APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH DEKAT UNTUK KUANTIFIKASI EUGENOL, MENTOL, DAN METIL SALISILAT DALAM OBAT NYERI OTOT
NURTIYAS LUTHFIANI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK NURTIYAS LUTHFIANI. Aplikasi Spektrofotometri Inframerah Dekat untuk Kuantifikasi Eugenol, Mentol, dan Metil Salisilat dalam Obat Nyeri Otot. Dibimbing oleh SRI MULIJANI dan RUDI HERYANTO. Campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat dapat dianalisis menggunakan spektrofometri inframerah dekat (NIRS) dan dibandingkan dengan analisis kromatografi gas. Tahapan penentuan NIRS sebagai alat analisis suatu zat ialah uji kesesuaian alat, pembuatan model kalibrasi, uji prediksi, dan uji validasi. Uji kesesuaian alat menghasilkan gangguan yang rendah untuk alat NIRS FOSS Rapid Content Analyzer. Pembuatan model kalibrasi menggunakan teknik kalibrasi multivariat (kuadrat terkecil parsial) pada kurva turunan kedua. Uji prediksi menghasilkan nilai galat baku prediksi (SEP) untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat berturut-turut sebesar 0.019, 0.09, dan 0.145. Uji validasi campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat berturut-turut menghasilkan linearitas sebesar 0.858, 0.973, dan 0.891. Nilai kisaran (%) sebesar 67–119 untuk eugenol, 60–110 untuk mentol, dan 69–120 untuk metil salisilat. Nilai akurasi, keterulangan, presisi intermediet, dan spesifisitas untuk ketiga zat aktif berturut-turut sebesar SEP > 1.4 × SEL, RSD < 2%, tidak berbeda nyata, dan > 0.900. Berdasarkan hasil uji prediksi dan validasi, NIRS dapat digunakan untuk pengukuran campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat. ABSTRACT NURTIYAS LUTHFIANI. Aplication of Near Infrared Spectrophotometry for Quantification of Eugenol, Menthol, and Methyl Salycilate in Analgesic Balm. Supervised by SRI MULIJANI and RUDI HERYANTO. The mixture of eugenol, menthol, and methyl salicylate can be analyzed by near infrared spectrophotometry (NIRS) and compared with the chromatography gas analysis. The steps to validate NIRS as the analytical tool included feasibility test, calibration model building, prediction test, and validation test. The feasibility test produced low perturbation for NIRS FOSS Rapid Content Analyzer tool. The calibration model building used multivariate calibration (partial least square), with 2nd derivative curve. Prediction test gave the standard error prediction (SEP) for eugenol, menthol, and methyl salicylate of 0.019, 0.09, and 0.0145, respectively. Validity test for the mixture of eugenol, menthol, and methyl salicylate gave linearity of 0.858, 0.973, and 0.891, respectively. The range of value (%) were 67–119 for eugenol, 60–110 for mentol, and 69–120 for methyl salicylate. The value of accuracy, repeatability, intermediate precision, and specificity for the mixture were SEP > 1.4 × SEL, RSD < 2%, no significant difference, and > 0.900, respectively. Based on the results of prediction and validation test, NIRS is applicable for measurement of the mixture of eugenol, menthol, and methyl salicylate.
APLIKASI SPEKTROFOTOMETRI INFRAMERAH DEKAT UNTUK KUANTIFIKASI EUGENOL, MENTOL, DAN METIL SALISILAT DALAM OBAT NYERI OTOT
NURTIYAS LUTHFIANI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul Skripsi
Nama NIM
:
Aplikasi Spektrofotometri Inframerah Dekat untuk Kuantifikasi Eugenol, Mentol, dan Matil Salisilat dalam Obat Nyeri Otot : Nurtiyas Luthfiani : G44096004
Disetujui
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr Sri Mulijani, MS NIP 196304011991032001
Rudi Heryanto, MSi NIP 19760428 2005011002
Diketahui Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS NIP 195012271976032002
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya yang berlimpah sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Februari sampai Agustus 2011 bertempat di Laboratorium PT Taisho Pharmaceutical Indonesia, Tbk Depok. Penulis mengucapkan terima kasih kepada yang terhormat Ibu Dr Sri Mulijani, MS selaku pembimbing pertama dan Bapak Rudi Heryanto, MSi selaku pembimbing kedua atas petunjuk dan bimbingan yang telah diberikan kepada penulis selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terima kasih kepada seluruh staf Departemen Quality Operation PT Taisho Pharmaceutical Indonesia, Tbk dan PT Haes Brother. Ungkapan terima kasih kepada seluruh keluarga atas dukungan dan kasih sayangnya. Ucapan terima kasih kepada mahasiswa Ekstensi Kimia IPB yang telah memberikan semangat, motivasi, dan dorongan dalam menyusun karya ilmiah ini. Semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi penulis maupun bagi pembaca.
