A PATHOGÉN AUTOANTITESTEK SZEREPE ÉS KIMUTATÁSA SZISZTÉMÁS LUPUS ERYTHEMATOSUSBAN

A PATHOGÉN AUTOANTITESTEK SZEREPE ÉS KIMUTATÁSA SZISZTÉMÁS LUPUS ERYTHEMATOSUSBAN

PH.D. ÉRTEKEZÉS SALLAI KRISZTINA KATALIN

TÉMAVEZETŐ: PROF. GERGELY PÉTER SZIGORLATI BIZOTTSÁG TAGJAI:

PROF. FEKETE BÉLA DR. PRECHL JÓZSEF DR. BARTHA KATALIN

HIVATALOS BÍRÁLÓK:

DR. KISS EMESE DR. KOLEV KRASZIMIR

2006 BUDAPEST SEMMELWEIS EGYETEM, DOKTORI ISKOLA MOLEKULÁRIS ORVOSTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA

ÖSSZEFOGLALÓ A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség, fontos jellemzője - az egész szervezetre kiterjedő gyulladásos állapot mellett - számos patogén autoantitest termelődése. Kutatómunkám során kiemelkedő figyelmet fordítottam az autoantitestek kimutatásával összefüggő laboratóriumi vizsgálatokra, mivel ezen ellenanyagok megjelenésének és a kórfolyamatokban betöltött szerepének hátterében álló folyamatok még nem teljesen tisztázottak. Munkám részeként olyan teszteket is elemeztem és értékeltem, amelyektől várható volt, hogy eredményesen alkalmazhatóak lesznek az SLE rutin diagnosztikájában. Megvizsgáltam: 1) a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, ennek jelentőségét a betegség kialakulásában, és szervi manifesztációinak – elsősorban a lupus nephritis – megjelenésében 2) az összefüggést a betegek DNáz aktivitása és a szérum antinukleoszóma antitest szintje között 3) az antifoszfolipid antitestek megjelenését az SLE-s

populációban

és

ezek

összefüggését

a

tromboembóliás

epizódok

bekövetkeztével. 4) az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és az ezek hátterében álló, az SLE-től független tromboembóliás kockázati tényezőket 5) annak lehetőségét, a sejtfelszíni Fc receptorok blokkolásával gátolhatóak-e az antitestek és immunkomplexeik által közvetített effektor funkciók az autoimmun betegségek, elsősorban az SLE kezelésében. Eredményeim szerint, bár az SLE-s betegek szérumában szignifikánsan csökkent a DNáz enzim aktivitása, ez nem áll összefüggésben a betegség aktivitásával, vagy a betegség során kialakuló vesekárosodással, viszont negatív korrelációt mutat a betegek antinukleoszóma antitest szintjével. A vizsgált SLE-s betegcsoportban mintegy tízszer gyakoribbnak találtam a trombózis incidenciáját az áltagnépességhez viszonyítva. Kimutattam, hogy SLE-ben – az öröklött tényezők mérsékelt befolyása mellett elsősorban a betegek több mint harmadának plazmájában kimutatható antifoszfolipid antitestek okozzák a kiemelkedő tromboembóliás rizikót. Az Fc receptorokra vonatkozó, szintetikus peptidekkel végzett vizsgálataink szerint peptidkonjugátumokkal kiválthatók monocita effektor funkciók, azonban konjugálatlan, szabad formában a peptidek nem gátolták sem az immunkomplexek FcR-okhoz való kötődését, sem a sejtek FcR közvetítette IL-6 termelését, viszont gátló hatással voltak a TNFα termelésre.

2

SUMMARY Systemic lupus erythematosus is an autoimmune disorder characterized by a systemic inflammatory state and the presence of a wide range of pathogenic autoantibodies. My research focused on the detection and characterization of these autoantibodies, since many details about their development and their pathogenic effects are still unclear. My work also included the evaluation of laboratory tests which might help the diagnosis, disease activity or prediction about the outcome of the SLE. The aims of my work were: 1) to measure serum DNase activity in the SLE population with the aim of evaluating the significance of DNase activity in the development of SLE, especially in lupus nephritis; 2) to study the association between the DNase activity and the production of antinucleosome antibodies; 3) to examine the presence of antiphospholipid antibodies in SLE, and their role in the development of thromboembolic episodes; 4) to examine the role of other, SLE independent thromboembolic risk factors, and evaluate the clinical value of thrombophilia screen in SLE; 5) to analyze the inhibitory effect of synthetic peptides from the Fc region of the antibodies on the Fcγ receptor mediated effector functions of human monocytes, and evaluate the possible use of these in the treatment of SLE. My results confirm that patients with SLE have reduced serum DNase activity, but the enzyme activity doesn’t show association with disease activity or organ involvements such as lupus glomerulonephritis, but

it negatively correlates with serum

antinucleosome antibody concentration. According my results, the incidence of thromboembolism is about 10-fold higher in SLE that that of the normal population, and the antiphospholipid antibodies play the primary role in the development of thromboses in SLE. Other, inherited risk factors seem to be of lesser importance. The IgG Fc peptides, although in conjugates they could trigger macrophage effector functions via the FcRs, were unable to inhibit the binding of immuncomplex-bound antibodies to the receptors, nor could inhibit the IL-6 cytokine production induced by the antibodies.

3

TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK

6

BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS

8

AZ SLE KLINIKAI HÁTTERE AZ SLE KIALAKULÁSÁNAK MOLEKULÁRIS HÁTTERE AZ ANTI-DNS ÉS ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK JELENŐSÉGE DNÁZ SZEREPE AZ ANTITESTEK KIALAKULÁSÁBAN GENETIKAI HAJLAMOSÍTÓ TÉNYEZŐK MBL ÉS POLIMORFIZMUSAI FC RECEPTOROK FOKOZOTT TROMBÓZISKÉSZSÉG SLE-BEN AZ ALVADÁSI RENDSZER ÁTTEKINTÉSE FŐBB TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK Antitrombin deficiencia A protein C – protein S rendszer defektusai APC rezisztencia és a Leiden-mutáció A protrombin G20210A mutáció Emelkedett VIII-as faktor szint Emelkedett homocisztein szint SZERZETT TROMBOFÍLIÁS TÉNYEZŐK, AVAGY A TROMBÓZIS KIALAKULÁSÁT SEGÍTŐ

8 11 11 12 13 14 15 16 16 18 19 19 20 20 21 22

ÁLLAPOTOK

A gyulladás szerepe a trombózis kialakulásában Az APA-k szerepe a trombózis kialakulásában

23 23 23

CÉLKITŰZÉSEK

26

MÓDSZEREK

27

A VIZSGÁLT BETEGCSOPORT A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE A VIZSGÁLATOKHOZ AZ ANTINUKLEOSZÓMA ÉS ANTI-DNS ANTITESTEK SZINTJÉNEK A MÉRÉSE DNÁZ AKTIVITÁS MÉRÉS AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK SZINTJÉNEK MÉRÉSE ELISA MÓDSZERREL A FOSZFOLIPID-SPECIFIKUS LA MÉRÉSE KOAGULÁCIÓS MÓDSZERREL A TERMÉSZETES ANTICOAGULÁNS FEHÉRJÉK SZINTJEINEK MÉRÉSE AZ APCR MEGHATÁROZÁSA A LEIDEN MUTÁCIÓ ÉS A PROTROMBIN MUTÁCIÓ DETEKTÁLÁSA AZ V-ÖS FAKTOR VIZSGÁLATA DNS SZEKVENÁLÁSSAL A VIII-AS FAKTOR SZINTJÉNEK MÉRÉSE A VON WILLEBRAND FAKTOR SZINTJÉNEK A MÉRÉSE HOMOCISZTEIN SZINT MÉRÉS A SZINTETIKUS PEPTIDEK ÉS PEPTIDKONJUGÁTUMOK CITOKINTERMELÉSRE GYAKOROLT

27 27 27 28 28 29 29 30 30 31 31 32 32

HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA FCR-OK ÉS A PEPTIDEK KÖZTI KÖTŐDÉS VIZSGÁLATA STATISZTIKAI ANALÍZIS

32 33 34

4

EREDMÉNYEK

35

A NUKLEOSZÓMA ELLENI ANTITESTEK ÉS A DNÁZ AKTIVITÁS SLE-BEN DNÁZ ENZIMAKTIVITÁS AZ SLE-S BETEGCSOPORTBAN ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK (ANCSA) SLE-BEN AZ ANTINUKLEOSZÓMA ANTITESTEK KAPCSOLATA AZ ANTI-DSDNS ANTITESTEKKEL ÉS A DNÁZ ENZIMAKTIVITÁSSAL A DNÁZ AKTIVITÁS SZEREPE AZ SLE KÖVETÉSÉBEN KÖVETÉSES VIZSGÁLATOK A TROMBOEMBÓLIÁS ESEMÉNYEK BEKÖVETKEZTÉNEK ÉS A TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK JELENLÉTÉNEK A KAPCSOLATA SLE-S BETEGKNÉL A TROMBÓZIS INCIDENCIÁJA SLE-BEN AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK ELŐFORDULÁSA A VIZSGÁLT POPULÁCIÓBAN AZ ANTIFOSZFOLIPID ANTITESTEK ÉS A TROMBÓZIS KOCKÁZATÁNAK ÖSSZEFÜGGÉSE EGYÉB, ÖRÖKLÖTT TROMBOEMBÓLIÁS RIZIKÓFAKTOROK ELŐFORDULÁSA A VIZSGÁLT

35 35 37

POPULÁCIÓBAN

FV Leiden és FII G20210A mutációk Szerzett APCR vizsgálata Természetes antikoaguláns fehérjék (AT, PC és PS) FVIII és vWF szintek Homocisztein szint AZ ÖRÖKLÖTT RIZIKÓFAKTOROK JELENLÉTÉNEK KAPCSOLATA A TROMBOEMBÓLIÁS

39 41 42 45 45 46 47 50 50 51 53 53 53

FV Leiden és FII G20210A mutációk Természetes anticoaguláns fehérjék FVIII és vWF Homocisztein szint AZ APAK ÉS AZ ÖRÖKLÖTT TROMBOEMBÓLIÁS KOCKÁZATI TÉNYEZŐK EGYÜTTES HATÁSA AZ FCR-OK GÁTLÁSÁNAK VIZSGÁLATA A PEPTIDEK KÖTŐDÉSE AZ FC RECEPTOROKHOZ IC-KÖTÉS GÁTLÁSA PEPTIDKONJUGÁTUMOK CITOKINTERMELÉST INDUKÁLÓ HATÁSA MONOMER PEPTIDEK GÁTLÓ HATÁSA

54 54 54 54 56 56 58 59 59 60 61

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

62

ÖSSZEFOGLALÁS

69

IRODALOMJEGYZÉK

71

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

82

ESEMÉNYEK KIALAKULÁSÁVAL

5

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK ACR

American College of Reumatology

ADCC

antitest-függő sejtes citotoxicitás

ANCSA

antinukleoszóma-antitest

APA

antifoszfolipid antitest

APC

aktivált protein C

aPTI (=aPTT)

aktivált parciális tromboplasztin idő

AT

antitrombin

ß2-GPI

ß-2-glikoprotein I

C4BP

C4 kötő fehérje

Cal

cardiolipin

CBA

kollagén kötő aktivitás

CBS

cisztationin-ß-szintetáz

CI

konfidencia intervallum

DNáz

dezoxi-ribonukleáz

DNS

dezoxi-ribonukleinsav

dNTP

dezoxi-nukleotid

ECLAM

European Consensus Lupus Activity Measurement

EKG

elektro-kardiogram

ELISA

enzimkötött immunszorbens technika

Fc

„fragment crystallizable”

FcR

Fc receptor

FITC

fluoreszcein-izo-tiocianát

FPIA

fluoreszcens polarizációs immuntechnika

FII

II-es alvadási faktor (protrombin)

FX

X-es alvadási faktor

FXa

aktivált FX

GN

glomerulonefritis

HLA

humán leukocita antigén

ICAM

intercellular cell adhesion molecule

IgG

immunglobulin G

6

IL

interleukin

IU

nemzetközi egység

LA

lupus antikoaguláns

MBL

mannóz-kötő lektin

MHC

fő hisztokompatibilitási komplex

MTHFR

metil-tetrahidrofolát-reduktáz

MTT

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium-bromid

NK

natural killer cell

OR

odds ratio

PAI

plazminogén aktivátor inhibitor

PC

protein C

PCR

polimeráz láncreakció

PhL

foszfolipid

Ph-Ser

foszfatidil-szerin

PS

protein S

PT

protrombin idő

RR

relative risk

rpm

percenkénti fordulatszám

SAH

S-adenozil-homocisztein

SLAM

Systemic Lupus Activity Measure

SLE

szisztémás lupus erythematosus

SLEDAI

SLE disease activity index

TF

szöveti faktor

TFPI

TF pathway inhibitor

TNFα

tumor nekrózis faktor α

t-PA

szöveti-típusú plazminogén aktivátor

u-PA

urokináz-típusú plazminogén aktivátor

UCTD

nem differenciált kötőszöveti betegség

VCAM

vascular cell adhesion molecule

vWF

von Willebrand faktor

7

BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az SLE klinikai háttere A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség. Az immunrendszer szabályozásában több ponton fellépő zavar miatt a szervezet egyes saját struktúrái elleni antitestképződés indul, amelyet szisztémás gyulladás kísér. Nevének eredete a betegség jellegzetes bőrtüneteire vezethető vissza. Lupus vulgarisnak nevezték korábban a tuberkulózis egyik változatát, mivel farkasmarásra emlékeztető nyomokat hagyott az arcon. Ettől különböztették meg 1851-ben az erythemákat kiváltó lupus erythematosust, amelynek szisztémás tüneteit később Kaposi Mór írta le. Az SLE prevalenciája Európában 100.000 főre vetítve 40-70, éves incidenciája pedig 15/100.000 fő [1-4]. Ezekből az adatokból is kitűnik, hogy a betegség mortalitása nem magas, a betegek 5 éves túlélése 90 % felett van. A betegségre jellemző, hogy a férfi-nő arány a megbetegedettek közt 1:8-10-hez, valamint, hogy a színesbőrű népesség körében magasabb az előfordulása [5, 6]. Szintén érdemes megemlíteni, hogy a betegség kezdete leggyakrabban a fiatal felnőttkorra tehető, ritkább a pubertáskor előtti és az 55 év felett jelentkező lupus. A betegség kialakulásához sok tényező együttes hatása vezethet. Azonosítottak olyan géneket (pl. HLA izotípusok, IgG-Fc- valamint komplementreceptorok), amelyek egyes

genetikai prediszpozíció

HLA izotípus komplement– citokin és Fc receptorMBLgének

környezeti tényezők

SLE

hormonok fertőzések antibiotikumok gyógyszerek UV-sugárzás stressz

1. ábra: Az SLE kialakulásában szerepet játszó tényezők. A genetikai háttér mellett környezeti hatások is hozzájárulnak a betegség megjelenéséhez.

8

variánsai hajlamosítanak autoimmun betegségekre, vagy éppen az SLE-re. A genetikai prediszponáltság azonban önmagában nem elég. A környezeti tényezők közül az UVsugárzás, egyes gyógyszerek (pl. hidralazin, prokainamid, α-metil-dopa) [7, 8], és fertőzések (pl. Eppstein-Barr vírus) [9-13] is lehetnek a betegség közvetlen kiváltói. Hozzájárul a fentiekhez egyfajta hormonális hatás is: nem véletlen a betegek közti női dominancia, vagy az sem, hogy a lupuszosoknál gyakran tapasztalható állapotromlás a terhesség alatt, ösztrogéntartalmú gyógyszerek szedésekor, vagy éppen a premenstruális időszakban [14-18]. Sokszínűsége miatt az SLE diagnózisa a legtöbb esetben nem egyszerű. Az általános tünetek – láz, fáradékonyság, nyirokcsomó-duzzanat, gyorsult süllyedés – mellett gyakran jelentkezik leukopénia, artritis, bőrtünetek (1. táblázat). (A betegség egyik jelképe világszerte a pillangó, amely a betegek kis hányadának orrán és orcáján jelentkező, valóban pillangóra emlékeztető vöröses bőrjelenségre utal.) Kisebb 1. táblázat: Az SLE manifesztációinak gyakorisága a betegek körében. Szervi manifesztáció

Érintettek aránya

arthralgia vagy arthritis

95 %

bőrérintettség

80 %

hematológiai tünetek (anémia, leukopénia)

60-90 %

lázas állapotok

50-70 %

veseérintettség

30-60 %

idegrendszeri tünetek

30-50 %

fényérzékenység

30 %

mellkasi fájdalom

20-45 %

hajhullás

15-30 %

szekunder antifoszfolipid szindróma

20 %

százalékban már a diagnózis idejére kialakult a betegnél vesekárosodás, idegrendszeri tünet, trombózis. Néhány laboratóriumi paraméter megváltozása is alátámaszthatja a lupus diagnózisát. A gyakorlatban az American College of Rheumatology (ACR) által

9

kialakított kritériumrendszer 11 pontja közül legalább négy együttes teljesülése esetén mondható ki az SLE fennállása [19](2. táblázat). 2. táblázat: A szisztémás lupus erythematosus (SLE) diagnosztikai kritériumai [19]. A fenti 11 közül négy igazolódása esetén mondható ki a betegség diagnózisa. 1. Vespertilio (pillangó-erythema): lapos vagy kiemelkedő bőrpír az orron és az orcákon, ami nem terjed rá a nasolabiális redőre. 2. Discoid bőrjelenség: kiemelkedő erythemás foltok, tapadó keratotikus hámlással és follikuláris dugókkal, a régebbi léziókban atrófiás hegesedéssel 3. Fényérzékenység: a napfényre adott szokatlan bőrreació 4. Orális

fekélyek:

többnyire

fájdalmatlan

orális

vagy

nazofaringeális

fekélyképződés 5. Arthritis: nem destruáló arthritis két vagy több perifériális izületben, fájdalom, duzzanat és izületi folyadék jelenléte jellemzi 6. Serositis: pleuritis és/vagy pericarditis dörzszörejjel, folyadékkal vagy EKG-val alátámasztva 7. Vesebetegség: napi 0,5 g-ot meghaladó állandó proteinuria és/vagy szemcsés cylinderek a vizeletben 8. Neurológiai tünetek: nem gyógyszer vagy anyagcserezavar indukálta görcsök és/vagy psychosis 9. Hematológiai tünetek

(a következők

bármelyike):

hemolitikus anémia

reticulocytosissal, leukopénia, limfopénia, vagy trombocitopénia 10. Immunológiai eltérések (bármelyik): kóros anti-DNS antitest szint, anti-Sm pozitivitás vagy cardiolipin pozitivitás 11. ANA pozitivitás A betegség aktivitása időben váltakozó. Hosszú tünetmentes periódusok után is újra jelentkezhet exacerbáció. A betegség aktivitásának megítélésekor a beteg klinikai állapota a döntő. Emellett laboratóriumi leletek is segítenek az immunrendszer aktiváltsági állapotának megítélésében. Mivel a betegség többféle formában jelentkezik, és lefolyása egyénenként változó, nincs olyan paraméter, amely minden beteg esetében egyértelműen segítené a betegségaktivitás megítélését. Éppen ezért dolgozták ki az SLE

10

aktivitását objektíven jellemezni célzó indexeket, amelyek közül mi az egyik legelterjedtebbet, a SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index) pontrendszert [20] használtuk vizsgálataink során. Eszerint különböző pontértékeket számítunk az egyes tünetekre, majd ezek összessége adja meg a betegség aktivitásának mértékét. 8 pontot számítunk az alábbi tünetekre: akut görcsök, pszichózis, vasculitis, retinavasculitis okozta látászavar, agyidegtünetek, lupus fejfájás, cerebrovasculáris léziók, „organic brain” szindróma. 4 pontot számítunk a következőkre: arthritis legalább két izületben, myositis, haematuria, pyuria, napi 0,5 g-ot meghaladó proteinuria, szemcsés vagy vörös vértestes cylinduria. 2 pontot számítunk az alábbiakra: Pleuritis, pericarditis, nyálkahártyafekély, alopecia, friss exanthema, alacsony komplement szint, magas anti-DNS szint. Végül 1 pontot jelentenek: láz, trombocitopenia, leukopenia. Mivel a kezelés elsősorban a beteg pillanatnyi állapotától függ, remisszióban teljesen elhagyható, míg az aktív lupus ellen esetenként csak igen agresszív terápiával lehet hatásos. Az

exacerbációk

közeledtének,

valamint

a

későbbi

szervi

manifesztációk

kialakulásának az előrejelzése fontos, megoldás előtt álló feladat a kutatók számára.

Az SLE kialakulásának molekuláris háttere A betegség tüneteinek többségét a nagy mennyiségben képződő autoantitestek antigénekkel képzett komplexei okozta károsodások váltják ki. Az antitestek közül a kromatin elemeit, a kettősszálú DNS-t, a hisztonfehérjéket, vagy az ezekből kialakuló összetett struktúrákat, a nukleoszómákat felismerő antitestek kiemelkedő jelentősséggel bírnak a betegség kialakulását illetően [21-23]. Az anti-DNS és antinukleoszóma antitestek jelenősége Az anti-DNS antitestek jelenlétének vizsgálata a betegség diagnózisának felállításakor és a betegségaktivitás követésekor is elengedhetetlen [21, 24, 25]. Újabb tanulmányok

11

emellett felhívják a kutatók és klinikusok figyelmét az antinukleoszóma antitestek (ANCSA) diagnosztikai jelentőségére is [26-28]. Ezek az antitestek antigénjüket felismerve vele immunkomplexet képeznek, majd a veseglomerulusokban lerakódva a szervben szöveti károsodást okozhatnak [29, 30]. Az immunkomplexek által kiváltott glomerulonephritis (GN) az SLE-s betegek 30-60 %-át érinti [31-33]. Leírták, hogy kísérleti állatokban a T-sejtes válasz gátlása nemcsak az anti-DNS szintet csökkenti, hanem a lupus nephritis kialakulását is gátolja. Azt is kimutatták, hogy az SLE-ben megjelenő anti-DNS antitestek többnyire nagy affinitású, IgG izotípusú ellenanyagok, amelyek termelődése T-sejt függő. Ezzel bizonyították, hogy az autoantitestek képzése antigén által indukált, T-sejt dependens úton indul [34-37]. DNáz szerepe az antitestek kialakulásában Az apoptotizált sejtek eltávolításának defektusa az elhalt sejtekből felszabaduló nagymennyiségű sejttörmelék, köztük kromatin komponensek keringésben való felgyülemlése révén előidézheti az autoantitestek termelését, és az SLE kialakulását [38, 39]. A hasnyálmirigy által termelt DNáz I, és a lép által termelt DNáz II enzimek elhasítják a nukleoszómák kettősszálú DNS láncait, ezzel elősegítik a keringő kromatinállomány lebontását, eltávolítását. A DNáz I egy 30,4 kDa molekulatömegű glikoprotein, amely kation-kötő szekretoros endonukleázként hasítja a DNS-t, szekvencia-specifikusan [40]. A DNáz II szintén glikoprotein, molekulatömege 45kDa [41]. Savas pH-optimumának megfelelően a sejtmagon kívül a lizoszómákban és néhány szekrétumban jelenik meg. Régóta ismert az elgondolás, amely szerint a DNáz I enzim csökkent működése szerepet játszhat az SLE és az SLE-ben jelentkező lupus nephritis kialakulásában [42, 43]. Ezt a feltevést több kísérlet is alátámasztja. DNáz I deficiens egerek vizsgálata azt mutatta, hogy a kísérleti állatokban SLE-hez hasonló betegség alakult ki: antinukleáris antitest pozitivitással, magas anti-DNS szinttel, illetve a veseglomerulusokban megfigyelhető immunkomplex-lerakódással [44]. Ezek a hatások eltérő mértékben, a DNáz I szinttől függően jelentkeztek az egereken. Egy másik kutatócsoport eredményei szerint, az SLE-s egereknek adott intravénás DNáz injekciót követően csökkent az állatokban az autoimmun válasz erőssége [45].

