainak elemzésekor. Az elhúzódó reanimációs tevékenység (hosszabb ROSC idő) okozta miokardium hipoperfúzió, valamint a több epinephrin adás (miokardium oxigénigényét növelve) együttesen, a szív endokrin diszfunkcióját jelző NTproBNP emelkedést eredményezett, függetlenül a későbbi szeptikus szövődményektől. A reanimáció után szeptikus állapotba került betegek adatait elemezve, hasonló NTproBNP-emelkedést észleltünk, mint más szerzők szeptikus shockban (10, 11). Az eltérő patofiziológiai folyamatok ellenére, a súlyos szepszis (ASYS/PEA-S) illetve a súlyos szívizom iszkémia (VF) által okozott miokardiális diszfunkció hasonló nagyságrendű NTproBNP-emelkedést okozott anyagunkban. Irodalmi adatok szerint, a szervtámogató kezelésben részesülő intenzíves betegekben a miokardiális diszfunkció becslésében hasznosnak találták a natriureticus peptid hormon monitorozását (11, 14, 15). Saját anyagunkban, a Rudiger és mtsai. által szeptikus betegekben leírt NT-proBNP-szintet meghaladó markeremelkedést találtunk az asystolia/PEA miatt reanimált szeptikus alcsoportban (11). Mivel pumpafunkció- illetve keringési perctérfogatmérés betegeinkben rutinszerűen nem történt, ezért nem tudjuk kizárni a szignifikáns „periarrest” miokardiális diszfunkció
lehetőségét,
mely
hozzájárulhatott
a
nagy
mértékű
NT-proBNP-
szintemelkedéshez önmagában is. Azonban korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy az emelkedett BNP- és NT- proBNP-szintek nem feltétlenül utalnak “low cardiac output” állapotra illetve fokozott bal kamrai töltőnyomásra (11, 14). Ezt a megfigyelést korábbi kardiogén és nem kardiogén shockos betegekben végzett intenzív osztályos tanulmányok is támogatják, melyek nem találtak korrelációt a keringési perctérfogat és pulmonális artériás éknyomás, valamint a BNP-szintek között (15). Ezek az adatok a marker emelkedésében 177
inkább a szeptikus komponens szerepét támogatják. Az NT-proBNP szintjének emelkedése a VF miatt újraélesztett betegekben valószínüleg más patomechanizmus útján jön létre, ugyanis szinte mindig súlyos miokardiumiszkémia előzi meg a kamrafibrillációt. Ismert, hogy súlyos koronária betegekben akutan kialakuló koszorúsér-elzáródást gyors NT-proBNP-emelkedés kísér a szérumban (16). Azt is leírták, hogy a közvetlen post-reszuszcitációs fázisban a kamrafibrillációt szignifikánsan nagyobb miokardiális diszfunkció követi (17), és ezt a diasztolés funkciózavarban megnyilvánuló jelenséget jellegzetes natriuretikus peptidszint-emelkedés kíséri (18, 19). Természetesen a miokardiális iszkémián kívül egyéb faktorok is hozzájárulhatnak az NT-proBNP emelkedéséhez szeptikussá vált újraélesztett betegeinkben. Bízonyítékok vannak amellett, hogy gyulladásokban emelkedik az NT-proBNP (14). Állatkísérletes adatok azt mutatják, hogy a hormonszint-emelkedés hátterében interleukin-6, interleukin-1β és tumor necrosis factor-α (TNF-α) által okozott BNP mRNS-indukció áll (20,21). Ez magyarázza saját adatainkat, miszerint szignifikánsan magasabb NT-proBNP-szinteket találtunk azokban az újraélesztett betegeinkben, akik szeptikussá váltak. Ezek alapján, a reanimáción átesett betegekben az NT-proBNP hasznos marker lehet a súlyos szepszis korai előrejelzésére már az intenzív osztályra történő felvételkor. A proinflammatorikus citokineket teszik felelőssé a PCT szint emelkedéséért súlyos szepszisben, amit mi is észleltünk saját szeptikus betegeinkben. A szérumban mért PCT-t, elsősorban bakteriális eredetű szeptikus állapotban, megbízható markernek tartják. Ismert, hogy a PCT-szint alapján el lehet különíteni a bakteriális és nem infekciós eredetű akut fázis reakciót kardiopulmonális reszuszcitációt követően (4). Korábban közölt saját adataink is alátámasztják a PCT előbb említett differenciáldiagnosztikai hasznát (3, 4). A szérum PCTszint szignifikánsan magasabb volt a szeptikus betegekben, de azokban is emelkedést észleltünk, akikben a keringésösszeomlást szignifikáns hypoxiás periódus előzte meg. Ez támogatja azt a korábban leírt elképzelést, mely a PCT-gén aktivációját szöveti hypoperfúzióval magyarázza (3, 22). A reanimációt követő 24. órában mért szérum PCT-szint és az anoxia ideje között fennálló szignifikáns negatív korreláció azzal magyarázható, hogy az akut fázis fehérjék az inzultust követő 24. órában érik el csúcskoncentrációjukat a szérumban. A reanimált betegcsoportnál valószínüleg a hosszabb anoxiaidő, az ATP-raktárak depléciója révén csökkentheti a PCT termelődését, mivel az több foszforilációs kaszkádon keresztül történő energiaigényes folyamat. Szignifikáns különbség volt az intenzív osztályos felvételkori APACHE II 178
pontszámban a három vizsgált csoport között. A szignifikánsan magasabb APACHE II pontszámok az ASYS/PEA-NS és ASYS/PEA-S csoportokban jelentős kísérőbetegségek jelenlétéről árulkodnak, melyek a keringésmegállás etiológiai tényezőiként is szóba jönnek (23). A co-morbid faktorok, a hosszabb hipoperfúziós periódussal ebben a csoportban magyarázhatják a mortalitásbeli különbséget az ASYS/PEA és a VF csoport között, ahogy azt mások is találták (23). Azonban azokban a betegekben, ahol a kezdeti ritmus PEA volt, nem találtunk szignifikáns különbséget a szeptikus és nem szeptikus betegek túlélésében. Összefoglalva, azt mondhatjuk, hogy reanimált betegekben az NT-proBNP a PCT-hez hasonlóan jelentősebben emelkedett a szeptikus csoportban. Azonban annak eldöntésére, hogy ezért a reanimációs tevékenységgel direkt módon összefüggő miokardialis diszfunkció mennyiben felelős, nagyobb esetszámon végzett újabb tanulmány készítésére van szükség, az újraélesztés utáni pumpafunkció/keringési perctérfogat mérésével.
