Biomarker molekulák jelentısége az idegrendszer betegségeiben Kovács L. Gábor PTE ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézete, PTE ETK Diagnosztikai és Menedzsment Intézete és MEDIPOLIS Egyetemi Tudásközpont, Pécs
Genetika és a betegségek iránti fogékonyság Fenotipus 1
Fenotipus 2
Fenotipus 3
Fenotipus 4
Etnikum Környezet
Kor Nem Gének azonosítása Farmakokinetika Metabolizmus
Endokrin Biomarker Molekulák
Élettan
Proteóma Transzkriptóma
Immunológia Morfometria
Betegségek iránti fogékonyság prediktív értékelése
Biomarker: olyan biokémiai jellemzı, amely alkalmazható a betegségek elırehaladásának vagy a gyógykezelés eredményességének nyomon követésére
Fıbb jellemzıi: – Objektíven mérhetı – Objektíven értékelhetı – Normális vagy kóros folyamatok indikátora, vagy a szervezet gyógyszerre adott válaszának jelzıje
FDA definíció (bizonyossági szintek): – Lehetséges biomarker – Valószínő biomarker – Bizonyított értékő biomarker
A biomarkerek osztályozása
Kórlefolyás markerei – Terápiában nem részesülı betegeknél prediktív a kimenetel szempontjából.
Biológiai aktivitás markerei – A gyógyszerhatással összefüggı válasz nagysága és gyakorisága.
Helyettesítı végpont – Epidemiológiai, terápiás, kórélettani és egyéb tudományos bizonyítékokon alapuló, a klinikai kimenetelt megbízhatóan elırejelzı markerek. – Egyszerő vagy összetett marker, amely a terápia klinikai hasznát mutatja.
Biomarkerek osztályozása
„State markerek”: a betegség meglétét jelzik „Stage markerek”: a súlyosságot jelzik
Liquor markerek Perifériás markerek
Genetikai markerek Fenotípus markerek
Biomarkerek klinikai használata Biomarker típusa
Biomarker leírása
Szőrımarkerek Prognosztikai markerek Diagnosztikai markerek Rétegzıdési markerek
-
Toxicitási markerek
-
Hatásossági markerek Differenciálódási markerek
Betegségprevenció A legjobb terápia kiválasztása Diagnózis, differenciáldiagnózis Gyógyszerhatás valószínőségének kimutatása Toxicitás valószínőségének kimutatása A klinikai kimenetel elırejelzése Differenciálás
Központi idegrendszeri rendellenességek: alig értjük, és nincs hatékony terápia?
Központi idegrendszeri rendellenességek – Neurodegeneratív (pl. AD, HD, PD) – Pszichiátriai (depressziós kórállapotok, skizofrénia, szenvedélybetegségek). Genetikus és környezeti tényezık. Számos teória – csak kevés biokémiai útvonalat térképeztek fel. A betegség tünetei, progressziója és a terápiára adott válasz változó. Az állatmodellek nem teljesen megfelelıek. Megbízható biomarkerek segítséget jelentenének.
Neurodegeneratív betegségek
Számos különbözı központi idegrendszeri betegség jellemzıje a progresszív idegszövet-pusztulás (neurodegneráció). Alzheimer-kór Parkinson-kór Amyotrophiás lateral sclerosis Huntington-chorea
Alzheimer-kór (AD): létezik-e ideális biomarker? Folyamatos romlást mutató (progresszív) agyi megbetegedés, mely demenciához vezet és a mindennapi életvitelt, önellátó képességet nagyban befolyásolja. A következı kritériumoknak kellene megfelelnie:
Neuropatológiailag igazolt esetekben legyen pozitív: – > 85% érzékenység AD kimutatására; – > 75% specificitás az AD elkülönítésére a dementia egyéb okaitól;
Legyen megbízható és olcsó; Legyen kényelmes a használata, és ne legyen ártalmas a betegre.
Alzheimer-kór (AD) Elırejelzı markerek: azonosíthatják azokat az egyéneket, akik:
Korai AD-ben szenvednek (már a pre-dementia stádiumban). Hajlamosak szimptómás AD kialakulására. Akiknek leginkább hasznára lehet a betegség progresszióját lassító vagy preventív intervenciós eljárások kifejlesztése.