12

Egy közel 40 éve tett megfigyelés szerint a borjú DNáz I enzimmel történő kezelés emberekben is visszaszorítja a DNS és rokon struktúrák antigén jellegét; valamint, hogy a kezelés hatására a betegek egy részének anti-DNS szintje csökkent, illetve klinikai állapota javult [46]. A borjú DNáz immunogén hatása miatt rekombináns humán enzimmel folytatódtak a kísérletek. Azonban a bíztató egérkísérletek [45] ellenére sem sikerült a rekombináns humán DNázzal hatásosan visszaszorítani az autoimmun folyamatokat [47]. Japán kutatók két betegben is azonosították az A172G báziscserével járó mutációt a DNASE I gén 2. exonjában [48]. A betegek, akiknek genomjában ez a mutáció heterozigóta formában jelen volt, alacsony DNáz I enzimaktivitással és az SLE-s csoportban mértnél is szignifikánsan magasabb anti-DNS szinttel rendelkeztek, de nem mutatták semmilyen, a mutációval összefüggésbe hozható egyedi manifesztációját a betegségnek. Genetikai hajlamosító tényezők A családfa és ikervizsgálatok, valamint a közelmúlt genetikai vizsgálatainak tapasztalata szerint az SLE kialakulásának hátterében nem állhat kizárólag egy gén, hanem több gén is rendelkezik olyan variánssal, amelyek együttállása a betegségre hajlamosító genotípust alakíthat ki [49-52]. Egyes becslések szerint legalább négy genetikai defektus, vagy hajlamosító allél szükséges ahhoz, hogy a betegség fenotípusosan is megjelenjen [53]. Igaz azonban az is, hogy egyes ritka mutációk (például a komplementrendszer korai elemeinek deficienciájához vezetők) homozigóta formában önmagukban is a lupuszhoz hasonló tünetegyüttes megjelenéséhez vezethetnek [54, 55]. Az SLE-re hajlamosító genetikai eltéréseket az érintett fehérjék funkciója szerint három fő csoportba oszthatjuk: Az első csoportban olyan genetikai polimorfizmusok vagy mutációk szerepelnek, amelyek hatásaként sérül a szervezet fiziológiás sejttörmelékeltávolító rendszere. Példaként említhetjük az MBL, a C1q és más komplementfehérjék, valamint egyes enzimek génjének defektusait. A második halmazba kerülnek azok a gének, amelyek eltérései - termékeik immunreguláló szerepénél fogva – hozzájárulnak az immunológiai tolerancia áttöréséhez. Ilyen genetikai eltérések a Fas, Fas-ligand mutációi. A harmadik csoportban azokat a géneket találjuk, amelyek változatai a betegség lefolyására, szervi manifesztációira vannak hatással.

13

Többen is vizsgálták az SLE összefüggését az MHC géncsalád polimorf elemeivel [56, 57]. Az MHC II DR2 és DR3 allélek 2-5-szörös relatív kockázatot hordoznak az SLE kialakulására, ezen felül kimutattak bizonyos összefüggést a fenti allélek és egyes SLEre jellemző - ribonukleoproteinek és kromatinelemek ellen irányuló - autoantitestek megjelenése

között

is

[58].

Az

MHC

III

géncsalád

egyes

-

a

korai

komplementfehérjéket kódoló - elemeinek deficienciája súlyos autoimmun folyamatok beindulását eredményezheti. Ennek az lehet az oka, hogy a komplementrendszer fontos szerepet tölt be az immunkomplexek eltávolításában, amely funkció kiesése esetén a felszaporodó komplexek gyulladásos, hiperszenzitivitási reakciókat okozhatnak. MBL és polimorfizmusai Az MBL (mannose binding lectin) molekula szerkezetileg a komplement rendszer C1q komponenséhez hasonlítható. A két fehérje funkciójában is találunk azonosságokat. Az MBL képes felismerni a különböző mikroorganizmusok – baktériumok, gombák felszínén található mannóztartalmú membránmotívumokat. A kórokozókhoz való kötődéssel aktiválják a komplementrendszer lektin-dependens útvonalát, ezzel elősegítik a patogén komplement általi lízisét vagy azt, hogy a makrofágok - opszonizált fagócitózis útján – hatékonyan elpusztítsák a mannózmotívumokkal rendelkező kórokozót. Az MBL fehérje szintje egyénenként változó, alakulását nagyban befolyásolja az MBL gén 1-es exonjában található három ismert polimorfizmus valamelyikének jelenléte, vagy a gén promóter régiójában leírt három polimorfizmus megjelenése [59]. Ezek mindegyike a plazmában a vad genotípusú egyénekénél alacsonyabb MBL koncentrációt eredményez.

Leírták, hogy az alacsonyabb MBL koncentráció

hajlamosíthat az SLE-re [60]. Ennek hátterében több folyamat is állhat. Egyrészt, az MBL megfelelő mennyiségének hiányában lassabban megy végbe az apoptotikus sejttörmelék eltávolítása, a felhalmozódó sejtalkotók pedig – az arra hajlamos egyének szervezetében – antigénként beindítják a különféle autoantitestek képződését. Másrészt, csökkent MBL szint mellett a szervezet hajlamosabb a bakteriális és virális fertőzésekre, amelyek – szintén az SLE-re prediszponált egyének esetében - közvetlen kiváltói lehetnek a betegségnek. Újabb tanulmányok vizsgálják a csökkent termelést

14

eredményező polimorfikus MBL allélek összefüggéseit az anti-C1q, illetve az antifoszfolipid antitestek termelődésével [61, 62]. Fc receptorok Az ellenanyag molekulák Fc alegységének megkötésére képes receptorok (FcR [63]) a legtöbb

hemopoetikus

eredetű

sejten

megtalálhatóak.

Osztályozásuk

Ig

izotípuspreferenciájuk szerint történik; szerkezetük, és ezzel összefüggésben funkciójuk alapján pedig aktiváló vagy gátló Fc receptorokat különböztetünk meg [64, 65]. A legtöbb esetben a sejtek felszínén egyidejűleg gátló és aktiváló receptorok is megjelennek. Az IgG izotípusú ellenanyagokat felismerő FcγR-ok a nagy affinitású FcγRI kivételével gyengén kötik az IgG-t, ezért a szabad antitest nem, kizárólag az immunkomplexben szereplő, ezáltal megváltozott térszerkezetű ellenanyag molekulák kötődnek a receptorhoz, és váltanak ki végrehajtó funkciót. Az FcR-ok által közvetített effektor funkciók a receptortól, és az azt kifejező sejttípustól függően sokfélék lehetnek [65]. Aktiváló FcR-on keresztül kiváltható az NK sejtek antitest-függő citotoxikus reakciója (ADCC), serkenthető a makrofág sejtek fagocitáló képessége, és indukálható gyulladásoscitokin-termelésük. A gátló jellegű FcγRII fontos szerepet tölt be B-sejtek antigéntermelésének szabályozásában. Az FcγRIIa génjében leírt polimorfizmus a molekula 131-es pozíciójában egy aminosav cseréjéhez vezet. Ismert, hogy a kizárólag H131 FcγRIIa molekulákat hordozó sejtek sokkal hatékonyabban képesek az IgG2 megkötésére, míg az R131 FcγRIIa-val rendelkezők kevésbé. Hasonlóan, az FcγRIIIa gén polimorfizmusának köszönhető F158 FcγR-ok az IgG 1-es, 3-as, és 4-es alosztályába tartozó molekulákat kötik kisebb affinitással, mint a V158 FcγR-ok. Az MBL molekulához hasonlóan az FcγR-ok Ig-kötést befolyásoló polimorfizmusairól is leírták, hogy hozzájárulnak az autoimmun folyamatok kialakulásához [66-68]. Ezeknek a megfigyeléseknek a magyarázata az lehet, hogy a csökkent ellenanyag kötés az immunkomplexek eltávolításának defektusát okozhatja, ezzel hozzájárulhat hiperszenzitivitási reakciók kialakulásához. Az FcR-ok gyulladásos folyamatok közvetítésében betöltött szerepének tárgyalásakor ki kell hangsúlyoznunk az eltérő funkciójú receptorok egyensúlyának fontosságát. Az

15

aktiváló FcγRIII receptor bizonyítottan részt vesz az immunkomplex-mediált gyulladásos, szövetkárosító folyamatokban [69]. Az FcγRIIb, az egyetlen ismert gátló receptor viszont intracelluláris jelátviteli utakon képes gátolni az FcγRIII aktivációját [70].

Leírták,

hogy

míg

az

FcγRIIb

konstitutív

módon

kifejeződik

a

veseglomerulusokban, az FcγRI és FcγRIII fiziológiás körülmények között nem. Vannak azonban olyan mediátorok (pl. IFNγ), amelyek hatására az aktiváló receptorok megjelennek a sejtfelszínen, a gátló FcγRIIb mennyisége viszont lecsökken. Ez a folyamat végül heves gyulladásos reakcióhoz, ezzel pedig vesekárosodáshoz vezet. Egy másik példa szerint azok a transzgenikus egerek, amelyek a humán FcγRIIa-t a humán sejtekre fiziológiásan jellemző mennyiságben kifejezték, trombocitaaktivációt előidéző ellenanyag beadására trombocitopéniával reagáltak, míg a vad típusú FcγRIIa-t nem expresszáló - egerek csak kis mértékben, a jelátvitel gátoltsága miatt nem aktiválható FcγRI és FcγRIII receptorokkal sem rendelkező egerek pedig egyáltalán nem mutattak trombocitopéniára utaló tüneteket. Azok az FcγRIIa transzgenikus egerek pedig, amelyek működőképes FcγRI és FcγRIII fehérjékkel is rendelkeztek, trombocitaaktivációt követően néhány órával trombózis és sokkreakció következtében elpusztultak [71].

Fokozott trombóziskészség SLE-ben Az alvadási rendszer áttekintése A véralvadási és fibrinolitikus rendszerek helyes működése segít fenntartani a létfontosságú keringést ereinkben. Amennyiben a rendszer valamelyik eleme nem megfelelően működik, a fennálló kényes egyensúly eltolódik, felléphet egyrészt vérzékenység, amely vérveszteségen és szöveti károsodáson keresztül vezethet életveszélyes állapotokhoz, vagy felléphet fokozott alvadékonyság, amely az érpályák elzárása révén fontos területek, szervek funkciójának kiesését okozhatja. Az alvadás megindulása in vivo az intravasálisan fiziológiás körülmények között nem, vagy csak nyomokban jelenlévő szöveti faktor (TF) megjelenésével kezdődik. A TF transzmembrán glikoprotein, amely megtalálható a nagyobb ereket körülvevő adventitia réteg sejtjein, epitélsejteken illetve egy esetleges érsérülést követő károsodásnak fokozottan kitett helyeken (pl. agy, veseglomerulusok), de nyugalmi állapotban

16

hiányzik a plazmával érintkező endotélium és a vér alakos elemeinek felszínéről. Az érfal sérülése, vagy a monocita sejtek aktivációja következtében TF kerül kapcsolatba a plazmával, megköti és aktiválja az ott keringő VII-es alvadási faktort. A VII-es faktor aktivált enzimalakja (FVIIa) foszfolipid membránfelszín jelenlétében, a TF-hez kötötten képes hasítani, és ezzel aktiválni a IX-es és X-es alvadási faktorokat, azok pedig kis mennyiségben egymást. Az FXa foszfolipid felszín és Ca2+-ionok jelenléte mellett képes a protrombin (II-es faktor) kis mennyiségének aktiválására. Az így keletkezett trombin (FIIa) beindít egy másik utat: hasítással aktiválja a XI-es faktort, amely autokatalízise mellett a IX-es faktort aktiválja nagy mennyiségben. Emellett a trombin és az FXa is aktiválni képes a VIII-as faktort, amely így kofaktorként a FIXa-hoz kötődve, a foszfolipid felszínnel és a Ca2+-ionokkal kialakítja a X-es faktor aktiválásának leghatákonyabb komplexét, az angolból átvett szóval „tenase”-komplexet. Az így nagy mennyiségben keletkezett FXa, az előzőekhez hasonlóan foszfolipidekkel, Ca2+-ionokkal, és kofaktorával, az FVa-val a protrombint nagy mennyiségben trombinná hasító protrombináz komplexet képzi. Az eddigi folyamatok mind oda vezetnek, hogy a keletkező trombin a plazmában keringő fibrinogént (I-es faktort) hasítva, fibrin keletkezéséhez, annak H-hidakkal történő összekapcsolódásához, így egy laza fibrinháló kialakulásához vezet, amit végül az aktivált XIII-as faktor stabilizál.

FVII

FIX

Ca2+ + PhL FIXa - FVIIIa

FI FII

fibrin

FIIa

+ FXIIIa

TF-FVIIa FXIIa FX

FXa - FVa Ca2+ + PhL

FXIa

2. ábra: A véralvadási rendszer főbb folyamatainak áttekintése

17

FXI

FXII

Az alvadási kaszkád beindulásával egyidőben megkezdődik az antikoaguláns hatású fehérjék aktiválódása is. A TFPI (tissue factor pathway inhibitor) FXa-val képzett komplexe a TF és FVIIa komplexéhez köt, és azok működését, a IX-es és X-es faktorok aktivációját gátolja. Az FXa-nak és a trombinnak több inhibitora is ismert, így az α1antitripszin, az α2-makroglobulin, vagy a heparin-kofaktor II. A leghatékonyabb gátlást azonban az antitrombin (AT) fejti ki a statikus, vagyis a keletkező trombin mennyiségétől függetlenül jelenlévő inhibitorok közül. Az antitrombin, amely önmaga is szerin-proteáz, igen hatékony szerin-proteáz inhibitor („serpin”); kofaktoraival, a heparán-szulfát-proteoglikánokkal illetve az antikoaguláns kezelés során is alkalmazott heparinszármazékokkal, a trombin, az FXa és az FIXa enzimek inaktiválásáért felelős. Mennyiségi vagy minőségi elégtelensége fokozott alvadékonysághoz vezet. Hasonlóan jelentős természetes antikoaguláns fehérje az aktivált protein C (APC) és kofaktora a protein S (PS). A protein C (PC) az endotél sejtek felszínén található EPCR-hez (endoteliális PC receptorhoz) kötődve kerül kapcsolatba az őt aktiváló, sejtfelszíni trombomodulinhoz kötődő trombinnal. Aktivációja után, kofaktorának a PS-nek segítségével a tenáz és protrombináz komplexekben szereplő FVIIIa-t és FVa-t hasítja, ezzel több nagyságrenddel csökkenti a trombinképződés sebességét. A PC, vagy a PS hiánya erősen hozzájárul a trombózis kialakulásához. Ezen felül, a fibrinképződés mellett azonnal megjelenik annak plazmin által történő bontása is. A plazmin a plazminogénből keletkezik a szöveti- valamint az urokináz típusú plazminogén aktivátorok (t-PA és u-PA) segítségével; feladata a fibrin hasításán felül az extracelluláris mátrix bontásáért felelős mátrix metalloproteázok (pl. kollegenáz, zselatináz) aktiválása is. A plazminogén, más néven fibrinolitikus rendszerben

részletes

ismertetése

e

dolgozatnak

nem

célja,

illő

azonban

megjegyeznünk, hogy a működésében részt vesz több inhibitor is, amelyeknek defektusa különböző mértékű vérzékenységet okoz. Főbb tromboembóliás rizikófaktorok Az alvadási és fibrinolitikus rendszer komplex és igen jól szabályozott. Ennek következménye, hogy csak kivételesen ritka esetekben vezet egyetlen, a rendszert érintő defektus trombózis kialakulásához. Számos örökletes, és szerzett állapotot írtak le,

18

amelyekről bebizonyosodott, hogy kisebb-nagyobb mértékben hozzájárulnak a tromboembóliás események bekövetkeztéhez. Antitrombin deficiencia Az elsőként, az 1960-as évek közepén felismert örökletes trombózisra hajlamosító tényező az antitrombin (AT) deficienciája volt [72]. Az AT képzésének mennyiségi zavarai, vagy a funkciót érintő mutációk ma is a trombofíliás állapotok ismert kiváltói közül a legsúlyosabbak közé tartoznak. Ma úgy tudjuk, hogy az AT teljes hiánya, amely homozigóta AT mutációk következményeként állhat elő, a legtöbb esetben az élettel összeegyeztethetetlen, viszont leírtak már homozigóta mutációt az AT heparin-kötő helyén [73, 74], amely az AT funkciójának részleges elvesztésével jár. Heterozigóta formában számos AT mutáció ismert, ezek a lakosság 0,02-0,20 %-át érintik [75, 76], a trombofíliás eseteknek pedig mintegy 5 %-ában megtalálhatók [77, 78]. Az AT, amely maga is a szerin-proteáz emzimcsaládba tartozik, egyben szerin-proteáz inhibitor („szerpin”) is, vagyis a szerin-proteáz aktivitású alvadási faktorokat, legelső sorban a trombint, az aktivált X-es és IX-es faktorokat hasítja. Ebben természetes kofaktorai a heparán-szulfát-proteoglikánok, illetve farmakológiai kofaktorai, a heparin és ennek származékai segítik. Mutációk ismertek az AT aktív centrumában, valamint a heparin-kötő helyen, ezek heterozigóta formában is fokozott trombóziskészséget okoznak [79, 80]. A protein C – protein S rendszer defektusai Az 1980-as években írták le először egy másik természetes antikoaguláns fehérjének, a protein C-nek (PC) és kofaktorának, a protein S-nek (PS) az örökletes zavarát, mint trombózisra erősen hajlamosító tényezőket [81-84]. Azóta mindkét fehérjének több mint száz polimorf változatát megismertük [85-89]; ezek a teljes népesség mintegy 0,1-0,3 %-ában megtalálhatók [90, 91]. Súlyosabb esetekben, homozigóta vagy kettős heterozigóta formában a PC vagy a PS hiánya vagy funkcionális deficienciája már újszülöttkorban tromboembóliás események bekövetkeztéhez vezethet [92]. Az aktivált PC (APC) az aktivált V-ös és VIII-as faktorok inaktiválását végzi. Az FVa-t a 306-os, 506-os, és a 679-es pozícióban lévő argininek mellett hasítja el. Az R679 melletti hasítás nem járul hozzá az FVa funkcióvesztéséhez, az R506 melletti hasítás

19

részleges inaktivációt eredményez, míg az R306 melletti hasítás az FVa aktivitásának teljes elvesztéséhez vezet [93]. APC rezisztencia és a Leiden-mutáció Az 1990-es évek elején derült fény az aktivált V-ös faktor APC elleni rezisztenciájának hátterében álló eltérésre, vagyis az FV génben bekövetkezett G1691A báziscserének köszönhetően a fehérje 506-os pozíciójában a vad típusú arginin helyett egy glutamin megjelenésére [94]. Ezzel az eltéréssel - amelyet felfedezésének helyéről „Leidenmutáció”-nak neveznek - az FVa APC általi hasítása, vagyis inaktiválása jelentősen, ám nem teljes mértékben lecsökken, vagyis egy igen fontos reguláló lépés marad ki a folyamatból. Ez fokozott alvadékképződéshez, így visszatérő, elsősorban a mélyvénákat érintő trombózisok kialakulásához vezet [95-97]. A Leiden-mutációt hordozó allél a teljes európai népesség 3-7 %-ában [97-99], Magyarországon a lakosság 6-10 %-ában megtalálható [100-102]; érdekesség, hogy az ázsiai népesség körében a Leiden-allél előfordulása rendkívül ritka [103-105]. Az FVIIIa-t az APC az R336-os és R562-es pozíciókban hasítja. Érdekes megjegyezni, hogy a vad típusú FV jelenléte szignifikáns mértékben segíti az FVIIIa APC általi hasítását, azonban a Leiden-mutációt hordozó gén termékeként keletkező FV ezt a funkciót nem képes betölteni, vagyis egy második úton is elősegíti az alvadékképződést. APC rezisztenciát, és így fokozott alvadékonyságot okoz - az FV R506Q változatához hasonlóan - az FV „Cambridge-mutáció” [93], amely a 306-os pozícióban bekövetkező arginin treonin aminosavcserét eredményezi. Ez azonban, ellentétben a Leidenmutációval, igen ritka [106]. Ismertté vált, hogy az APC kofaktora, a PS elsősorban az FVa R306-os hasításához szükséges; konformációs változást eredményez az APC-n, így segíti annak aktív centrumát a szubsztráthoz közelebb kerülni. Emellett, a PS az FXa-hoz, az aktivált V-ös és a VIII-as faktorokhoz kötve gátolja a protrombin-trombin átalakulást, ezzel is kifejtve antikoaguláns hatását. A protrombin G20210A mutáció Az enzimatikusan aktív trombin mennyiségét szabályozzák fent említett inhibitorai, de azt, hogy alapvetően mennyi keletkezik, döntően befolyásolja a protrombin gén promóter régiója is. A promóter régióban található, 1996-ban leírt G20210A mutáció

20

hatására, a mutáns allélt heterozigóta formában hordozók plazmájában kb. 30%-kal magasabb

lesz a protrombin

szintje [107].