Köszönetnyilvánítás A szerzők köszönetet mondanak Orosz Ibolya laborasszisztensnőnek a biomarkerek bemérésében végzett áldozatos munkájáért. Irodalomjegyzék 1. Adrie C, Adib-Conquy M, Laurent I, et al. Successful cardiopulmonary resuscitation after cardiac arrest as a "sepsis-like" syndrome. Circulation 2002;106: 562-568. 2. Karzai W, Oberhoffer M, Meier-Hellmann A, et al. Procalcitonin-a new indicator for the systemic response to severe infections. Infection 1997;25: 329-334. 3. Fries M, Kunz D, Gressner AM, Rossaint R, Kuhlen R. Procalcitonin serum levels after out-of-hospital cardiac arrest. Resuscitation 2003;59: 105-109. 4. Oppert M, Reinicke A, Müller C, Barckow D, Frei U, Eckardt KU. Elevations in procalcitonin but not C-reactive protein are associated with pneumonia after cardiopulmonary resuscitation. Resuscitation 2002;53:167-170. 5. Gottlieb S, Kukin ML, Ahren D et al. Prognostic importance of atrial natriuretic peptide in patients with chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 1989;13: 153-159. 6.Hall C, Rouleau JL, Moye L et al: N-terminal proatrial natriuretic factor: an independent predictor of long-term prognosis after myocardial infarction. Circulation 1994;89: 1934-1942. 7. Brueckmann M, Huhle G, Lang S. et al. Prognostic value of plasma N-Terminal pro-Brain Nautriuretic Peptide in patients with severe sepsis. Circulation 2005;112: 527-534. 8. Magga J, Marttila M, Mantymaa P et al. Brain natriuretic peptide in plasma, atria, and ventricles of vasopressin- and phenylephrin infused conscious rats. Endocrinology 1994; 134: 179
2505-2515. 9. Hunt PJ, Espiner EA, Nicholls MG et al. Differing biological effects of equimolar atrial and brain natriuretic peptide infusions in normal man. J Clin Endocrinol Metab 1996;81: 38713876. 10. Chua G, Kang-hoe L. Marked elevations in N-terminal brain natriuretic peptide levels in septic shock. Critical Care 2004;8: 248-250. 11. Rudiger A, Gasser S, Fischler M, Hornemann T, von Eckardstein A, Maggiorini M. Comparable increase of B-type natriuretic peptide and aminoterminal pro-B-type natriuretic peptide levels in patients with severe sepsis, septic shock, and acute heart failure. Crit Care Med 2006;34: 2140-2144. 12. American College of Chest Physicians – Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med 1992;20: 864-875. 13. Molnár T, Kőszegi T, Szakmány T, Bogár L. A szérum S100β és procalcitonin szintjének prognosztikai jelentősége újraélesztett betegeknél. Újraélesztés 2004;1: 51-56. 14. Charpentier J, Luyt C-E, Fulla Y, et al. Brain natriuretic peptide: A marker of myocardial dysfunction and prognosis during severe sepsis. Crit Care Med 2004;32: 660–665. 15. Tung RH, Garcia C, Morss AM, et al. Utility of B-type natriuretic peptide for the evaluation of intensive care unit shock. Crit Care Med 2004;32: 1643–1647. 16. Ndrepepa G, Braun S, Mehilli J, et al. Plasma levels of N-terminal pro-brain natriuretic peptide in patients with coronary artery disease and relation to clinical presentation, angiographic severity, and left ventricular ejection fraction. Am J Cardiol 2005;95: 553-557. 17. Kamohara T, Weil MH, Tang W, et al. A comparison of myocardial function after primary cardiac and primary asphyxial cardiac arrest. Am J Respir Crit Care Med 2001;164(7): 1221-1224. 18. Gazmuri RJ, Berkowitz M, Cajigas H. Myocardial effects of ventricular fibrillation in the isolated rat heart. Crit Care Med 1999;27: 1542-1550. 19. Costello-Boerrigter LC, Boerrigter G, Redfield MM, et al. Amino-terminal pro-B-type natriuretic peptide and B-type natriuretic peptide in the general community: determinants and detection of left ventricular dysfunction. J Am Coll Cardiol 2006;47: 345-353. 20. Tanaka T, Kanda T, Takahashi T, Saegusa S, Moriya J, Kurabayashi M. Interleukin-6induced reciprocal expression of SERCA and natriuretic peptides mRNA in cultured rat ventricular myocytes. J Int Med Res 2004;32: 57-61.
