SARI PUSTAKA
HUMAN KALLIKREIN 6 SEBAGAI BIOMARKER KEGANASAN OVARIUM
I MADE MAHADINATA PUTRA
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I BAGIAN/SMF OBSTETRI DAN GINEKOLOGI FK UNUD/RS SANGLAH DENPASAR 2011
LEMBAR PENGESAHAN SARI PUSTAKA
HUMAN KALLIKREIN 6 SEBAGAI BIOMARKER KEGANASAN OVARIUM
Sari Pustaka ini telah diujikan pada tanggal 15 Oktober 2011
Pembimbing : dr. Ida Bagus Upadana Pemaron, SpOG
………………………………
Penguji : 1. dr. I Putu Gde Wardhiana, SpOG(K)
………………………………
2. dr. I Gusti Putu Mayun Mayura, SpOG
………………………………
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I BAGIAN/SMF OBSTETRI DAN GINEKOLOGI FK UNUD/RSUP SANGLAH DENPASAR 2011
DAFTAR ISI Halaman Daftar Isi............................................................................................................. i Daftar Singkatan................................................................................................ ii Daftar Gambar .................................................................................................. iii Daftar Tabel ..................................................................................................... iv BAB 1 PENDAHULUAN ............................................................................... 1 BAB 2 HUMAN KALLIKREIN .................................................................... 3 2.1 Perkembangan Human Kallikrein ............................................... 3 2.2 Struktur Gen Kallikrein ............................................................... 4 2.3 Fisiologi Gen Kallikrein .............................................................. 6 2.4 Peranan Kallikrein Terhadap Angiogenesis ................................ 8 2.4.1 Angiogenesis .............. ........................................................8 2.4.2 Tumor dan Angiogenesis ................................................. 10 2.5 Human Kallikrein Sebagai Biomarker ...................................... 13 2.6 Human Kallikrein 6 Sebagai Biomarker Keganasan Ovarium . 14 2.7 Cara Pemeriksaan Human Kallikrein 6 ..................................... 17 2.8. Penelitian Human Kallikrein 6 di Indonesia ............................. 18 BAB 3 RINGKASAN .................................................................................... 19 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 20
DAFTAR SINGKATAN
TVS
: Transvaginal Sonografi
CA 125
: Cancer Antigen 125
PSA
: Prostate Spesific Antigen
KLK
: Gen Kallikrein
KLK1
: Gen Kallikrein 1
hK
: Human Tissue Kallikrein
hK6
: Human Tissue Kallikrein 6
WHO
: World Health Organization
IMT
: Indeks Massa Tubuh
DMBA
: Dimethylbenzanthrene
FIGO
: International Federation of Gynecology and Obstetric
HSCCE
: Human Stratum Corneum Chymotryptic Enzyme
NES 1
: Normal Epithelial Cell – Spesific Gene 1
TADG 14
: Tumor Associated, Differentially Expressed Gene 14
TLSP
: Trypsine Like Serine Protease
kb
: Kilo base
kDa
: Kilo Dalton
Gly-Asp-Ser-Gly
: Glyserine-Aspartate-Serine-Glysine
PF III
: Platelet Factor III
HMWK
: High Molecular Weight Kininogen
U-PA
: Urokinase-type Plasminogen Activator
U-PAR
: Urokinase-type Plasminogen Activator Receptor
MMP
: Matriks Metalloproteinase
IGFBP
: Insuline-like Growth Factor Binding Protein
PAR
: Protease Activated Receptor
mRNA
: messenger Ribose Nucleic Acid
DNA
: Deoxyribose Nucleic Acid
HRP
: Streptavidine-horseradish Peroxydase
TMB
: Tetra Methyl Benzidine
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 2.1 Skema rangkaian 15 gen kallikrein ............................................... 5 Gambar 2.2 Skema proses pembekuan darah ................................................... 7 Gambar 2.3 Hubungan antara sistem koagulasi, fibrinolitik, dan kinin............ 8 Gambar 2.4 Mekanisme Angiogenesis ............................................................. 9 Gambar 2.5 Pengaruh Angiogenesis dan Metastase Tumor ........................... 11 Gambar 2.6 Peran Human Tissue Kallikrein pada Perkembangan Tumor ..... 12
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 2.1 Nomenklatur Human Kallikrein............................................................. 4 Tabel 2.2 Human Kallikrein sebagai Petanda Tumor Ovarium (mRNA atau kadar protein) ...................................................................................... 13 Tabel 2.3 Perbandingan Sensitivitas dan Spesifisitas Serum hK6 ...................... 14 Tabel 2.4 Ekspresi
hK6
pada Analisis
Imunohistokimia Berdasarkan
Karakteristik Histopatologis ............................................................... 16
BAB 1 PENDAHULUAN