Bogor, Februari 2012
Nurtiyas Luthfiani
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tegal pada tanggal 9 Agustus 1986 dari Ayah Ahmad Subekhi dan Ibu Nurjanah. Penulis merupakan putri ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2004 penulis lulus dari SMAN 1 Slawi dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi D3 Analisis Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Tahun 2009 penulis kembali lulus seleksi masuk IPB untuk Program Ekstensi Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah aktif dalam Ikatan Mahasiswa Kimia (Imasika) IPB pada tahun 2005/2006. Selain itu, penulis bekerja di PT Taisho Pharmaceutical Indonesia, Tbk sebagai Quality Control Compliance dari tahun 2008 sampai sekarang.
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ..................................................................................................................... vii DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................... vii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................................... vii PENDAHULUAN....................................................................................................................... 1 METODE Bahan dan Alat .................................................................................................................. 2 Lingkup Kerja ................................................................................................................... 2 HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Kesesuaian Alat ......................................................................................................... 3 Pembuatan Model Kalibrasi Eugenol, Mentol, dan Metil Salisilat ................... 4 Uji Prediksi ........................................................................................................................ 6 Penentuan Standar Galat Laboratorium ..................................................................... 7 Uji Validasi ........................................................................................................................ 7 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ............................................................................................................................. 8 Saran .................................................................................................................................... 9 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................ 9 LAMPIRAN ................................................................................................................................ 10
vi
DAFTAR TABEL Halaman 1 2 3 4
Data kalibrasi campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat ............................. 5 Uji prediksi terhadap model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat ........ 7 Nilai SEL dan spesifikasinya .............................................................................. 7 Uji parameter validasi ......................................................................................... 8
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Spektrum (a) dan gangguan (b) yang dihasilkan pada uji kesesuaian alat menggunakan NIRS FOSS Smart Probe ............................................................ 4 2 Spektrum (a) dan turunan kedua spektrum (b) yang dihasilkan pada uji kesesuaian alat menggunakan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer ................ 4 3 Persamaan matematika pada PLS ....................................................................... 5
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Bagan alir penelititan ....................................................................................... 11 Data komposisi matriks campuran mentol, eugenol, dan metil salisilat .......... 12 Data penentuan model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat .............. 13 Data dan grafik nilai PRESS eugenol, mentol, dan metil salisilat ................... 15 Data prediksi eugenol, mentol, dan metil salisilat ........................................... 18 Data SEL eugenol, mentol, dan metil salisilat ................................................. 21 Kriteria nilai SEP dan R2 .................................................................................. 21 Data akurasi ...................................................................................................... 21 Data uji presisi.................................................................................................. 22