180
21. Ma KK, Ogawa T, de Bold AJ. Selective upregulation of cardiac brain natriuretic peptide at the transcriptional and translational levels by pro-inflammatory cytokines and by conditioned medium derived from mixed lymphocyte reactions via p38 MAP kinase. J Mol Cell Cardiol 2004;36: 505-513. 22. Szakmany T, Toth I, Kovacs Z, et al. Effects of volumetric versus pressure guided fluid therapy on postoperative inflammatory response: A prospective, randomised clinical trial Intensive Care Med 2005; 31: 656-663. 23. Kause J, Smith G, Prytherch D et al. A comparison of antecedents to cardiac arrests, deaths and emergency intensive care admissions in Australia and New Zealand, and the United Kingdom--the ACADEMIA study. Resuscitation. 2004;62: 275-282.
181
1. táblázat. Demográfiai és klinikai adatok
ASYS/PEA-NS
ASYS/PEA-S
VF
P
n=17
n=8
n=10
Életkor (év)
63 (50-71)
72 (54-78)
70 (50-74)
NS
Nem (férfi)
16
6
7
NS
APACHE II.
29 (24-31)
31 (27-32)
23 (20-26)
p<0,05
Anoxia idő (perc)
3 (2-7)
2 (2-4)
4 (3-5)
NS
ROSC (perc)
18 (7-27)
12 (7-17)
13 (10-21)
NS
Epinephrine (mg)
4 (2-8)
3 (1-4)
2 (2-5)
NS
72 órás túlélés *
4/17
1/8
8/10
p<0,01
28 napos túlélés*
2/17
0/8
8/10
p<0,01
Rövidítések: ASYS/PEA-NS: asystolia/pulzus nélküli elektromos aktivitás - nem szeptikus betegek, ASYS/PEA-S: asystolia/pulzus nélküli elektromos aktivitás – szeptikus betegek, VF: kamrafibrilláció, APACHE II: Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II. pontszám, Anoxia idő: a keringésleállás és az újraélesztés között eltelt idő, ROSC: a spontán keringés visszatéréséig eltelt idő, NS: nem szignifikáns (Mann-Whitney-teszt, medián, interkvartilis tartomány ill. *chi-négyzet próba)
182
1. ábra
PCT T0 időpontban (ng/mL)
40
p=0.002 A szeptikus (ASYS/PEA-S), a nem szeptikus (ASYS/PEA-NS) és a
30
p=0.03
kamrafibrilláció
(VF)
csoportokban T0 időpontban mért 20
PCT-szinteket ábrázoltuk box-plot diagram 10
formájában.
Whitney-teszt, percentilis,
medián,
(Mann25-75
minimum-maximum
értékek)
0
ASYS/PEA-NS
VF
NT-proBNP T0 időpontban (pg/mL)
ASYS/PEA-S
2. ábra
p<0.05 40000
A három csoport (ASYS/PEANem
30000
Szeptikus,
Szeptikus,
VF)
ASYS/PEANT-proBNP
szintjeinek összehasonlítása a T0 20000
10000
időpontban
box-plot
diagram
formájában
ábrázolva.
(Mann-
Whitney percentilis, értékek)
0
ASYS/PEA-NS
VF
ASYS/PEA-S 183
teszt,
median,
25-75
minimum-maximum
Paper 10 S100 fehérje meghatározása és szerepe az intenzív osztályon Dr. Molnár Tihamér PTE ÁOK, Aneszteziológia és Intenzív Terápiás Intézet, Pécs
Összefoglalás: A hatvanas évek közepétől mostanáig számos intra- és extracelluláris folyamatban betöltött szerepe tisztázásra került, ennek az elsődlegesen astrocytákban termelt fehérjének. A sejten belül a szignál transzdukcióban illetve a calcium homeosztázis fenntartásában játszik szerepet, míg az extracelluláris térbe szekretálva koncentráció függő módon trophicus és toxicus hatásokat egyaránt kifejthet. Jelen irodalmi összefoglaló célja, hogy az utóbbi évek érdekes tudományos eredményeit összefoglalja és az S100b klinikai gyakorlatban betöltött információs értékét bemutassa traumás agysérülésben és a sürgősségi medicina néhány területén. Számos szerző hangsúlyozza, hogy a központi idegrendszeri sejtsérülés monitorozásában analóg szerepet játszik az S100b protein, mint a C-reaktív protein a szisztémás gyulladásos reakcióban.
Kulcsszavak: S100B protein, traumás agysérülés, cardio-pulmonalis reanimatio
Summary: Since the mid-1960s, wide variety of intra- and extracellular activities have been elucidated of this primarily astroglia derived protein. Within cells, it may have a role in signal transduction and is involved in calcium homeostasis, while secreted glial S100B exerts trophic and toxic effects in the extracellular space depending on its concentration. The aim of this review is to summarize the most interesting scientific findings of the past few years and to demonstrate the most beneficial infomation of using S-100 measurements in the everyday clinical parctice especially in patients with traumatic brain injury and other critical care setting. Several authors emphasize the S100B’s potential role as a biomarker of CNS injury, analogous to the role of C-reactive protein as a marker of systemic inflammation.