Kanker ovarium merupakan kanker kedua terbanyak pada wanita dan memiliki angka mortalitas dan morbiditas yang tinggi setelah kanker serviks dan korpus uteri. Di Amerika Serikat, kanker ovarium terhitung sebagai penyebab kematian terbanyak dibandingkan dengan kanker ginekologi lainnya. Pada tahun 2003 terdapat 25.400 kasus, dengan angka kematian sebesar 59,66% dan tahun 2007 menjadi 22.430 kasus baru dengan angka kematian meningkat mencapai 68,12%. Bahkan pada tahun 2010 diperkirakan sebanyak 21.880 kasus baru, dengan angka kematian yang masih tinggi yaitu sebesar 63,30%. Di Rumah Sakit Umum Pusat (RSUP) Sanglah, pada tahun 2005 diperoleh angka kejadian kanker ovarium sebesar 35% dari seluruh kanker ginekologi dengan angka harapan hidup selama lima tahun hanya sebesar 15% 1,2,3 Peningkatan rasio angka kesakitan dan kematian penderita kanker ovarium dapat disebabkan oleh karena sulitnya melakukan deteksi dini, dimana 70% wanita penderita kanker ovarium terdiagnosa pada stadium lanjut. Penyakit ini mempunyai angka ketahanan hidup lima tahun (5-years survival rate) sebesar 85% jika terdiagnosa pada stadium dini (stadium I atau II), tetapi akan menurun sampai kurang dari 20% apabila diagnosa baru ditegakkan pada stadium III atau IV. 4,5 Perkembangan metode baru dalam mendiagnosa kanker ovarium pada stadium dini akan memberikan kontribusi dalam perjalanan penyakit pasien. Berbagai penelitian telah dikembangkan untuk dapat melakukan deteksi dini pada kanker ovarium. Namun sampai saat ini belum ditemukan suatu alat deteksi dini yang ideal bagi penderita kanker ovarium. Pemanfaatan alat transvaginal sonografi (TVS) dan petanda tumor CA 125 merupakan dua diantara sekian banyak alat deteksi dini terbaru yang telah dilakukan penelitian secara mendalam. TVS memiliki sensitivitas yang rendah sebagai alat untuk deteksi dini kanker ovarium, dan hanya mampu mendeteksi besar volume dari tumor ovarium saja,
sehingga TVS hanya dapat mendeteksi tumor ovarium yang volumenya meningkat secara signifikan.6,7 Penelitian deteksi dini kanker ovarium dengan menggunakan petanda tumor CA 125 telah menyimpulkan bahwa CA 125 tidak dapat digunakan sebagai alat deteksi dini kanker ovarium pada wanita yang berisiko tanpa keluhan. Hal ini disebabkan oleh karena sensitivitas yang dimiliki CA 125 masih sangat rendah dan adanya positif palsu yang tinggi akibat berbagai kondisi, seperti : penyakit radang panggul, endometriosis, kista ovarium, dan fibroid. 7,8 Berbagai penelitian terhadap peran genetik telah dikembangkan dalam rangka memahami etiologi dan patofisiologi kanker ovarium, baik melalui pemeriksaan secara langsung terhadap mutasi pada gen atau pun tidak langsung melalui abnormalitas ekspresi protein yang dihasilkan oleh gen termutasi. Dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, rangkaian gen dalam tubuh manusia dapat memberikan harapan munculnya biomarker baru. Dengan metode pendekatan tersebut, teridentifikasi beberapa petanda tumor yang dapat meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas dalam diagnosis dan prognosis kanker ovarium. 1,6,7 Kallikrein adalah subkelompok protease serin yang terdiri atas 15 gen, dan berlokasi pada kromosom 19q13.4. Kallikrein diekspresikan pada banyak jaringan seperti prostat, payudara, ovarium dan testis. 9,10 Dalam referat ini akan dibicarakan peran human kallikrein 6 sebagai kandidat biomarker yang lebih spesifik, berkaitan dengan kanker ovarium.
BAB 2 HUMAN KALLIKREIN
2.1. Perkembangan Human Kallikrein Kallikrein adalah subkelompok protease serin. Pada mulanya diketahui bahwa gen kallikrein terdiri dari tiga macam, kemudian pada tiga tahun terakhir dapat diteliti lokasi dari gen tersebut dan ditemukan juga bahwa gen kallikrein terdiri dari 15 macam.11,12 Penemuan dari kelompok gen kallikrein dapat dibagi menjadi dua era. Era pertama tahun 1930-1980, yang dikenal dengan penemuan gen kallikrein klasik. Human kallikrein yang awalnya ditemukan pada urin manusia, ditemukan pula pada pankreas dalam jumlah yang banyak dan penamaan kallikrein diambil dari bahasa Yunani, kallikreas, yang berarti pankreas. 12,13,14 Pada akhir 1980-an ditemukan dua gen dengan struktur yang sama terhadap KLK1/hK1, yang seterusnya dikenal sebagai KLK2 dan KLK3/PSA. Gen-gen ini berkelompok pada daerah kromosom yang sama (19q13.4) dengan KLK1. Pada saat itu disimpulkan bahwa kelompok human kallikrein mempunyai tiga anggota dan postulat ini bertahan sampai sepuluh tahun.13,14,15 Era kedua (1994-2001) menunjukkan perkembangan dari kelompok kallikrein menjadi 15 gen dan lokus human kallikrein telah dapat diidentifikasi. Masa pertengahan sampai akhir tahun 1990-an penemuan terbaru yang mengkloning beberapa gen serin protease dengan kesamaan struktur terhadap gen kallikrein klasik, yaitu :11 1. Human Stratum Corneum Chymotryptic Enzyme (HSCCE)/KLK7 2. Normal Epithelial Cell – Spesific Gene 1 (NES 1)/KLK10 3. Protease M / Zyme / Neurosin / KLK 6 4. Neuropsin / TADG 14 / KLK8 5. Tripsine – Like Serine Protease (TLSP / Hypostasin) / KLK11. Gen-gen ini dikenal sebagai gen kallikrein jaringan yang juga terletak pada 19q13.4. Ditemukan pula tujuh gen kallikrein selain gen-gen diatas yang disebut:12