Ez több

trombin keletkezését

eredményezheti, és ezzel fokozott alvadékonysághoz vezethet. Ez a mutáció a magyarországi népesség 2,5-5 %-ában mutatható ki [100]; az eddig ismertetett defektusokénál mérsékeltebb – heterozigóta formában mintegy 2-3 szoros - kockázatot hordoz [107, 108]. Önmagában jellemzően még homozigóta formában sem vezet trombózis kialakulásához, azonban megemeli mind a vénás, mind az artériás trombózisok bekövetkezésének valószínűségét. A protrombin gén más változatairól is leírták, hogy hozzájárulnak a protrombin szint megemeléséhez. Például, a 13-as intronban található A19911G polimorfizmus esetében megfigyelték, hogy a homozigóta G allélt hordozók plazmájában 7 %-kal magasabb a protrombin szintje, mint a homozigóta A alléllal rendelkezőkében [109]. Bár összefüggést találtak a trombózis megnövekedett kockázata és a GG genotípus között, ennek jelentősége elmarad a korábban említett kockázati tényezőkétől. Emelkedett VIII-as faktor szint Hasonlóan a protrombin, azaz a II-es faktor fokozott termelődéshez, más alvadási faktorok emelkedett szintjéről is megállapították, hogy hozzájárulnak a koagulációs rendszer

egyensúlyának

az

alvadékonyság

irányába

történő

eltolódásához.

Leggyakrabban a VIII-as faktor szerepét említi az irodalom [108, 110, 111], de születtek eredmények, amelyek a IX-es, XI-es, valamint az I-es faktorok magas szintje és a trombózis mérsékelten (1,5-3-szorosan) emelkedett rizikója közötti kapcsolatot támasztják alá [108]. Vizsgálatok során kiderült, hogy az emelkedett FVIII szint határozottam, 3-5-szörösre megemeli – elsősorban a vénás – trombózis kialakulásának relatív kockázatát. Ismert, hogy a VIII-as faktor a plazmában a von Willebrand faktorhoz (vWF-hez) kötötten kering, valamint az is, hogy az AB0 vércsoportrendszer szerinti 0-ás vércsoportú személyek plazmájában mind a vWF, mind az FVIII szintje szignifikánsan alacsonyabb a többi vércsoportba tartozókénál. Mind a magas vWF szint, mind a nem 0-ás vércsoport trombózis kialakulásának relatív kockázatával tapasztalt összefüggése a magasabb FVIII szint hatásának tulajdonítható. Az emelkedett FVIII szint és a fokozott alvadékonyság közti kapcsolat hátterében több mechanizmus állhat: a nagyobb mennyiségű FVIII erősebb kofaktor aktivitásával fokozza az FIXa, ezzel a tenáz-

21

komplex X-es faktort aktiváló működését. Mivel az FVIII és az FV mindketten az APC szubsztrátjai, az FVIII szint emelkedése egyben az FV csökkent inaktivációját is eredményezi. Az alvadási rendszer kaszkádszerű felépítésének köszönhetően azonban a tenáz- és protrombináz-komplexek funkciójának lineáris emelkedése exponenciális fibrinképződést, illetve alvadékonyságot eredményez. Emelkedett homocisztein szint A homocisztein (Hcy) szint megemelkedése is állhat trombofíliás állapot hátterében [112, 113]. A magas Hcy koncentrációt kezdetben az arteriosclerosis és az artériás trombózisok kialakulásának megnövekedett kockázatával hozták összefüggésbe [114, 115], de mára egyre több adat támasztja alá szerepét a vénás trombózisok kialakulásában [116, 117]. A Hcy szint emelkedését okozhatja a Hcy-anyagcsere valamely enzimének öröklött defektusa. Erre ismert példa a metil-tetrahidrofolátreduktáz (MTHFR) génjének gyakori C677T polimorfizmusa [118-120], amely az MTHFR enzim hőre labilis változatának expresszióját, ezzel homozigóta formában az enzimaktivitás 50 %-os csökkenését eredményezi. Az MTHFR feladata metionin előállítása a Hcy metilációjával (a reakcióhoz a metilcsoportot az enzim a metiltetrahidro-folsav, az MTHF demetilációjával nyeri), így az enzim csökkent működése Hcy szint enyhe emelkedésével jár. Egy másik enzim, a cisztationin-ß-szintáz (CBS), a cisztein Hcy-ből történő képzéséért felelős. Az enzim génjének számos mutációja ismert, amelyek homozigóta formában a CBS teljes hiányát okozhatják, de heterozigóta genotípus esetén is vezethet akár már fiatal korban artheriosclerosishoz és vénás trombózisok kialakulásához [121-123]. A mutáció homozigóta formájának előfordulása azonban igen ritka (1:100.000). A Hcy-szint megemelkedését többnyire mégis a fent említett enzimek kofaktorainak, a B6 és B12 vitaminnak, valamint az MTHF szintéziséhez szükséges folsavnak a hiánya okozza. A hiperhomociszteinémiának a trombózis és a kardiovaszkuláris betegségek kialakulására gyakorolt hatása több folyamat révén érvényesül [113, 124]. Egyrészt, a Hcy autooxidációja során reaktív oxigéngyökök keletkeznek, amelyek az endotélt károsítják, egyben a keringő trombocitákat és monocitákat aktiválják. Másrészt, a Hcy gátolja egyes anticoaguláns fehérjék működését: blokkolja az AT kötését a membrán heparán-szulfát-proteoglikánokhoz; a trombomodulin redukálása révén gátolja a

22

trombin-trombomodulin kapcsolat kialakulását, ezzel a PC aktivációját; módosítja a tPA-receptor t-PA kötőhelyét, így gátolva a fiblinolízist. Szerzett trombofíliás tényezők, avagy a trombózis kialakulását segítő állapotok A trombózis kockázatát emeli néhány állapot, például terhesség, poszt-menopauzális hormonpótló vagy orális fogamzásgátló kezelés, infekciók, malignus megbetegedések, sebészeti beavatkozások, obesitas, amelyeket szerzett rizikófaktoroknak nevezünk. Ezek közé tartozik a keringő antifoszfolipid antitestek megjelenése is, amely lehet spontán, de társulhat infekciókhoz, autoimmun betegségekhez is. Az SLE-re jellemző gyulladás és az antifoszfolipid antitestek protrombotikus hatásának vélt mechanizmusait érdemes röviden összefoglalni. A gyulladás szerepe a trombózis kialakulásában A gyulladás a véralvadás több fázisára is hat, a kezdeti lépésektől egészen a regulációig [125, 126]. A gyulladásos citokinek mint a TNFa, IL-1, IL-6 beindítják a szöveti faktor expresszióját és fokozzák a keringő, úgynevezett „blood-born” TF mennyiségét [126130]. Ezen kívül, a gyulladásos mediátorok a komplementrendszer aktivációján vagy fokozott apoptózis előidézésén keresztül hozzájárulnak negatív töltésű foszfolipidek felszínre kerüléséhez, ami kedvez az alvadási folyamatok beindulásának. A gyulladásos reakciók során gátlódik a természetes antikoaguláns fehérje, a PC aktivációja. A C4BP fehérje fokozott expressziója következtében pedig lecsökken a szabad, funkcionálisan aktív PS mennyisége, hiszen a PS többsége a plazmában a C4BP szabályozó komplementfehérjéhez kötve kering [131]. Az APA-k szerepe a trombózis kialakulásában A megfigyelés magyarázatául, miszerint az antifoszfolipid antitestek (APA-k) jelenléte in vivo hozzájárul a trombózisok kialakulásához, több elmélet is született az elmúlt években. Többségüket máig sem cáfolták meg, a legvalószínűbb tehát az, hogy az APAk kisebb-nagyobb mértékben számos úton hatnak a koagulációs rendszerre, mind az alvadást elősegítő, mind az azt gátló folyamatok révén, ám összességben az egyensúlyt az alvadékonyság irányába tolják el [132-135]. Két fő csoportra oszthatjuk az APA-k koagulációt érintő hatásmechanizmusait: a molekuláris eseményekre ható és a sejtközvetített hatások csoportjaira.

23

A molekuláris szintű hatások megértéséhez fontos tudni, hogy nyugalmi állapotban a sejtmembrán kettősrétegének belső rétegében olyan negatív töltésű foszfolipidek (például foszfatidil-szerin) találhatók, amelyek a sejtek aktiválódásakor a külső felszínre kerülnek. Ezekhez Ca2+ ionokon keresztül képesek hozzákapcsolódni a Gla-doménnel rendelkező alvadási faktorok (FVII, FIX, FX, FII) és antikoaguláns fehérjék (PC, PS); ez a kötés szükséges a felsorolt enzimek működéséhez. Így a véralvadási rendszer több folyamata - a TF-FVIIa komplex általi FIX és FX aktiváció, az FX tenáz-komplex általi aktivációja, a protrombináz-komplex által végrehajtott protrombin-trombin átalakítás, valamint a gátló folyamatok közül a PC aktivációja, majd az APC FVa-t és FVIIIa-t inaktiváló működése - során elengedhetetlen a foszfolipid felszín jelenléte. Azonban az antifoszfolipid antitestek is ezeket az anionos felszíneket és a hozzájuk kötődő fehérjéket ismerik fel, és támadják meg; ezzel pedig gátolják a foszfolipidfüggő reakcióutakat az alvadási rendszerben. Kimutatták, hogy a ß-2-glikoprotein I (ß2-GPI) membránfehérje, valamint a hozzá kötődő APA-k versengenek a szabad foszfolipid felszínért a fent felsorolt enzimkomplexekkel, ezzek gátolva működésüket [136, 137]. Azt is megfigyelték, hogy a tisztított ß2-GPI ezen a módon hatékonyabban gátolja a PC aktiválódását és működését, mint a trombin keletkezéséhez vezető folyamatokat, vagyis a rendszert az alvadékonyság irányába tolja el. Az utóbbi évek tanulmányai kiemelik az APA-k és az annexin V kompetíciójának szerepét a tromboembóliás események pathogenezisében [138]. Az annexin V fehérje molekulák – amelyeket a placentából és a véredényekből is izoláltak - nagy affinitással kötnek az anionos foszfolipid felszínhez, azon összekapcsolódnak, és mintegy kétdimenziós kristályrácsot képezve pajzsként védik az alvadási komplexektől. Így meggátolják, hogy a különböző folyamatok révén kis mennyiségben felszínre kerülő anionos foszfolipidek közreműködésével beinduljon az alvadási kaszkád. Az APA-k foszfolipidekhez való kötődése megbontja az annexin V kristályrácsát, és lecsökkenti annak alvadásgátló hatását. APA-pozitív betegek placentájából származó sejteken, trophoblaszt-sejtkultúrákon és mesterséges foszfolipidfelszínen végzett kísérletek igazolják ezt a működést. Az annexin V-tel való kölcsönhatás megmagyarázza azt is, miért okoz trombózist az APA-k jelenléte in vivo, és miért gátolja az alvadást in vitro. In vitro ugyanis - az annexinek távollétében - az APA-k a szabad foszfolipidfelszínt

24

blokkolják az alvadási komplexek elől, viszont nem zavarják meg az annexin antikoaguláns hatását. A sejtközvetített folyamatok lényege, hogy a monociták és trombociták membránjához kötve

az

antifoszfolipid

antitestek

képesek

beindítani

vagy

felerősíteni

az

intravaszkuláris sejtek aktivációjához vezető jelátviteli útvonalakat. Aktiválódásuk során a sejtek szöveti faktort (TF) expresszálnak [139]. A TF egy része az azt termelő sejtek membránján marad, egy másik hányad azonban kis membránpartikulumokkal, ún. micropartikulumokkal együtt lefűződik a trombocitáról vagy monocitáról, míg újabb vizsgálatok szerint kis mennyiségben szolubilis formában is található TF a plazmában. A TF jelenléte a plazmában keringő FVII aktiválásával beindítja az alvadási kaszkádot, a trombusképződéshez vezető

folyamatokat. Több tanulmány eredményei is

alátámasztják, hogy az antifoszfolipid antitestek jelenlétében emelkedik a TF expresszió [140, 141], illetve, hogy a magasabb plazma TF szint korrelál az APA-k jelenlétével, és a pozitív tromboembóliás kórtörténettel [142, 143]. A korábban trombózist már elszenvedett SLE-s betegek tisztított IgG antitest frakciója ezt a hatást erősebben mutatja, mint a trombózisos kórelőzmény nélküli SLE-s betegek antitestei. Az endotélsejtek APA-kal történő inkubációja során megfigyelték, hogy a sejtek aktiválódnak, fokozódik a membránjukon a trombociták és leukociták adhézióját segítő molekulák, például a szelektinek (P- és E-szelektin), ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule), VCAM-1 (vascular cell adhezion molecule) expresszója. A TF mellett emelkedik még a t-PA, vWF és a PAI-1 termelés és szekréció, valamint a proinflammatórikus citokonek, az IL-1 és IL-6 termelődése is [144]. A trombociták APA általi aktivációja közvetlenül beindítja azokat a jelátviteli folyamatokat,

amelyek

következményeként

anionos

foszfolipidek

kerülnek

a

vérlemezkék membránjának felszínére, illetve megjelennek a trombocitaaggregációt közvetítő membránstruktúrák [132], amelyek közül a legfontosabb a GPIIb-IIIa membránkomplex. Az APA-k köthetnek a trombocitamembrán foszfolipidjeihez és az ahhoz asszociált fehérjékhez, elsősorban a ß2-GPI-hez az antigénfelismerő Fabfragmentumukkal, vagy az Fc fragmentumukkal a vérlemezkék membránján megtalálható FcγRII receptorhoz. Fontos megjegyezni, hogy így akár fiziológiás vagy éppen kóros körülmények közt már a trombociták kismértékű aktivációja is további aktivációhoz és aggregációhoz vezet.

25

CÉLKITŰZÉSEK Munkám célja az volt, hogy megvizsgáljam az autoantitestek és immunkomplexeik által okozott szervi károsodások és szisztémás jelenségek hátterét SLE-ben; valamint, hogy olyan laboratóriumi módszereket keressek, amelyekkel jól jelezhető vagy követhető a betegség alakulása. Közelebbi céljaim voltak: •

Megvizsgálni a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, felmérni a DNáz

aktivitás

jelentőségét

a

betegség

kialakulásában,

és

szervi

manifesztációinak – elsősorban a lupus nephritis - megjelenésében. Kiértékelni, mennyire

hasznosítható

paraméter

a DNáz

enzimaktivitás

a

betegek

laboratóriumi követése során. •

Megvizsgálni, milyen összefüggés van a betegek DNáz aktivitása és a szérum antinukleoszóma

antitest

szintje

között,

valamint

meghatározni

az

antinukleoszóma antitest szint mérésének klinikai jelentőségét. •

Meghatározni az antifoszfolipid antitestek megjelenését az SLE-s populációban és

megvizsgálni

ezek

összefüggését

a

tromboembóliás

epizódok

bekövetkeztével. •

Meghatározni az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és kimutatni az ezek hátterében álló, az SLE-től független, többnyire öröklődő tromboembóliás kockázati tényezőket, illetve megvizsgálni a trombofília-szűrés indokoltságát SLE-ben.

•

Megvizsgálni annak a lehetőségét, hogy szintetikus peptidkonjugátumokkal előidézhető-e az immunkomplexek hatása, illetve a receptorok blokkolásával gátolhatóak-e az antitestek és immunkomplexeik által közvetített effektor funkciók az autoimmun betegségek, elsősorban az SLE kezelésében.

26

MÓDSZEREK A vizsgált betegcsoport A vizsgálatok során összesen 173 SLE-s beteg mintáit használtuk fel tájékoztatásuk után, belegyezésükkel. Közülük 155-en a Semmelweis Egyetem Immunpathológiai Járóbeteg-szakrendelésének

gondozásában

álltak,

10-en

az

I-es

számú

Gyermekgyógyászati Klinikán, 8-an pedig a II-es számú Belgyógyászati Klinikán részesültek ellátásban. A betegek diagnózisa a Tan és munkatársai által 1982-ben lefektetett kritériumrendszer [19] alapján történt. A betegség aktivitását minden esetben a SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index) számításával [20] kapott pontokkal jellemeztük. A DNáz enzim aktivitásával kapcsolatos kísérletekbe 113 SLE-s beteget vontunk be, tőlük 185 szérummintát vettünk. A betegek közt 105 nő és 8 férfi volt, 13 és 79 év közötti életkorban, átlagéletkoruk 38,3 ± 14,1 év volt a mintavételek idején. A kísérletek során 9 nem-differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedő beteg (7 nő, 2 férfi; 45,8 ± 11,9 évesek) és további 14 nem autoimmun beteg kontroll (11 nő 3 férfi; 43 ± 22,1 évesek) mintáját is megvizsgáltuk. A tromboembóliás kockázatok elemzéséhez 105 SLE-s beteget vizsgáltunk ki. Köztük 99 nő és 6 férfi volt, 18 és 68 év között, átlagéletkoruk 41,0 ± 11,7 év volt, az SLE diagnózisának felállításától vizsgálatunkig átlagosan 14,6 ± 9,1 év telt el. A minták előkészítése a vizsgálatokhoz A DNáz aktivitás méréshez, illetve a különböző antitestek kimutatásához natív vérből centrifugálással (4000 rpm 5’) nyert szérumot, az alvadási vizsgálatokhoz nátriumcitráttal alvadásgátolt, és két centrifugálással trombocitamentesített plazmát, a genetikai vizsgálatokhoz pedig leukocitákban dús „buffy coatból” tisztított DNS-t használtunk. Az antinukleoszóma és anti-DNS antitestek szintjének a mérése Az antitestek szintjének meghatározása enzim-kötött immunszorbens, azaz ELISA (enzime-linked immunosorbent assay) technikával történt. A mérésekhez kereskedelmi forgalomban lévő kiteket használtunk (Orgentec GmbH, Mainz, Németország). Az immunszorbens módszer az antigén és a specifikus antitest közötti erős, nem-kovalens

27

kölcsönhatás felhasználásán alapszik. A kitekben található polisztirol lemezeken gyárilag kikötött tisztított antigén (ebben az esetben kettős szálú DNS illetve nukleoszóma) található. Erre a felületre kikötnek a mintákban található specifikus antiDNS és antinukleoszóma antitestek. Miután mosással eltávolítottuk a lemezről a nem specifikus antitesteket, peroxidáz enzimmel konjugált, humán IgG specifikus, nyúlban termeltetett antitesteket kötünk a rendszerben maradt specifikus ellenanyagokhoz. Ezeknek mennyiségét később a peroxidáz enzim által tetra-metil-benzidin szubsztrátból átalakított színes reakciótermék 405 nm-en fotométerrel leolvasott abszorbanciájából határozzuk meg. A gyártó leírását követve, hatpontos kalibrációs görbe felhasználásával végeztük a méréseket. Pozitívnak értékeltük a gyártó által javasolt 20 IU/ml méréshatár feletti antitest-koncentrációt tartalmazó mintákat. DNáz aktivitás mérés A DNáz enzim aktivitását is kereskedelmi forgalomban lévő ELISA elven alapuló kittel végeztük (Orgentec GmbH, Mainz, Németország). A módszer lényege röviden összefoglalva a következő: A polisztirol ELISA lemezekre gyárilag DNáz-szubsztrát volt kitapasztva. A lemezre rámértük a betegek hígított szérum mintáit, majd egy órán keresztül 37 ºC-on inkubáltuk a lemezeket. Az inkubációs idő leteltével a lemezen érintetlenül megmaradt szubsztrát mennyiségét mértük az ELISA módszer elve alapján peroxidáz enzimmel jelölt a DNáz-szubsztrátra specifikus antitest segítségével. A DNáz specifikus szubsztrát fogyásából hatpontos kalibrációs görbe segítségével számoltuk ki a mintákban található DNáz enzim aktivitását. A vizsgálatokat minden minta esetén legalább két párhuzamos méréssel végeztük. A longitudinális összehasonlításokhoz felhasznált mintákat egyidőben mértük le, ezzel is kiküszöbölve a mérések közti variabilitásból adódó hibát. Az antifoszfolipid antitestek szintjének mérése ELISA módszerrel Az

anti-foszfolipid

antitestek

szintjének

meghatározásához

kétféle

módszert

használtunk. Szilárdfázisú, ELISA elven alapuló módszerrel mértük a betegek szérumában található antitestek mennyiségét, míg koagulációs módszert alkalmaztunk a foszfolipid-specifikus lupus antikoaguláns aktivitás mérésére.

28

A fentiekben már ismertetett ELISA technikával az alábbi antifoszfolipid antitestek mennyiségi meghatározását végeztük el: egy kevert IgG és IgM izotípusú antitesteket is detektálni képes szűrőteszt után a pozitív mintákban külön-külön megmértük az IgG és IgM izotípusú anti-cardiolipin antitestek mennyiségét (anti-CalG, anti-CalM); továbbá kevert, IgG, IgA és IgM izotípusú antitesteket kimutató szűrőteszttel végeztük az antiß2-glikoprotein I (anti-ß2-GPI), az anti protrombin (anti-FII) és az anti-foszfatidil-szerin (anti-ph-Ser) ellenanyagok mennyiségi meghatározását (a gyártó minden esetben: Orgentec GmbH). A foszfolipid-specifikus LA mérése koagulációs módszerrel A lupus anticoaguláns (LA) aktivitás vizsgálatához nátrium-citráttal alvadásgátolt, és ismételt

centrifugálással trombocitáktól mentesített

plazmákat

használtunk.

