Autoantitestek kimutatásának laboratóriumi problémái Dr. Németh Julianna, Dr. Miklós Kata Országos Gyógyintézeti Központ Immundiagnosztikai Osztály Budapest
• 1901 P. Ehrlich – „Horror autotoxicus des Organismus” – szövetkárosító autotoxinok
• 1948 Hagraves – LE sejt
• 1957 autoantitest név • sejt-, szerv-, szervrendszer-, szövetellenes antitestek
alma=antigén, autoantigén, tesztben használt antigén
kéz=antitest, autoantitest vizsgálandó minta
Különböző eljárásokkal kimutatható legkisebb ellenanyag koncentrációk • • • • • • • • • • •
Nefelometria Immunelektroforézis Radiális immundiffúzió Rakéta-immunelektroforézis Komplement fixáció Haemagglutináció Immunfluoreszcencia Enzim immunoassay (ELISA) Lumineszcencia Radio-immunoassay (RIA, Farr) Immunoblot
• 20 – 50 mg • 20 – 40 mg • 5 – 10 mg • 2 – 10 mg • 0.2 – 1.0 mg • 0.2 – 1.0 mg • 1 – 100 ng • 0.2 – 100 pg • 0.1 – 100 pg • 0.1 – 100 pg • 0.2 – 100 pg
Indirekt immunfluoreszcencia elve
Indirekt immunfluoreszcencia • Előnyei: – a vizsgálathoz használt antigén természetes környezetében látható – a mintahígítás változtatásával (csökkentésével) a metodika érzékenysége fokozható – inkubációs idő növelésével a vizsgálat érzékenysége növelhető – a beteg különféle autoantitestjei sokszor nem tankönyvi vagy jól ismert formában jelennek meg, ilyenkor lehetőség van sejt /szövet / szerv metszetek kombinált használatára (biochip) – konjugátum változtatásával izotípus specifikus – szűrésre alkalmas – kis mintaszám esetén is olcsó – részben automatizálható
Indirekt immunfluoreszcencia • Hátrányai: – – – – – – – –
kiértékelés gyakorlatot igényel kiértékelésben sok a szubjektív elem fluoreszcens mikroszkóp szükséges heterofil antitestek zavaró hatása háttér fluoreszcencia zavaró hatása aspecifikus lelet nem ritka konfirmáló metodikára szükség lehet (GBM, ANCA) nagy minta szériára megszorításokkal alkalmas
Indirekt immunfluoreszcencia automatizálása
Immunassay (ELISA, EIA) Előnyei: magas szenzitivitás kis és nagy aviditású antitestek kimutatása kvantitatív meghatározás izotípus meghatározás lehetséges automatizálható nagy számú minta, gyors (olcsó) vizsgálata
Hátrányai: sokszor bizonytalan antigén (forrás) bizonytalan antigén tisztaság egyedi standardok és kontrollok nemzetközi standardizálás hiánya aspecifikus reakciók okozta álpozitivitás (CIC, RF, Ig)
ELISA automatizálása
Immunoblot (dot blot, line-blot, WB) • Előnyei:
• Hátrányai:
• magas specificitás • nagy tisztaságú antigén • egyidőben több antitest válasz (betegség specifikus panelek) • könnyen kiértékelhető • sürgős vizsgálatra alkalmas • egy beteg vizsgálatára alkalmas
• szemikvantitatív • kiértékelése szemmel szubjektív • drága • nagy számú vizsgálatra nem alkalmas • szűrővizsgálatra nem alkalmas
Blot technika
Autoantitest meghatározások laboratóriumi sajátosságai • Hígítások megválasztása – – – –
gyerek / felnőtt ( ANA) diagnózis / monitorozás (ANCA) végtiter (> 1:160) prozóna jelenség
• Mosási lépések fontossága • Kvalitatív eredmény (pozitív, negatív, bizonytalan) • Kvantitatív lelet ( határérték pozitivitás!) – RNP MCTD-ben mindig magas – AMA PBC-ben mindig magas titerű – SMA alacsony titerben nem diagnosztikus értékű
Prozóna / postzóna jelenség
• • • •
Mérési tartomány megválasztása Extrém alacsony, extrém magas minták mérése Hiba észrevétele Mérési trükkök (450/405 nm)
Autoantitest meghatározások zavaró tényezői • heterofil antitestek • természetes / protektív antitestek • magas keringő immunkomplex koncentráció • magas RF • gyógyszerek • plazmapótszerek
Minőségbiztosítás • preanalitikai hiba ( szobahő/+4oC): – minta vétel ( lipémia, hemolizis) – minta tárolás: • mélyhűtött minta többszöri feloldása és vissza-fagyasztása ( neg. minta háttér fluoreszcenciája nő, aspecifikus kötődések zavaró hatása) • kontrollok (kit-k használata, saját kontrollok, konjugátum kontroll) • WHO standardok • külső minőség-ellenőrzés (NEQAS, PSIT)
Autoantitestek izotípusának meghatározása • szűrővizsgálathoz használt konjugátum kiválasztás szempontjai • coeliakia (IgA/IgG) • APS ( IgG/IgA/IgM) • neurológiai autoantitestek ( IgG/IgM) • pozitív minták azonosítása • zavaró tényezők ( szélsőséges immunglobulin értékek) • gazdaságossági tényezők (szűrés / konfirmálás)