1. Prostase / KLK-L1/ARM1/PRSS17/KLK4 2. Human Stratum Corneum Tryptic Enzyme (HSCTE) / KLK-L2/ KLK5 3. KLK-L3/KLK9 4. KLK-L4/KLK13 5. KLK-L5/KLK12 6. KLK-L6/KLK14 7. Prostinogen/ KLK 15 Semua gen-gen tersebut semula disebut sebagai pseudokallikrein. Sesuai asas nomenklatur/taksonomi, maka gen kallikrein dan simbol protein disingkat menjadi KLK dan hK.11,12 Tabel 2.1. Nomenklatur Human Kallikrein Tanda Tanda Gen Tanda Protein Nama/tanda protein Gen Baru Lama Baru KLK1 KLK1 hK1 Pancreatic/renal kallikrein, hPRK KLK2 KLK2 hK2 Human glandular kallikrein 1, hGK1 KLK3 KLK3 hK3 Prostase spesific antigen, PSA KLK4 PRSS17, hK4 Protase, KLK-L1, EMSP1 KLK-L1, KLK4 KLK5 KLK-L2 hK5 KLK-L2 protein, HSCTE KLK6 PRSS 9 hK6 Zyme, Protease M, Neurosin KLK7 PRSS 6 hK7 HSCCE KLK8 PRSS 19 hK8 Neuropsin, ovasin, TADG-14 KLK9 KLK-L3 hK9 KLK-L3 protein KLK10 PRSSL1, hK10 NES 1 protein NES 1 KLK11 PRSS20 hK11 TLSP/Hippostatin KLK12 KLK-L5 hK12 KLK-L5 protein KLK13 KLK-L4 hK13 KLK-L4 protein KLK14 KLK-L6 hK14 KLK-L6 protein KLK15 hK15 Dari 176 gen serin protease pada tubuh manusia, gen ini berkelompok dan terletak berdekatan dalam jumlah yang besar.12
2.2. Struktur Gen Kallikrein Ukuran kelompok gen kallikrein jaringan berbeda diantara spesies. Gen-gen berlokasi seperti tandan pada lokus kromosom yang sama. Pada tikus rumah, gen-
gen kallikrein berkelompok pada kromosom 7 dalam lokus tunggal. Kelompok gen kallikrein pada tikus sedikitnya ada 24; 14 diantaranya diproduksi sebagai protein fungsional, dan sisanya sebagai pseudogen. Pada tikus percobaan juga dijumpai kelompok yang besar gen kallikrein yaitu 15-20 gen. Sedikitnya 10-11 gen sebagai protein fungsional, dimana diekspresikan dengan pola yang berbeda pada tiap organ. Kelompok gen kallikrein jaringan pada babi lebih kecil dibandingkan hewan pengerat lainnya, dimana hanya dijumpai tiga gen kallikrein.11 Kelompok gen human kallikrein telah diketahui terdiri dari tiga gen, tetapi pada penelitian terakhir terhadap gen kallikrein menunjukkan bahwa dijumpai sedikitnya 15 anggota dari kelompok ini. Hal ini dipercaya bahwa gen-gen dari kelompok ini adalah kelompok gen yang berkembang atau duplikat kromosom dari gen induk, yang mempunyai aktivitas yang sama atau aktivitas yang diduga sebagai kebalikan dari struktur primer dan tersier (semuanya tidak dapat diisolasi dari bentuk alamiah ataupun diproduksi sebagai protein rekombinan). 11,12 Gen kallikrein jaringan berkumpul pada kromosom 19, seperti kelompok gen lainnya misalnya gen granzyme berkelompok pada kromosom 14 dan trypsinogen pada kromosom 7 dan 9. Semua gen kallikrein jaringan berlokasi pada region 320 kilobase (kb).11,12
Gambar 2.1. Skema rangkaian 15 gen kallikrein16 Kallikrein adalah glikoprotein yang tahan panas dengan rantai polipeptida dengan berat molekul bervariasi antara 27-40 kDa. Kallikrein adalah serin protease seperti elastase, trombin, plasmin, dan tyrosin dengan karakteristik sisa serin dan kebalikan dari rantai asam amino Gly-Asp-Ser-Gly pada tempat katalitiknya. Ada 29 kebalikan atau variasi asam amino sekitar tempat katalitik yang dapat dijumpai pada kallikrein jaringan.11
2.3. Fisiologi Gen Kallikrein Akhir-akhir ini beberapa peranan biologi telah ditunjukkan oleh gen kallikrein klasik yaitu KLK1, KLK2, dan KLK3. Aktivitas primer gen KLK1 yaitu mempengaruhi pemecahan kininogen dengan berat molekul rendah untuk melepaskan lysil-bradikinin (kallidin), yang dapat berikatan pada reseptornya yaitu bradikinin, reseptor B1 dan B2 pada target jaringan.11,17 Hal ini sebagai perantara untuk berbagai proses seperti : 12,18,19
pengaturan tekanan darah,
kontraksi otot polos,
kemotaksis neutrofil dan induksi nyeri,
mempengaruhi permeabilitas kapiler,
pertumbuhan sel darah,
keseimbangan elektrolit dan
berperan dalam reaksi inflamasi.
Kallikrein ikut berperan dalam proses pembekuan darah. Saat ini teori yang banyak dianut untuk proses pembekuan darah adalah teori cascade atau waterfall yang dikemukakan oleh Mac Farlane, Davie dan Ratnoff. Menurut teori ini faktor pembekuan darah diubah menjadi bentuk aktif oleh faktor sebelumnya dalam rangkaian reaksi enzimatik. Faktor pembekuan darah beredar dalam darah sebagai prekursor yang akan diubah menjadi enzim bila diaktifkan.20,21 Proses pembekuan darah dimulai melalui jalur intrinsik yang dicetuskan oleh aktivasi berbagai elemen, serta jalur ektrinsik yang dicetuskan oleh tromboplastin jaringan. Kedua jalur ini kemudian akan bergabung menjadi jalur bersama yang melibatkan faktor X, V dan Platelet Factor III (PF III), protrombin, dan fibrinogen, seperti yang ditunjukkan pada gambar berikut.20,21
Gambar 2.2. Skema proses pembekuan darah 21
High Molecular Weight Kininogen (HMWK) merupakan suatu kofaktor dari faktor XIIa yang akan mengubah prekallikrein menjadi kallikrein yang akan meningkatkan aktivasi faktor XII dan seterusnya. Disamping itu kallikrein akan mengaktifkan faktor VII menjadi faktor VIIa pada jalur ekstrinsik, sehingga mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin pada sistem fibrinolitik, serta mengubah kininogen menjadi kinin yang berperan dalam reaksi inflamasi. Jadi aktivasi faktor XII disamping mencetuskan pembekuan darah baik jalur intrinsik maupun jalur ektrinsik, juga mencetuskan sistem fibrinolitik dan kinin.20,21 Penemuan lain juga melaporkan peranan sistem kallikrein-kinin dalam menimbulkan dan mempertahankan aliran darah plasenta melalui : 12,22