vii
PENDAHULUAN Proses analisis pengawasan mutu pada industri farmasi mencakup analisis bahan baku dan produk akhir. Teknik analisis kromatografi umumnya digunakan, yaitu kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dan kromatografi gas (GC). Teknik analisis menggunakan HPLC dan GC tergolong mahal, waktu analisisnya lama, dan menghasilkan limbah bahan kimia yang berbahaya bagi lingkungan (Blanco & Alcala 2006). Hal ini menyebabkan perlunya pengembangan suatu teknik analisis pengawasan mutu yang cepat, murah, meminimumkan tingkat galat manusia dan limbah bahan kimia, dengan ketepatan dan ketelitian analisis yang tinggi (Blanco et al. 2000). Spektroskopi inframerah dekat/near infrared spectroscopy (NIRS) merupakan alternatif teknik analisis yang dapat digunakan untuk pengawasan mutu suatu zat atau campuran pada industri farmasi dengan proses analisis yang cepat, sederhana, mudah, tanpa preparasi sampel, tanpa bahan kimia, menghasilkan sedikit limbah, dan takdestruktif (USP Convention 2011). Fenomena interaksi materi dengan gelombang elektromagnetik bersifat spesifik, baik absorpsi maupun emisi. Interaksi tersebut menghasilkan sinyal yang disadap sebagai alat analisis kualitatif dan kuantitatif. Panjang gelombang NIRS terdiri atas 2 wilayah, yaitu panjang gelombang pendek di sekitar 780– 1100 nm dan panjang gelombang panjang di sekitar 1100–2500 nm. Absorpsi yang menonjol terjadi pada wilayah inframerah tengah yang berhubungan dengan efek overtone molekul dan vibrasi kombinasi gugus fungsi -CH, -NH, dan -OH (Luypaert et al. 2007). Sebagian besar senyawa kimia dan biokimia menunjukkan pita serapan yang khas pada wilayah spektrum inframerah dekat sehingga dapat digunakan untuk pengukuran kualitatif dan kuantitatif pada senyawa tersebut (USP Convention 2011). Adanya tumpang-tindih spektrum dan sensitivitas yang rendah pada NIRS menyebabkan NIRS tidak dapat digunakan untuk pengukuran secara langsung dan diperlukan teknik regresi multivariat untuk mencapai pengukuran yang selektif. Teknikteknik kalibrasi statistis multivariat yang dapat digunakan untuk pengukuran antara lain regresi linear ganda (MLR), analisis komponen utama (PCA), dan kuadrat terkecil parsial (PLS) (Rajalahti & Kvalheim 2011).
Salah satu analisis spektrum yang penting adalah membentuk model kalibrasi melalui metode pengenalan pola untuk mengidentifikasi kemiripan dan pola utama data. Metode ini menghitung persamaan regresi berdasarkan data spektrofotometri dan informasi analit yang diketahui. Selanjutnya, model ini dapat digunakan untuk memprediksikan konsentrasi sampel yang tidak diketahui. Selisih antara konsentrasi yang dibuat dan konsentrasi dugaan dari model dipakai sebagai parameter kebaikan model (Saragih 2007). Parameter kebaikan model kalibrasi tersebut meliputi R2 (koefisien determinasi), prediksi jumlah-kuadrat galat sisa (PRESS), galat baku kalibrasi (SEC), galat baku prediksi (SEP), dan simpangan nisbah kinerja (RPD). Koefisien determinasi/R2 adalah nilai kelinearan antara prediktor dan respons. Nilai R2 yang sangat baik adalah 0.9975 sampai 1.000. Nilai PRESS adalah ukuran kebaikan model dalam mencocokkan konsentrasi yang diperoleh dari model dengan konsentrasi yang dibuat. Nilai SEC dihasilkan dari rataan kuadrat selisih konsentrasi dugaan himpunan kalibrasi, sedangkan SEP dihasilkan dari rataan kuadrat selisih konsentrasi dugaan himpunan prediksi. Nilai PRESS, SEC, dan SEP yang semakin mendekati nol menunjukkan model yang semakin baik. Kisaran/SEP merupakan nilai kisaran konsentrasi dibandingkan dengan nilai SEP. Nilai yang baik adalah lebih dari 5. RPD adalah nisbah standar deviasi metode pembanding terhadap nilai SEP. Nilai RPD yang baik adalah lebih dari 10 (EMEA 2009). Aplikasi NIRS dalam industri farmasi ialah untuk identifikasi bahan aktif dan bahan