Key words: S100B protein, traumatic brain injury, cardio-pulmonary resuscitation
184
Általában azokat a plazmában mérhető molekulákat, enzimeket, fehérjéket tekintjük biomarkereknek, melyek független diagnosztikus és/vagy prognosztikus értékkel bírnak bizonyos kórképeket illetően. Egy biomarker klinikai haszna elsősorban attól függ, hogy változása mennyire szignifikáns módon jellemző egy adott betegségre. Ideális esetben pontos, megbízható, szenzitív, specifikus és magas prediktív értékkel bír. A klinikai alkalmazhatóság szempontjából pedig értékét növeli, ha nem csak prediktív, hanem additív értéke is van, ami azt jelenti, hogy több információt nyújt, mint a hagyományos rizikó faktorok. Fontos, hogy a mérés eredménye könnyen és gyorsan hozzáférhető legyen segítve az ágy melletti döntéshozatali mechanizmust és nem utolsó sorban költséghatékony is legyen, például kiváltva drágább diagnosztikus eljárásokat (1). S-100B protein Ma már tudjuk, hogy az S100 az alacsony molekulasúlyú calcium-kötő fehérjék családjába tartozik, mólsúlya 21.000 Da, biológiai fél életideje 2 óra, valamennyi gerincesben megtalálható (Donato,1991). Kezdetben azt gondolták, hogy kizárólag agy specifikus, később más szövetekben is kimutatták, habár sokkal alacsonyabb koncentrációban (Hidaka, 1983, Kindblom 1984, Takahashi 1985). A heterodimer S-100a (αβ) forma a melanocytákban és glia sejtekben, míg a homodimer S-100b (ββ) forma a glia és Schwann sejtekben fordul elő nagy koncentrációban. Jelenlétét demonstrálták bizonyos tumorokban, mint glioma, melanoma, schwannoma és differenciált neuroblastoma illetve bizonyos betegségekben mint Down szindróma. 1. A központi idegrendszer károsodását jelző biomarker Az intenzív osztályon a primér központi idegrendszeri károsodás súlyosságának felmérésére és a szekunder agyi sejtsérülés idejében való felismerésére kidolgozott standard módszerek (fizikális vizsgálat, képalkotás, TCD, kiváltott válasz, EEG stb.) korlátozott értékűek, mivel a kritikus állapotú betegek gyakran igényelnek különböző szedatív, analgetikus gyógyszerelést, esetleg izomrelaxációt illetve a különböző vizsgálati helyszínekre való szállításuk is nem csekély rizikóval társul. Ezért a 70-80-as évektől kezdve folyamatosan nőtt az igény, a fentieket kiváltó, megbízható biomarkerek felfedezése irányába. A legtöbb tanulmányban artériás mintából történik az S-100b meghatározás, de néhány szerző a bulbus juguli mintavételt preferálja az extracranialis bemosódás elkerülése végett (2). A kamradrainből nyert liquor vizsgálata utóbbi időben háttérbe szorult, mert kiderült, hogy maga a kamradrain bevezetése (reaktív gliosis, astrocyta aktiváció) befolyásolja a mért értéket (3). 185
2. Kitűnő szenzitivitása miatt alkalmas a koponya trauma, stroke és cardiopulmonalis reszuszcitációt követő agysérülés bizonyítására. Ezek közül hely hiányában a traumás koponya sérülés, valamint a keringésleállás során kialakuló hypoxiás agykárosodás következményeit tárgyaljuk részletesebben. Számos tanulmány született, mely a sikeres reanimációt követő klinikai kimenetel szempontjából vizsgálta az S100b prediktív értékét. Martens és társai azt találták, hogy 0.7 µg/l felett az S100b 96% specificitással és 95% pozitív prediktív értékkel jelezte előre a rossz kimenetelt (4). Számításba kell venni, hogy a reanimáció kapcsán mind a mellkasi kompresszió, mind a defibrillátor alkalmazása az S-100 extracranialis forrásból származó emelkedéséhez vezethet. Rosen és társai azonban azt találták, hogy ez mindig rövid idejű emelkedést okozott, míg a sorozatosan levett mintákban észlelt tartós emelkedés pontosan tükrözi a központi idegrendszeri sejtsérülést (5). Hachimi-Idrissi és társai 58 kórházon kívüli sikeresen reanimált beteget vizsgáltak, akiknél a tudat visszatérésének tükrében hasonlították össze a betegek kórházi felvételét követő első szérum S-100 szintjét. Azt találták, hogy az S-100 >0.7 µg/l prediktora volt a tartós eszméletlen állapotnak (a pozitív prediktív érték (PPV): 84%, a negatív prediktív érték (NPV): 78%, a pontosság 77.6%) (6). A sorozatban mért S-100 dinamikáját több tanulmány is részletesen elemezte, a különböző szerzők által javasolt cut-off értékeket az 1.Táblázatban foglaltam össze. Amennyiben a postreanimációs 5. napon mért szérum S-100 koncentráció ≥1.5 µg/l, akkor 12.6 szorosára nőtt a kedvezőtlen kimenetel (perzisztáló vegetatív állapot vagy halálozás) rizikója (7).