A

mérésekhez egy szűrő és megerősítő vizsgálatokból álló háromlépéses tesztrendszert dolgoztunk ki. Első lépésként három független szűrőtesztet végeztünk. Azokat a plazmákat vizsgáltuk tovább, amelyek esetében a három teszt különböző reagenseivel (dPT 1:200, Innovin, Dade Behring, Németország; PTT-LA, Diagnostica Stago, Franciaország; dRVVT Screen, Gradipore, USA) elvégzett aktivált parciális tromboplasztin idő (aPTI) illetve protrombin idő (PT) mérés során legalább egy teszttel a kontroll 1,1-szeresénél hosszabb időt mértünk. A kiszűrt plazmákat először keveréses teszttel vizsgáltuk tovább. Amennyiben kevert normál plazmával 1:1 arányban keverve nem kaptunk normál aPTI értéket, azaz a normál plazma hozzáadása nem korrigálta a megnyúlást, a foszfolipid neutralizációs tesztekkel (Staclot LA, Diagnostica Stago és dRVVT Confirm, Gradipore) vizsgáltuk a mintát tovább. Azok a plazmák, amelyek esetében foszfolipid reagens hozzáadása után normál aPTI-t mértünk, vagyis a foszfolipidek neutralizálták a lupus anticoaguláns aktivitást, megállapítható volt a foszfolipid-specifikus lupus anticoaguláns pozitivitás. A természetes anticoaguláns fehérjék szintjeinek mérése A protein C (PC), protein S (PS) illetve antitrombin (AT) deficiencia okozta protrombotikus állapotokat a betegek PC, PS és AT aktivitásának mérésével kívántuk kiszűrni. A méréseket egy Sysmex CA-1500 típusú koagulométeren végeztük gyárilag előállított és tisztított PC (Chromogenix, Olaszország), PS (Dade Behring, USA) és AT

29

(Sigma, USA) reagensekkel. A reagensek gyártói által ajánlott alábbi normál határértékeket jelöltük ki: a PC-re mindkét nemnél 70-149 %, a PS normál tartománya nőknél: 59-118 %, férfiaknál: 75-130 %, az AT határértékei pedig szintén azonosak voltak mindkét nem esetén: 50-150 %. Az APCR meghatározása Az ötös alvadási faktor (FV) aktivált protein C (APC) elleni rezisztenciájának hátterében leggyakrabban az FV Leiden mutációja áll. Az általunk használt reagens (Chromogenix, Instrumentation Laboratory SpA, Milánó, Olaszország) is elsősorban az ilyen plazmák kiszűrésére volt alkalmas. A méréseket - akárcsak a többi alvadási tesztet - Sysmex CA-1500 típusú koagulométeren végeztük. A vizsgálat elve a következő: a betegektől származó plazmákat négyszeres mennyiségű, gyártó által biztosított FVhiányos plazmával hígítottuk. Ezt a keveréket 1:1 arányban elegyítettük a gyártó által megadott, tisztított foszfolipideket és kontakt aktivátort tartalmazó aPTI-reagenssel, majd CaCl2 hozzáadása meginduló alvadás detektálásával megmértük az aPTI-t. A mérést megismételtük, de ezúttal a CaCl2 reagens helyett APC-t is tartalmazó CaCl2 reagenssel indítottuk az alvadást. Amennyiben az antikoaguláns hatású aktivált PC jelentétében nem nyúlt meg kellően az aPTI, az APC elleni rezisztenciát állapíthattunk meg. Amennyiben a két aPTI aránya 2-nél kisebb volt, az FV Leiden mutációjának heterozigóta jelenléte volt feltételezhető, amennyiben az arány még az 1,4-et sem haladta meg, homozigóta FV Leiden genotípusra következtethettünk. A Leiden mutáció és a protrombin mutáció detektálása Az V-ös faktor 10-es exonjában található G1691A, és a II-es faktor, másnéven protrombin génjének promoter régiójában található G20210A báziskicserélődéseknek a kimutatását DNS olvadási görbe analízissel végeztük, kereskedelmi forgalomban lévő kitek (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) reagenseivel. A módszer lényege, hogy a PCR technikával felszaporított V-ös illetve II-es faktor gének vizsgált szakaszához fluoreszcens festékkel jelölt, specifikus DNS oligonukleotid próbát hibridizáltunk alacsony hőmérsékleten, majd a reakcióelegy fokozatos melegítése közben detektáltuk a vizsgált génszakaszokról leváló DNS-próbák – mennyiségükkel arányos - fluoreszcens jelét. A DNS szálak alacsonyabb hőmérsékleten bekövetkező

30

szétválása, olvadása, a pontatlan összekapcsolódásra, nem teljes komplementaritásra utalt, ami a detektálni kívánt mutációk jelenlétét igazolta. Az V-ös faktor vizsgálata DNS szekvenálással Az V-ös faktor két, az aktivált protein C-vel való reakciójához szükséges argininjét (Arg 306 és Arg 679) és ezek környezetét vizsgáltuk. Az izolált DNS-ből két szakaszt PCR reakció során felszaporítottunk. Ehhez a következő reakcióelegyet használtuk 50 µl végső reakciótérfogatban: PCR buffer 1x végkoncentrációban (Eppendorf, Németország), dNTP mix egyenként 0,2 mM végkoncentrációban, primerek egyenként 0,3 µM végkoncentrációban (Genodia, Magyarország), 2U HotStart Taq-polimeráz (Eppendorf, Németország), 5 µl tisztított DNS, PCR tisztaságú víz. A felhasznált primerek szekvenciája a következő volt: 306F: 5’-GGGATGCAGGCTTACATTGAC-3’; 306R: 5’-TTCGCTGGTATTACAGGTGCAT-3’ 679F: 5’-GAAGCAAAAAGCTGAGGCTGA-3’ 679R: 5’-ACGAATTCAGTGCCATTCTCC-3’ A reakcióhoz az alábbi PCR programot használtuk: 95ºC 10’; 30 x (95ºC 15”, 60ºC 15”, 72ºC 30”); 72ºC 7’. A PCR termékeket 2%-os agaróz gélen futtattuk, ezzel ellenőrizve a reakció specifikusságát, majd megtisztítottuk (PCR Purification Kit, Qiagen, Németország). Ezt követően cycle sequencing reakcióval (Cycle Seq Reaction Kit, Applied Biosystems, USA) állítottuk elő a különböző hosszúságú fluoreszcensen jelölt oligonukleotidokat, amelyeket ABI 310 genetikai analizátoron futtattunk. A szekvenciák elemzéséhez az Applied Biosystems Sequence Scanner szoftverét használtunk. A VIII-as faktor szintjének mérése A plazma VIII-as faktor szinteket fotometrikus úton határoztuk meg. A mérések elve az alábbi: olyan reakcióközeget biztosítottunk Ca2+, foszfolipidek valamint aktivált IX-es faktor kellő mennyiségű hozzáadásával, hogy a X-es faktor aktiválásának sebességét meghatározó tényező a VIII-as faktor mennyisége illetve aktivitása lett, így a keletkező aktivált FX mennyiségéből - amit kromogén szubsztrátjának (S-2765) hidrolízisekor

31

felszabaduló kromofór csoport színintenzitásának detektálásával követhettünk számolhattuk ki a plazma FVIII tartalmát. A plazma FVIII szint normál tartományát 50150 %-ban határoztuk meg. A von Willebrand faktor szintjének a mérése A von Willebrand faktor mennyiségi meghatározásakor a plazmában található von Willebrand faktor antigén (vWF:Ag) koncentráció mellett a von Willebrand faktor kollagén kötési aktivitását (CBA: collagen binding activity) is megmértük. Mindkét tesztet ELISA módszerrel végeztük. A vWF:Ag szint meghatározásakor a lemezeket anti-humán-vWF antitesttel érzékenyítettük, a CBA méréséhez pedig kollagénnel. Ezekhez kötött ki a plazmában található összes vWF illetve a kollagént kötő aktív vWF. Mindkét esetben anti-humán-vWF-hez konjugált tormaperoxidáz által átalakított kromogén szubsztráttal, hatpontos kalibrációs görbe segítségével kvantifikáltuk a vWF szintet. A normál tartomány a standard humán plazmában találhazó vWF:Ag illetve CBA 50-150 %-a volt. Homocisztein szint mérés A plazma homocisztein szintek meghatározása fluoreszcens polarizációt alkalmazó immuntechnikával (FPIA: Fluorescence Polarization Immunoassay) történt Abbott IMx immunanalizátor segítségével. A vizsgálat előkészítése során a plazmában található fehérjékben kötött vagy diszulfid-hídban szereplő homociszteineket di-tio-treitollal szabad homocisztein alakká redukáljuk, majd az összes homociszteint átalakítjuk Sadenozil-homociszteinné (SAH) SAH-hidroláz enzim hozzáadásával. A keletkező SAH mennyiségét aszerint határozzuk meg, hogy milyen erős floureszcens jelet ad a SAH-val a monoklonális ellenanyaghoz való kötésért versengő fluoreszcensen jelölt reagens. A kvantitatív meghatározás hatpontos kalibrációs görbe alapján történt. A szintetikus peptidek és peptidkonjugátumok citokintermelésre gyakorolt hatásának vizsgálata A kísérleteket humán monocita eredetű, Monomac sejtvonallal végeztük. Sejttenyésztő lemez lyukaiba kimértük a vizsgálandó peptidkonjugátumok és a pozitív kontrollként használt aggregált IgG különböző koncentrációjú oldatainak 100-100 µl-ét. Ehhez

32

lyukanként 200.000 sejtet mértünk. 24 órás 37 ºC-os inkubálás után meghatároztuk a felülúszók IL-6 és TNFα szintjét. Megvizsgáltuk azt is, hogy a peptidek monomerjei hogyan befolyásolják a sejtek aggregált IgG hatására meginduló citokintermelését. Ebben az esetben a sejttenyésztő lemezre kimért Monomac sejtekhez a monomer peptidek keverékének különböző koncentrációjú oldatát mértük, majd fél óra inkubálás után adtuk az elegyhez a citokintermelést indukáló aggregált IgG preparátumot. A peptidkeverék végső koncentrációja az IgG-hez képest 3-, 15- és 75-szörös moláris felesleg volt. A citokintermelést a fölülúszókból 1, 2, 4 és 24 óra után határoztuk meg. A TNFα-termelést WEHI 164 TNF-érzékeny sejtvonal felhasználásával állapítottuk meg. A sejtek a hozzáadott TNFα-tartalmú felülúszó hatására apoptózist szenvednek, a citokintartalmat így a túlélő sejtek mennyiségéből határoztuk meg. Az MTT festéket az élő sejtek mitokondriális enzimei ibolya színű formazán kristályokká alakítják, ezt SDSben feloldva, majd fotometriás úton kvantifikálva megállapítható a sejtpusztulás, azaz a TNFα mennyisége. Az IL-6 mennyiségi meghatározását szendvics ELISA módszerrel végeztük. A lemez érzékenyítése rekombináns anti-humán-IL-6 antitesttel történt (Biosource, USA), második ellenanyagként pedig biotinált anti-hIL-6-ot (Biosource, USA) használtunk, amelyhez ExtrAvidin-HRPO konjugátumot (Sigma, USA) adtunk. Végül ennek enzimatikus aktivitásából számoltuk ki az felülúszók IL-6 szintjét, hatpontos, rekombináns IL-6 (Biosource, USA) hígításával készült standard sor segítségével. FcR-ok és a peptidek közti kötődés vizsgálata A

szintetikus

peptidek

kötődését

a

monociták

Fc

receptoraihoz

áramlási

citofluorimetriás módszerrel (Beckton-Dickinson FACSCalibur készülék és CellQuest szoftver) vizsgáltuk. A mérésekhez 500.000 Monomac sejtet használtunk. A sejtszuszpenziókhoz hozzáadtuk a vizsgálni kívánt biotinos peptidek különböző koncentrációjú oldatát, majd 30 perces 4 ºC-os inkubálást és mosást követően a sejtekhez kötődött peptideket FITC-ExtrAvidin konjugátummal jelöltük. Újabb mosás után a sejtek FITC-konjugátumtól származó fluoreszcenciájának intenzitását lemérve következtettünk a peptidek és a sejtfelszíni receptorok kapcsolatának erősségére.

33

A gátlásra irányuló méréseink során a jelöletlen peptideket adtunk a sejtekhez, majd biotinált aggregált IgG-t, és ez utóbbi kötődésének lemérésével állapítottuk meg, hogy a peptidek milyen mértékben voltak képesek kiszorítani az IgG-t a sejtfelszíni receptorok kötőhelyeiről. Statisztikai analízis A kapott adathalmazokat elsőként leíró statisztikával jellemeztük: átlagot, standard deviációt számítottunk, illetve ellenőriztük az adathalmazok eloszlását. A normál eloszlást követő változók csoportjait (pl. DNáz aktivitás) Student-féle t-teszttel hasonlítottuk össze. A folytonos, de nem normál eloszlást követő változók (pl. az antinukleoszóma antitestek koncentrációja) esetén pedig a nem-paraméteres Mann-Whitney U-tesztet alkalmaztuk. Szignifikánsnak minősítettük a csoportok közti különbséget, amennyiben p<0,05 értéket kaptunk. A különböző változók közti korreláció jellemzésére Spearman-féle rangkorrelációs koefficienst számítottunk. A diszkrét változók analíziséhez (pl. az MBL polimorfizmusok vizsgálata) χ2-próbát végeztünk, amelyhez a küszöbértékeket α=0,05 szignifikanciaszint szerint állapítottuk meg. Az éves incidenciák számításakor az események számát osztottuk az eltelt betegévek számával. A betegévek meghatározásakor a diagnózis felállításától a vizsgálat időpontjáig vagy a vizsgált esemény (pl. vénás trombózis) bekövetkeztéig eltelt időt vettük figyelembe. A kockázati tényezők erejének jellemzésére relatív kockázatot (RR: relative risk) és esélyhányadost (OR: odds ratio) számítottunk 95 %-os konfidencia intervallumokkal. Emelkedettnek minősítettük a kockázatot, amennyiben a konfidenciaintervallum minden eleme 1-nél nagyobb szám volt. Számításainkat a Microsoft Excel, Statistica 6.0 illetve MedCalc szoftverek segítségével végeztük.

34

EREDMÉNYEK A nukleoszóma elleni antitestek és a DNáz aktivitás SLE-ben DNáz enzimaktivitás az SLE-s betegcsoportban A SLE betegek szérumában szignifikánsan alacsonyabb DNáz-aktivitást mértünk, mint a nem autoimmun betegektől származó kontroll szérumokban (3. ábra). A betegek szérumában 63,75 (± 12,1) % volt a DNáz enzimaktivitás, ami a kórosan alacsony tartományba esik. Kórosan alacsony, 70% alatti volt 75 betegnek, az SLE-s csoport 66,4 %-ának DNáz aktivitás értéke. Ezzel szemben a nem autoimmun beteg kontrollok átlagos DNáz aktivitása 81.3 (± 9.25) % volt, és mindössze egy betegnél, ez a csoport 7.1 %-a, tapasztaltunk kórosan alacsony szintet. A kontroll és SLE-s csoport közti különbség statisztikailag szignifikáns (p<0,001). A nem differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedő betegek csoportjának DNáz aktivitása 64,9 (±18,2) % volt. Ez az SLE-s csoportéval közel egyezőnek bizonyult (p=0,854), azonban a nem autoimmun kontroll betegek csoportjától sem különbözött szignifikánsan (p=0,295).

DNáz aktivitás %

100

80

60

40

20

SLE (113)

UCTD (9)

nem AI (14)

3. ábra: DNáz enzimaktivitás a három vizsgált betegcsoportban. Az oszlopdiagramról a csoportokban mért átlagos DNáz aktivitás értékeket és szórásokat lehet leolvasni, a pontok pedig az egyes mért értékeket jelölik. Az SLE-s csoport DNáz aktivitása (63,75 ± 12,1 %) szignifikánsan (p<0,001) alacsonyabb volt a nem autoimmun beteg (nem AI) kontrollokétól (81.3 ± 9.25 %), de nem különbözött (p=0,854) a nem-differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedőkétől (64,9 ± 18,2 %).

35

Megvizsgáltuk a betegek DNáz aktivitása és a veseérintettség közti kapcsolatot is (4. ábra). Az SLE-s betegeket az alábbi három csoportba soroltuk: VA - aktív vesebetegséggel élők (33 beteg); VB - korábban fellépett, de gyógyult a vesekárosodásos betegek (18 beteg); VC - veseérintettségtől mentesek (61 beteg). A három csoport átlagos DNáz aktivitás értékei a következők voltak: VA: 60,95 ± 11,23 %; VB: 63,5 ± 10,32 %; VC: 65,48 ± 13,04 %. Bár tendencia észrevehető, a csoportok közötti különbség statisztikailag nem jelentős. A VA és VC csoportok, vagyis az aktív vesebetegek és a veseérintettségtől teljesen mentesek DNáz aktivitása közötti különbség esetében sem kaptunk szignifikáns eltérést (p=0,082), a két másik összehasonlításban (a korábban vesebetegek aktívakkal, ill. egészségesekkel történő összevetése) pedig még kisebb különbségeket kaptunk (VA-VB: p=0,420; ill. VB-VC: p=0,505).

DNáz aktivitás %

100

80

60

40

20

SLE

SLE-VA

SLE-VB

SLE-VC

4. ábra: DNáz aktivitás a teljes SLE-s csoportban (SLE; 63,75 ± 12,1 %), és a veseérintettség szerint megkülönböztetett három SLE-s alcsoportban: VA - aktív vesebetegséggel élők (60,95 ± 11,23 %); VB - korábban fellépett, de gyógyult a vesekárosodásos betegek (63,5 ± 10,32 %); VC - veseérintettségtől mentesek (65,48 ± 13,04 %). A csoportok között nincs szignifikáns különbség.

36

Antinukleoszóma antitestek (ANCSA) SLE-ben Az SLE-s betegek szérumában magas antinukleoszóma antitest koncentrációt találtunk (5. ábra). A csoport átlagos értéke 356,3 ± 851 IU/ml volt. A magas szórás érték is mutatja, hogy igen tág tartományba estek az ANCSA eredmények (0-10.000 IU/ml-ig). 90 beteg (79,6 %) szérum antitest koncentrációja haladta meg a 20 IU/ml-es küszöbértéket; közülük 58 személynek (51,3 %) az eredménye volt 100 IU/ml-nél is magasabb, 9-nek (8 %) pedig meghaladta az 1000 IU/ml-es koncentrációt is. A nem autoimmun kontroll csoportból mindössze egy személynél találtunk kimutatható mennyiségű antinukleoszóma antitestet, de ennek koncentrációja sem haladta meg a 20 IU/ml-es határértéket, vagyis a kontrollok közül senki sem minősült ANCSA pozitívnak. A kontroll csoport átlagos ANCSA szintjét 1,44 ± 2,77 IU/ml-ben határoztuk meg, ami az SLE-s betegcsoportétól jelentősen különbözött (p<0,001). Az UCTD betegek közül 5-nek (62,5 %) a szérumában találtunk kimutatható mennyiségű antinukleoszóma antitestet. A csoport átlagos ANCSA titere 39,9 ± 57,7 IU/ml volt, ami az SLE betegcsoporténál szignifikánsan alacsonyabb, a kontroll

antitest titer (IU/ml)

csoporténál szignifikánsan magasabb (p<0,01 mindkét esetben). 356,3 10000 39,9 1,44

1000

100

10

1

SLE

UCTD

nem AI

5. ábra: Antinukleoszóma antitest (ANCSA) titerek a három vizsgált betegcsoportban, logaritmikus skálán ábrázolva. A csoportokban mért átlagos ANCSA titerek, ezek szórása, és az egyes mért értékek vannak feltüntetve. Az SLE-s csoport ANCSA szintje (356,3 ± 851 IU/ml) szignifikánsan (p<0,01) magasabb volt a nem-differenciált kötőszöveti betegségben (UCTD) szenvedőkétől (39,9 ± 57,7 IU/ml) és a nem autoimmun beteg (nem AI) kontrollokétól (1,44 ± 2,77 IU/ml).

37

Az

anti-nukleoszóma

antitestek

jelenléte és

a

veseérintettség kapcsolatának

vizsgálatakor összehasonlítottuk az alábbi három csoport feltűntetett ANCSA szintjeit: VA - aktív vesebetegséggel élők: 247 ± 344 IU/ml; VB - betegek korábban fellépett, de gyógyult vesekárosodással: 171 ± 183 IU/ml; VC - veseérintettségtől mentesek 459 ± 1120 IU/ml. A csoportok között semmilyen párosításban nem találtunk szignifikáns különbséget (p>0,05 minden esetben) (6. ábra).

antitest titer (IU/ml)

10000 1000 100 10 1

SLE

SLE-VA

SLE-VB

SLE-VC

6. ábra: Anti-nukleoszóma antitest (ANCSA) titerek a teljes SLE-s csoportban (SLE; 356,3 ± 851 IU/ml), és a veseérintettség szerint megkülönböztetett három SLE-s alcsoportban: VA - aktív vesebetegséggel élők (247 ± 344 IU/ml); VB - korábban fellépett, de gyógyult a vesekárosodásos betegek (171 ± 183 IU/ml); VC veseérintettségtől mentesek (459 ± 1120 IU/ml). A csoportok között nincs szignifikáns különbség.

38

Az antinukleoszóma antitestek kapcsolata az anti-dsDNS antitestekkel és a DNáz enzimaktivitással Megvizsgáltuk - összesen 212 betegmintában - az ANCSA és anti-DNS antitestek kapcsolatát egymással. Spearman-féle rangkorrelációs eljárással szignifikánsan erős összefüggést találtunk (rs=0,744; p<0,001) (7. ábra).

anti-nukleoszóma

10000

1000

100

10

1 1

10

100

1000

10000

anti-DNS 7. ábra: Antinukleoszóma antitest titerek az anti-DNS antitest titerek függvényében, logaritmikus skálán feltüntetve. A két antitest koncentrációja között szignifikáns (p<0,001) korreláció tapasztalható.

Megfigyeltük azt is, hogy a betegek ANCSA pozitivitása nemcsak az anti-DNS pozitivitással korrelál, hanem a hiszton és kromatin elleni antitestek jelenlétével is. Szignifikáns eltolódást találtunk ugyanis (khi2-statisztikával p<0,001) az anti-hiszton illetve anti-kromatin pozitív betegek körében az ANCSA pozitivitás irányába. Ezek alapján az anti-hiszton vagy anti-kromatin pozitív mintákban nagyobb eséllyel találunk antinukleoszóma antitestet is. Ez utóbbi összefüggés elsősorban az anti-DNS negatív minták esetében (RR=2,6 CI95%=1,47-4,6) érvényesül, az anti-DNS pozitív minták esetében nem jelentős (RR=1,11 CI95%=1,04-1,19).

39

A DNáz enzimaktivitás statisztikailag szignifikáns negatív korrelációt mutat a szérumban mérhető ANCSA titer logaritmusával (p<0,01), vagyis az alacsonyabb DNáz aktivitású betegmintákban nagyságrendekkel magasabb a nukleoszóma elleni antitestek koncentrációja. Ezzel a megfigyeléssel egybecseng az az eredmény, amely szerint az ANCSA pozitív betegek DNáz aktivitása szignifikánsan alacsonyabb az ANCSA negatív betegek enzimaktivitásánál (63,3% ± 13,3% illetve 71,7% ± 13,0%; p<0,001) (8. ábra). Érdekes, hogy - bár az antinukleoszóma és anti-DNS antitestekre való pozitivitás egymással erősen korrelál – a fenti összefüggés az anti-DNS antitestek esetében kevésbé markáns. Az anti-DNS pozitív betegek mintáiban is alacsonyabbnak találtuk a DNáz enzim aktivitását, mint az anti-DNS negatívakéban (61,4% ± 14,6% illetve 66,1% ± 13,0%, és ez a különbség is szignifikánsnak mutatkozott (p=0,028), de kevésbé, mint a nukleoszóma elleni antitestek esetén.