tambahan pada obat, mengukur kadar air, mengukur kadar bahan aktif dan bahan tambahan, serta mengukur keseragaman kandungan suatu zat pada obat (Luypaert et al. 2007). Campuran mentol, eugenol, dan metil salisilat yang terkandung pada obat nyeri otot yang diteliti pada penelitian ini merupakan senyawa organik yang dapat dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif menggunakan NIRS. Penelitian ini bertujuan menentukan model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat dalam obat nyeri otot berdasarkan NIRS. Uji prediksi dan validasi selanjutnya dilakukan untuk membuktikan kebaikan dari model kalibrasi yang diperoleh. Hasil pengukuran NIRS juga dibandingkan dengan hasil pengukuran metode pembandingnya, yaitu GC
METODE Bahan dan Alat Alat-alat yang digunakan pada percobaan adalah NIRS FOSS Rapid Content Analyzer, NIRS FOSS Smart Probe, wadah sampel yang berupa reflectance sample vessel, reflektor yang terbuat dari emas (gold reflector), GC Shimadzu 2010, neraca analitik, pipet volumetrik 1 mL, pipet volumetrik 20 mL, labu ukur 50 mL, labu ukur 100 mL, dan corong pemisah. Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan adalah matriks campuran mentol, eugenol, dan metil salisilat sebanyak 27 matriks, standar pembanding mentol, eugenol, dan metil salisilat USP, ometoksimetilbenzoat, kloroform, natrium sulfat, dan asam sulfat. Lingkup Kerja Penelitian terdiri atas beberapa tahap (Lampiran 1). Tahap pertama adalah pembuatan campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat sebanyak 27 sampel. Tahap kedua adalah uji kesesuaian alat dengan menggunakan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer dan NIRS FOSS Smart Probe. Tahap ketiga adalah analisis 27 matriks dengan NIRS dan GC. Tahap keempat adalah pembuatan model kalibrasi dengan metode PLS, tahap kelima adalah prediksi terhadap model kalibrasi dengan menggunakan sampel produksi sebanyak 100, tahap keenam adalah menentukan standar galat laboratorium (SEL), dan tahap ketujuh adalah uji parameter validasi sesuai dengan parameter validasi untuk pengukuran kandungan senyawa pada obat berdasarkan USP Convention (2011). Pembuatan Matriks Campuran Mentol, Eugenol, dan Metil Salisilat Campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat yang digunakan untuk pembuatan model kalibrasi dibuat di laboratorium dengan kisaran sebesar 70–120% dari kadar mentol, eugenol, dan metil salisilat dalam campuran (USP Convention 2011). Komposisi untuk masing-masing zat tersaji pada Lampiran 2. Uji Kesesuaian Alat (FOSS 2009) Matriks nomor 2 dan 3 yang telah dibuat diukur dengan menggunakan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer dengan cara sampel dimasukkan ke dalam wadah sampel yang berupa reflectance sample vessel, dipadatkan, kemudian ditekan dengan gold reflector
sampai tidak ada gelembung, dan diukur. Selain itu, matriks untuk nomor 1–5 diukur dengan menggunakan NIRS FOSS Smart Probe dengan cara probe dimasukkan ke dalam sampel, kemudian sampel diukur. Spektrum yang dihasilkan oleh masingmasing alat dibandingkan. Pengukuran Matriks dan Sampel Produksi dengan NIRS untuk Pembuatan Model Kalibrasi Sebanyak 27 matriks dan sampel produksi dianalisis dengan menggunakan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer. Matriks diukur seperti dijelaskan pada Uji Kesesuaian Alat. Pengukuran Matriks dan Sampel Produksi dengan Metode Pembanding (GC) untuk Pembuatan Model Kalibrasi Standar internal disiapkan dengan cara melarutkan sebanyak 1 mL ometoksimetilbenzoat dengan kloroform ke dalam labu ukur 50 mL. Larutan kemudian ditera dengan kloroform dan dikocok hingga larut sempurna. Larutan standar disiapkan dengan cara melarutkan sebanyak 33.5 mg eugenol dan 135 mg mentol dengan sekitar 20 mL kloroform, lalu larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL. Larutan kemudian ditera dengan kloroform dan dikocok hingga larut sempurna. Larutan standar kerja disiapkan dengan cara sebanyak 100 mg metil salisilat dilarutkan dengan 20 mL kloroform, lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL. Ke dalamnya ditambahkan 20 mL larutan standar dan 1 mL standar internal, kemudian ditera dengan kloroform dan dikocok hingga larut sempurna. Matriks