S-100
értékeket különböző időpontban mérve (helyszínen/kórházi felvételkor és 12 órával a szívmegállás illetve a spontán keringés visszatérése után), a 12 órás S-100 protein szint bizonyult független prediktornak a rossz prognózist (halálozás, perzisztáló vegetatív állapot, súlyos neurológiai maradványtünet ) illetően egy utánkövetéses tanulmányban (8). A korai S100b és procalcitonin emelkedés szerepét vizsgálták területen sikeresen újraélesztett (OHCA) betegekben. A kórházi felvételt követő első órában levett szérum minták S100b és procalcitonin koncentrációjának ROC analízisét mutatjuk be az 1. ábrán a rossz prognózis előrejelzésére. Mivel a sikeresen újraélesztett betegek kezelésében egyre nagyobb teret kap az indukált hypothermia, ezért érdemes megemlíteni, hogy ezekben az esetekben csökken az S-100
186
protein prognosztikus értéke a kimenetelre vonatkozóan, míg a neuron specifikus enolase (NSE) információs értéke megmarad (9) Eszerint a neuronok érzékenyebbek hypoxiás károsodásra, mint az astrocyták. Hachimi-Idrissi és társai hypothermiás és normothermiás cohortokat hasonlítottak össze és az általuk közölt adatok, a kedvező kimenetelű hypothermia csoportban szignifikánsan alacsonyabb S100b értékeket jeleztek az első 24 órában. Konklúziójukban az S-100 protein, mint a terápia hatásosságának markere jelenik meg (10). 3. A szérumszint emelkedésének nagysága prediktív értékű a klinikai kimenetelre nézve (bizonyos küszöbérték felett a mortalitás és az agyhalál megbízhatóan előre jelezhető) A költséghatékony egészségügyben nagy nyomás nehezedik az egészségügyi személyzetre, hogy fölösleges agresszív terápiát ne végezzen a reménytelen kimenetelű betegek esetében, ezért óriási az igény olyan markerek bevezetésére, melyek megbízható prediktorai a mortalitásnak. Először Regner és munkatársai végeztek összehasonlítást traumás eredetű agyhalottakban és túlélőkben a szérumban mért S100b vonatkozásában és szignifikánsan magasabbnak találták agyhalottakban (11) Mivel a poly- és multitraumatisatio per se szignifikáns mértékben hozzájárul az S100b szérumszintjének emelkedéséhez, ezért Pelinka és társai megpróbálták a koponyatraumát és a multitraumát mint potenciális S100b forrást szétválasztani (12). Az első 48 órában nem volt szignifikáns különbség a tiszta koponyatrauma, a tiszta multitrauma és a kevert csoport között, azonban ezt követően az első csoportban, a nem túlélőkben (agyhalottakban) perzisztálóan magas maradt az S100b szintje a szérumban, sőt trifázisos jelleggel a szekunder agysérülést is jól jelezte a marker kinetikája. Végül is Pelinka arra a következtetésre jutott, hogy a sorozatban mért S100b pontosabb prediktor mint a csak az első 24 órában mért adat. Ezzel szemben Vos és társai az első 24 óra S100b emelkedését mind a mortalitással, mind a kimenetellel korreláló tényezőnek találták (13). S100b >1.13 µg/l mellett valamennyi beteg meghalt. Más biomarkereket (GFAP, NSE) is vizsgáltak ezen betegekben és hasonlóan magas szenzitivitást és negatív prediktív értéket találtak, azonban a specificitás és a pozitív prediktív érték kiábrándítóan alacsony volt, így erre klinikai döntést nem lehet alapozni. Ezért logisztikus regressziós analízist használva több biomarker (S100b, NSE, GFAP) és a GCS pontszám együttese alapján végeztek prognózis becslést és azt jobbnak találták, mint a képalkotó vizsgálat, GCS vagy ISS alapján végzett kalkulációt. Dimopoulou sikeresen újraélesztett betegekben mért sorozatban, 6 napon keresztül S100b-t, agyhalottakban szignifikánsan magasabb volt, mint a túlélőkben (median: 2.32 vs.1.04 µg/l) (14).
187
4. Normál szérumszint szignifikáns központi idegrendszeri sérülés hiánya mellett szól (magas negatív prediktív érték). A normál tartománnyal kapcsolatban
fontos megjegyezni, hogy szenzitív assay
alkalmazásával normál kontrolokban is mérhető az S100b alacsony koncentrációban. Nygaard szerint 0.12 µg/l alatt (15), Anderson szerint 0.01-0.13 µg/l között van a normál tartomány (16), míg mások magasabb értékekben határozták meg (0.12-0.5 µg/l) (17). Vos húzta meg a legmagasabb küszöbértéket 1.13 µg/l értékben (13). Savola kritikával élt az előző adatokat illetően és nagyobb esetszámú tanulmányában 0.2 µg/l-nél húzta meg azt a határt, mely megbízhatóan elkülöníti a központi idegrendszeri sejtsérülést és vér-agygát diszfunkciót a normáltól, amennyiben az S100b egyéb extracranialis forrásai kizárhatóak (18). Romner enyhe koponyatraumában a betegek 99%-ban 0.2 µg/l alatti S100b szint mellett normál CT eredményt talált (19). Hasonlóan, Towned és társai koponyatraumát szenvedett betegek mindössze 1%-ában találtak neurológiai deficitet, ha az S100b 0.32 µg/l alatt maradt (20). Úgy tűnik, hogy a nem és az életkor nincs hatással a normál szérumszint alakulására. 5. A specificitását viszont rontja az a tény, hogy szérumszintjének emelkedését extracranialis források is okozhatják . Ez utóbbi kiküszöbölhető egyéb biomarkerek – GFAP, NSE – mérésével illetve a perifériás szövetsérülések tipizálásával. Az S-100 protein család tagjai előfordulnak melanocytákban, adipocytákban, chondrocytákban, epidermális Langerhans sejtekben. A beta izomer megtalálható a vázizomzatban, bőrben, valamint a fehér és barna zsírszövetben (21). Maratoni futók szérumában magasabb S100b szintet mértek futás után, nyilvánvaló agykárosodás nélkül, mely 20 óra alatt tért vissza a verseny előtti szintre (22). Más tanulmányok adatait is elemezve arra a következtetésre jutottak, hogy a 24 órán túl fennálló szérumszint emelkedés agyi eredet mellett szól. Mivel a traumás koponyasérülés esetén az első 24 órás érték megbízhatósága rendkívül fontos, ezért bizonyos szerzők a szérum CK érték párhuzamos vizsgálatát javasolják. A szívsebészeti beavatkozások után mért S-100 protein emelkedést is óvatossággal kell kezelni, hiszen itt a traumatizált zsírszövet, izom és csontvelő is multiplex forrásként szerepel és akár 40µg/l értéket is elérhet a műtéti területből összegyűjtött vérben (23). 6. A jövőben egyre nagyobb szerepet fog kapni a szekunder agykárosodás monitorozásában és terápiás döntési algoritmusokban. A primér agyi inzultust követően kialakuló patofiziológiai történések (ischaemia, agyoedema, gyulladásos kaszkád, axonális degeneráció, apoptosis etc.) eredménye az un. szekunder agykárosodás, mely gyakran szemünk előtt az intenzív osztályon alakul ki, de észlelése (ICP 188