DNáz aktivitás %

90

80

70

60

50

40

ANCSA neg

ANCSA poz

8. ábra: Az ANCSA pozitív és ANCSA negatív betegek DNáz aktivitásának összehasonlítása. ANCSA pozitív betegcsoport enzimaktivitása (63,3% ± 13,3%) szignifikánsan (p<0,001) alacsonyabb, mint az ANCSA negatív betegcsoporté (71,7% ± 13,0%).

40

A DNáz aktivitás szerepe az SLE követésében Felmerült a kérdés, hogy mennyire jól használható paraméter a DNáz aktivitás változása a betegség aktivitásának megállapításakor a betegek követése során. Megvizsgáltuk azt, hogy van-e korreláció a betegek szérumában mért DNáz aktivitás és a mintavétel időpontjában meghatározott, a betegség aktivitását jellemző SLEDAI pontértékek között. Nem volt szignifikáns a két változó közti negatív korreláció (rs=0,071; p=0,339), csak gyenge tendencia volt észrevehető (9.ábra).

DNáz aktivitás %

100

80

60

40

20 0

2

4

6

8

10

12

14

16

SLEDAI 9. ábra: DNáz aktivitás a betegségaktivitást jellemző SLEDAI értékek függvényében. Nem találtunk valós korrelációt a két változó között (rs=-0,071; p=0,339). Szemben azzal a megfigyeléssel, hogy a DNáz aktivitás nem korrelál a betegségaktivitást jellemző SLEDAI értékkel, az antinukleoszóma és anti-DNS szintek illetve a SLEDAI közt találtunk összefüggést. Ennek a hátterében az állhat, hogy az anti-DNS antitestek jelenléte 2 ponttal hozzájárul a SLEDAI alakulásához, éppen ezért az anti-DNS antitestek és a SLEDAI között talált korreláció (rs=0,494; p<0,001) nem tekinthető valósnak. Feltehetőleg az ANCSA és a SLEDAI közti szignifikáns korreláció (rs=0,369; p<0,01) is összefügg a SLEDAI számítási módjába belekalkulált anti-DNS antitestekkel, hiszen az ANCSA és az anti-DNS antitestek egymással erős korrelációt mutattak (10. ábra).

41

antitest-koncentráció (IU/ml)

10000

anti-nukleoszóma anti-DNS

1000

100

10

1 0

2

4

6

8

10

12

14

16

SLEDAI 10. ábra: Az anti-DNS és ANCSA titerek a SLEDAI függvényében. Mindkét antitest szignifikáns (p<0,01), pozitív korrelációt mutat (rs=0,494 az anti-DNS antitestekkel és rs=0,369 az antinukleoszóma antitestekkel) a betegség aktivitását mérő SLEDAI értékekkel. Követéses vizsgálatok Longitudinális vizsgálattal 6 betegünk DNáz aktivitását és antitest-szintjeit követtük azzal a céllal, hogy megfigyeljük, a teljes csoporttól függetlenül az egyes betegek esetében hogyan alakulnak egymáshoz és a betegség aktivitásához képest a vizsgált paraméterek (11. ábra). Nem találtunk olyan beteget, akinek az esetében a DNáz aktivitás a betegség aktivitásával bármilyen irányú egyértelmű összefüggést mutatott volna. Az egyik beteg esetében viszont az egymást követő mintákban erős pozitív korrelációt mértünk a DNáz aktivitás és a két antitest mennyisége közt (rPearson=0,95 az anti-DNS-sel és rPearson =0,66 az ANCSA-val; „F” beteg a 11. ábrán). Azt is megfigyeltük, hogy a DNáz aktivitása nem mutatott jelentős ingadozást az azonos személyektől különböző időpontokban vett szérumokban, az ugyanattól a személytől származó minták szórása (6 és 9,4 % között) átlagosan 7,7 %-a volt a minták átlagának. Ellenben, nagyobb változékonyságot tapasztaltunk az anti-DNS és antinukleoszóma antitestek mennyiségének követése során, az anti-DNS antitestek koncentrációjának szórása átlagosan 66,25 %-a (22,7-113,3 % közt) volt a beteg átlagos antitest-

42

koncentrációjának. A 6 beteg közül 3 személynél tapasztalhattunk nagyságrendbeli változást az anti-DNS antitestek titerében a követés néhány hónapja alatt. Megfigyelhető az is, hogy az anti-DNS és ANCSA titerek a legtöbb esetben együtt változnak. Két olyan betegünk volt a 6-ból, akiknél a követés teljes ideje alatt erősen pozitív, az anti-DNS értékeket többszörösen meghaladó ANCSA-t mértünk („C” és „D” beteg a11. ábrán). Módunkban állt a vizsgálatokba bevont 9 UCTD beteget a vizsgálattól számítva három évig figyelemmel kísérni. Korábban megállapítottuk, hogy közülük 4 személynek volt 70 % alatti, kóros tartományba eső DNáz aktivitás értéke, egy személynek határértékközeli 71 %-os aktivitást mértünk, 4 betegnél pedig normál tartományba eső DNáz aktivitást mértünk. A betegek közül egy betegnél - akinél korábban kórosan alacsony (53,8 %) DNáz aktivitást mértünk - fejlődött ki SLE. Két betegnél - a normál aktivitású csoportból - Sjögren szindrómát diagnosztizálhattunk, a többiek esetében nem alakult ki az UCTD-től különböző autoimmun kórkép.

43

anti-DNS

"A" beteg

2000 1600 1200

2

4

4

4

anti-DNS anti-nukleoszóma DNáz aktivitás 160

"B" beteg

anti-nukleoszóma 160 DNáz aktivitás

2000

1000*(C3*C4) 120

1600

1000*(C3*C4)

4

9

4

4

6

4

120

1200 80

80

800

800 40

400 0

0

02.08.

03.01.

03.05.

"C" beteg

2000 1600

2

4

03.08.

40

400 0

04.01.

0

02.11.

03.01.

anti-DNS anti-nukleoszóma 200 DNáz aktivitás 1000*(C3*C4)160

2

03.06.

03.09.

anti-DNS

"D" beteg

200

03.11.

anti-nukleoszóma 200 DNáz aktivitás 1000*(C3*C4) 160

160

9

0

4

2

5

0

120

120

800

80

80

80

400

40

40

40

0

0

0

1200

0

02.09.

03.03.

"E" beteg

200

03.09.

02.07. 02.11. 03.01. 03.04. 03.06. 03.12.

anti-DNS anti-nukleoszóma DNáz aktivitás 200 100*(C3*C4)

160

160 120 80

2

10

0

120

anti-nukleoszóma DNáz aktivitás 200 1000*(C3*C4)

1600

8 1200 800

40

40

400

0

0

03.06.

anti-DNS

"F " beteg

2000

80

02.10.

120

4

2

6

4

8

120 80 40

0

03.10.

0

02.09. 02.11.

03.01. 03.05. 03.08. 03.11.

11. ábra: Hat SLE-s beteg DNáz, komplement (C3, C4), anti-DNS és anti-nukleoszóma szintjeinek, valamint betegségaktivitásuk változása 1-1,5 éves követésük során. A diagrammok x-tengelyén vannak feltüntetve a mintavételi dátumok (év, hónap); a baloldali y-tengelyen található az antitestek titerét jelző skála (a narancs és kék színű oszlopok mutatják a betegek anti-DNS illetve ANCSA szintjeit); a jobboldali ytengelyen található a DNáz aktivitáshoz (sárga jelzés) és a komplement szinthez (zöld jelek: C3 és C4 szorzatának 1000, illetve egy esetben 100-szorosa) tartozó skála. Az oszlopok feletti bordó számok a mintavételkor megállapított betegségaktivitást jelző SLEDAI pontértékeket mutatják. Nem találtunk korrelációt a DNáz aktivitás és a betegségaktivitás közt, viszont az „F”-beteg esetében erős pozitív korrelációt mutat a DNáz aktivitás és az anti-DNS antitestek szintjének változása.

44

160

A tromboembóliás események bekövetkeztének és a tromboembóliás rizikófaktorok jelenlétének a kapcsolata SLE-s betegknél A trombózis incidenciája SLE-ben A 105 vizsgált lupuszos beteg közül 22-nek, vagyis 20,95 %-nak szerepel a kórtörténetében tromboembóliás esemény. Közülük öt személynek volt csak artériás, 14-nek csak vénás trombózisa, három beteg pedig mind artériás, mind vénás epizódon átesett már. 1335 betegév alatt 22 első tromboembóliás esemény következett be, így a vizsgált populációban az első trombózis incidenciája 16,5 per 1000 év. A vénás események éves előfordulása 12,4 per 1000 év volt (12. ábra), vagyis több mint kétszerese az artériás események incidenciájának, ami 5,4 per 1000 év volt. Az artériás epizódok minden esetben agyi események voltak, hét beteg esetében agyi mikrotrombózisok, egy betegnél ismétlődő stroke. A vénás trombózison átesett betegek közül 14 személynek volt mélyvénás trombózisa, egy kivétellel minden esetben az alsó végtag volt érintett. Közülük öt betegnél visszatérő DVT-ről van szó. Két másik személynek felületi thrombophlebitise volt, egy fiatal nő betegnek pedig agyi vénát érintő trombózisa.

incidencia 1000 évre

24 20 16 12

12,4

13

SLE populáció

SLE populáció

saját eredmény

Mok et al

8 4 0

0,1-2,5

átlagnépesség

12. ábra Az általunk vizsgált SLE-s csoportban előforduló vénás trombózisok éves incidenciájának összehasonlítása az átlagnépességben és egy vegyes etnikumú SLE-s populációban mért adatokkal [145].

45

Az antifoszfolipid antitestek előfordulása a vizsgált populációban A vizsgált 105 fős SLE-s csoportból 45 beteg mintájában, vagyis a betegek 43,9 %-ánál mutattuk ki az antifoszfolipid antitestek valamelyik altípusát. A rutin diagnosztikában leggyakrabban vizsgált anticardiolipin antitest 22 beteg, a csoport 21 %-ának mintájában volt kimutatható. Közülük 10 személynek csak IgG típusú antitestje volt, 2 személynek csak IgM, a fennmaradó 10 beteg mintájában pedig mindkét izotípusú ellenanyag jelen volt. 27 szérumban, vagyis a szérum minták 25,7 %ában találtunk anti-ß2-glikoprotein antitestet. 22 beteg szérumában volt anti-protrombin antitest kimutatható, anti-foszfatidil-szerin antitestet pedig 18 szérumban találtunk. Jól meghatározható volt a betegek egy 11 fős csoportja, akiknek mintájában kimutatható, de a küszöbértéket meg nem haladó mennyiségű, foszfatidil-szerin elleni antitestet detektáltunk. Az ő esetükben ELISA módszerrel semmilyen más antifoszfolipid antitestet nem tudtunk kimutatni, mintáikat „gyengén pozitív” megjegyzéssel a negatívak közé soroltuk. 37 plazmában, vagyis a minták 35,2 %-ában találtunk lupus anticoaguláns aktivitást. Ezek 64,9 %-ában, azaz 24 mintában találtunk ELISA módszerrel is antifoszfolipid antitesteket. Megvizsgáltuk az összefüggést a szilárd fázisú és a koagulációs módszerrel kimutatható antitestek jelenléte között. Azon betegeknél, akiknek a szérumában mind a négyféle ELISA módszerrel kimutatott antitest jelen volt, 80 %-ban detektáltunk koagulációs módszerrel lupus anticoagulánst. Azon betegek közül, akiknél háromféle antitestet találtunk ELISA-val, 77,8 % volt LA pozitív. A kétféle antitestre pozitív betegek plazmáinak 66,7 %-ban volt jelen LA. Azok közül, akiknél csak egyféle antifoszfolipid ELISA eredménye lett pozitív, 50 % plazmájában volt kimutatható LA aktivitás. A 11 ELISA módszerrel negatívnak minősített beteg közül, akiknek a szérumában egyedül alacsony koncentrációjú anti-foszfatidil-szerin antitestet találtunk, négy betegnek (36,4%-nak) a plazmájában találtunk LA-t. Végül az ELISA módszerrel teljesen negatív 62 beteg közül csupán 10 személynek, azaz 16,1 %-nak a plazmájában volt LA kimutatható. A különböző antigénekre specifikus APA ELISA teszt típusok közül egyik sem mutatott statisztikailag is szignifikáns, egyértelmű összefüggést a LA aktivitással, bár volt eltérés az egyes tesztek között a lupus antikoagulánssal való együttes megjelenés arányában (3.

46

táblázat). Érdekes megfigyelés, hogy a 9 ELISA módszerrel kizárólag anti-cardiolipin pozitivitást mutató minta közül 7 betegnél találtunk LA-t, míg az öt csak antiprotrombin pozitív beteg közül csak egynél. Ezt a különbséget azonban statisztikailag nem találtuk szignifikánsnak.

LA (%)

RR (CI95%) LA-sal együtt**

4,53‡ (2,26-9,07)

81,8

4,03‡ (2,06-7,86)

7,78‡ (2,82-21,44)

5,06‡ (2,39-10,71)

74,1

5,10‡ (2,58-10,1)

18

5,00† (1,58-15,80)

1,81† (0,82-3,99)

66,7

2,91† (1,41-5,91)

22

6,82‡ (2,38-19,52)

3,14† (1,57-6,30)

77,3

4,31‡ (2,23-8,34)

n

RR (CI95%)*

RR (CI95%) a teljes SLE-s csoportban**

a-cardiolipin

22

8,18‡ (2,95-22,71)

a-ß2-glikoprotein I

27

a-protrombin a-foszfatidil-szerin †

p<0,01 ‡ P<0,001 * az antifoszfolipid antitest negatív betegek csoportjához viszonyított tromboembóliás rizikó; ** a teljes SLE-s populáción belüli tromboembóliás kockázat

3. táblázat: Az ELISA módszerrel kimutatott négyféle antifoszfolipid antitest (APA) és a lupus antikoaguláns (LA) együttes előfordulása, valamint tromboembóliás kockázatuk LA-tól függetlenül, illetve azzal együtt megjelenve.

Az antifoszfolipid antitestek és a trombózis kockázatának összefüggése A vizsgált SLE-s betegcsoportban a legjelentősebb thromboembóliás kockázati tényezőnek a - mind a szilárd fázisú (ELISA), mind a koagulációs módszerrel kimutatott - antifoszfolipid antitestek (APA) jelenléte bizonyult (13. ábra). A 45 APA pozitív beteg közül 18, a betegek 40%-a esett már át tromboembóliás eseményen, míg a 60 APA negatív beteg közül csak 4 személy (6,7%). Az APA negatív csoport esélyhányadosa és relatív kockázata a teljes SLE-s populációhoz képest szignifikánsan alacsony volt (OR=0,11 CI95%=0,03-0,35; RR=0,17 CI95%=0,06-0,46). Ezzel szemben a legmagasabb kockázatot az ELISA módszerrel kimutatott antitestek és a LA aktivitás együttes jelenléte jelentette (OR=7,85 CI95%=2,74-22,49; RR=4,28 CI95%=2,12-8,62) (4. táblázat).

47

ELISA és LA -

56

ELISA + és LA -

6

2 11

trombózismentes betegek

2

VTE ELISA és LA +

10

ELISA + és LA +

11

VTE és ATE

21

ATE

0

8

10

1 4

20

30

40

50

60

13. ábra: A trombózison átesett SLE-s betegek aránya négy alcsoportban aszerint, hogy kivizsgálásuk során detektálható volt-e ELISA módszerrel a szérumukban antifoszfolipid antitest (APA), illetve kimutattunk-e koagulációs módszerrel a plazmájukban lupus anticoaguláns aktivitást (LA). Jól látható, hogy a trombózison átesett betegek legnagyobb arányban (52,2 %) azok közt vannak, akiknél APA és LA is jelen volt, míg legkisebb arányban (6,7 %) az antifoszfolipid antitesttől mentes betegek között fordult elő tromboembóliás esemény. A csak LA vagy csak APA pozitív betegek csoportjaiban átmeneti értékeket kaptunk (28,6 illetve 25 %, sorrendben).

Nem volt jelentős különbség az artériás és vénás események relatív kockázata között az APA pozitív betegcsoportban. Például, az ELISA és koagulációs módszerrel is kimutatott APA pozitív betegek esetében az antifoszfolipid antitesttel nem rendelkezők csoportjában tapasztalthoz képest az artériás és vénás epizódok relatív kockázata közel azonos (RR=6,25 CI95%=1,3-30,04 illetve RR=7,5 CI95%=2,22-25,35); a csak LA pozitívak csoportjában pedig az artériás és vénás trombózisok relatív kockázatának értékei (RR=3,95 CI95%=1,05-14,89 és RR=3,95 CI95%=1,61-9,67) egymástól csak a konfidencia intervallumban térnek el.

48

betegek száma

RR (CI95%)*

ATE

VTE

3

6

nincs pozitív APA ELISA

73

egy pozitív APA ELISA

4

3,75 (0,54-26,19)

1

0

kettő pozitív APA ELISA

9

6,67 (2,02-22,04))

1

5

három pozitív APA ELISA

9

6,67 (2,02-22,04)

2

3

négy pozitív APA ELISA

10

6,00 (1,78-20,19)

1

3

bármelyik APA ELISA pozitív

32

7,03 (2,55-19,42)

5

11

LA pozitív

37

6,49 (12,35-17,92)

6

12

APA ELISA vagy LA pozitív

24

8,13 (2,94-22,44)

5

9

APA ELISA és 60 1 2 3 LA is negatív * az antifoszfolipid antitest negatív betegek csoportjához viszonyított tromboembóliás rizikó

4. táblázat: Az ELISA módszerrel kimutatott antifoszfolipid antitestek előfordulása, tromboembóliás relatív kockázatuk, valamint lupus antikoagulánssal való együttes megjelenésük aránya és relatív TE kockázata.

49

Egyéb, öröklött tromboembóliás rizikófaktorok előfordulása a vizsgált populációban Az antifoszfolipid antitesteken felül, megvizsgáltuk az SLE-s csoportban más, olyan faktorok jelenlétét is, amelyek ismert módon a normál populációban is hozzájárulnak trombózisok illetve trombofíliás állapot kialakulásához. FV Leiden és FII G20210A mutációk Ezek közül a leggyakoribb az V-ös faktor Leiden-mutációja révén a faktoron kialakuló rezisztencia az aktivált protein C hasítása ellen. Az általunk vizsgált 105 fős betegcsoportban is ez volt a leggyakoribb öröklött defektus, 9 betegnél találtuk meg heterozigóta, 1 betegnél pedig homozigóta formában. A heterozigóta betegek egyikénél egy másik ismert mutációt - a protrombin gén promóter régiójában található G20210A báziskicserélődést - is azonosítottunk, szintén heterozigóta formában. Ez utóbbi, protrombin mutációt heterozigóta formában még egy másik betegnél is kimutattuk.

14. ábra: Olvadáspont analízis görbéje a Leiden-mutáció kimutatásához. A vad típusú allél szekvenciájára tervezett fluoreszcens próba erősebb kötődést mutat a vele tökéletesen komplementer vad DNS szálhoz, míg gyengébben a Leiden-mutációt hordozó szálhoz. A DNS minták melegítése során a Leiden-szálról alacsonyabb hőmérsékleten válik le és ad jelet a próba. Az ábrán zölddel látható a heterozigóta pozitív kontroll, szürkével a DNS-mentes negatív kontroll, narancs színnel (257-es minta) egy homozigóta Leiden-mutációt hordozó beteg görbéje, vastag kék vonallal pedig (256-os minta) egy vad típusú beteg görbéje.

50

Szerzett APCR vizsgálata Aktivált PC elleni rezisztenciát mutattunk ki egy olyan betegnél is, akinél a Leiden mutáció vad típusát találtuk (256-os számú minta a 14. ábrán). DNS szekvenálással tovább vizsgáltuk a beteg V-ös faktorának további két olyan szakaszát, a 306-os és 679es argininek régióit, amelyek szükségesek ahhoz, hogy az APC képes legyen megkötni és hasítani az V-ös faktort. Nem találtunk mutációt egyik vizsgált szakaszon sem.

R306

R679

betegminta

kontroll

15. ábra: DNS-szekvenálás elektroferogrammja az FV vizsgálatához. A baloldali elektroferogrammokon bekeretezett rész a 306-os, a jobboldaliakon jelölt terület a 679es arginint kódoló bázisokat mutatja (mindkét esetben a reverz szál szekvenciája van feltüntetve). Felül a beteg, alul a vad típusú kontroll szekvenciája látható. A két szekvenciarészlet megegyező.

51

Ismert, hogy a lupus anticoaguláns jelenléte hozzájárulhat szerzett APC rezisztencia kialakulásához. Mivel az imént említett beteg plazmájában jelentős mértékű LA aktivitást mértünk, ennek a jelenségnek tulajdonítottuk az APC elleni rezisztenciát. Éppen ezért megvizsgáltuk, hogy a többi LA pozitív betegnél is jelentkezik-e a fent említett hatás. Ebből a vizsgálatból kizártuk azokat a betegeket, akiknél Leidenmutációt találtunk, hiszen az ő plazmájukban a mutáció következtében mértünk fokozott APC rezisztenciát. Összehasonlítottuk tehát a Leiden-mutációra negatív betegek két csoportjának, a LA negatívaknak és pozitívaknak az APCR értékeit (16. ábra). A LA negatív csoportba sorolt 59 beteg átlagos APCR aránya 2,46 ± 0,28 volt, a 35 LA pozitív beteg átlagos aránya pedig 2,39 ± 0,39. A két érték között nincsen szignifikáns

aPTI APC jelenlétében / aPTI APC nélkül

különbség (p=0,344).

3

2

2,46

2,39

1 1,29

1,58

0

Leiden hom.

Leiden het.

Leiden - és LA - Leiden - és LA +

16. ábra: APC rezisztenciát (APCR) jelző aPTI hányadosok az SLE-s betegek négy alcsoportjában. A legkisebb hányadost (1,29), azaz a legerősebb APCR-t a homozigóta Leiden mutációt hordozó egyetlen betegnél mértük. A 9 heterozigóta beteg plazmájában mért hányados is szignifikánsan alacsonyabb volt (1,58 ± 0,2; p<0,001), mint a Leidenmutációt nem hordozók két csoportjáé. A Leiden negatív lupus anticoaguláns (LA) negatív és pozitív betegek hányadosai között nem volt szignifikáns különbség (2,46 ± 0,28 és 2,39 ± 0,39; p=0,344).