proses vasodilatasi,
antiagregasi trombosit,
proliferasi sel dan
mempengaruhi invasi sel trofoblast saat kehamilan
FIBRINOLITIK KININ
PLASMIN
KININOGEN
PLASMINOGEN
XII
VII KALLIKREIN
XIIa
VIIa PREKALLIKREIN
INTRINSIK
EKSTRINSIK
Gambar 2.3. Hubungan antara sistem koagulasi, fibrinolitik dan kinin 21
2.4. Peranan Kallikrein Terhadap Angiogenesis Sistem kinin kallikrein telah ditunjukkan pada aktivasi angiogenesis dari percobaan terhadap tikus. Konsep kallikrein jaringan tidak hanya menunjukkan enzim-enzim dan fungsi-fungsi tertentu, tetapi juga terhadap kelompok enzim dengan penyimpanan dan struktur protein yang berlokasi pada lokus gen yang sama. Potensi yang saat ini sedang diteliti adalah peran kallikrein dalam proses angiogenesis. Kallikrein jaringan melepaskan kinin dari kininogen melalui pemecahan enzimatik. Peningkatan kadar kinin akan memacu peningkatan ekstravasasi plasma, vasodilatasi, dan inflamasi lokal. Kinin juga meningkatkan metabolisme melalui fosforilasi pada reseptor insulin sehingga menimbulkan translokasi terhadap pengangkutan glukosa ke membran plasma. Proses ini akan mengakibatkan terjadinya angiogenesis, menghambat apoptosis dan remodelling jaringan.23,24
2.4.1. Angiogenesis Angiogenesis adalah proses pertumbuhan pembuluh darah yang berasal dari perubahan struktur sel endotel pembuluh darah yang mengakibatkan perluasan aliran darah. Angiogenesis dapat berupa proses yang fisiologis ataupun patologis. Fungsi fisiologis terjadi pada pertumbuhan embrio dan pada siklus reproduksi wanita. Angiogenesis juga dapat berlangsung pada keadaan yang patologi seperti pada pertumbuhan tumor.23,24 Mekanisme angiogenesis dimulai dengan perubahan pada permukaan sel endotel, vasodilatasi, dan peningkatan permeabilitas kapiler yang dapat memicu ekstravasasi plasma protein. Kemudian proses destabilisasi membrana basalis oleh proteinase yang mengakibatkan sel endotel terpisah satu sama lain dan bermigrasi. Proses ini terus berjalan menimbulkan percabangan dan membentuk lubang pembuluh darah. Proses ini disempurnakan dengan pembentukan pericytes dan sel otot polos serta organisasi pembuluh darah yang baru membentuk jaringan seperti tiga dimensi. 23,25
Gambar 2.4. Mekanisme Angiogenesis 26 Hubungan antara tumor dengan mekanisme angiogenesis dapat terjadi dalam beberapa tahapan berikut: Awalnya tumor melepaskan angiogenic growth factor, yang berdifusi ke jaringan di sekitar tumor. Angiogenic growth factor ini akan berikatan dengan reseptor pada sel endotel yang berdekatan. Sekali reseptor ini berikatan dengan growth factor, maka sel endotel ini akan teraktivasi dan akan memberikan sinyal ke inti sel.26,27,28 Sel endotel ini akan mulai menghasilkan molekul baru termasuk beberapa enzim. Enzim-enzim ini akan melarutkan dan membuat lubang yang sangat kecil seperti sarung, yang tertutup pada lamina basalis. Kemudian sel endotel mulai berproliferasi dan bermigrasi ke arah luar mendekati massa tumor.26 Peranan molekul tertentu seperti integrin akan berikatan secara erat sehingga membantu pertumbuhan pembuluh darah. Dengan bantuan enzim matrix metalloproteinase maka jaringan akan dihancurkan untuk memfasilitasi perjalanan pembuluh darah yang baru.26,27 Kemudian tunas sel endotel tersusun membentuk lengkung pembuluh darah dimana lengkung pembuluh darah ini berhubungan dengan pembuluh darah utama
yang mengalirkan darah. Akhirnya, pembuluh darah baru terbentuk melalui penyempurnaan dengan pembentukan otot polos dan pericytes, sehingga aliran darah dapat berlangsung.27,28
2.4.2. Tumor dan Angiogenesis Angiogenesis memegang peranan penting dalam pertumbuhan tumor secara primer maupun dalam terjadinya metastase. Dilaporkan bahwa kallikrein berperan dalam mengatur proses-proses vital seperti : apoptosis, angiogenesis, dan metastase tumor dengan pemecahan substrat spesifik, mencakup growth factors, reseptor-reseptor hormon atau jaringan ikat. Enzim proteolitik terlibat dalam perkembangan tumor karena pengaruh degradasi matriks ekstraseluler.29 Matriks ekstraseluler adalah struktur khusus yang tersusun dari high molecular weight protein yang mengelilingi baik sel normal maupun sel kanker. Salah satu komponen matriks ekstraseluler adalah kolagen. Degradasi kolagen III oleh hK6, dapat mengarah pada timbulnya metastase. Komponen matriks ekstraseluler non kolagen seperti fibronectin, dan laminin, juga sangat penting dalam proses metastase. Fibronectin berperan dalam proses interaksi dengan molekul integrin selama migrasi sel tumor. Degradasi protein ini akan mempengaruhi migrasi sel, perlekatan, dan transduksi sinyal. Laminin adalah bagian dari matriks ekstraseluler dan basal membran yang membentuk jaringan dengan kolagen IV.26,27 Tumor dapat mempengaruhi aliran darah melalui efek mekanik pada pembuluh darah di sekitar tumor. Angiogenesis yang diinduksi oleh tumor menghasilkan pembuluh darah yang kompleks dengan aliran darah yang abnormal. Tumor dapat mengabsorbsi kebutuhan makanan dan oksigen dengan mekanisme difusi pada ukuran tumor 1-2 mm, dimana pada ukuran ini kebutuhan terhadap sel tumor dapat dipenuhi. Proses ini meliputi pemilihan terhadap pembuluh darah terdekat untuk dimulainya proses angiogenesis yang akan terus berlangsung dan bahkan akan menginfiltrasi kedalam massa tumor.26,27