Halál elıtti biokémiai markerek:
Évek óta vizsgálják különféle perifériás szövetekben és sejtekben: – – – – –
Vörösvértestek Limfociták Vizelet Haj Bır
Amiloid prekurzor fehérje
Az APP-gén a 21. kromoszómán van. Az APP transzmembrán fehérje, amelyet szekretázok bontanak le. Ezek a felelısek a különféle hosszúságú (39-43 aminosav) amiloid béta-fehérjék keletkezéséért. A szekretázok sAPP-t bocsátanak ki (az APP extracelluláris részét), amely fontos élettani szerepet játszik, többek között trofikus aktivitásokban. Az amiloid béta-kódoló szekvencia patológiás mutációi familiáris AD-t idéznek elı. Az Abéta 40 és 42 az amiloid plakk fı összetevıi.
A presenilin-1 gén szekvenciája (kék) és az APP szekvenciájának egy része (zöld)
Alzheimer
A neurofibrilláris szövevényben (mikrotubulus) egy sejtváz-fehérje (tau protein) polimerizált terméke halmozódik fel.
A neuron és a glia komponense. Számos etiológiai tényezı (pl. foszforiláció, mutáció) kapcsolja a neurodegenerációhoz. Az intracelluláris felhalmozódás egyik oka a hiperfoszforiláció lehet. A biológiai mintázat és az eloszlás alapján legalább öt különféle „taupátia” különíthetı el, az egyik az AD.
Perifériás biomarkerek Alzheimer-kórban
Amiloid béta 42 peptid a plazmában: nem eléggé szenzitív és specifikus a korai diagnózishoz
Amiloid prekurzor fehérje a thrombocytákban: a thrombocytákban mérhetı APP-koncentráció azonos az agyban mérhetıvel
Amiloid kaszkád a thrombocytákban: az amiloid kaszkád molekuláris kulcselemei: – APP formák – béta-szekretáz (béta helyen hasító APP enzim) felelıs az amiloidogén útvonalért – alfa-szekretáz (dizintegrin és metalloproteáz) felelıs a nem-amiloidogén metabolizmusért
Liquor biomarkerek Alzheimer-kórban
Amiloid béta peptid: – A plakkok fı fehérje alkotóeleme – Az APP proteolitikus hasítása során keletkezik.
Össz-tau és foszfo-tau szintek: – Az abnormálisan hiperfoszforilált (p-tau) páros helikális filamentumok fı fehérje alegysége.
Oxidatív stressz biomarkerek: – A fehérje-, lipid- és nukleinsavoxidáció markereinek emelkedése – Az antioxidáns enzimek csökkent aktivitása
„State marker” marker Alzheimerkórban: össz-tau a liquorban AD: az idegszöveti károsodás és degeneráció intenzitását mutatja. Ischaemiás stroke: átmenetileg emelkedik, ez korrelál az érintett terület nagyságával. Creutzfeldt-Jakob-betegség: itt emelkedik legnagyobb mértékben. Depresszió: normális koncentráció.
„Stage markerek” Alzheimer-kórban
Állapotjelzı markerek mutatják, hogy a degeneratív folyamat mennyire elırehaladott. Példa az AD-állapotjelzı markerekre: a hippocampus atrófiája, amely CT vagy MRI segítségével mutatható ki. Szintén állapotjelzı marker a klinikai besorolási skála (kognitív hanyatlás). Egy új celluláris állapotjelzı: a kazein-kináz (CK-1) magas szintje a vakuólumokban hasznos ADmarker.
Új diagnosztikus biomarkerek Alzheimer-kórban
Még nem találtak olyan neurokémiai markert, amely csak az AD-re lenne jellemzı. A diagnosztikus pontosságot fokozhatja, ha egyszerre több szérum és plazma biomarkert is meghatározunk. Új tömegspektrometriai technikákat fejlesztettek ki az AD korai kimutatása céljából, pl. MALDI-ToF (matrix-assisted laser-desorption-ionisation timeof-flight), tömegspektrometria (MS) és elektrospray-ionizáció (ESI).