monitorozás, neurológiai betegvizsgálat, képalkotó vizsgálat) az altatott- szedált betegben nem egyszerű, ugyanakkor jelentős morbiditást és mortalitást befolyásoló tényező. Ideális esetben, a szekunder agykárosodást korai stádiumban felismerve, időben kezdhetjük meg az elhárító terápiás intervenciót, megelőzve a permanens agysérülést. Egyre több tanulmány foglalkozik az S100B mérésének ilyen irányú szerepével, mely lehetővé teszi a nagy rizikójú betegek korai felismerését. A koncepció alapja, hogy az említett patofiziológiai történés sejt szinten kezdődik (cytotoxicus oedemával, melyet vasogen fázis követ) sokkal korábban, mint ahogy azt a tradicionális eszközökkel (ICP monitor vagy képalkotó eljárások) detektálni tudnánk (24). Míg a kutatók többsége megegyezik abban, hogy a liquor és szérum S100b alkalmasnak tűnik a szekunder agykárosodás előrejelzésére, jelenleg a rutinban használt tesztek túl lassúak, ezért újabban olyan teszteket próbálnak a piacra dobni, melyek kevesebb mint 2 óra alatt megbízható eredményt adnak. Jackson és társai azt találták, hogy minor agysérülést követően az S100b néhány óra alatt a sérülést megelőző normál szintre tért vissza, bizonyítandó a rövid felezési időt (25). Ezen logika alapján a tartósan magas szérum szint vagy bármilyen másodlagos eleváció felveti a szekunder agykárosodás valószínűségét. Más szerzők megjegyzik, hogy az ICP csúcsokat ill. képalkotó vizsgálattal detektált strukturális abnormalitásokat megelőző S100b kiugrások a szekunder agykárosodás bizonyítéka mellett, végső soron az agyhalált is előrejelzik (26). Petzold és társai szerint az S100b az ICP-nél 3-4 nappal hamarabb képes előre jelezni a mortalitást (27). 7. Szérumszintjének emelkedése órákkal előre jelzi az ICP vagy a képalkotó vizsgálattal detektált progressziót. Minor koponya trauma: GCS 13-15 mellett a betegek 20-38%-ban találtak szignifikáns S100b emelkedést a szérumban (28,29). Bizonyos tanulmányokban az S100b emelkedés és a CT-vel igazolt agyi contusio között pozitív korrelációt találtak (30). Mások a negatív CT vizsgálatok és pozitív S100b esetén diffúz agykárosodást feltételeztek, ezeket az eseteket MRI-vel tovább vizsgálva már nagyobb százalékban találtak abnormalitást. Ilyenkor a neuropsychiátriai tesztek eredményével (figyelem, memória, információ feldolgozás) a biomerker szérum szintje jól korrelált (31). Azt is megállapították, hogy az MRI pozitív és MRI negatív esetek szérum S100b szintjei között szignifikáns különbség van. Romner tanulmánya világított rá az S-100
protein
klinikai
szempontból rendkívül
értékes
negatív
prediktív
értékére
koponyatraumában. Azt találták, hogy az S100b 0.2µg/l alatt (ez volt az általuk használt teszt érzékenységének alsó határa) 99%-os negatív prediktív értékkel jelzi előre a negatív CT vizsgálati eredményt, melynek kézzelfogható haszna akkor nyilvánul meg, ha a biomarker mérése a CT vizsgálat elvégzését feleslegessé teszi (32). Azonban a teljesség kedvéért meg 189
kell jegyezni, hogy a fals negatív S-100 mérések és pozitív képalkotó vizsgálati eredmények felvetik a kérdést, hogy mi is a pontos patofiziológiai mechanizmus, mely a biomarker szérum szintjének emelkedéséhez vezet? Egyenlőre ott tartunk, hogy mind az idegsebészet, mind a sürgősségi medicina továbbra is keresi azt a megbízható biomarkert, mely segít azonosítani azt a betegcsoportot, mely a későbbi neurológiai funkcióromlás szempontjából fokozott rizikót képez. A gyakorlatban például nehéz eldönteni koponyatraumát követően, hogy melyik beteg igényel intenzív osztályos megfigyelést és melyik ’normál’ osztályos elhelyezést. Az a probléma, hogy az eddig elvégzett tanulmányok meg sem kísérelték az S100b szérum szintjét a neurológiai romlással korreláltatni minor koponyatraumában. Súlyos koponyatrauma esetén más a helyzet. Az eddig használt kimenetelt előrejelző prediktorok közül a kórházi felvételkor észlelt GCS: 3-8 például csak 62%-os szenzitivitással jelzi a fatális kimenetelt (33). A Traumatic Coma Data Bank (TCDB) a 80-as évek elején lett életre hívva azzal a szándékkal, hogy standard protokoll alapján kezelt, nagy esetszámú, súlyos koponyatraumát szenvedett betegek adatait elemezve különböző statisztikai módszerekkel a megfelelő prediktorokat megtalálják. A kórházi felvételkor mért S-100 protein értékeket korreláltatták a kimenetelt befolyásoló egyéb tényezőkkel, úgymint CT lelet, GCS, ISS, neurológiai fizikális vizsgálat, GOS. Egyenes arányosságot találtak az ISS-el és fordított arányosságot a GOS-el, a szérum S100b szignifikánsan magasabb volt a rossz kimenetelt jelző GOS=1-3 csoportban (meanS100b range: 1.1-4.9 µg/l), mint a GOS=4-5 csoportban (0.3-1.6, p<0.01). Számos tanulmány alapján a fatális kimenetel küszöbértékét 2.0-2.5 µg/l közé helyezték (34,35). Az S100b magasabb volt azokban, akiknél hypotensio, hypoxia és hiányzó pupilla reflex volt jelen, míg a felvételkori GCS-el nem korrelált.