Gambar 2.5. Pengaruh Angiogenesis dan Metastase Tumor 26 Migrasi sel kanker dari tumor primer dan invasi sel kanker ke jaringan sekitarnya merupakan langkah awal proses metastasis tumor. Dalam proses ini sistem fibrinolisis yang berperan khususnya urokinase-type plasminogen activator(uPA). U-PA akan berikatan dengan reseptornya(u-PAR) yang terdapat pada banyak sel antara lain monosit dan sel tumor, yang selanjutnya akan mempermudah perubahan plasminogen menjadi plasmin. Plasmin adalah protease yang mampu menghancurkan matriks ekstraseluler secara langsung atau tidak langsung dengan mengaktifkan matrix metalloproteinase (MMP). MMP akan menghancurkan kolagen dan protein matriks sehingga memungkinkan sel tumor dan monosit menginvasi matriks ekstraseluler dan jaringan sekitarnya.21
Gambar 2.6. Peran Human Tissue Kallikrein pada Perkembangan Tumor16 Human tissue kallikrein 1(hk1), hK2, dan hK3 merangsang pertumbuhan dan daya tahan sel tumor dengan merusak insulin-like growth factor binding proteins (IGFBP2,3,4 dan 5) yang melepas IGF1(mitogenic growth factor), yang berikatan dengan reseptor IGF1(IGF-1R) dan merangsang proliferasi sel tumor dan mencegah apoptosis. hK2 dan hK4 juga mengaktivasi sistem urokinase plasminogen activator- urokinase plasminogen activator receptor (u-PA dan uPAR), yang mengaktivasi latent growth factors dari matriks ekstraseluler. Human tissue kallikrein(hK) secara langsung merangsang pertumbuhan sel tumor melalui protease-activated receptors (PARs). hK3 juga dapat menekan pertumbuhan sel tumor dengan mengeluarkan TGFβ(Transforming Growth Factor) dari kompleks latennya, sehingga dapat berikatan dengan reseptornya(TGFβR). Human tissue kallikrein merangsang angiogenesis dengan memecah komponen-komponen struktural subendotel membran basal(BM) dan matriks ekstraseluler. hK juga berperan dalam kaskade proteolitik periseluler dengan aktivasi sistem u-PA dan u-PAR (terjadinya aktivasi plasmin) dan matrix metalloproteinases (MMPs) yang selanjutnya merusak matriks ekstraseluler, memfasilitasi invasi endotel dan migrasi. hK3 mengaktivasi latent TGFβ dan hK1 melepaskan bradikinin dari kininogen, merangsang respon angiogenesis melalui reseptor bradikinin. hK dapat mengakibatkan PAR signalling, yang menginduksi
proliferasi sel endotel. Secara berlawanan, hK3,hK6 dan hK13 juga menghambat angiogenesis dengan melepaskan angiostatin-like fragments dari plasminogen.16
2.5. Human Kallikrein Sebagai Biomarker Peranan dan pengaruh yang pasti dari kallikrein pada manusia masih belum jelas. Serin protease dikatakan mempunyai pengaruh pada perkembangan tumor, seperti invasi, proliferasi, dan metastase. Biomarker adalah molekul-molekul endogen (misalnya DNA, mRNA, protein) yang dapat diukur pada cairan tubuh, atau jaringan untuk mendeteksi adanya keganasan, evaluasi risiko kanker, mengetahui prognosis, dan monitor respon terapi, dalam usaha meningkatkan manajemen pengelolaan pasien.30 Goyal dkk menyatakan bahwa serine protease bekerja sebagai tumor supresor, seperti faktor anti angiogenik, apoptosis molekuler, atau penurunan pertumbuhan sel. Penemuan lain juga menjelaskan bahwa ekspresi yang berlebihan dari kallikrein, berhubungan dengan prognostik yang buruk pada pasien-pasien kanker.11,12 Tabel 2.2. Human Kallikrein sebagai Petanda Tumor Ovarium (mRNA atau kadar protein)12
2.6. Human Kallikrein 6 Sebagai Biomarker Keganasan Ovarium Gen KLK6 mengkodekan hK6 telah dapat dikloning secara terpisah oleh penelitian terdahulu yang masing-masing diberi nama zyme, protease dan neurosin. Akhir-akhir ini dibentuk nomenklatur yang seragam untuk semua penemuan baru kallikrein.1,31 Gen KLK6 mengkode trypsin-like protease dengan panjang 244 asam amino yang mengandung 16 asam amino sebagai pembawa sinyal peptida dan lima asam amino sebagai pembawa peptida aktif sehingga enzim yang matur hanya mengandung 223 asam amino.1 Beberapa penelitian tentang hubungan hK6 dengan kanker ovarium menunjukkan bahwa diantara banyak jenis kanker, hanya pada kanker ovarium, kadar hK6 pada sirkulasi menunjukkan peningkatan secara bermakna.32,33 Diamandis dkk melakukan pengukuran kadar hK6 dengan immunoassay pada 146 wanita dengan kanker ovarium. Kadar serum hK6 berhubungan dengan CA 125 dan meningkat konsentrasinya pada stadium lanjut, derajat tinggi dan pasienpasien dengan histopatologi tumor ovarium tipe serosum.31 Penelitian dilakukan terhadap 97 wanita sehat, 141 pada wanita dengan tumor jinak dan 146 dengan tumor ganas ovarium konsentrasi rata-rata 2,9 µg/L – 3,1 µg/L dijumpai pada wanita normal dan tumor jinak ovarium sedangkan pada tumor ganas ovarium dijumpai peningkatan dengan kadar rata-rata 6,8 µg/L. Kemudian konsentrasi hK6 ini akan menurun setelah dilakukan pembedahan dengan nilai rata-rata 3,9 µg/L.1 Tabel 2.3. Perbandingan Sensitivitas dan Spesifisitas Serum hK61