Az Alzheimer-kór genetikai diagnózisa
Az összes eset 0.3%-ában kb. 100 lehetséges mutáció Presenilin-1 gén mutációi Presenilin-2 gén mutációi Amiloid prekurzor fehérje gén mutációi ApoE polimorfizmus
Apolipoprotein E4 Alzheimer-kórban
Szerepe: – – – –
lipidek újraelosztása az idegsejtek között, a károsodott idegsejtek javítása, a szinaptodendritikus kapcsolatok fenntartása a toxinok eliminálása.
Az ApoE neurológiai rendellenességeket okozhat közvetlenül is, vagy összefüggésben az életkorral, fejsérüléssel, oxidatív stresszel, ischaemiával, gyulladással és túlzott amiloidpeptid képzıdéssel. Az ApoE4 patológiás konformáció, amely stabil, reaktív, potenciálisan patológiai aktivitással rendelkezı intermedierek képzıdéséhez járul hozzá.
Apolipoprotein E4 Alzheimer-kórban
Válaszként a stresszre az idegsejt apoE-t szintetizál. Az ApoE4 neuronspecifikus proteolízisen megy át, bioaktív toxikus fragmentumokat eredményezve. Szerkezetjavítók: az apoE4-et ‘‘apoE3-szerő’’ molekulává alakítva akadályozzák meg a toxikus apoE4 fragmentumok kialakulását, a ‘‘mitokondriális védık’’ pedig megakadályozzák a sejt energiaegyensúlyának felborulását
A Parkinson-kór etiológiája Környezeti tényezık
+ Parkinson-kór/ Parkinsonizmus
Gének
A Parkinson-kór (PD) diagnosztikája
Nincs specifikus biomarker PD-re. Diagnózis: – nyugalmi tremor – rigiditás – bradikinézis – a tüneteket kiváltó egyéb ok (pl. neuroleptikum-használat) hiánya. Az idiopátiás PD jellemzıen a test egyik oldalán kezdıdik. Nem ritka a téves diagnózis, így végleges vélemény csak a boncolás után állítható fel.
A Parkinson-kór ritka, familiáris formájáért felelıs gének Nagy családok analízise (sok érintett egyénnel) rávilágított arra, hogy számos génmutáció és locus-replikáció létezik, amely PD-t idéz elı. – α-synuclein – Parkin – DJ-1 – PINK – LRRK2 – UCHL1?
(Simplified pedigree demonstrating linkage to the parkin Ex3∆40 mutation. Munhoz. Arch Neurol 2004;61:701)
A Parkinson-kór sporadikus, késıi kezdető formájával összefüggésben lévı gének Néhány
– – – – –
pozitív adat:
Tau-H1 haplotípus α-synuclein promóter variáns UCHL1 variáns Vezikuláris monoamin transzporter-2 (VMAT2) Leucingazdag repeat kináz 2 (LRRK2)
Sok
más génnel kapcsolatban ellentmondó eredmények Lassú progresszió, módszertani nehézségek.
LRRK2 és környezeti hatások Leucingazdag repeat kináz 2 – Az LRRK2 mutáció változatos klinikai és patológiai fenotípust okoz. – A változatos fenotípus és a betegségkezdet széles spektruma arra utal, hogy egyéb genetikai variációk, környezeti tényezık és/vagy véletlenszerő események is módosítják az LRRK2-kapcsolt betegséget. Zimprich et. al. Neuron 2004. Taylor et al. Science, 2006
A környezeti tényezık figyelembevétele leegyszerősítheti a komplex betegségek megértését
LRRK2 gén
LRRK2 G2019S
LRRK2 G2019S
LRRK2 G2019S
Környezeti tényezık
+ + +
PCB, fertızések
Prenatális peszticidek
Foglalkozási fémártalom
Fenotípus/Patológia
Késıi kezdető PD; tipikus PD patológia (Lewy-testek)
Korai kezdet; kérgi Lewy-testek
Nagyon késıi vagy nem PD
Gyulladás és Parkinson-kór Kontroll
Boncoláskor a PD-s agyvelıben gyakran mutatóak ki aktív gyulladásra utaló jelek.
A gyulladás-asszociált génvariánsok befolyásolhatják a PD kezdetét.
Számos toxin (rotenon, MPTP, LPS) áll kapcsolatban a gyulladás fokozódásával és a dopaminerg neuronok pusztulásával.