52

Természetes antikoaguláns fehérjék (AT, PC és PS) Megmértük a természetes anticoaguláns fehérjék aktivitását a betegek plazmáiban. A protein C és protein S szintek vizsgálatából kihagytuk azokat a betegeket, akik tartós coumarin antikoaguláns kezelés alatt álltak, mivel e K-vitamin anyagcserére ható szer szedése nemcsak a K-vitamin-függő alvadási faktorok, hanem a PC és PS szintén Kvitamint igénylő szintézisére is hat, így ezeknél a betegeknél csökkent PC és PS szinteket mérünk. Egy betegnél találtunk kórosan alacsony, 29 %-os PC aktivitást, egy másik betegnél pedig csökkent, 46 %-os PS aktivitást. Szintén egy betegnél mértünk mérsékelten alacsony, 48 %-os antitrombin aktivitást.

FVIII és vWF szintek Megmértük a plazmák VIII-as faktor és von Willebrand faktor szintjét is. 10 beteg mintájában volt mindkét fehérje szintje és aktivitása emelkedett. 11 olyan mintát találtunk, amelyben az FVIII aktivitásának emelkedéséhez nem társult emelkedett vWF antigén szint, illetve aktivitás. Végül, két mintában csak a vWF szintje és aktivitása volt emelkedett, az FVIII szint nem.

Homocisztein szint A plazma homocisztein szintek mérésekor 20 mintában, a plazmák 19 %-ában, találtunk 15 µM feletti Hcy értéket. Közülük 6 személynél 20 µM-t is meghaladó értéket mértünk. Érdekes megjegyezni, hogy a 6 legmagasabb Hcy szinttel rendelkező beteg között 3 férfi és 3 nő volt. Ez szignifikáns eltolódás a nemek arányában a teljes SLE-s csoporthoz képest (χ2 próbával p ≤ 0,001), hiszen a vizsgálatban résztvevő SLE-s betegek mindössze 5,7 %-a férfi.

53

Az öröklött rizikófaktorok jelenlétének kapcsolata a tromboembóliás események kialakulásával Az öröklött tromboembóliás kockázati tényezőket vizsgálva az antifoszfolipid antitestek esetében számítottnál mérsékeltebb hatást tapasztaltunk. FV Leiden és FII G20210A mutációk A Leiden-mutáció tromboembóliás kockázatot jelentő hatását csak az antifoszfolipid negatív SLE-s betegek csoportjában tudtuk kimutatni (OR=7,25 CI95%=1,00-52,34; RR=5,17 CI95%=1,18-22,61), az antifoszfolipid pozitív betegcsoportban nem bizonyult statisztikailag

számottevő

tényezőnek

(OR=1,36

CI95%=0,17-10,84;

RR=1,18

CI95%=0,41-3,39). Érdekes, hogy nem szenvedett el trombózist sem a Leiden mutációra homozigóta beteg, sem az a személy, akinél heterozigóta formában a Leiden mutáció mellett a protrombin G20210A mutáció is jelen van. A protrombin G20210A mutációja ebben a populációban – feltehetően alacsony előfordulása miatt – nem hordozott statisztikailag

is

szignifikánsan

magas

tromboembóliás

kockázatot

(OR=3,9

CI95%=0,23-65,05; RR=2,45 CI95%=0,58-10,33). Természetes anticoaguláns fehérjék Nem szenvedett el trombózist az a három beteg, akiknél valamelyik természetes antikoaguláns fehérje (PC, PS vagy AT) csökkent aktivitását mértük. Nem volt jelentős különbség a trombózist elszenvedett csoport és a tromboembóliás eseményektől mentes csoport átlagos AT aktivitása közt sem (114,0 % ± 24,9 % illetve 105,1 % ± 33,2 % sorrendben, p=0,256). FVIII és vWF Négy személynek volt trombózisa azon 11 beteg közül, akiknek a plazmájában emelkedett FVIII és vWF szinteket mértünk. Az FVIII szint akár a von Willebrand faktorral együtt, vagy attól függetlenül megemelkedett szintje enyhén, statisztikailag nem szignifikáns mértékben emelkedett kockázatot hordozott (OR=2,3 CI95%=0,796,67; RR=1,87 CI95%=0.87-3.99 az FVIII emelkedése esetén; OR=2,41 CI95%=0,649,14; RR=1,9 CI95%=0,78-4,6 a FVIII és vWF együttes emelkedése esetén). Nem volt szignifikáns a különbség a trombózist elszenvedett csoport és a tromboembóliás

54

eseményektől mentes csoport átlagos vWF antigén szintje között (118,4 % ± 53,6 % illetve 98,1 % ± 41,9 % sorrendben, p=0,109).

trombózisos csoport n=22

trombózistól mentes csoport n=83

RR (CI 95%)

lupus antikoaguláns

16 (72.7%)

21 (25.3%)

4.90 (2.10-11.45)

antifoszfolipid antitestek ELISA-val

15 (68.2%)

17 (20.5%)

4.89 (2.21-10.83)

FV Leiden mutáció

4 (18.2%)

6 (7.2%)

n.sz. 2.11 (0.89-5.02)

FII G20210A mutáció

1 (4.5%)

1 (1.2%)

n.sz. 2.45 (0.58-10.33)

emelkedett FVIII és von Willebrand faktor szintek

4 (18.2%)

6 (7.2%)

n.sz. 2.11 (0.89-5.02)

emelkedett homocisztein szint

6 (27.3%)

14 (16.9%)

n.sz. 1.59 (0.71-3.55)

antitrombin deficiencia

0

1

-

alacsony protein C szint

0

1

-

alacsony protein S szint

0

1

-

1 (4.5%)

35 (42.2%)

0.09 (0.01-0.65)

kockázati tényező

nincs kimutatott kockázati tényező

5. táblázat: A vizsgált tromboembóliás kockázati tényezőkhöz társuló trombózisos esetek száma, valamint a trombózis kialakulására vonatkozó relatív kockázati (RR) értékek 95 %-os konfidencia intervallummal (CI95%).

55

Homocisztein szint Hat betegnek volt trombózisa a 20 közül, akiknek a plazmájában 15µM feletti Hcy szintet mértünk. Közülük két személynek volt artériás és vénás tromboembóliás epizódja is, egy beteg csak artériás, három pedig csak vénás eseményen esett át. Vizsgálatunk során így a 15 µM feletti Hcy szint nem bizonyult szignifikáns trombózis kockázati tényezőnek (OR=1,85 CI95%=0,62-5,55; RR=1,59 CI95%=0,71-3,55). Nem volt szignifikáns a különbség a trombózist elszenvedett csoport és a tromboembóliás eseményektől mentes csoport átlagos plazma Hcy szintje között sem (12,2 ± 4,3 µM illetve 11,5 ± 4,6 µM sorrendben, p=0,534). Az APAk és az öröklött tromboembóliás kockázati tényezők együttes hatása Felmerül a kérdés, hogy az antifoszfolipid antitestek jelenléte jelentette magas tromboembóliás kockázatot hogyan emeli egy második, öröklött kockázati tényező. Megvizsgáltuk, hogy az antifoszfolipid antitest pozitívak csoportján belül mekkora kockázatot viselnek az APA mellett Leiden mutációval, emelkedett FVIII vagy Hcy szinttel élő betegek. A számértékek nem mutattak jelentős kockázatemelkedést (5. táblázat). Amennyiben az ilyen kombinált eltéréssel rendelkezőknek az APA negatívak csoportjával szemben mutatott relatív kockázatát hasonlítottuk össze az APA pozitív csoport ugyanezen értékével, akkor sem találunk jelentős különbséget. RR (CI95%) az APA pozitív csoporton belül APA APA + FVL APA + Hcy APA + FVIII és vWF

1 1,3 (0,53-3,18) 1,35 (0,63-2,86) 1,6 (0,70-3,63)

RR (CI95%) az APA negatív csoporthoz viszonyítva 7,03 (2,55-19,42) 7,5 (2,17-25,91) 7,5 (2,42-23,25) 9,0 (2,75-29,49)

6. táblázat: Az antifoszfolipid antitestekhez társuló gyakoribb kockázati tényezők hatása trombózis kialakulásának relatív kockázatára (RR 95 %-os konfidencia intervallummal CI95%). Látható, hogy egyik kombináció esetében sem kapunk az első sorban szereplő, a teljes APA pozitív csoportra vonatkozó értéktől szignifikánsan eltérő kockázatot.

56

A különböző rizikófaktorok között az antifoszfolipid antitestek meghatározó szerepét mutatja az a tény, hogy az emelkedett Hcy szinttel rendelkező, APA negatív betegek közük 8,3 %-nak volt trombózisa, míg az emelkedett Hcy szinttel és APA-val rendelkezők közül 62,5 %-nak. Hasonló különbséget kaptunk a többi rizikófaktorral rendelkező – az emelkedett plazma FVIII szintű és a Leiden-mutációt hordozó - betegek esetében is (17. ábra).

trombózison átesettek aránya (%)

80

APA negatívak APA pozitívak

60

40

20

0

Leiden

FVIII

Hcy

-

17. ábra: A tromboembóliás eseményen már átesett betegek aránya a rizikófaktorok szerinti csoportokban: a Leiden-mutációt hordozók (Leiden), a magas VIII-as faktor (FVIII) illetve magas homocisztein (Hcy) szinttel élők, és – az antifoszfolipid antitesteken (APA-n) kívül - semmilyen kimutatott rizikót nem viselők (-) körében. A kék oszlopok jelzik azt, hogy a rizikófaktor szerinti csoporton belül az antifoszfolipid antitesttel nem rendelkezők mekkora hányada szenvedett el már trombózist; mellettük a piros oszlopok ugyanezt az arányt jelzik az antifoszfolipid pozitív betegek körében. A piros és kék oszlopok közti különbség szemléletesen mutatja az antifoszfolipid antitestek hozzájárulását a trombózisok kockázatához. Csak a kék oszlopokat megfigyelve a három rizikótényező (Leiden, Hcy és FVIII) protrombotikus hatásának erősségét hasonlíthatjuk össze.

57

Az FcR-ok gátlásának vizsgálata Az Fc receptorok fontos szerepet töltenek be az antitestek és immunkomplexek hatásainak

-

úgy,

mint

a

gyulladásoscitokin-termelés

serkentése

vagy

a

trombocitaaktiváció - közvetítésében az SLE patogenezise során. Későbbi esetleges terápiás alkalmazás céljával megvizsgáltuk, hogy szintetikus peptidkonjugátumokkal előidézhetőek-e az immunkomplexek által kiváltott hatások, valamint, hogy monomer peptidekkel (18. ábra) gátolhatóak-e ugyanezek.

könnyűlánc

Fab

Fab

nehézlánc kapocsrégió CH2 domén az általunk vizsgált régió

RP

255

RTPEVTC(Acm)VVVDVSHEDP271

KS

288

KTKPREQQYNS

PV

230

PAPELLGGPSV240

298

18. ábra Az IgG molekula szerkezete, a vizsgált peptidek elhelyezkedése a molekulán, valamint szekvenciájuk.

58

A peptidek kötődése az Fc receptorokhoz Áramlásos citometriás eljárással mértük meg, hogyan kötődnek az IgG Fc régiójából származó szintetikus peptidek a monociták sejtfelszíni Fc receptoraihoz. A biotinnal konjugált peptideket FITC-avidines jelöléssel vizsgáltuk. A peptidek szekvenciánként eltérő mértékben kötöttek a receptorokhoz (19. ábra). A kötődés dózisfüggőnek mutatkozott.

negatív kontroll bKS bPV bRP IgG kontroll

19. ábra: a biotinált RP, PV és KS peptidek összehasonlítása monocita sejtek Fc receptoraihoz kötődésük szempontjából; legerősebb kötődést a bRP peptid mutatta. x tengely: fluoreszcenciaintenzitás, y tengely: az adott fluoreszcenciaintenzitású sejtek száma.

IC-kötés gátlása Bár kimutattuk a vizsgált Fc régióból származó peptidek receptorhoz való kötődését, nem sikerült gátolni ezekkel az immunkomplexeket modellező fluoreszcensen jelölt IgG-aggregátumok monocitákhoz való kötődését, még 125-szörös relatív peptidfelesleg mellett sem (20. ábra).

59

125xpeptidfelesleg 25xpeptidfelesleg

negatív kontroll

5xpeptidfelesleg IgG kontroll

20. ábra: az RP jelű IgG Fc peptid nem gátolja, még 125-szörös feleslegben sem az aggregált IgG sejtfelszíni Fc receptorhoz kötődését; az IgG mennyisége 0,16nmol/500.000 sejt, az RP peptidé az IgG mellett 20, 5, illetve 0,8 nmol volt; x tengely: fluoreszcenciaintenzitás, y tengely: az adott fluoreszcenciaintenzitású sejtek száma.

Peptidkonjugátumok citokintermelést indukáló hatása Megvizsgáltuk, hogy az IgG Fc részéből származó szintetikus peptidkonjugátumok hogyan hatnak a monociták Fc receptorok által közvetített effektor funkciójára, a citokintermelésre. A három, az IgG Fc-fragment receptorkötő régiójából származó szintetikus peptidet biotinnal konjugáltunk, majd ezeket avidinnel kötöttük össze. Az így kapott konjugátumok - hasonlóan a kötődésvizsgálatok során tapasztaltakhoz – szekvenciáktól függően eltérő mértékben váltottak ki IL-6 és TNF-α termelést a vizsgált humán monocita sejtvonalon.

60

Monomer peptidek gátló hatása Megvizsgáltuk, hogy a peptidek monomer formában képesek-e versengeni az komplexben lévő IgG-vel a receptorok kötőhelyeiért, így gátolva az immunkomplexek citokintermelést indukáló hatását. Elsőként a három különböző szakasznak megfelelő peptideket vizsgáltuk az aggregált IgG-vel szemben, a legnagyobb koncentrációban 30-szoros feleslegben. Nem tapasztaltunk gátló hatást a monocitákon sem az IL-6, sem a TNF-α termelés esetében sem. Kipróbáltuk az Fc régió három különböző pontjáról származó peptidek keverékét is, az aggregált

IgG-vel szemben legnagyobb koncentrációban egyenként

75-szörös

feleslegben. Nem tapasztaltunk gátlást a hozzáadott immunkomplexek IL-6-termelést indukáló hatásával szemben. Sikerült viszont gátolni a peptidkeverékkel a monociták TNF-α-termelését.

[TNF] mg/ml 2,5·106

+ kontroll 75x peptidfelesleg

2·106

15x peptidfelesleg 3x peptidfelesleg

1,5·106 106 5·105

1 óra

2 óra

24 óra

21. ábra: IgG Fc peptidkeverék gátló hatása az immunkomplex által kiválott TNF termelésre a stimulálást követő különböző időpontokban lemérve.

61

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK A DNáz aktivitással kapcsolatos megfigyeléseink alátámasztják más szerzők korábbi állításait, miszerint az SLE-s betegek szérumában a DNáz enzim aktivitása alacsonyabb, mint az egészséges személyek szérumában mérhető enzimaktivitás [42, 146]. Ezt a megállapítást kiegészítettük azzal, hogy a csökkent DNáz aktivitás az SLE-hez hasonló UCTD tünetegyüttes fellépése során is megfigyelhető. Az UCTD-s betegek 3 éves követése során azt tapasztaltuk, hogy közülük mindössze egy betegnél alakult ki SLE; ennél a betegnél a korábbi mérések során alacsony DNáz aktivitást mértünk. Sajnos ez nem elegendő információ ahhoz, hogy eldönthessük, a csökkent DNáz aktivitás előre jelezheti-e az UCTD betegeknél a későbbi SLE kialakulását. A csökkent DNáz aktivitás eredetére eddig még nem született pontos magyarázat. Az egyik elmélet szerint az enzimet kódoló DNASE1 gén 2-es exonjában található mutáció lenne a felelős az alacsonyabb enzimaktivitásért [48]. E mutáció előfordulási gyakorisága azonban igen alacsony [146-149], így nem adhat magyarázatot az SLE-s betegek mintegy kétharmadának a szérumában mérhető csökkent DNáz aktivitásra. Ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre egy esetleges – valószínűleg antitest jellegű - enzim-inhibitor kimutatott működéséről. Néhány tanulmány alátámasztja [150], mások cáfolják [42, 146] egy DNáz ellenes antitestek jelenlétét a betegek szérumában. A DNáz enzim fiziológiás funkcióját magyarázó elméletek alapján ésszerű volna azt feltételezni, hogy az enzim mérsékelt aktivitása hozzájárul az SLE-s betegek esetében glomerulonephritis kialakulásához. Ennek laboratóriumi alátámasztása volna, ha a veseérintettséggel küzdő SLE-s betegekben alacsonyabb lenne a DNáz aktivitás. Méréseink szerint azonban az enzim aktivitása nem különbözik meggyőzően, vagyis statisztikailag szignifikáns mértékben az aktív vesebeteg és a veseérintettségtől mentes SLE-s alcsoportok között, azaz vizsgálatunk nem támasztotta alá a DNáz enzim szerepét a veseérintettség kialakulásának folyamatában. Amennyiben a fenti összefüggés az enzim aktivitása és a glomerulonephritis kialakulása közt fennállna, és a DNáz aktivitása genetikai tényezők befolyása miatt volna alacsonyabb, nemcsak az aktív, hanem a gyógyult vesebeteg csoportban is alacsonyabb DNáz aktivitást kellene tapasztalnunk. A gyógyult vesebetegek és a veseérintettségtől mentes SLE-s betegek

62

közt azonban még kisebb volt a különbség. Adataink alapján kizárható, hogy az SLE-s betegek veseérintettségének kialakulását a DNáz enzim genetikai rendellenessége okozza, vagy jelentős mértékben befolyásolja. Vizsgálataink során az SLE-s betegek közel 80%-ának szérumában találtunk antinukleoszóma antitesteket. Más tanulmányok eredményei széles tartományban 37,5-100 % szórnak [26, 151-153], de minden esetben megállapítják a nukleoszóma elleni antitestek megjelenését SLE-ben. Bár az ANCSA szérumbeli koncentrációja és a betegség aktivitása között találtunk szignifikáns korrelációt, ez valószínűleg csak következménye a nukleoszóma és a DNS elleni antitestek megjelenése közti erős összefüggésnek. A betegség aktivitását ugyanis SLEDAI pontértékekkel jellemeztük, amely indexnek egyik összetevője az anti-DNS antitestek jelenléte. Ellentmondó adatokat közöltek más szerzők ebben a tárgyban is; egyesek megerősítik [152, 153], mások cáfolják [26, 151, 154] az ANCSA és a betegség aktivitása közti korrelációt. A negatív eredményt közlők közül többen a betegség aktivitását más pontrendszerekkel kvantifikálták, például az ECLAM (European Consensus Lupus Activity Measurement) vagy a SLAM (Systemic Lupus Activity Measure) értékeket figyelembe véve [26, 151]. Érdekes, hogy ezek között a jelen dolgozatban megfogalmazott eredményekkel ellentmondani látszó vizsgálatok között olyan is van, amely során ugyanazt a vizsgálati módszert és reagenseket használták a szerzők [26], mint vizsgálatunk során. Ennek az ellentmondásnak a magyarázatául ismét az eltérő betegségaktivitási-pontrendszerek alkalmazása hozható fel. A nukleoszómák és az ellenük termelődő antitestek, valamint a nukleoszómák eltávolításában szerepet játszó DNáz a keringésben dinamikus egyensúlyban vannak. Egy korábbi publikáció szerint [154] azok a szérumok, amelyekben magas nukleoszóma antigén koncentrációt találtak, egyben alacsony antinukleoszóma antitest szinttel rendelkeztek. A szerzők magyarázata szerint a nukleoszóma elleni antitestek az immunkomlexek képzése révén hozzájárulnak a nukleoszómák keringésből történő eltávolításához. Az említett tanulmány nem vizsgálja a DNáz enzim aktivitását, amely ebben a megvilágításban az antinukleoszóma antitestekkel versengve degradálja a keringésben megtalálható nukleoszómákat. Megfigyelésünk, amely szerint az ANCSA titerek és a DNáz enzim aktivitása negatív korrelációt mutatnak, ennek a korábban közölt elméletnek nem mond ellent.

63

A DNáz enzimmel kapcsolatos vizsgálatok összegzéseként elmondható, hogy bár a DNáz enzim csökkent aktivitása az SLE-nek jellemzője, laboratóriumi paraméterként nem alkalmas a betegség aktivitásának követésére, vagy veseérintettség előrejelzésére. A betegségre jellemző gyulladásos folyamatok és az antifoszfolipid antitestek jelenléte a keringésben az SLE betegeket a trombózis szempontjából magas rizikójú csoportba helyezik. A különböző tromboembóliás események – mind az artériás, mind a vénás epizódok – gyakrabban, és fiatalabb korban jelentkeznek az SLE betegek körében. Mivel a cardiovascularis megbetegedések az európai népesség körében vezető halálozási okok, nem meglepő, hogy az európai SLE-s populációban is a trombózisokat találták – az aktív lupusz és az infekciós szövődmények mellett – a leggyakoribb haláloknak [155]. Az általunk vizsgált SLE betegek körében az artériás és vénás tromboembóliás események incidenciája 5,4 és 12,4 volt ezer betegévre vetítve. Egy korábbi tanulmány, amely 625 SLE beteg adatait dolgozta fel, hasonló gyakoriságot talált a vénás események előfordulásában, de magasabbat az artériás epizódok esetében [145]. Ennek a különbségnek magyarázata lehet, hogy az említett tanulmányban három különböző etnikai csoporthoz tartozó betegek szerepeltek, köztük ázsiaiak, afro-amerikaiak, és kaukázusiak, amíg a mi populációnk kaukázusi betegekből állt. A három különböző etnikumú

SLE-s

betegcsoport

összehasonlításakor

az

artériás

események

legalacsonyabb, és a vénás események legmagasabb előfordulási arányát a három közül a 227 kaukázusi betegből álló csoportban mérték. Ezek a gyakoriságok az általunk megállapítottakhoz hasonlóak voltak. Az általunk vizsgált SLE-s csoportból a betegek 21 %-ának volt már valamilyen formában trombózisa. Hasonló etnikai, nem- és korösszetételű betegcsoporttal végzett felmérések ezt a hányadot 20 és 37 % között mérték [156, 157]. Egy 1000 európai SLEs beteg adatait elemző vizsgálat során a 10 éves követési idő alatt a betegek 9,2 %-a esett át trombózison [155]. A trombózison átesett betegeink átlagos életkora az epizód bekövetkeztekor az artériás illetve vénás trombózisok esetében is alacsonyabb volt (40,1 és 33,1 év; sorrendben), mint az általános populációban tapasztalt [158, 159], de nem különbözött az antifoszfolipid szindrómás populációban mérttől (35,0 és 34,5 év; sorrendben) [160].