Sensitivitas serum hK6 pada 90% dan 95% spesifisitas adalah 52% dan 47% dari seluruh pasien. Pada stadium dini (stadium I atau II), sensitivitas serum hK6 berkisar 21-26%. Apabila dikombinasi dengan CA 125, sensitivitas meningkat menjadi 37-42%. Konsentrasi hK6 preoperatif merupakan indikator prognosis paling kuat terhadap perkembangan pasien. Pasien dengan kadar hK6 preoperatif diatas 4,4 µg/L secara signifikan memiliki prognosis yang lebih jelek dibandingkan dengan pasien dengan kadar serum hK6 preoperatif yang lebih rendah.1 Dua penelitian sebelumnya mendapatkan bukti awal hK6 mempunyai arti klinis pada kanker ovarium. Diamandis menemukan sebanyak 66% dari 80 orang pasien dengan kanker ovarium dengan peningkatan serum hK6 sebesar 15 µg/L. Data dari Tanimoto menunjukkan peningkatan ekspresi transkrip hK6 pada tumor ovarium. Dengan PCR kuantitatif, terjaring 44 pasien dengan tumor ovarium dan 10 ovarium normal dan mendapatkan 6 ekspresi hK6 mRNA yang meningkat secara bermakna baik pada stadium dini dan stadium lanjut, namun tidak pada ovarium normal.34 Menurut Hoffman, hK6 dibentuk oleh sel-sel epitel ovarium dan tersebar secara difus dengan kompartemen sitoplasmik. Kanker ovarium epitelial merupakan salah satu dari keganasan ginekologi dengan prognosis penyakit yang buruk. Hal ini disebabkan oleh karena lebih dari tiga perempat diagnosis
ditegakkan saat penyakit sudah menyebar (metastasis) baik regional maupun metastase jauh.34 White dkk, mendapatkan lokasi imunohistokimia KLK6 dan KLK13 pada sel epitel permukaan ovarium, dan sel epitel kanker ovarium. KLK6 memberikan pewarnaan yang kuat pada adenokarsinoma tipe musinosum, sedangkan KLK13 terekspresi kuat pada tumor jenis clear cell. Saat diagnosis ditegakkan, 65% dari seluruh pasien, terdiagnosis dengan kanker ovarium tipe serosum. Didapatkan ekspresi KLK6 mRNA yang tinggi berhubungan dengan karsinoma ovarium tipe serosum. Pada seluruh kanker ovarium tipe endometrioid memiliki ekspresi KLK13 mRNA yang tinggi.35 Peningkatan konsentrasi serum kallikrein pada kanker ini kemungkinan karena peningkatan vaskularisasi (angiogenesis) dari sel kanker, penghancuran struktur kelenjar jaringan yang terlibat, dan kebocoran protein tersebut ke dalam sirkulasi sistemik. Hal ini dapat terjadi oleh karena ekspresi gen yang berlebihan.34,36 Ekspresi gen ini didapatkan meningkat pada 67 orang dari 80 kasus tumor ovarium dan terdapat perbedaan yang bermakna antara tumor ovarium jinak dan ovarium normal serta tumor borderline dan invasif (p<0,001). Ekspresi hK6 yang tinggi, banyak ditemukan pada stadium dini dan tumor low grade, menunjukkan bahwa ekspresi berlebihan protein hK6 adalah merupakan fenomena awal dalam perkembangan kanker ovarium.37 Tabel 2.4. Ekspresi hK6 pada Analisis Imunohistokimia Berdasarkan Karakteristik Histopatologis37
Pada tabel diatas menunjukkan bahwa pada jaringan ovarium normal (sehat) dan tumor ovarium jinak memiliki skor rata-rata imunostaining (mean immunostaining score) yang lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kanker (tumor ovarium borderline dan invasif). Pada penelitian tersebut didapatkan peningkatan ekspresi protein hK6 pada sel-sel tumor ovarium dibandingkan dengan sel epitel ovarium normal, dan tumor ovarium jinak, serta tidak terdapat perbedaan ekspresi hK6 yang bermakna diantara kelompok subtipe, derajat diferensiasi tumor, dan stadium kanker ovarium. Kanker ovarium tipe musinosum dapat berasal dari lesi jinak atau borderline. Ekspresi hK6 yang meningkat merupakan tahapan awal perkembangan kanker dan hK6 berpotensi sebagai biomarker dalam deteksi dini kanker ovarium. Kadar hK6 mRNA konsisten dengan kadar protein, yang menunjukkan bahwa proses transkripsi adalah suatu mekanisme yang mengatur ekspresi hK6. Mekanisme lain yang dapat menyebabkan peningkatan ekspresi hK6 pada tumor ovarium adalah amplifikasi gen, yang dapat diperiksa dengan Southern blot dan quantitative real-time PCR.37
Menurut Emami dkk, KLK6 adalah kandidat biomarker yang paling menjanjikan, karena secara klinis terkait dengan stadium lanjut, derajat diferensiasi tinggi (high grade), tipe histologis serous, disease-free survival dan respon terhadap kemoterapi.38 Tabel 2.5. Model Multiparameter Gen Kallikrein dan Biomarker Lainnya38
2.7. Cara Pemeriksaan Human Kallikrein 6 Pemeriksaan hK6 menggunakan sistem immunoassay dua langkah dengan format 96-well plate menggunakan hK6 rekombinan standar dan dua antibodi monoklonal tikus. Hal ini mengacu pada gambaran pemeriksaan terdahulu oleh Diamandis. Lempeng Elisa ini telah diselubungi dengan antibodi monoklonal spesifik terhadap protein hK6. Ditambah Buffer II ke dalam semua sediaan dan dilanjutkan dengan hK6 standar atau sampel yang tidak diketahui. Protein hK6 pada sediaan standar atau sampel diikat oleh ikatan antibodi monoklonal.39 Setelah material yang tidak terikat dibuang, biotin pendeteksi antibodi monoklonal ditambahkan ke seluruh lempeng Elisa. Pendeteksi antibodi biotin ini berikatan dengan hK6 protein membentuk formasi sandwich. Ikatan antibodi