dan sampel produksi ditimbang sebanyak 0.9–1.10 g, dimasukkan ke dalam corong pisah 125 mL, lalu ditambahkan 15 mL larutan natrium sulfat jenuh dan 5 mL asam sulfat. Larutan kemudian diekstraksi dengan 20 mL kloroform sebanyak 3 kali. Hasil ekstraksi dikumpulkan pada labu ukur 100 mL, ditambahkan 1 mL standar internal, lalu ditera dengan kloroform dan dikocok hingga larut sempurna. Larutan matriks dan sampel produksi serta larutan standar disaring dengan filter 0.45 µm. Hasil saringan ditampung pada vial GC untuk diinjeksikan. Pembuatan Model Kalibrasi (FOSS 2009) Model kalibrasi dibuat menggunakan matriks campuran dan sampel produksi dengan himpunan kalibrasi tersaji pada
Lampiran 3. Model kalibrasi ditentukan menggunakan perangkat lunak Vission dengan teknik PLS menggunakan kurva turunan kedua. Prediksi Hasil Analisis NIRS (FOSS 2009) Untuk memprediksi model kalibrasi, sampel dianalisis menggunakan NIRS dan metode pembandingnya. Analisis menggunakan NIRS dilakukan terhadap 100 sampel produksi yang tidak termasuk dalam himpunan kalibrasi, dengan prosedur seperti dijelaskan pada Uji Kesesuaian Alat. Prediksi dengan metode pembanding GC dilakukan terhadap 100 sampel produksi yang telah dianalisis dengan NIRS tersebut. Penyiapan standar internal, larutan standar, dan larutan standar kerja, serta pengukuran GC dilakukan seperti telah dijelaskan di atas. Penentuan Galat Baku Prediksi Prediksi sampel produksi dengan NIRS dan GC digunakan untuk menentukan nilai SEP dengan rumus sebagai berikut:
SEP
2 n y YV,i v,i i 1 n
Keterangan: SEP = Galat baku prediksi yv = Nilai analisis NIRS YV = Nilai analisis GC n = Jumlah sampel Penentuan Linearitas, Akurasi, Presisi, Spesifisitas, dan Kisaran (Mark et al. 2002) Linearitas, akurasi, dan kisaran ditentukan menggunakan perangkat lunak Vission pada saat pembuatan model kalibrasi. Spesifisitas dilakukan dengan cara mengukur sampel yang komposisinya mirip dengan campuran mentol, eugenol dan metil salisilat, kemudian spesifisitas ditentukan dengan perangkat lunak. Presisi terdiri dari atas 2 macam, yaitu keterulangan dan presisi intermediet. Keterulangan dilakukan dengan cara mengukur sampel konsentrasi 100% sebanyak 13 kali. Presisi intermediet juga dilakukan dengan cara mengukur sampel pada konsentrasi 100% sebanyak 13 kali, tetapi pengukuran dilakukan pada hari yang berbeda dengan analis yang berbeda. Analisis dengan Metode Pembanding (BMS 1997) Untuk memperoleh nilai SEL, matriks nomor 1, 2, 6, 15, 20, 27 (Lampiran 2)
dianalisis oleh 2 analis dengan menggunakan instrumen GC yang sama. Penyiapan standar internal, larutan standar, dan larutan standar kerja, serta pengukuran GC dilakukan seperti telah dijelaskan diatas. Hasil yang diperoleh dari pengukuran dengan GC digunakan untuk menghitung nilai SEL dengan rumus sebagai berikut: 2 n y y 2 ,i i 1 1,i SEL n Keterangan: SEL = Galat baku laboratorium y1/2 = Nilai pengukuran metode pembanding pada kondisi yang berbeda n = Jumlah sampel
HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Kesesuaian Alat Tahapan penggunaan NIRS sebagai alat analisis ialah uji kesesuaian alat/feasibility study, pembuatan model kalibrasi, uji prediksi, dan uji validasi (FOSS 2009). Uji kesesuaian alat pada NIRS mencakup pengecekan gangguan secara visual pada spektrum yang dihasilkan (EMEA 2009). Uji ini dilakukan dengan cara menganalisis matriks campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat pada 2 model alat NIRS, yaitu NIRS FOSS Smart Probe dan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer, kemudian melihat gangguan yang dihasilkan pada 2 model alat tersebut (FOSS 2009). Analisis dengan NIRS FOSS Smart Probe dilakukan dengan cara memasukkan probe ke dalam sampel dan menghasilkan spektrum pada Gambar 1. Spektrum ini merupakan hasil pengukuran untuk matriks nomor 1 sampai dengan 5. Gambar 1(a) menunjukkan adanya gangguan pada spektrum yang dihasilkan (ditunjukkan dalam kotak). Gangguan tersebut menyebabkan alat ini tidak dapat digunakan untuk menganalisis campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat pada obat penghilang nyeri otot. Gambar 1(b) memperlihatkan gangguan yang sangat jelas pada spektrum setelah dilakukan perbesaran.