Következtetés: A központi idegrendszeri sejtsérülés és a szérum S100b érték között direkt korreláció áll fenn. A legjobb szenzitivitást az enyhe koponya traumában találták, ahol pontosan korrelál a klinikai kimenetellel. A normál tartományban
maradó S100b
megbízhatóan előre jelzi a jó neurológiai kimenetelt. Mérsékelt emelkedése korrelál a postconcussion szindrómával, közepes emelkedése előrejelzi a neuropsychológiai tesztekkel bizonyítható kognitív neurológiai károsodást. A jelentősen emelkedett S100b a mortalitás prediktora. A pontos küszöbértékek meghatározása, különös tekintettel az agyhalál előrejelzésére, még kidolgozás alatt áll. Számos befolyásoló faktort azonosítottak ,melyek módosítják az S100b specificitását, ez jelentős problémát jelent, amikor extracranialis sérülések, sebészi beavatkozások illetve reanimációt utáni állapot zavarja a ’tisztán látást’ az agyi sérülés tekintetében. Ilyenkor az anamnézis, a perifériás sérülések nagyságának 190
dokumentálása, a sebészi beavatkozások quantifikálása, a sorozatos S100b mintavétel és egyéb biomarkerek (GFAP, NSE) párhuzamos mérése jelenti a megoldást a specificitás javítása érdekében. A gyors mérési eredmény érdekében ágy melletti teszteket dolgoztak ki, melyek a döntési algoritmusokban megjelenve gyorsabb intervencióra adnak lehetőséget, különösen a szekunder agykárosodás korai felismerése tekintetében illetve alkalmat adva a terápia hatásosságának lemérésére.
Irodalom: 1. Sen J, Belli A.: S100B in neuropathologic states: The CRP of the brain? J Neurosci Res, 85:1373-80, 2007 2. Raabe A, Menon D, Gupta S, et al.: Jugular and arterial concentrations of serum S100b protein in patients with severe head injury: a pilot study. J Neurol Neurosurg and Psychiatry, 65:930-2, 1998 3. Kruse A, Cesarini K, Bach F, et al.: Increases of neuron-specific enolase, S-100 protein, creatine kinase and creatine kinase BB isoenzym in CSF following intraventricular catheter implantation. Acta Neurochir, 110:106-9, 1991 4. Martens P, Raabe A, Hohnsson P, et al.: Serum S-100 and neuron specific enolase for prediction of regaining consciousness after global cerebral ischemia. Stroke, 29:2363-6, 1998 5. Rosen H, Rosengren L, Herlitz J, et al.: Increased serum level of the S-100 protein are associated with hypoxic brain damage after cardiac arrest. Stroke, 29:473-7, 1998 6. Hachimi-Idrissi S., Van der Auwera M., Schiettecatte J., et al.: S-100 protein as early predictor of regaining consciousness after out of hospital cardiac arrest. Resuscitation, 53:251–257, 2002 7. Pfeifer R, Borner A, Krack A, et al.: Outcome after cardiac arrest: predictive values and limitations of the neuroproteins neuron-specific enolase and protein S-100 and the Glasgow Coma Scale. Resuscitation, 65:49–55, 2005 8. Mussack T, Biberthaler P, Kanz K et al.: Serum S-100B and interleukin-8 as predictive markers for comparative neurologic outcome analysis of patients after cardiac arrest and severe traumatic brain injury. Crit Care Med, 30:2669–2674, 2002 9. Tiainen M, Roine RO, Pettila V et al.: Serum neuron-specific enolase and S-100B protein in cardiac arrest patients treated with hypothermia, Stroke, 34:2881–2886, 2003 10. Hachimi-Idrissi S, Zizi M, Nguyen D, et al.: The evolution of astroglial S-100beta protein with cardiac arrest treated with mild hypothermia. Resuscitation, 64:187-92, 2005
191
11. Regner A, Kaufmann M, Friedmann G, et al.: Increased serum S100B protein concentrations following severe head injury in humans: a biochemical marker for brain death? Neuroreport, 12:691-4, 2001 12. Pelinka L, Toegel E, Mauritz W, et al.: Serum S100B: A marker of brain damage in traumatic brain injury with and without multiple trauma. Shock, 19:195-200, 2003 13. Vos P, Lamers K, Hendriks J, et al.: Glial and neuronal proteins in serum predict outcome after severe traumatic brain injury. Neurology, 62,1303-10, 14. Dimopoulou I, Korfias S, Dafni U, et al.: Protein S100b serum levels in trauma induced brain death. Neurology, 60:947-51, 2003 15. Nygaard O, Langbakk B, Romner B.: Age and sex related changes in S100 protein concentrations in the cerebrospinal fluid and serum in patients with no previous history of neurological injury. Clin Chem, 43:541-3, 1997 16. Anderson R, Hansson L-O, Nilsson O, et al.: High serum S100 levels for trauma patients without head injury. Neurosurg, 48:1255-8, 2001 17. Ingebrigtsen T, Romner B, Marup-Jensen S, et al.: The clinical value of serum S-100 protein measurement in minor head injury, a Scandinavian Multicenter Study. Brain Inj, 14:1047-55, 2000 18. Savola O, Pyhtinen J, Leino T, et al.: Effects of head and extracranial injuries on serum protein S100B levels in trauma patients. J Trauma Injury, Infection, Critical Care, 