A gyulladásellenes ágensek védıhatásúnak bizonyultak néhány állatmodellben.
A humán alkalmazás részletei jelenleg még megfontolás tárgyát képezik.
LPS LPS önmagában
3H önmagában
LPS + 3H
Morphinian (3H) protects dopaminergic neurons from LPS toxicity Zhang. Faseb 2005;19:395.
Amyotrophiás Lateralsclerosis (Louis Gehrig-kór)
A felsı és alsó motoneuronok degenerációja, amely végtaggyengeségben, beszéd- és nyelési nehézségben nyilvánul meg, és végül légzıizom-elégtelenséghez vezet. Az ALS-esetek 90%-a sporadikus, 10%-a familiáris. Incidencia: 3/100.000 fı Általában 2-5 évvel a diagnózis felállítása után halálhoz vezet, a betegek 10%-a él több, mint 10 évig A familiáris esetek egyötödéért a szuperoxiddizmutáz mutációi a felelısek. Jelenleg nincs olyan vérteszt, amely alkalmas lenne az ALS diagnózisára vagy a betegség lefolyásának monitorozására
STEPHEN HAWKING (1942- )
Cu2+, Zn2+ szuperoxid dizmutáz (SOD)
153 aminosav Két azonos alegységbıl álló dimér, az alegységek mindegyike egy Zn2+ és egy Cu2+ atomot köt Normálisan mint szuperoxid (O2-) scavenger mőködik a sejtekben Cu2+SOD O2O2 Cu1+SOD O2H2O2 A mutáns SOD-nak csökkent az affinitása a Zn2+ irányában Transzgénes állatkísérletek szerint a mutáns SOD-nak toxikus funkciója alakul ki
Huntington-chorea (HD)
Autoszomális dominánsan öröklıdı, progresszív neurodegeneratív kórkép. A korai tünetek a kognitív képességeket és a mozgást érintik, beleértve a depressziót, a hangulatingadozást, a feledékenységet, az akaratlan rángatózást és a koordinációs zavart. Ahogy a folyamat elırehalad, a koncentráció és a rövidtávú memória rosszabbodik és a fej, a törzs és a végtagok akaratlan mozgásai fokozódnak. A beteg képessége a sétára, beszédre és nyelésre romlik.
A genetikai mutációk a 4, kromoszóma IT-15 génjét érintik (trinukleotid repeat mutáció).
A fehérjék osztályozása HD-ben
N-acetil-aszpartát (NAA)
Az acetil csoportot szállítja a lipidek szintéziséhez. Szabályozza az agyi fehérje szintézist. Az acetil-CoA és az aszpartát raktározott formája. Agyi ozmotikus nyomás egyik fenntartója. Érzékeny és kvantitatív mérése már 1995 óta elfogadott módszer az idegsejtek épségének megállapítására HD-ban és más neurológiai betegségekben. Hiánya mágneses rezonancia spektroszkópiával (MRS) mérhetı, amely hasonló az MRI-hez.
A DNS és RNS oxidativ károsodásának perifériás biomarkerei Huntington betegségben •Agyi oxidativ stressz perifériás biomarkerei: 8-hidroxideoxiguanozin (8OHdG) és a 8OHrG •Mindkét marker az idegsejteket ért oxidatív károsodás vérbıl mérhetı markerének tekinthetı. •A 8OHdG-szint más idegsejtkárosodások esetén is megemelkedik, mint pl. stroke, Parkinson-kór és Alzheimer-kór. •A 8OHdG egyaránt emelkedik korai, manifeszt HD-ben és premanifeszt HDben.
Az idegsejtkárosodás biokémiai markerei Szükséges jellemzık Magas specificitás agykárosodásra Magas szenzitivitás agykárosodásra Azonnali analízis Látens Point-of-Care teszt iTBI iTBI
• Irritabilitás • Kólika • ALTE • Hányás
Magas kockázat ismétlıdı károsodásra/ halálra
Agykárosodás szőrése
Lehetséges markerek: Neuronspecifikus enoláz (NSE) S100B Mielin-bázikus fehérje (MBP)
Neuronspecifikus enoláz (NSE)
Az idegsejtek citoplazmájában lévı enzim Liquorból és szérumból mérhetı ELISA vizsgálathoz 100µl szérum szükséges, 1 óra alatt van eredmény Szérum féléletidı: 24 óra Figyelem: Érzékeny a hemolízisre!