biotin ini dideteksi dengan penambahan senyawa streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) dan substrat Tetramethylbenzidine(TMB).39 Reaksi ini dihentikan dengan pemberian asam sulfat yang mengubah warna biru menjadi kuning yang diukur pada panjang gelombang 450 nm. Absorpsi cahaya tersebut sesuai dengan jumlah hK6 pada sampel.39
2.8. Penelitian Human Kallikrein 6 di Indonesia Penelitian human kallikrein 6 telah dilaksanakan di Indonesia, tepatnya di Fakultas Kedokteran Universitas Sumatra Utara. Dalam penelitian tersebut, Marpaung membandingkan ketepatan human kallikrein 6 sebagai prediksi keganasan ovarium dibandingkan dengan CA 125. Dari penelitian tersebut disimpulkan bahwa insiden kanker ovarium banyak dijumpai pada usia reproduksi. Selain itu, didapatkan peningkatan secara bermakna human kallikrein 6 (hK6) pada tumor ganas ovarium dibandingkan dengan tumor jinak dan secara uji diagnostik didapatkan sensitivitas yang tinggi (71,4%) namun dengan spesifisitas yang rendah (33,3%). Dalam penelitian tersebut juga didapatkan peningkatan secara bermakna CA 125 pada tumor ganas ovarium dibandingkan dengan tumor jinak dan secara uji diagnostik didapatkan sensitivitas yang lebih besar dan spesifisitas yang lebih rendah dibandingkan dengan hK6. Penelitian ini dilakukan di RSUD dr Pirngadi Medan dan Laboratorium National University of Singapore.40 Penelitian human kallikrein-6 belum pernah dilakukan di Bali.
BAB 3 RINGKASAN
Kanker ovarium merupakan kanker kedua terbanyak pada wanita, dimana angka kejadiannya meningkat dari tahun ke tahun. Salah satu hal yang dapat menyebabkan terjadinya peningkatan rasio angka kesakitan dan kematian penderita kanker ovarium adalah sulitnya melakukan deteksi dini.1,2,5 Hingga saat ini belum dapat ditemukan suatu alat deteksi dini yang ideal bagi penderita kanker ovarium. Pendekatan genetik pada manusia, dapat membantu meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas beberapa petanda tumor dalam diagnosis dan prognosis kanker ovarium. 6,7 Potensi kallikrein yang saat ini sedang diteliti adalah perannya dalam proses angiogenesis. Peningkatan kadar kinin akan memacu peningkatan ekstravasasi plasma, vasodilatasi, dan inflamasi lokal. Proses ini akan mengakibatkan terjadinya angiogenesis, menghambat apoptosis dan remodeling jaringan.23,24 Angiogenesis berperan penting dalam pertumbuhan tumor secara primer maupun dalam terjadinya metastase. Enzim proteolitik terlibat dalam perkembangan tumor karena pengaruh degradasi matriks ekstraseluler.29 Migrasi sel kanker dari tumor primer dan invasi sel kanker ke jaringan sekitarnya merupakan langkah awal proses metastasis tumor. 21 Beberapa penelitian tentang hubungan hK6 dengan kanker ovarium menunjukkan bahwa hanya pada kanker ovarium, kadar hK6 pada sirkulasi menunjukkan peningkatan secara bermakna.32,33 Penelitian oleh Diamandis dkk mendapatkan bahwa konsentrasi hK6 preoperatif merupakan indikator prognosis paling kuat terhadap perkembangan pasien. Pasien dengan kadar hK6 preoperatif diatas 4,4 µg/L secara signifikan memiliki prognosis yang lebih jelek.1 Dari berbagai penelitian, menunjukkan bahwa human kallikrein 6 adalah biomarker yang paling menjanjikan, karena secara klinis terkait dengan diagnosis, prognosis dan monitoring kanker ovarium.38
DAFTAR PUSTAKA
1.
Diamandis EP. Et al. Human Kallikrein 6 (hK6) : A New Potential Serum Biomarker for Diagnosis and Prognosis of Ovarian Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 2003: 21(6): 1035-43.
2.
Karyana, K. 2005. ”Profil Kanker Ovarium di Rumah Sakit Sanglah Denpasar Periode Januari 2002 Sampai Desember 2004”(tesis). Denpasar : Universitas Udayana.
3.
Jemal A, Murray T, Samuels A, et al. Cancer Statistics. Cancer J Clin .2003: 53 : 5-26.
4.
Harlan LC, Clegg LX, Trimble EL. Trends in surgery and chemotherapy for women diagnosed with ovarian cancer in the United States. J Clin Onco. 2003. 21: 3488-94.
5.
Schilder J, M et al. Hereditary Ovarian Cancer : Clinical Syndrome and Management. Ovarian Cancer. 2nd edition. Rubin S, C. Lippincott Williams and Wilkins. 2001:181-200.
6.
Look, KY. Epidemiology, Etiology, and Screening of Ovarian Cancer. Ovarian Cancer. 2nd edition. Rubin S, C. Lippincott Williams and Wilkins. 2001:167-177
7.
Karst, A.M, Drakin, R. 2009. Ovarian Cancer Pathogenesis: A Model in Evolution. (serial online), [cited 2010 Aug. 4]. 2009. Available from: URL: http://www.hindawi.com/journals/jo/2010/932371.html.
8.
Hogdall, E.V.S., Christensen, L., Kjaer, S.K. CA125 Expression Pattern, Prognosis and Correlation with Serum CA125 in Ovarian Tumor Patients. From The Danish “MALOVA” Ovarian Cancer Study. (serial online),
[cited
2010
URL:
Aug.
21].
2007.
Available
from:
http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/types/ovary/ riskfactors. 9.
Hoskin, W, J. Basic Science of Gynaecology Oncology. Williams and Wilkins. 2000: 9-12.