56(6):122934, 2004 19. Romner B, Ingebrigtsen Z, Kongstad P, et al.: Traumatic brain damage: serum S-100 protein measurements related to neuroradiological findings. J Neurotrauma, 8:641-7, 2000 20. Towned W, Guy M, Pani M, et al.: Head injury outcome prediction in the emergency department: a role for protein S-100b? J Neurol Neurosurg and Psychiatry, 73:542-6, 2002 21. Zimmer D, Cornwall E, Landar A, et al.: The S100 protein family: history, function and expression. Brain Res Bull, 37:417-29, 1995 22. Hasselblatt M, Mooren F, von Ahsen N, et al.: Serum S100B increases in marathon runners reflect extracranial release rather than glial damage. Neurology, 62:1634-6, 2004 23. Anderson R, Hansson L-O, Nilsson O, et al.: High serum S100 levels for trauma patients without head injury. Neurosurg , 48:1255-8, 2001 24. Graham D, Ford I, Adams J, et al.: Ischemic brain damage is still common in fatal non missile head injury. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 52:346-50, 1989 25. Jackson R, Samra G, Radcliffe J, et al.: The early fall in levels of S100beta in traumatic brain injury. Clin Chem Lab Med, 38:1165-7, 2000 192
26. Raabe A, Seifert V.: Fatal secondary increase in serum S100B protein after severe head injury. J Neurosurg, 91:875-7, 1999 27. Petzold A, Green A, Keir G, et al.: Role of serum S100B as an early predictor of high intracranial pressure and mortality in brain injury: A pilot study. Crit Care Med, 30(12):270510, 2002 28. Ingebrigtsen T, Romner B, Marup-Jensen S, et al.: The clinical value of serum S-100 protein measurement in minor head injury, a Scandinavian Multicenter Study. Brain Inj, 14:1047-55, 2000 29. Ingebrigtsen T, Waterloo K, Jacobsen E, et al.: Traumatc brain damage in minor head injury: Relation of serum S-100 proteinmeasurement to magnetic resonance imaging and neurobehavioral outcome. Neurosurgery, 45(3):468-76, 1999 30. Savola O, HillbomM,: Early predictors of post-concussion symptoms in patients wilth mild head injury. Eur J Neurol, 10:175-181, 2003 31. Ingebrigtsen T, Waterloo K, Jacobsen E, et al.: Traumatc brain damage in minor head injury: Relation of serum S-100 proteinmeasurement to magnetic resonance imaging and neurobehavioral outcome. Neurosurgery, 45(3):468-76, 1999 32. Romner B, Ingebrigtsen Z, Kongstad P, et al.: Traumatic brain damage: serum S-100 protein measurements related to neuroradiological findings. J Neurotrauma, 8:641-7, 2000 33. Petzold A, Green A, Keir G, et al.: Role of serum S100B as an early predictor of high intracranial pressure and mortality in barin injury: A pilot study. Crit Care Med, 30(12):270510, 2002 34. Chen D, Ziiu L.: Dynamic change of serum protein S100B and its clinical significans in patients with traumatic brain injury. Clin J Traumatol, 8(4):245-8, 2005 35. Raabe A, Menon D, Gupta S, et al.: Jugular and arterial concentrations of serum S100b protein in patients with severe head injury: a pilot study. J Neurol Neurosurg and Psychiatry, 65:930-2, 1998 A cikkben használt rövidítések jegyzéke: TCD, transcranial doppler; PPV, Positive predictive value; NPV, negative predictive value; ROSC, return of spontaneous circulation; GOS, Glascow Outcome Scale; CPR, cardiopulmonary resuscitation; GCS, glasgow coma scale; ISS, injury severity score; MRI, magnetic resonance imaging; NSE, neuron specific enolase; GFAP, glial fibrillary acidic protein
193
1.Táblázat Különböző szerzők által indikált szérum S-100 cut-off értékek reanimált betegekben, a spontán keringés helyreállítása után.
Mintavételi Tanulmány
Kimenetel
idő
S-100 cut-
Specificitás
Szenzitivitás
PPV
NPV
off érték
(%)
(%)
(%)
(%)
0.76 ng/ml
100
54
100
33
0.7 µg/l
100
0.7 µg/l
85
66.6
84
78
0.7 µg/l
96
55
95
63
1 éves túlélés és Mussack et
helyszín és 12 h
neurológiai
al.
ROSC után
kimenetel (GOS) 1 hónapos
Zandbergen
24, 48, 72 h
neurológiai
et al.
post- CPR
kimenetel (GOS) Követés: a tudat
Hachimi-
Kórházi felvétel
Idrissi et al.
és 24 h ROSC
visszatértéig /halálozásig/ vegetatív állapotig 6 hónap: a tudat
Martens et
ROSC után 24
al.
és 48 h
visszatérte /halálozás/ vegetatív állapot Cerebralis
Pfeifer et al.
1-5 post-arrest
rehabilitáció és
nap
28 napos túlélés
1.50 ng/ml
96
0.19 µg/l
100
(GOS)
Rosen et al.
Bottiger et al.
1-3 post-arrest nap
1 éves kimenetel (GOS)
15, 30, 45, 60 min; 2, 8, 24,
14 napos túlélés
1.10 µg/ml
48, 72 h; 7 nap
194
100
56
Rövidítések: PPV, pozitív prediktív érték; NPV, negatív prediktív érték; ROSC, return of spontaneous circulation; GOS, Glascow Outcome Scale; CPR, cardio-pulmonary resuscitation
1. Ábra. Területen sikeresen újraélesztett (OHCA) betegek kórházi felvételét követő első órában levett szérum minták S100b és procalcitonin koncentrációja. ROC analízis a rossz prognózis előrejelzésére.
195
