Autoantitestek kimutathatóságának határai, jelenlétük zavaró hatása az immunanalitikai módszerekre Dr. Toldy Erzsébet Ph.D. Szombathely, Vas Megye és Szombathely Markusovszky Kórháza, Szombathely, PTE Diagnosztikai és Menedzsment Intézet, Pécs
MOLSZE Vándorgyűlés Bük, 2005.
Autoimmunitás • Fiziológiás immunműködés szerves részeként - mint biológiai jelenség az élő működés lényegi része
• Kóros immunműködés gyanánt - a szervezet homeosztazisát súlyosan veszélyeztető jelenség (európai népesség 1-3%-át érinti)
Fiziológiás autoimmunitás: immunologiai homunculus Magasabb rendű szervezet annak érdekében, hogy ne indulhasson el saját antigénjével szemben autoimmunreakció fenntart egy csekély mértékű autoimmunitást.
- CD5+ B sejtek - kicsiny affinitású proliferatív IgM típusú autoantitest termelődés
Egészség vége? Betegség kezdete?
fiziológiás autoimmunitás
pathologiás autoimmunitás
Az egyensúly fenntartását biztosító tényezők: • immuntolerancia: védelem a saját antigénstruktúrával szemben • anti-idiotípus hálózat
Anti-idiótípus reguláció Antitest Antigéndeterminánsok
Anti idiótípus- antitest
Fiziológiás védelem Patológiás következmény
Anti-anti-idiótípus- antitest
AUTOIMMUN BETEGSÉG
Antigének: „saját ?” és „nem saját?” Antisomatogén = ellenanyagtermelést
kiváltó
(Detre László, 1960, NY) • Autoantigén „saját”: a szervezetet saját felépítő struktúrái,
melyek felismerésére a T és B sejtek specifikus receptorokkal rendelkeznek, s immunválaszt (autoantitestet) fejlesztenek ki velük szemben.
• Heterophyl antigén „Nem saját”: az emlős szervezet
számos építőeleme homológiát mutat az evolució távoli fajait és egyedeit felépítő molekuláris elemekkel. - autoimmun kórképek kialakulásának egyik oka lehet az autoantigén struktúra megváltozása külső antigén hatására.
• Keresztrokonságok miatt valójában
heteroimmunitás →autoimmunitás
Az autoimmunitás ellenanyagai Ig típus Természetes
IgM alacsony affinitás
Patológiás
IgG, IgA, IgM magas affinitás
Termelődés CD5+ B1 sejt
B2 sejt
Szérumszint ng/ml
mg/ml
Autoantitest meghatározások korlátai Az eredmények meglehetősen módszerfüggők, ok: • alkalmazott antigén, anti human-Ig-antitest • alkalmazott méréstechnika legkülönfélébb: - analitikai és klinikai szenzitivitás, - analitikai és klinikai specificitás, - referencia érték, - ál pozitív értékek eltérő %-ban
Specifikus antitesteket meghatározó módszerek • Immunfluoreszcencia • Counter immunelektroforézis • Radiális immundiffúzió • Agglutináció • Immunoblot • Immuno-assay (ELISA, ECLIA, CLIA, RIA, RRA)
Szisztémás autoimmun markerek: ANA -IF leukémia Immun trombocytophenia Mononukleos is Autoimmun haemolitikus anaemia Primér biliáris cirrhos is Myas tenia Gravis Rheumatoid artritis (RA) autoimmun thyreoiditis Alkohol indukálta cirrhos is Virus hepatitis ek Ps orias is vulgaris anaemia pernicios a SLE-és betegek egés zs éges rokonai körében graviditas >60 éves egés zs éges felnőtt populációban <60 éves egés zs éges felnőtt populációban
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Szervspecifikus autoimmun markerek: pajzsmirigy antitestek
TPO-antitestek • TPO izoformák: eltérően expressálódnak TPO1 (105 KD) – domináns forma TPO2 (100 KD) –GB-ban kisebb • Antigenitás: két epitóp C2-fragmens (85 aminosav)- főbb epitóp C21-fragmens (99 aminosav)- Hashimotoban: 52-60% TPO epitopok találhatók a Tg –molekulában is. • TPO antitestek: Gátolják az enzimet, aktiválják a komplementrendszert, direkt cytotoxikusak.
TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. Al (UK): 2003-as tanulmány 13 assay
klinikai értékelés: 178 klinikailag ismert eset 100
100 100
%
80
94 80
100 91
60 40
maximum
20
minimum
0 Szenzitivitás
Specificitás Leletazonosság
TPO-antitestek meghatározása: Analitikai összevetése: mérések közötti eltérések Mérések száma: 13 x 10
50
max. 33,4
CV%
40
39,6
30 20 10 0
min. 1,3
1,5
Intra-assay
Inter-assay
TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. al: 2003-as tanulmány 13 ELISA
Pontosság vizsgálata 1700 1500 TPOAb U/ml
1300 1100
Célérték : 1000 U/ml
900 700
Célérték: 500 U/ml
500 300 100
Célérték: 250 U/ml 1.
2. 3. referens preparátum (U/ml)
13 módszerből 8-nak inkorrekt a kalibrációja
0% 2
30%
10
1
1
H Za ype va rp r 3 ro m tein ód a e sz m er ia be n H Za ype va rb r 1 ili 3 rub m in ód a sz em er ia be n
40%
H 12 aem m ol ód isi sz s z er av be a n r
10%
1 3 pa m em ód ia s z za e r va be r n
20%
Li
Vizsgált minta ál-pozitivitási gyakorisága
TPO-antitestek meghatározása: Sanderson et. al: 2003-as tanulmány 13 ELISA
Matrix effektus vizsgálata
60%
50% 2 1
3
3
4 2
11
1
1
10
Antitest interakciók az immunanalitikában
Immunglobulinok okozta keresztreakciók feltételei 1.) Az analitre nézve antigénkötő-molekularésszel rendelkező – specifikus- antitestek jelenléte a szérumban. 2.) A zavaró specifikus antitest koncentráció viszonya a módszer méréstartományát elérő, vagy azt meghaladó legyen. 3.) Aspecifikus immunglobulinok kóros mennyiségi arányai.
Interferenciáért felelős antitest típusok I.
Heterophyl antitestek
II. Human anti-animal-antitestek III. Reuma faktor IV. Specifikus antitestek az analit ellen
I. Interferenciáért felelős antitestek: Heterophyl antitestek - immunogenitásuk rosszul definiálható - a beteg anamnézisében az állati fehérjével történő expozició nem igazolható - multispecifikus: Rf és két v. több faj immunglobulinjával aktivitást mutat - prevalencia: 0,5-12%
II. Interferenciáért felelős antitestek Specifikus anti-human-animalantibodies (HAAAs) - Izotípusuk lehet: IgG, IgM, IgA, IgE - immunogenitásuk jól definiálható - a beteg anamnézisében az állati fehérjével történő expozició igazolható és az állatfaj azonos a tesztben alkalmazott állati immunglobulinnal - endogén antitest további besorolását a faj határozza meg: pl. HAMA, HARA - szérumkoncentrációi: µg/L-g/L is lehet! - évekig perzisztálhatnak a keringésben - előfordulásuk: 1-80% is lehet.
Az egér-antigének ellen keletkező humán antitestek előfordulási gyakorisága a keringésben I. Gyakoriság (%)
35 30 25
Tévesen magas
20 CK-MB, cTr 15 10 5 0 Egészséges RA N=54 véradó N=1008
Sjögren s. N=45
SLE N=54
P.M. P.M. cc. Autoimmun N=15
N=70
Gyakoriság (%)
Az egér-antigének ellen keletkező humán antitestek előfordulási gyakorisága II: Iatrogén okok. 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Ovarium cc. Egyéb cc. CA-125-mouse Ab Radiologiai Ab N=32 N=61
IL-6 Ab-el kezelt Renal cell met. Myeloma mult.
N=12
Az IgG struktúrája és a human antianimal antitestek Állati antitest
Human antiidiotípiás antitest Human anti-anti idiotípiás antitest
Human anti-izotípiás antitest Kricka: Clin. Chem. 1999.
Antitest interakciók az immuno metrikus módszerekben
jelölt Ab (animal) Antigen Capture Ab (animal)
jelölt Ab (animal) Antianimal Ab Capture Ab (animal)
jelölt Ab (animal) Antianimal Ab Antianimal Ab Capture Ab (animal)
Szilárd fázis
Helyes
Tévesen pozitív
Tévesen negatív Kricka Clin. Chem. 1999.
Interferenciáért felelős antitestek III.
Rheumatoid faktor (Rf) Eredetük: a humán IgG Fc fragmense ellen képződnek Izotípusuk: főként IgM Előfordulásuk: a normál populációban (idősebb kor): 5-10%, autoimmun betegekben gyakrabban. Rheumatoid arthritis kezdeti stádium (első év): 40-60% Később (2.-3. Évben) : 80% Úgy viselkednek, mint a heterophyl antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötődnek.