S100B
Kalciumkötı fehérje alfa és béta alegységekkel Az asztroglia sejtek citoszoljában található Liquorból és szérumból mérhetı ELISA vizsgálathoz 100µl szérum szükséges, 1 óra alatt van eredmény Nem érzékeny a hemolízisre Figyelem: – Nagyon rövid szérum féléletidı – Extracerebrális eredet is felmerül
Mielin-bázikus fehérje (MBP)
Nagy mennyiségben fordul elı az idegsejtek mielinjében Liquorból és szérumból mérhetı ELISA vizsgálathoz 100µl szérum szükséges, 1 óra alatt van eredmény Nem érzékeny a hemolízisre Szérum féléletidı: 12 óra Figyelem: – Csak súlyos sérülés vagy intracerebrális vérzés emeli a szintjét – Nagyon kevés korábbi kutatás foglalkozott vele
SCLEROSIS MULTIPLEX
Immunmediált kórállapot, amely genetikailag arra hajlamos egyéneknél alakul ki. Genetikai és környezeti tényezık (például vírusfertızések, bakteriális lipopoliszacharidák, szuperantigének, reaktív metabolitok és metabolikus stressz) elısegíthetik a kialakulását.
Liquorvizsgálat sclerosis multiplexben
Hasznos, de nem diagnosztikus értékő – Egyéb állapotok
Krónikus központi idegrendszeri fertızések, vírusfertızés utáni szindrómák, neuropátiák
Immunglobulin rendellenességek – Immunglobulin-termelés – Központi idegrendszeri plazmasejtek termelik
Oligoklonális immunglobulin sávok (IgG) – Liquorból, nem szérumból – Izoelektromos fókuszálás
Emelkedett IgG-index – A szérum és a liquor IgG/fehérje aránya – index = (liquor IgG/liquor albumin) (szérum IgG/szérum albumin)
OLIGOKLONÁLIS SÁVOK A LIQUORBAN
Szők specificitású immunglobulinok fokozott intrathecalis szintézise: oligoklonális sávok, az IgG termelése fokozott lehet, enyhe lymphocytás pleiocytosis (majdnem minden esetben kevesebb, mint 50 mononukleáris sejt)
EGYÉB BIOMARKEREK SCLEROSIS MULTIPLEXBEN
Axonális citoszkeleton markerek a liquorban és a plazmában – A neurofilamentum könnyő- vagy nehézlánca – Tubulin és aktin – Tau fehérjék
A membrán homeosztázis markerei – 24S-hidroxikoleszterin (agyra specifikus, a CYP-46 bontja le) – ApoE
Egyéb markerek – – – –
NSE Amyloid prekurzor fehérje N-acetilaszpartát 14-3-3 fehérje (7 izotípus, lehetséges feladata: jelátvitel)
Adatheterogenitás és -komplexitás Phenotype
Genomikus, proteomikus, transzkriptomikus, metabalomikus, fehérje-fehérje interakciók, szabályozó biohálózat, „finombeállítások”, betegség, mintázatok és motívumok, fehérjeszerkezet, fehérje-osztályozás, „specialista” fehérjék (enzimek, receptorok), …
Disease Clinical trial
Gene Genome sequence sequence
Disease Drug Gene Gene expression expression
Proteome
Disease Disease
Protein Protein Structure
homology Protein Sequence
P-P interactions
BIOMARKEREK - ÖSSZEGZÉS
A vér korábban nem vizsgált biomarkerek tárházát tartalmazza, amelyek tükrözik a szövetek aktuális élettani állapotát. A test minden sejtje élettani állapotának nyomát hagyja termékei formájában, amelyeket a vérbe juttat, melléktermékként vagy a szomszédos sejtek felé irányuló szignálként. A rutin laboratóriumi vértesztek csak egy apró szeletét jelentik ennek a lehetséges tárháznak, és csak néhány specifikus marker létezik az életet veszélyeztetı betegségekre.
Analitikai szempontból illúzió arra gondolni, hogy adott betegségre kizárólagosan jellemzı biomarkert találjunk, miközben biológiai szempontból még alig értjük a lényegét.