Sürgős autoantitest meghatározás • Glomerulonephritisek DD • Sürgősség oka (terápia választás) • ANCA asszociált vasculitisek – M. Wegener :cANCA – RPGN: pANCA • Goodpasture sy: GBM • SLE: ANA, ds-DNA • Metodikaválasztás: – gyors – megbizható – kombinált
Diagnosztikai és interpretálási problémák • 1.az antigén ismerete a tesztben: SS-A • 2.szenzitivitás és specificitás diagnosztikai jelentősége: RA diagnosztika • 3.nemzetközi diagnosztikai ajánlás befolyása a teszt kiválasztására: cardiolipin tesztek • 4.két eltérő teszt egy betegség igazolásához: ANCA diagnosztika • 5.kétféle teszt az AMA diagnosztikában
Tesztben használt antigén ismerete • SS-A 60 és 52kDa • Diagnosztikai jelentőség: – – – – –
SLE RA M. Sjögren neonatális lupus gyógyszer indukálta lupus – egyéb szisztémás autoimmun betegség – egészségesek 5%-a pozitív
Rheumatoid arthritis szerológiai markerei szenzitivitás / specificitás Metodika
Szenzitivitás (%)
Specificitás (%)
RF (IgM) (1937)
~ 75 %
< 65 %
WR (1948)
~ 50 %
~ 87 %
APF (1964)
49-60 %
73-90 %
AKA (1979) Filaggrin (filament aggregating protein)
35-55 %
88-98 %
Anti-CCP1 (1998)
55-70 %
91-99 %
Anti-CCP2
68-85 %
91-99 %
Rheuma faktor előfordulási gyakorisága Kórkép
Gyakoriság (%)
Kórkép
Gyakoriság (%)
RA
70-90
endocarditis subacuta
25-65
SLE
15-35
bakteriális fertőzések
5-60
Sjögren-szindróma
75-95
parazitás fetőzések
20-90
MCTD
50-60
vírusos fertőzések
15-65
szisztémás sclerosis
20-30
cryoglobulinaemia II
100
vasculitis
5-20
daganatos betegségek
5-25
CAH, PBC
15-70
egészségesek 50 év alatt
<5
gyulladásos tüdőbetegség
10-50
egészségesek 70 év felett
10-25
Rheumatoid arthritis szerológiai markerei szenzitivitás / specificitás Metodika
Szenzitivitás (%)
Specificitás (%)
RF (IgM) (1937)
~ 75 %
< 65 %
WR (1948)
~ 50 %
~ 87 %
APF (1964)
49-60 %
73-90 %
AKA (1979) Filaggrin (filament aggregating protein)
35-55 %
88-98 %
Anti-CCP1 (1998)
55-70 %
91-99 %
Anti-CCP2
68-85 %
91-99 %
Antifoszfolipid szindróma (APS) diagnosztikai kritériumai Wilson és mts. 1999
Laboratóriumi kritériumok 6 héten belül legalább 2 alkalommal mért pozitív cardiolipin IgG és / vagy IgM koncentráció közepes vagy magas titerben, olyan standard ELISA teszttel, amely β2-GPI- függő cardiolipint mér 6 héten belül legalább 2 alkalommal pozitívnak talált plazma lupus antikoagulans ( az LA mérést az International Society on Thrombosis and Hemostasis előírásai szerint kell végezni)
Cardiolipin teszt sajátosságai • • • • •
Bovin / human β2GPI Diluens / puffer / plate Közepes vagy magas koncentráció Szűrés ( GAM) érzékeny teszt Konfirmálás ( IgG, IgA, IgM) specifikus teszt • Ismétlés
International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophyl Cytoplasmic Antibodies 1999
• Ajánlás – „új beteg” laboratóriumi vizsgálatánál csak mindkét metodika kombinált eredménye alapján szabad a leletet kiadni (IIF, ELISA) – a kétféle vizsgálat (IIF és ELISA) sorrendje is fontos: az IIF történjen előbb – IIF mintázat nem elég specifikus a diagnózis felállításához, ezért terápiás döntéshez az ANCA ELISA leletre is szükség van – minden nem c mintázat esetén ANA vizsgálata is ajánlott – mindkét teszt forma quantitatív végzése ajánlott
ANCA diagnosztika International Consensus Statement on Testing and Reporting of Antineutrophyl Cytoplasmic Antibodies 1999
• Minimális diagnosztika: – minden, IIF-val pozitív ANCA mintából MPO és PR-3 ELISA végzése ajánlott
• Optimális diagnosztika: – minden, a laboratóriumban történő ANCA vizsgálat a 2 módszer kombinálásával adjon eredményt
AMA diagnosztika • Arany standard: rágcsáló máj /vese / gyomor IIF • Diagnosztikai ajánlás: 1.teszt: AMA2 ELISA – rekombináns: • szenzitivitása.98% • specificitása: 85% – biokémiai tisztítású: • szenzitivitása: 93% • specificitása: 96% • AMA IIF- / ELISA v.BLOT+ • AMA IIF+/ ELISA v.BLOT-
Autoantitest diagnosztika jelentősége • Betegség diagnózisa: EMA cöliákiában • Betegségek közötti laboratóriumi differenciáldiagnózis: RF pozitivitás • Betegség prognosztikai jellemzése: centromer antitest • Therápia monitorizálása: ds-DNA elleni antitest titere) • Szervi manifesztációk előrejelzése: myositis SRP+ (szív), Mi-2+ (bőr)