64

Egy eset kivételével minden trombózison átesett betegnél találtunk kimutatható kockázati tényezőt, vagy tényezőket. Így megállapíthatjuk, hogy a tromboembóliás rizikófaktorokkal rendelkezők körében jóval magasabb volt a trombózis incidenciája (25,5 per 1000 betegév), mint a kockázati tényezővel nem rendelkezők esetében (2 per 1000 betegév). Ez utóbbi adat hozzávetőleg egyező a normál populációra jellemző értékkel. Külön-külön

megvizsgálva

az

egyes

trombofíliára

hajlamosító

tényezőket,

megállapítottuk, hogy az SLE-s populációban ezek közül a legnagyobb mértékben az antifoszfolipid antitestek jelenléte járul hozzá a tromboembóliás események előidézéséhez. Megállapítottuk, hogy az SLE-s betegek több mint egyharmadának a plazmájában kimutatható lupus anticoaguláns aktivitás, illetve a betegek 17-26 %-ának mintájában jelen vannak a különböző szilárd fázisú módszerrel vizsgált antifoszfolipid antitestek. Ezek az arányok nem térnek el a mások által korábban megállapítottaktól [156, 157, 161-169]. Azok a betegek, akiknek a keringésében ezek közül az antitestek közül valamelyik megtalálható, a tromboembóliás események bekövetkezésére 4-8-szoros kockázattal élnek SLE-s betegtársaikhoz képest. Az antitestek közül az anti-ß2-glikoprotein I, az anti-cardiolipin, a lupus antikoaguláns, illetve ezek együttes előfordulása jelentette a legmagasabb kockázatot a trombózis kialakulására. Ezzel szemben az anti-protrombin antitestek csak mérsékelt hatást mutattak. A cardiolipin és ß2-GPI elleni antitestek és a trombózis kialakulásának kapcsolatát többen bizonyították, és az anti-protrombin antitest pozitivitás alacsonyabb klinikai értékéről is található már adat [168, 169]. Amennyiben az anti-foszfolipidekhez más kockázati tényezők is járulnak ez a kockázat tovább emelkedhet. Azon betegek közül, akiknek az esetében az antifoszfolipid antitestek egyetlen kimutatott kockázati tényezőként jelentkeztek, 30 %-nak volt trombózisa, míg azok közül, akinek az esetében további rizikófaktorok is kimutathatóak voltak, 50 % ez az arány. Azon betegek közül, akiknél semmilyen rizikófaktort nem tudtunk detektálni, mindössze egy személynek volt trombózisa, szemben a csupán antifoszfolipid antitesttel rendelkezők 30 %-ával. Ez az összehasonlítás is az antifoszfolipid antitestek erős trombózis kialakulását elősegítő hatását mutatja. Alátámasztandó az antifoszfolipidek jelentőségét a trombózis kialakulása során, illetve

65

az egyes kockázati tényezők együttes hatásának erejét, mérlegeljük azt, hogy az antifoszfolipid antitestek az emelkedett homocisztein vagy VIII-as faktor szinthez, illetve APC rezisztenciához társulva 2-5-szörösre emelik az adott rizikófaktorral együtt élő betegek körében a trombózison átesettek arányát. Pontosan a foszfolipidek elleni antitestek erős hatása miatt a többi vizsgált kockázati tényező esetében az SLE-s populáción belül nem tudtuk alátámasztani azoknak a teljes populációban

jelentős

tromboembóliás

kockázatot

jelentő

hatását.

Példaként

megemlíthető, hogy számításaink alapján az APA negatív SLE-sek körében a Leidenmutáció többszörös kockázati tényezőnek bizonyult (OR=7,25 CI95%=1,00-52,34; RR=5,17 CI95%=1,18-22,61), ez jól látszik a viszonylag alacsony elemszám miatti tág konfidencia-intervallum ellenére is; ezzel szemben az APA pozitívak körében ez a hatás teljesen elhanyagolhatónak

mutatkozott

(OR=1,36

CI95%=0,17-10,84; RR=1,18

CI95%=0,41-3,39). Az általunk vizsgált SLE-s betegcsoportban az FV Leiden és protrombin G20210A mutációk előfordulási gyakorisága hasonló volt a magyarországi népességen végzett egyéb tanulmányok eredményeihez [100-102]. Érdekes megjegyezni, hogy a Leiden mutáció gyakorisága hazánkban az európai átlagnál magasabb. A két említett mutáció elterjedését leíró vizsgálatok azt az érdekes eredményt hozták, miszerint a Leiden mutáció Európában északról dél felé, és nyugatról kelet felé egyre nagyobb előfordulási gyakoriságot mutat, míg a protrombin mutáció kiemelkedően magas elterjedtségét az Ibériai-félsziget népességében írták le [98, 170]. Emelkedett (150 % feletti) FVIII szintet a trombózison átesett betegeink körében mintegy kétszer gyakrabban találtunk, mint a trombózistól mentes SLE-s betegek közt (32 és 17 %). Hasonló arányt, de valamivel alacsonyabb előfordulást (25 és 11 %) közöl egy korábbi tanulmány 301-301 az átlagpopulációból kiválasztott trombózisos beteg és egészséges kontroll személy vizsgálata után [111]. Mérsékelten emelkedett homocisztein szinteket a trombózisos és attól mentes betegeink 27 és 17 %-ánál találtunk. Egy korábbi, az átlagpopuláció hasonló csoportjainak Hcy szintjét összehasonlító vizsgálat 29 és 12 %-ot állapított meg [171]. Bár több adat született arról, hogy SLE-ben a betegek plazma Hcy szintje magasabb, mint az egészséges kontrolloké, van olyan vizsgálat, amely kiemeli, hogy az SLE-s betegeknek

66

csupán a kardiovaszkuláris megbetegedésekkel küzdő csoportjának értékei emelkednek szignifikánsan a normál populációban mért szintek fölé [172]. Mivel a különböző deficienciák, amelyek a trombózis kialakulását előidézik, a koagulációs rendszer más-más elemét érintik, eltérő lehet a hozzájuk kötődő tromboembóliás epizód klinikai képe is. Például, a négy heterozigóta FV-Leidenmutációt hordozó beteg, akiknek volt már trombózisa, minden esetben vénás tromboembólián esett át. Ezzel szemben az az öt beteg, akiknél emelkedett homocisztein szint és lupus anticoaguláns együttes előfordulását találtuk a trombózis hátterében, három artériás és négy vénás epizódot is elszenvedett. Ez utóbbi betegeknél az artériás trombózis relatív kockázata magasabb volt, mint a vénás eseményeké (OR=9,1 CI95%= 1,74-47,5 illetve 5,11 CI95%=1,21-21,53; RR=6,4 CI95%=1,82-22,51 illetve 3,28 CI95%=1,35-7,98). Az antifoszfolipidekkel összefüggésben viszont megállapíthatjuk, hogy nem volt eltérés az APA pozitív és APA negatív csoportok között az artériás és vénás epizódok eloszlásában. Két olyan beteget találtunk, akiknél szuperficiális thrombophlebitis alakult ki. Mindkettejük esetében a lupus anticoaguláns volt az egyetlen kimutatható trombózisra hajlamosító tényező. Bár ez a rendellenesség gyakran jelentkezik gyulladásos állapotokkal együtt, az említett két betegnek a thrombophlebitis kialakulásának idején inaktív volt az SLE-je. Egy

fiatal

nőbetegünknél,

koncentrációban

jelenlévő

akinek összes

tromboembóliás

vizsgált

rizikófaktora

antifoszfolipid-antitest

a

és a

magas lupus

anticoaguláns volt, agyi vénás sinus trombózis alakult ki. Korábbi esetek ismertek az irodalomban, ahol fiatal betegek agyi sinusában fellépő tromboembólia hátterében a lupus anticoaguláns áll [173, 174]. A vizsgált betegcsoportban bekövetkezett tromboembóliás események körülbelül harmada (az artériás események 25 %-a, a vénás epizódok 35,3 %-a) az SLE diagnózisát követő két éven belül következett be. További egyharmad (az artériás események 37,5 %-a, a vénás epizódok 29,4 %-a) a diagnózist követő második és tizedik év között, míg a fennmaradó harmad (az artériás események 37,5 %-a, a vénás epizódok 35,3 %-a) következett be a betegség tizedik éve után. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a tromboembóliák – mind az artériás, mind a vénás események – az SLE korai manifesztációi közé tartoznak.

67

Ismert, hogy a gyulladást- és trombocitaaktivációt gátló készítmények - mint az acetilszalicilsav származékai - egyben a trombóziskészséget is mérsékelik, mivel gátolják a trombociták aggregációjához vezető jelátviteli útvonalakat. Ilyen hatása volna az aktiváló Fcγ receptorokat gátló vegyületeknek is. Az Fc receptorokra vonatkozó, szintetikus peptidekkel végzett vizsgálataink szerint a peptidkonjugátumok

koncentrációfüggő

módon,

egymástól

eltérő,

és

az

immunkomplexektől elmaradó mértékben képesek kötődni a receptorokhoz és kiváltani monocita effektor funkciókat, mint például a gyulladásos citokinek termelése. A peptidek konjugálatlan, szabad formában nem gátolták sem az immunkomplexek FcR-okhoz való kötődését, sem a sejtek FcR közvezítette IL-6 termelését. Egyedül a TNFα termelést voltunk képesek gátolni az IgG Fc régiójából származó peptidekkel.

68

ÖSSZEFOGLALÁS A szisztémás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség, fontos jellemzője - az egész szervezetre kiterjedő gyulladásos állapot mellett - számos patogén autoantitest termelődése. Kutatómunkám során kiemelkedő figyelmet fordítottam az autoantitestek kimutatásával összefüggő laboratóriumi vizsgálatokra, mivel ezen ellenanyagok megjelenésének és a kórfolyamatokban betöltött szerepének hátterében álló folyamatok még nem teljesen tisztázottak. Munkám részeként olyan teszteket is elemeztem és értékeltem, amelyektől várható volt, hogy eredményesen alkalmazhatóak lesznek az SLE rutin diagnosztikájában. Megvizsgáltam: 1) a DNáz enzim aktivitását SLE-s betegek plazmájában, ennek jelentőségét a betegség kialakulásában, és szervi manifesztációinak – elsősorban a lupus nephritis – megjelenésében 2) az összefüggést a betegek DNáz aktivitása és a szérum antinukleoszóma antitest szintje között 3) az antifoszfolipid antitestek megjelenését az SLE-s

populációban

és

ezek

összefüggését

a

tromboembóliás

epizódok

bekövetkeztével. 4) az SLE-s csoportban előforduló trombózisok gyakoriságát, és az ezek hátterében álló, az SLE-től független tromboembóliás kockázati tényezőket 5) annak lehetőségét, a sejtfelszíni Fc receptorok blokkolásával gátolhatóak-e az antitestek és immunkomplexeik által közvetített effektor funkciók az autoimmun betegségek, elsősorban az SLE kezelésében. Eredményeim szerint, az SLE-s betegek szérumában a nem autoimmun betegekéhez képest szignifikánsan alacsonyabb a DNáz enzim aktivitása. Ez azonban nem áll összefüggésben

a

betegség

aktivitásával,

vagy a

betegség

során

kialakuló

vesekárosodással, ezért nincs klinikai jelentősége a betegek követése során. A DNáz aktivitás negatív korrelációt mutat a betegek antinukleoszóma antitest szintjével. Ez a megfigyelés alátámasztja azt az elképzelést, amely szerint a DNáz enzim

csökkent

működése

hozzájárul

a

DNS,

nukleoszóma,

illetve

más

kromatinstruktúrák elleni tolerancia áttörésében, és az autoimmun folyamatok megjelenésében. A vizsgált SLE-s betegcsoportban mintegy tízszer gyakoribbnak találtam a trombózis incidenciáját az áltagnépességhez viszonyítva. Kimutattam, hogy SLE-ben elsősorban a

69

betegek több mint harmadának plazmájában kimutatható antifoszfolipid antitestek megjelenése vezet ehhez a kiemelkedő tromboembóliás rizikóhoz. A klasszikus, jobbára öröklött trombofília tényezők az antifoszfolipid antitestek mellett csak mérsékelten járultak hozzá a trombózisok kialakulásához, ezért a trombofília vizsgálatok rutinszerű bevezetése a tromboembóliás tünetektől mentes autoimmun betegeknél nem indokolt. Az Fc receptorokra vonatkozó, szintetikus peptidekkel végzett vizsgálataink szerint peptidkonjugátumokkal kiválthatók monocita effektor funkciók. Konjugálatlan, monomer formában azonban a peptidek nem gátolták sem az immunkomplexek FcRokhoz való kötődését, sem a sejtek FcR közvetítette IL-6 termelését, viszont gátló hatással voltak a TNFα termelésre. Az általunk vizsgált peptidpreparátumoknak ebben a formában nincs farmakológiai jelentőségük.

70

IRODALOMJEGYZÉK 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

13. 14. 15. 16. 17. 18.

Johnson, A.E., et al., The prevalence and incidence of systemic lupus erythematosus in Birmingham, England. Relationship to ethnicity and country of birth. Arthritis Rheum, 1995. 38(4): p. 551-8. Stahl-Hallengren, C., et al., Incidence studies of systemic lupus erythematosus in Southern Sweden: increasing age, decreasing frequency of renal manifestations and good prognosis. J Rheumatol, 2000. 27(3): p. 685-91. Uramoto, K.M., et al., Trends in the incidence and mortality of systemic lupus erythematosus, 1950-1992. Arthritis Rheum, 1999. 42(1): p. 46-50. Hopkinson, N.D., M. Doherty, and R.J. Powell, The prevalence and incidence of systemic lupus erythematosus in Nottingham, UK, 1989-1990. Br J Rheumatol, 1993. 32(2): p. 110-5. Cooper, G.S., et al., Differences by race, sex and age in the clinical and immunologic features of recently diagnosed systemic lupus erythematosus patients in the southeastern United States. Lupus, 2002. 11(3): p. 161-7. Hart, H.H., R.R. Grigor, and D.E. Caughey, Ethnic difference in the prevalence of systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis, 1983. 42(5): p. 529-32. Sarzi-Puttini, P., et al., Drug-induced lupus erythematosus. Autoimmunity, 2005. 38(7): p. 507-18. Stratton, M.A., Drug-induced systemic lupus erythematosus. Clin Pharm, 1985. 4(6): p. 657-63. James, J.A., et al., An increased prevalence of Epstein-Barr virus infection in young patients suggests a possible etiology for systemic lupus erythematosus. J Clin Invest, 1997. 100(12): p. 3019-26. Dror, Y., et al., Systemic lupus erythematosus associated with acute EpsteinBarr virus infection. Am J Kidney Dis, 1998. 32(5): p. 825-8. Gross, A.J., et al., EBV and systemic lupus erythematosus: a new perspective. J Immunol, 2005. 174(11): p. 6599-607. Gergely, P., Jr., et al., Increased prevalence of transfusion-transmitted virus and cross-reactivity with immunodominant epitopes of the HRES-1/p28 endogenous retroviral autoantigen in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Immunol, 2005. 116(2): p. 124-34. Zandman-Goddard, G. and Y. Shoenfeld, Infections and SLE. Autoimmunity, 2005. 38(7): p. 473-85. Cutolo, M., et al., Sex hormones influence on the immune system: basic and clinical aspects in autoimmunity. Lupus, 2004. 13(9): p. 635-8. Rider, V. and N.I. Abdou, Gender differences in autoimmunity: molecular basis for estrogen effects in systemic lupus erythematosus. Int Immunopharmacol, 2001. 1(6): p. 1009-24. Petri, M., Exogenous estrogen in systemic lupus erythematosus: oral contraceptives and hormone replacement therapy. Lupus, 2001. 10(3): p. 222-6. Lahita, R.G., The role of sex hormones in systemic lupus erythematosus. Curr Opin Rheumatol, 1999. 11(5): p. 352-6. Ostensen, M., Sex hormones and pregnancy in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Ann N Y Acad Sci, 1999. 876: p. 131-43; discussion 144.

71

19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27.

28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38.

Tan, E.M., et al., The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 1982. 25(11): p. 1271-7. Bombardier, C., et al., Derivation of the SLEDAI. A disease activity index for lupus patients. The Committee on Prognosis Studies in SLE. Arthritis Rheum, 1992. 35(6): p. 630-40. Blatt, N.B. and G.D. Glick, Anti-DNA autoantibodies and systemic lupus erythematosus. Pharmacol Ther, 1999. 83(2): p. 125-39. Burlingame, R.W. and R. Cervera, Anti-chromatin (anti-nucleosome) autoantibodies. Autoimmun Rev, 2002. 1(6): p. 321-8. Pisetsky, D.S., Antibody responses to DNA in normal immunity and aberrant immunity. Clin Diagn Lab Immunol, 1998. 5(1): p. 1-6. Tozzoli, R., et al., Guidelines for the laboratory use of autoantibody tests in the diagnosis and monitoring of autoimmune rheumatic diseases. Am J Clin Pathol, 2002. 117(2): p. 316-24. von Muhlen, C.A. and E.M. Tan, Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum, 1995. 24(5): p. 323-58. Cairns, A.P., et al., Antinucleosome antibodies in the diagnosis of systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis, 2003. 62(3): p. 272-3. Amoura, Z., et al., Presence of antinucleosome autoantibodies in a restricted set of connective tissue diseases: antinucleosome antibodies of the IgG3 subclass are markers of renal pathogenicity in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 2000. 43(1): p. 76-84. Amoura, Z., S. Koutouzov, and J.C. Piette, The role of nucleosomes in lupus. Curr Opin Rheumatol, 2000. 12(5): p. 369-73. Tang, S., S.L. Lui, and K.N. Lai, Pathogenesis of lupus nephritis: an update. Nephrology (Carlton), 2005. 10(2): p. 174-9. Kewalramani, R. and A.K. Singh, Immunopathogenesis of lupus and lupus nephritis: recent insights. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2002. 11(3): p. 273-7. Houssiau, F.A., Management of lupus nephritis: an update. J Am Soc Nephrol, 2004. 15(10): p. 2694-704. Font, J., et al., Clusters of clinical and immunologic features in systemic lupus erythematosus: analysis of 600 patients from a single center. Semin Arthritis Rheum, 2004. 33(4): p. 217-30. Brugos, B., et al., Retrospective analysis of patients with lupus nephritis: data from a large clinical immunological center in hungary. Scand J Immunol, 2006. 64(4): p. 433-7. Van Bruggen, M.C., C. Kramers, and J.H. Berden, Autoimmunity against nucleosomes and lupus nephritis. Ann Med Interne (Paris), 1996. 147(7): p. 4859. Spronk, P.E., et al., Anti-dsDNA production coincides with concurrent B and T cell activation during development of active disease in systemic lupus erythematosus (SLE). Clin Exp Immunol, 1996. 104(3): p. 446-53. Herrmann, M., et al., What triggers anti-dsDNA antibodies? Mol Biol Rep, 1996. 23(3-4): p. 265-7. Bruns, A., et al., Nucleosomes are major T and B cell autoantigens in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 2000. 43(10): p. 2307-15. Berden, J.H., et al., Lupus nephritis: a nucleosome waste disposal defect? J Nephrol, 2002. 15 Suppl 6: p. S1-10.

72

39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56.

57.

58.

Walport, M.J., Lupus, DNase and defective disposal of cellular debris. Nat Genet, 2000. 25(2): p. 135-6. Suck, D. and C. Oefner, Structure of DNase I at 2.0 A resolution suggests a mechanism for binding to and cutting DNA. Nature, 1986. 321(6070): p. 620-5. MacLea, K.S., R.J. Krieser, and A. Eastman, Revised structure of the active form of human deoxyribonuclease IIalpha. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 292(2): p. 415-21. Chitrabamrung, S., R.L. Rubin, and E.M. Tan, Serum deoxyribonuclease I and clinical activity in systemic lupus erythematosus. Rheumatol Int, 1981. 1(2): p. 55-60. Lachmann, P.J., Lupus and desoxyribonuclease. Lupus, 2003. 12(3): p. 202-6. Napirei, M., et al., Features of systemic lupus erythematosus in Dnase1-deficient mice. Nat Genet, 2000. 25(2): p. 177-81. Macanovic, M., et al., The treatment of systemic lupus erythematosus (SLE) in NZB/W F1 hybrid mice; studies with recombinant murine DNase and with dexamethasone. Clin Exp Immunol, 1996. 106(2): p. 243-52. Lachmann, P.J., Experimental aspects of systemic lupus erythematosus. Proc R Soc Med, 1967. 60(5): p. 464-5. Davis, J.C., Jr., et al., Recombinant human Dnase I (rhDNase) in patients with lupus nephritis. Lupus, 1999. 8(1): p. 68-76. Yasutomo, K., et al., Mutation of DNASE1 in people with systemic lupus erythematosus. Nat Genet, 2001. 28(4): p. 313-4. Sullivan, K.E., Genetics of systemic lupus erythematosus. Clinical implications. Rheum Dis Clin North Am, 2000. 26(2): p. 229-56, v-vi. Wong, M. and B.P. Tsao, Current topics in human SLE genetics. Springer Semin Immunopathol, 2006. Harley, J.B., et al., The genetics of human systemic lupus erythematosus. Curr Opin Immunol, 1998. 10(6): p. 690-6. Vyse, T.J. and B.L. Kotzin, Genetic susceptibility to systemic lupus erythematosus. Annu Rev Immunol, 1998. 16: p. 261-92. Schur, P.H., Genetics of systemic lupus erythematosus. Lupus, 1995. 4(6): p. 425-37. Atkinson, J.P., Complement activation and complement receptors in systemic lupus erythematosus. Springer Semin Immunopathol, 1986. 9(2-3): p. 179-94. Walport, M.J., K.A. Davies, and M. Botto, C1q and systemic lupus erythematosus. Immunobiology, 1998. 199(2): p. 265-85. Jonsen, A., et al., Analysis of HLA DR, HLA DQ, C4A, FcgammaRIIa, FcgammaRIIIa, MBL, and IL-1Ra allelic variants in Caucasian systemic lupus erythematosus patients suggests an effect of the combined FcgammaRIIa R/R and IL-1Ra 2/2 genotypes on disease susceptibility. Arthritis Res Ther, 2004. 6(6): p. R557-62. Truedsson, L., et al., Sharing of MHC haplotypes among patients with systemic lupus erythematosus from unrelated Caucasian multicase families: disease association with the extended haplotype [HLA-B8, SC01, DR17]. J Rheumatol, 1995. 22(10): p. 1852-61. Mok, C.C. and C.S. Lau, Pathogenesis of systemic lupus erythematosus. J Clin Pathol, 2003. 56(7): p. 481-90.

73

59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77.