Lippincott
10.
Kramer J, L et al. Epidemiology of Ovarian, Fallopian Tube and Primary Peritonal Cancer, In Gynecologic Cancer. Thomas Gillian. Elsevier Churchill Livingstone, 2004:327-340.
11.
Human Prostate-Spesific Antigen and Glandular Kallikrein : Production and Characterization of The Recombinant Protein and Association with Prostate Cancer. Oulu University Library. 2002 : 1-12.
12.
Borgono CA, Michael IP, Diamandis EP. Human Tissue Kallikreins : Physiologic Roles and Application in Cancer. Mol Cancer Res. 2004 : 257-80.
13.
Diamandis EP, Yousef GM, Clements J. New Nomenclature for the Human Kallikrein Gene Family. In Clinical Chemistry. 2000 : 11: 1855-58.
14.
New Tools : Human Tissue Kallikrein Products. 2004 :1-2. Available from http://www. RD system.
15.
Harvey T.J, Hooper J.D, Myers S.A, et al. Tissue-spesific Expressions Patterns an Fine Mapping of the Human Kallikrein (KLK) Locus on Proximal 19q13.4. The Journal of Biological Chemistry. 2000 : 275(48): 37397-406.
16.
Borgono C.A, Diamandis E.P. The Emerging Roles of Human Tissue Kallikreins in Cancer. Nature Reviews Cancer. 2004 : 877-90.
17.
Wolf W.C, Evans DM, Chao Lee, et al. A Spesific Tissue Kallikrein Inhibitor Supressor Cancer Cell Invasiveness. American Journal of Pathology. 2001: 1-13.
18.
Chao Julie, Miao R.Q, Chent Vincent, et al. Novel Roles of Kallistatin, a Spesific Tissue Kallikrein Inhibitor, in Vascular Remodelling. Biol Chem. 2001: 382: 15-21.
19.
Carretero O.A. Vascular remodelling and the Kallikrein-Kinin System. J.Clin.Invest. 2005:115: 1-7.
20.
Escobar C.E., Harmening D.M., Joiner Maier D.M, et al. Hemostasis and Introduction to Thrombosis. Clinical Hematology and Fundamentalis of Hemostasis. 4th Ed. 2001: 441-70.
21.
Setiabudy R.D. Hemostasis dan Trombosis.Edisi 4. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 2009 : 142-150.
22.
Hecquet C, Tan Fulong, Marcio B.M, et al. Human Bradykinin B2 Receptor is Activated by Kallikrein and other Serine Proteases. In Molecular Pharmacology. 2000 : 58(4):1-18.
23.
Emanueli C et al. Angiogenesis Theraphy with Human Tissue Kallikrein for The Treatment of Ischemic Disease. Cardiovasculer Research. 2004.
24.
Schmaier AH. The Kallikrein-Kinin and The Renin Angiotensin Systems Have A Multi Layered Interaction. Am J Phsial Intgr Comp Physiol. 2003 : 285:1-13.
25.
Sonoda H et al. Multiple Processing Forms and Their Biological Activities of A Novel Angiogenesis Inhibitor Vasohibin. Biochemical and Biophysical Research Communication. 2006:342(64): 1-646.
26.
Pandya NM et al. Angiogenesis – A New Target For Future Therapy. Vascular Pharmacology. Department of Pharmacology. India. 2006: 1-10.
27.
J de Castro, Gilberto et al. Angiogenesis and Cancer : A Cross-Talk between Basic Science and Clinical Trials (the “do ut des” paradigm), Elsevier. 2006 : 1-11.
28.
Mettouchi A et al. Distinct Rates of β1 Integrins During Angiogenesis. In European Journal of Cell Biology .2006 :85:243-7.
29.
Yousef GM, et al. Kallikreins, steroid hormones and ovarian cancer : is there a link? Minerva Endocrinology. 2002 : 27:157-66.
30.
Rye P.D. Stigbrand T. The Bioinformatic Catalyst in The Kallikrein Family. Tumor Biology. 2004 : 327 – 8.
31.
Diamonds, E.P. et al. Human Kallikerin 6 (zyme/Protease M/Neurosin) : A New Serum Biomarker of Ovarian Carcinoma. Clinical Biochemistry. 2000 : 33(7):579-83.
32.
Magklara, A et al. Characterization of the enzymatic activity of human kallikrein 6 : autoactivation, substrate specificity. Biochemical and Biophysical Research Communication. 2003: 307: 948-55.
33.
Pampalakis, G et al. Cloning and Characterization of Novel Isoforms of The Human Kallikrein 6 gene. Biochemical and Biophysical Research Communication. Elsevier. 2004 : 320:54-61.
34.
Hoffman, BR et al. Immunofluorometric quantitation and histochemical localisation of kallikrein 6 protein in ovarian cancer tissue : a new independent unfavourable prognostic biomarker. British Journal of Cancer. 2002 : 87:76371.
35.
White NMA, et al. KLK6 and KLK13 predict tumor recurrence in epithelial ovarian carcinoma. British Journal of Cancer. 2009: 101: 11071113.
36.
Yousef GM, et al. Expanded Human Tissue Kallikrein Family-A Novel Panel of Cancer Biomarkers. Tumor Biology Review. 2002: 23:185-92.
37.
Zhang W, et al. Characterisation of Human kallikrein 6/protease M expression in ovarian cancer. Bristish Journal of Cancer. 2004 : 91:725-31.
38.
Emami N,et al. Utility of Kallikrein-Related Peptidases (KLKs) as Cancer Biomarkers. Clinical Chemistry. 2008 : 54(10): 1600-1607.
39.
Human Kallikrein 6 Research Elisa (hK6). Available at : http ://www.ibex.ca/vz-kalorvield.htm.
40.
Marpaung J. 2007.”Ketepatan Human Kallikrein-6 sebagai Prediksi Keganasan Ovarium dibandingkan dengan CA-125”(tesis). Medan : Universitas Sumatra Utara.