4
5
sedangkan sisanya adalah sampel produksi (Blanco & Alcala 2006). Model kalibrasi dibuat dengan perangkat lunak Vission menggunakan teknik kalibrasi multivariat PLS (Broad et al. 2002; Luypaert et al. 2007). Pembuatan kalibrasi ini diawali dengan pemrosesan awal spektrum untuk menghilangkan pengaruh kuat dari hamburan spektrum dan untuk meminimumkan baseline offsets. Spektrum yang digunakan adalah turunan kedua/2nd derivative (Broad et al. 2002; Blanco & Alcala 2006). PLS dapat memprediksikan serangkaian peubah takbebas dari peubah bebas yang jumlahnya sangat banyak, memiliki struktur sistematik linear dan nonlinear dengan atau tanpa data yang hilang, serta memiliki kolinearitas yang tinggi. PLS dapat memprediksi sampel yang tidak diketahui dengan ketepatan lebih baik dibandingkan dengan teknik kalibrasi multivariat lainnya (Hopke 2003). Gambar 3 menunjukkan persamaan yang digunakan dalam PLS. A menunjukkan data spektrum, S dan U menunjukkan skor, Fa dan Fc menunjukkan nilai loading, Ea dan Ec merupakan galat, sedangkan C menunjukkan konsentrasi data (FOSS 2009). Hasil kali Fa dan S mendekati data spektrum, sedangkan hasil kali U dan Fc mendekati konsentrasi sebenarnya. Tujuan algoritma PLS adalah meminimumkan galat dengan terus menjaga korelasi A dan C dalam hubungan dalam, U = S B (Brereton 2000). A= S.Fa + Ea U= S.B C= U.Fc + Ea C= S.B.U +E
Hubungan luar Hubungan Hubungan dalam dalam
Gambar 3 Persamaan matematika pada PLS. Tabel 1 menunjukkan data kalibrasi campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat. Sampel produksi untuk kalibrasi eugenol lebih banyak daripada sampel untuk kalibrasi mentol dan metil salisilat karena kadar eugenol dalam campuran lebih rendah dibandingkan dengan kadar mentol dan metil salisilat yaitu 1.370%, sedangkan kadar mentol dan metil salisilat berturut-turut 5.430 dan 10.200% (FOSS 2009).