Interferenciáért felelős antitestek IV. Specifikus antitestek az analit ellen -
Troponin T és I CK-totál, CK-MB mass, T4, T3 CEA, CA-15-3, CA-125, AFP hCG, FSH, LH Tg Prolactin
Módszerek az interakciót okozó antitestek kiszűrésére II. Heterophyl ill. Rf és AAAT jelenlétekor 1.) Gyárilag az assay pufferhez blokkoló ágenst -
borjú v. murin immunglobulin, nem specifikus egér antitest (MAK33) Biotinizált egyszárú antitest használata Warren D.J. et al. CEA Clin.Chem. 2005.
2.) A minta előkezelése az immuno-assay előtt: - kezelés PEG, alkohol, ammónium szulfát oldattal - Protein A kromatográfia, ultrafiltráció, - Gél diffúziós kromatográfia - Detergens szulfhydril ágens - Minták hőkezelése - Minták hígítása szériában (non linear response) - Alternatív módszer, - Recovery –teszt, vagy az antitestet közvetlenül mérő módszer. Pl. TgAb
Tg + Tg-visszanyerés (recovery) mérése Alacsony Tg visszanyerés nem jár mindig együtt TgAb pozitivitással, 100% nem zárja ki az Ab pozitivitást!
Jelenlegi konszenzus: nincs értelme visszanyerési %-t meghatározni! Szenzitív TgAb módszerrel a TgAb-t kell mérni!
Kell-e szűrni antitest interferenciákra a laboratóriumban? IGEN, ha .
• a populáció jelentős %-át érinti: pl macroprolactinaemia, • Az eredmény a döntéshozatalban meghatározó: pl. Tg • Az anamnesis megköveteli
Laboratóriumé a felelősség!
Kell-e szűrni RF interferenciákra a laboratóriumnak ? Marks V. et al. Clin. Chem. 2002.
• 10 Rf-pozitív donor mintáját 74 analitre 66 laborban vizsgáltak • 3445 eredményből 8,7 %-a volt tévesen pozitív. • 21 % -a közülük durván félrevezető téves pozitív lelet volt. • A blokkoló reagenssel történő kezelés után 4,2%-ra csökkentek a téves leletek.
Random hibával számolni kell és a klinikusokkal tudatni kell az interferenciák jelentőségét.
Kell-e szűrni ritka antitest interferenciákra a laboratóriumban? Emerson J.F. et al. California, Clin Chem. 2003.
Vizsgált szérum: 160 Mért paraméterek: TSH, PSA, hCG, Cortisol 0,8-7 %-ban változott meg a lelet klinikai interpretációja
~3% Következtetésük: - A minták előszűrése nem szükséges - A blokkoló reagens alkalmazásával csak 21% volt a hiba korrigálható, míg hígítással csak ~3%. - Ismertté kell tenni az anamnesist
Kell-e szűrni ritka antitest interferenciákra a laboratóriumban? (Ismail A. A, et al. Clin. Chem. 2002. ) Vizsgált szérum: 5310 28 esetben félrevezető FSH, LH, TSH vizsgálati eredmény született antitest interferencia miatt.
0,53 % • Mivel ezek a vizsgálatok milliókra rúgnak a UK ban, így a kellemetlen következmények ezreket érintenek. Ezért a korai kiszűrése lenne indokolt ezeknek az interakcióknak.
Törekvés a tökéletességre Luciant L. Leope: “Striving for Perfection” Clin. Chem. 48. 11. 2002 Harvard School of Public Health, Boston
USA lakóssága: 247 millió Vizsgált betegek száma: >30 millió/év >12 %
A diagnosztikában és kezelésben elkövetett komplikációk száma Megelőzhető műtét ~1 millió/év ~3,30%
Labor
?
Megelőzhető halálok ~71ezer/év ~0,24%
Laboratóriumi tesztek megbízhatósága 1000 tesztből 5 inkorrekt 0,5 %
Dícséretre méltó: a munka sajátjából adódik Ugyanakkor kicsi hibák pusztítóak lehetnek! A gyakorlat: a klinikai szakemberek jobban hisznek a teszteknek, mint a saját itélőképességüknek! Egészséges szkepticizmus hiánya!
Az antitest interakciók kiküszöbölése: LEHETETLEN, DE…. …..együtt kell élni vele a következőképpen: • Több módszert kell elérhetővé tenni • Team munkában: - tudatosítani kell a klinikusokban immunanalitikai módszerek korlátait,
az
- klinikai összefüggéseket ismertté kell tenni a labor felé.
Ideális laboratóriumi szakember • büszke a módszere magas szintű minőségére, • de állandóan gondolkodik és tovább lát, tudatában annak, hogy óhatatlanul követ el hibát időről időre, • egészséges szkepticizmussal eredményeket
fogadja
az
• készen áll a klinikai képbe nem illő hiba tisztázására.