Tsutsumi, A., R. Takahashi, and T. Sumida, Mannose binding lectin: genetics and autoimmune disease. Autoimmun Rev, 2005. 4(6): p. 364-72. Garred, P., et al., Association of mannose-binding lectin gene variation with disease severity and infections in a population-based cohort of systemic lupus erythematosus patients. Genes Immun, 2001. 2(8): p. 442-50. Seelen, M.A., et al., A role for mannose-binding lectin dysfunction in generation of autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Rheumatology (Oxford), 2005. 44(1): p. 111-9. Ohlenschlaeger, T., et al., Mannose-binding lectin variant alleles and the risk of arterial thrombosis in systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 2004. 351(3): p. 260-7. Berken, A. and B. Benacerraf, Properties of antibodies cytophilic for macrophages. J Exp Med, 1966. 123(1): p. 119-44. Ravetch, J.V. and S. Bolland, IgG Fc receptors. Annu Rev Immunol, 2001. 19: p. 275-90. Daeron, M., Fc receptor biology. Annu Rev Immunol, 1997. 15: p. 203-34. Takai, T., Roles of Fc receptors in autoimmunity. Nat Rev Immunol, 2002. 2(8): p. 580-92. Hogarth, P.M., Fc receptors are major mediators of antibody based inflammation in autoimmunity. Curr Opin Immunol, 2002. 14(6): p. 798-802. Manger, K., et al., Fcgamma receptor IIa, IIIa, and IIIb polymorphisms in German patients with systemic lupus erythematosus: association with clinical symptoms. Ann Rheum Dis, 2002. 61(9): p. 786-92. Hazenbos, W.L., et al., Impaired IgG-dependent anaphylaxis and Arthus reaction in Fc gamma RIII (CD16) deficient mice. Immunity, 1996. 5(2): p. 1818. Stefanescu, R.N., et al., Inhibitory Fc gamma receptors: from gene to disease. J Clin Immunol, 2004. 24(4): p. 315-26. Taylor, S.M., et al., Thrombosis and shock induced by activating antiplatelet antibodies in human Fc gamma RIIA transgenic mice: the interplay among antibody, spleen, and Fc receptor. Blood, 2000. 96(13): p. 4254-60. Egeberg, O., Inherited Antithrombin Deficiency Causing Thrombophilia. Thromb Diath Haemorrh, 1965. 13: p. 516-30. Chowdhury, V., et al., Homozygous antithrombin deficiency: report of two new cases (99 Leu to Phe) associated with arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost, 1994. 72(2): p. 198-202. Kuhle, S., et al., Homozygous antithrombin deficiency type II (99 Leu to Phe mutation) and childhood thromboembolism. Thromb Haemost, 2001. 86(4): p. 1007-11. Perry, D.J. and R.W. Carrell, Molecular genetics of human antithrombin deficiency. Hum Mutat, 1996. 7(1): p. 7-22. Tait, R.C., et al., Prevalence of antithrombin deficiency in the healthy population. Br J Haematol, 1994. 87(1): p. 106-12. Bucciarelli, P., et al., Risk of venous thromboembolism and clinical manifestations in carriers of antithrombin, protein C, protein S deficiency, or activated protein C resistance: a multicenter collaborative family study. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1999. 19(4): p. 1026-33.

74

78. 79. 80.

81. 82. 83. 84. 85. 86.

87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95.

96.

Harper, P.L., et al., The incidence of dysfunctional antithrombin variants: four cases in 210 patients with thromboembolic disease. Br J Haematol, 1991. 77(3): p. 360-4. Bayston, T.A. and D.A. Lane, Antithrombin: molecular basis of deficiency. Thromb Haemost, 1997. 78(1): p. 339-43. Lane, D.A., et al., Antithrombin mutation database: 2nd (1997) update. For the Plasma Coagulation Inhibitors Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost, 1997. 77(1): p. 197-211. Griffin, J.H., et al., Deficiency of protein C in congenital thrombotic disease. J Clin Invest, 1981. 68(5): p. 1370-3. Schwarz, H.P., et al., Plasma protein S deficiency in familial thrombotic disease. Blood, 1984. 64(6): p. 1297-300. Comp, P.C., et al., Familial protein S deficiency is associated with recurrent thrombosis. J Clin Invest, 1984. 74(6): p. 2082-8. Broekmans, A.W., J.J. Veltkamp, and R.M. Bertina, Congenital protein C deficiency and venous thromboembolism. A study of three Dutch families. N Engl J Med, 1983. 309(6): p. 340-4. Reitsma, P.H., Protein C deficiency: from gene defects to disease. Thromb Haemost, 1997. 78(1): p. 344-50. Reitsma, P.H., et al., Protein C deficiency: a database of mutations, 1995 update. On behalf of the Subcommittee on Plasma Coagulation Inhibitors of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost, 1995. 73(5): p. 876-89. Millar, D.S., et al., Molecular genetic analysis of severe protein C deficiency. Hum Genet, 2000. 106(6): p. 646-53. Aiach, M., et al., Protein C and protein S deficiencies. Semin Hematol, 1997. 34(3): p. 205-16. Gandrille, S., et al., Protein S deficiency: a database of mutations--summary of the first update. Thromb Haemost, 2000. 84(5): p. 918. Miletich, J., L. Sherman, and G. Broze, Jr., Absence of thrombosis in subjects with heterozygous protein C deficiency. N Engl J Med, 1987. 317(16): p. 991-6. Dykes, A.C., et al., A study of Protein S antigen levels in 3788 healthy volunteers: influence of age, sex and hormone use, and estimate for prevalence of deficiency state. Br J Haematol, 2001. 113(3): p. 636-41. Seligsohn, U., et al., Homozygous protein C deficiency manifested by massive venous thrombosis in the newborn. N Engl J Med, 1984. 310(9): p. 559-62. Williamson, D., et al., Factor V Cambridge: a new mutation (Arg306-->Thr) associated with resistance to activated protein C. Blood, 1998. 91(4): p. 1140-4. Bertina, R.M., et al., Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature, 1994. 369(6475): p. 64-7. Dahlback, B., M. Carlsson, and P.J. Svensson, Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(3): p. 1004-8. Rosendaal, F.R., et al., High risk of thrombosis in patients homozygous for factor V Leiden (activated protein C resistance). Blood, 1995. 85(6): p. 1504-8.

75

97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. 112. 113. 114. 115. 116.

Ruggeri, M., et al., Factor V Leiden mutation carriership and venous thromboembolism in polycythemia vera and essential thrombocythemia. Am J Hematol, 2002. 71(1): p. 1-6. Lucotte, G. and G. Mercier, Population genetics of factor V Leiden in Europe. Blood Cells Mol Dis, 2001. 27(2): p. 362-7. Herrmann, F.H., et al., Prevalence of factor V Leiden mutation in various populations. Genet Epidemiol, 1997. 14(4): p. 403-11. Balogh, I., et al., High prevalence of factor V Leiden mutation and 20210A prothrombin variant in Hungary. Thromb Haemost, 1999. 81(4): p. 660-1. Pongracz, E., et al., [Significance of Factor V gene A506G mutation (Leiden) in the pathogenesis of ischemic stroke]. Ideggyogy Sz, 2003. 56(5-6): p. 157-64. Stankovics, J., et al., [Incidence of factor V G1681A (Leiden) mutation in samplings from the Hungarian population]. Orv Hetil, 1998. 139(19): p. 1161-3. Jun, Z.J., et al., Prevalence of factor V Leiden and prothrombin G20210A mutations in Chinese patients with deep venous thrombosis and pulmonary embolism. Clin Lab Haematol, 2006. 28(2): p. 111-6. Pepe, G., et al., Prevalence of factor V Leiden mutation in non-European populations. Thromb Haemost, 1997. 77(2): p. 329-31. Kim, Y.W., et al., Absence of factor V Leiden mutation in Koreans. Thromb Res, 1997. 86(2): p. 181-2. Franco, R.F., et al., The prevalence of factor V Arg306-->Thr (factor V Cambridge) and factor V Arg306-->Gly mutations in different human populations. Thromb Haemost, 1999. 81(2): p. 312-3. Poort, S.R., et al., A common genetic variation in the 3'-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood, 1996. 88(10): p. 3698-703. Bertina, R.M., Elevated clotting factor levels and venous thrombosis. Pathophysiol Haemost Thromb, 2003. 33(5-6): p. 395-400. Ceelie, H., et al., Polymorphisms in the prothrombin gene and their association with plasma prothrombin levels. Thromb Haemost, 2001. 85(6): p. 1066-70. Kyrle, P.A., et al., High plasma levels of factor VIII and the risk of recurrent venous thromboembolism. N Engl J Med, 2000. 343(7): p. 457-62. Koster, T., et al., Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet, 1995. 345(8943): p. 152-5. Cattaneo, M., Hyperhomocysteinemia, atherosclerosis and thrombosis. Thromb Haemost, 1999. 81(2): p. 165-76. Harpel, P.C., X. Zhang, and W. Borth, Homocysteine and hemostasis: pathogenic mechanisms predisposing to thrombosis. J Nutr, 1996. 126(4 Suppl): p. 1285S-9S. Brattstrom, L., et al., Hyperhomocysteinaemia in stroke: prevalence, cause, and relationships to type of stroke and stroke risk factors. Eur J Clin Invest, 1992. 22(3): p. 214-21. Haim, M., et al., Serum Homocysteine and Long-Term Risk of Myocardial Infarction and Sudden Death in Patients with Coronary Heart Disease. Cardiology, 2006. 107(1): p. 52-56. Falcon, C.R., et al., High prevalence of hyperhomocyst(e)inemia in patients with juvenile venous thrombosis. Arterioscler Thromb, 1994. 14(7): p. 1080-3.

76

117. 118. 119.

120. 121.

122. 123. 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. 132. 133. 134. 135.

den Heijer, M., et al., Hyperhomocysteinemia as a risk factor for deep-vein thrombosis. N Engl J Med, 1996. 334(12): p. 759-62. Frosst, P., et al., A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet, 1995. 10(1): p. 111-3. Legnani, C., et al., Hyperhomocyst(e)inemia and a common methylenetetrahydrofolate reductase mutation (Ala223Val MTHFR) in patients with inherited thrombophilic coagulation defects. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997. 17(11): p. 2924-9. Schmitz, C., et al., Genetic polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase and myocardial infarction. A case-control study. Circulation, 1996. 94(8): p. 1812-4. Choumenkovitch, S.F., et al., In the cystathionine beta-synthase knockout mouse, elevations in total plasma homocysteine increase tissue Sadenosylhomocysteine, but responses of S-adenosylmethionine and DNA methylation are tissue specific. J Nutr, 2002. 132(8): p. 2157-60. Kelly, P.J., et al., Stroke in young patients with hyperhomocysteinemia due to cystathionine beta-synthase deficiency. Neurology, 2003. 60(2): p. 275-9. Mudd, S.H., et al., Homocystinuria: An Enzymatic Defect. Science, 1964. 143: p. 1443-5. Di Minno, G., et al., Homocysteine, platelet function and thrombosis. Haematologica, 1999. 84 Suppl EHA-4: p. 61-3. Esmon, C.T., The impact of the inflammatory response on coagulation. Thromb Res, 2004. 114(5-6): p. 321-7. Shebuski, R.J. and K.S. Kilgore, Role of inflammatory mediators in thrombogenesis. J Pharmacol Exp Ther, 2002. 300(3): p. 729-35. Giesen, P.L., et al., Blood-borne tissue factor: another view of thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(5): p. 2311-5. Nawroth, P.P. and D.M. Stern, Modulation of endothelial cell hemostatic properties by tumor necrosis factor. J Exp Med, 1986. 163(3): p. 740-5. Bevilacqua, M.P., et al., Interleukin 1 (IL-1) induces biosynthesis and cell surface expression of procoagulant activity in human vascular endothelial cells. J Exp Med, 1984. 160(2): p. 618-23. Eilertsen, K.E. and B. Osterud, Tissue factor: (patho)physiology and cellular biology. Blood Coagul Fibrinolysis, 2004. 15(7): p. 521-38. Rezende, S.M., R.E. Simmonds, and D.A. Lane, Coagulation, inflammation, and apoptosis: different roles for protein S and the protein S-C4b binding protein complex. Blood, 2004. 103(4): p. 1192-201. Espinosa, G., et al., Antiphospholipid syndrome: pathogenic mechanisms. Autoimmun Rev, 2003. 2(2): p. 86-93. Singh, A.K., Immunopathogenesis of the antiphospholipid antibody syndrome: an update. Curr Opin Nephrol Hypertens, 2001. 10(3): p. 355-8. Field, S.L., et al., Recent insights into antiphospholipid antibody-mediated thrombosis. Baillieres Best Pract Res Clin Haematol, 1999. 12(3): p. 407-22. Rand, J.H., The antiphospholipid syndrome. Annu Rev Med, 2003. 54: p. 40924.

77

136. 137. 138. 139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. 146. 147. 148. 149.

150. 151. 152.

Borrell, M., et al., Immunoglobulin fractions isolated from patients with antiphospholipid antibodies prevent the inactivation of factor Va by activated protein C on human endothelial cells. Thromb Haemost, 1992. 68(3): p. 268-72. Mori, T., et al., beta 2-Glycoprotein I modulates the anticoagulant activity of activated protein C on the phospholipid surface. Thromb Haemost, 1996. 75(1): p. 49-55. Rand, J.H., Antiphospholipid antibody-mediated disruption of the annexin-V antithrombotic shield: a thrombogenic mechanism for the antiphospholipid syndrome. J Autoimmun, 2000. 15(2): p. 107-11. Wolberg, A.S. and R.A. Roubey, Mechanisms of autoantibody-induced monocyte tissue factor expression. Thromb Res, 2004. 114(5-6): p. 391-6. Kornberg, A., et al., Induction of tissue factor-like activity in monocytes by anticardiolipin antibodies. J Immunol, 1994. 153(3): p. 1328-32. Cuadrado, M.J., et al., Thrombosis in primary antiphospholipid syndrome: a pivotal role for monocyte tissue factor expression. Arthritis Rheum, 1997. 40(5): p. 834-41. Reverter, J.C., et al., Hypercoagulable state in patients with antiphospholipid syndrome is related to high induced tissue factor expression on monocytes and to low free protein s. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1996. 16(11): p. 1319-26. Reverter, J.C., et al., Effects of human monoclonal anticardiolipin antibodies on platelet function and on tissue factor expression on monocytes. Arthritis Rheum, 1998. 41(8): p. 1420-7. Meroni, P.L., et al., Endothelial activation by aPL: a potential pathogenetic mechanism for the clinical manifestations of the syndrome. J Autoimmun, 2000. 15(2): p. 237-40. Mok, C.C., et al., Incidence and risk factors of thromboembolism in systemic lupus erythematosus: a comparison of three ethnic groups. Arthritis Rheum, 2005. 52(9): p. 2774-82. Tew, M.B., et al., A molecular analysis of the low serum deoxyribonuclease activity in lupus patients. Arthritis Rheum, 2001. 44(10): p. 2446-7. Balada, E., et al., DNASE I mutation and systemic lupus erythematosus in a Spanish population: comment on the article by Tew et al. Arthritis Rheum, 2002. 46(7): p. 1974-6; author reply 1976-7. Chakraborty, P., et al., The A/T mutation in exon 2 of the DNASE1 gene is not present in Tunisian patients with systemic lupus erythematosus or in healthy subjects. Arthritis Rheum, 2003. 48(11): p. 3297-8. Simmonds, M.J., et al., A nonsense mutation in exon 2 of the DNase I gene is not present in UK subjects with systemic lupus erythematosus and Graves' disease: Comment on the article by Rood et al. Arthritis Rheum, 2002. 46(11): p. 310910. Yeh, T.M., et al., Deoxyribonuclease-inhibitory antibodies in systemic lupus erythematosus. J Biomed Sci, 2003. 10(5): p. 544-51. Benucci, M., et al., Disease activity and antinucleosome antibodies in systemic lupus erythematosus. Scand J Rheumatol, 2003. 32(1): p. 42-5. Min, D.J., et al., Anti-nucleosome antibody: significance in lupus patients lacking anti-double-stranded DNA antibody. Clin Exp Rheumatol, 2002. 20(1): p. 13-8.

78

153. 154.

155. 156.

157. 158. 159. 160. 161. 162. 163.

164. 165.

166. 167. 168.

Simon, J.A., et al., Anti-nucleosome antibodies in patients with systemic lupus erythematosus of recent onset. Potential utility as a diagnostic tool and disease activity marker. Rheumatology (Oxford), 2004. 43(2): p. 220-4. Amoura, Z., et al., Circulating plasma levels of nucleosomes in patients with systemic lupus erythematosus: correlation with serum antinucleosome antibody titers and absence of clear association with disease activity. Arthritis Rheum, 1997. 40(12): p. 2217-25. Cervera, R., et al., Morbidity and mortality in systemic lupus erythematosus during a 10-year period: a comparison of early and late manifestations in a cohort of 1,000 patients. Medicine (Baltimore), 2003. 82(5): p. 299-308. Brouwer, J.L., et al., The contribution of inherited and acquired thrombophilic defects, alone or combined with antiphospholipid antibodies, to venous and arterial thromboembolism in patients with systemic lupus erythematosus. Blood, 2004. 104(1): p. 143-8. Afeltra, A., et al., Thrombosis in systemic lupus erythematosus: congenital and acquired risk factors. Arthritis Rheum, 2005. 53(3): p. 452-9. Nordstrom, M., et al., A prospective study of the incidence of deep-vein thrombosis within a defined urban population. J Intern Med, 1992. 232(2): p. 155-60. Anderson, F.A., Jr., et al., A population-based perspective of the hospital incidence and case-fatality rates of deep vein thrombosis and pulmonary embolism. The Worcester DVT Study. Arch Intern Med, 1991. 151(5): p. 933-8. Erkan, D., et al., A cross-sectional study of clinical thrombotic risk factors and preventive treatments in antiphospholipid syndrome. Rheumatology (Oxford), 2002. 41(8): p. 924-9. Shapiro, S.S., The lupus anticoagulant/antiphospholipid syndrome. Annu Rev Med, 1996. 47: p. 533-53. Galli, M. and T. Barbui, Prevalence of different anti-phospholipid antibodies in systemic lupus erythematosus and their relationship with the antiphospholipid syndrome. Clin Chem, 2001. 47(6): p. 985-7. Love, P.E. and S.A. Santoro, Antiphospholipid antibodies: anticardiolipin and the lupus anticoagulant in systemic lupus erythematosus (SLE) and in non-SLE disorders. Prevalence and clinical significance. Ann Intern Med, 1990. 112(9): p. 682-98. Palomo, I., et al., Antiphospholipid antibodies in Chilean patients with systemic lupus erythematosus. J Lab Clin Med, 2002. 140(5): p. 336-41. Radway-Bright, E.L., C.T. Ravirajan, and D.A. Isenberg, The prevalence of antibodies to anionic phospholipids in patients with the primary antiphospholipid syndrome, systemic lupus erythematosus and their relatives and spouses. Rheumatology (Oxford), 2000. 39(4): p. 427-31. Amoroso, A., et al., Safety of conventional drugs and biologic agents for Rheumatoid Arthritis. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2003. 7(5): p. 139-45. Caccavo, D., et al., Raynaud's phenomenon and antiphospholipid antibodies in systemic lupus erythematosus: is there an association? Ann Rheum Dis, 2003. 62(10): p. 1003-5. Sebastiani, G.D., et al., Anticardiolipin and anti-beta2GPI antibodies in a large series of European patients with systemic lupus erythematosus. Prevalence and

79

169. 170. 171. 172. 173. 174.

clinical associations. European Concerted Action on the Immunogenetics of SLE. Scand J Rheumatol, 1999. 28(6): p. 344-51. Gould, T., et al., Prevalence and clinical correlates of anti-phospholipid antibodies in South Africans with systemic lupus erythematosus. Scand J Rheumatol, 2006. 35(1): p. 29-34. Rees, D.C., M. Cox, and J.B. Clegg, World distribution of factor V Leiden. Lancet, 1995. 346(8983): p. 1133-4. Simioni, P., et al., Hyperhomocysteinemia and deep-vein thrombosis. A casecontrol study. Thromb Haemost, 1996. 76(6): p. 883-6. Svenungsson, E., et al., Risk factors for cardiovascular disease in systemic lupus erythematosus. Circulation, 2001. 104(16): p. 1887-93. Levine, S.R., et al., Cerebral venous thrombosis with lupus anticoagulants. Report of two cases. Stroke, 1987. 18(4): p. 801-4. Levy, D.M., et al., Thromboembolism in paediatric lupus patients. Lupus, 2003. 12(10): p. 741-6.

80

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

Az értekezés témájában megjelent közlemények Scandinavian Journal of Rheumatology: Thrombosis Risk in Systemic Lupus Erythematosus: the Role of Thrombophilia Risk Factors (accepted for publication) Sallai K, Nagy E, Bodó I, Mohl A, Gergely P Clin Diagn Lab Immunol. 2005 Jan;12(1):56-9.: Antinucleosome antibodies and decreased deoxyribonuclease activity in sera of patients with systemic lupus erythematosus Sallai K, Nagy E, Derfalvy B, Muzes G, Gergely P Eur J Immunol. 2004 Apr;34(4):1127-35.: Functional mapping of the Fc gamma RII binding site on human IgG1 by synthetic peptides Medgyesi D, Uray K, Sallai K, Hudecz F, Koncz G, Abramson J, Pecht I, Sarmay G, Gergely J Az értekezés témájához kapcsolódó, de abban nem szereplő közlemény Magyar Immunológia 3, 16-21 (2004): SS-A(Ro) és SS-B(La) autoantitestek előfordulása szisztémás lupus erythematosusban Sallai K, Nagy E, Gergely P.

81

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Tisztelettel köszönöm Prof. Gergely Péternek, téma- és programvezetőmnek, valamint Prof. Mandl Józsefnek, a Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola vezetőjének a lehetőséget a doktori munkám és dolgozatom elkészítésére.

Hálásan köszönöm dr. Nagy Eszter és dr. Bodó Imre áldozatos segítségét, számos tanácsát és állandó támogatását közös munkánk során.

Sokszor köszönöm Berczeliné Sarus Renáta, Benák Tiborné, Homályné Herbály Mária, Kissné Szabó Katalin, Móricz Gyöngyi, Nagy Edit, Pósa Zsolt, dr. Szabó Teréz, Szegedi Sándorné, dr. Szilágyi Jánosné, a SE Központi Immunológiai Laboratórium dolgozóinak - nem csupán szakmai – segítségét, valamint dr. Mohl Adrienn Ph.D. hallgatónak segítségét és barátságát.

Nagy szeretettel köszönöm szüleim és egész családom megértő támogatását.

Köszönettel tartozom továbbá az etiópiai és brazil kávétermesztőknek, akik nélkül dolgozatom sosem készült volna el.

82