Tabel 1
Data kalibrasi campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat
Parameter kalibrasi Pemrosesan awal pektrum Panjang gelombang (nm)
Jumlah faktor PLS Jumlah Sampel laboratorium Jumlah sampel produksi Rerata (%) SDa SECb SECVc a simpangan baku, validasi silang
Metil salisilat Turunan kedua 400– 2500
Eugenol
Mentol
Turunan kedua 400–300, 1500– 800, 2000 – 2200 9
Turunan kedua 400–500
9
5
27
27
27
40
33
33
1.386 0.174 0.065 0.075 b galat baku
5.191 0.699 0.116 0.154 kalibrasi,
9.562 1.223 0.389 0.426 c galat baku
Panjang gelombang yang digunakan pada penentuan model kalibrasi eugenol adalah 400–1300, 1500–1800, dan 2000–2200 nm dengan menggunakan faktor 9. Penentuan nilai faktor merupakan hal yang sangat krusial agar diperoleh model kalibrasi yang tepat. Nilai faktor ini ditentukan berdasarkan nilai minimum dari PRESS yang menunjukkan prediksi jumlah kuadrat galat sisa yang terkecil (FOSS 2009; Septaningsih 2008). Nilai PRESS terkecil pada model kalibrasi eugenol diperoleh pada faktor 9, yaitu sebesar 0.8584 (Lampiran 4). Semakin besar nilai faktor, nilai R2 akan semakin tinggi, tetapi menurut FOSS (2009) nilai maksimum faktor yang boleh digunakan pada proses kalibrasi menggunakan perangkat lunak Vission adalah 10. Nilai faktor yang terlalu besar akan menyebabkan overfits pada model kalibrasi, sedangkan nilai yang terlalu kecil akan menyebabkan underfits (EMEA 2009). Parameter kalibrasi lainnya seperti SEC menunjukkan nilai yang baik karena mendekati nol, yaitu sebesar 0.065. Nilai SEC sebesar 0.065 maknanya ialah selisih antara nilai analisis NIRS dan nilai metode pembandingnya pada eugenol saat penentuan model kalibrasi sebesar 0.065. SEC diperoleh menggunakan rumus sebagai berikut: SEC
2 n y YC,i C,i i 1 n p
Keterangan: YC = Nilai analisis NIRS pada set kalibrasi yC = Nilai analisis GC pada set kalibrasi n = jumlah sampel p = faktor kalibrasi
6
Nilai SECV yang diperoleh untuk eugenol sebesar 0.075. SECV adalah galat baku yang terjadi pada saat validasi silang (USP Convention 2011). Nilai ini juga sangat baik karena mendekati nol. Nilai SECV diperoleh dengan menggunakan rumus sebagai berikut: SECV
2 n y YCV,i CV,i i 1 n p
Keterangan: YCV = Nilai analisis NIRS yCV = Nilai analisis GC n = Jumlah sampel Rerata yang diperoleh pada kalibrasi eugenol sebesar 1.386%, dengan simpangan baku (SD) sebesar 0.174. Berbeda dengan eugenol, panjang gelombang yang digunakan mentol adalah 400–2500 nm. Jumlah faktor yang digunakan ialah 9 karena nilai minimum log PRESS sebesar 1.8709 menunjukkan faktor 9. Himpunan sampel yang digunakan pada kalibrasi mentol menggunakan 27 matriks laboratorium dan 33 sampel produksi. Nilai rerata yang diperoleh sebesar 5.191% dengan SD sebesar 0.699. Nilai SEC juga baik karena nilainya yang mendekati nol, yaitu sebesar 0.116, tetapi belum sebaik nilai SEC eugenol. Sama halnya dengan nilai SEC, nilai SECV mentol yang diperoleh sebesar 0.154, kurang baik jika dibandingkan dengan nilai SECV eugenol. Hal ini disebabkan pengukuran mentol menggunakan seluruh panjang gelombang dari 400 sampai 2500 nm, sehingga terdapat lebih banyak matriks pengganggu dalam pembuatan model kalibrasi. Panjang gelombang yang digunakan untuk pembuatan model kalibrasi metil salisilat sama dengan mentol, yaitu 400– 2500 nm (FOSS 2009). Jumlah faktor yang digunakan ialah 5 karena nilai minimum log PRESS sebesar 13.597 menunjukkan faktor 5. Himpunan sampel yang digunakan ialah 27 matriks laboratorium dan 33 sampel produksi. Nilai rerata yang diperoleh sebesar 9.562% dengan SD sebesar 1.233. Nilai SEC yang diperoleh 0.389, sedangkan nilai SECV 0.426. Nilai parameter uji yang diperoleh pada model kalibrasi metil salisilat ini kurang baik dibandingkan dengan eugenol dan mentol karena pada metil salisilat, selain terdapat matriks pengganggu, digunakan semua kisaran panjang gelombang dari 400 sampai 2500 nm, faktor yang dipakai juga terlalu kecil, yaitu 5, sehingga kemungkinan terjadi
underfits pada spektrum yang digunakan untuk pembuatan model kalibrasi. Uji Prediksi Model kalibrasi yang telah diperoleh perlu diuji prediksi untuk membuktikan kebaikannya. Menurut Blanco & Alcala (2006), uji prediksi dilakukan menggunakan 2 himpunan sampel, yaitu sampel produksi dan laboratorium, yang tidak digunakan untuk proses kalibrasi. Uji prediksi pada penelitian ini dilakukan hanya dengan menggunakan sampel produksi sebanyak 100 batch karena model kalibrasi akan digunakan untuk analisis sampel produksi saja. Proses prediksi akan menghasilkan nilai SEP, yang merupakan ukuran ketepatan dari suatu model kalibrasi yang dibuat (USP Convention 2011). Nilai SEP semakin baik jika semakin mendekati nol (Septaningsih 2008). Selain nilai SEP, pada proses prediksi dapat diketahui nilai rerata galat pengukuran analisis NIRS dan GC yang disebut bias (EMEA 2009). Nilai bias dapat ditentukan dengan rumus sebagai berikut: Bias
in 1 (y Y ) i i n
Keterangan: Y = Nilai analisis NIRS y = Nilai analisis GC n = Jumlah sampel Terlihat pada Tabel 2, prediksi yang dilakukan terhadap model kalibrasi eugenol menghasilkan rerata kadar sebesar 1.425% dengan nilai SD 0.018 dan nilai RSD 1.263%. Nilai rerata yang diperoleh sesuai dengan spesifikasi kadar eugenol, yaitu 1.230–1.580% (BMS 1997). Nilai SD tergolong baik karena nilainya mendekati nol. Begitu juga dengan nilai RSD yang menunjukkan nilai kurang dari 2% (TPI 2010). Nilai SEP yang diperoleh 0.019 (Lampiran 5). Menurut Septaningsih (2008), nilai ini sangat baik karena mendekati nol, tetapi karena nilai SEL-nya 0.012 (Lampiran 6), nilai SEP ini lebih dari 1.4 × SEL. Menurut spesifikasi EMEA (2009), nilai SEP yang baik adalah kurang dari 1.4 × SEL. Menurut Cuadrado et al, (2004), nilai SEP eugenol yang diperoleh menunjukkan presisi yang baik karena nilai SEP yang dihasilkan 1.6 × nilai SEL nya (Lampiran 7).
7
Tabel 2 Uji prediksi terhadap model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat Parameter Eugenol Mentol kalibrasi Jumlah sampel laboratorium Jumlah sampel 100 100 produksi Rerata (%) 1.425 5.384 SDa 0.018 0.085 RSD (%)b 1.263 1.579 Bias 0.001 0.034 SEP 0.019 0.090 a simpangan baku, bsimpangan baku relatif
Metil salisilat 100 10.085 0.137 1.358 0.035 0.145
Prediksi yang dilakukan terhadap model kalibrasi mentol menghasilkan rerata kadar sebesar 5.384% dengan nilai SD 0.085 dan nilai RSD 1.579%. Nilai rerata yang diperoleh sesuai dengan spesifikasi kadar mentol, yaitu 4.89–6.24% (BMS 1997). Nilai SD lebih besar dibandingkan dengan eugenol, begitu juga dengan nilai RSD. Meskipun nilai RSD eugenol lebih baik dibandingkan dengan mentol, nilai ini masih sesuai dengan spesifikasi karena kurang dari 2% (TPI 2010). Nilai SEP yang diperoleh 0.090 (Lampiran 5). Menurut Septaningsih (2008), nilai ini juga sangat baik karena mendekati nol, tetapi karena nilai SEL-nya 0.069 (Lampiran 6), nilai SEP ini lebih dari 1.4×SEL. Menurut spesifikasi EMEA (2009), nilai SEP yang baik adalah kurang dari 1.4×SEL. Menurut Cuadrado et al. (2004), nilai SEP yang diperoleh menunjukkan presisi yang baik karena besarnya 3 × nilai SEL-nya (Lampiran 7). Secara keseluruhan, hasil uji parameter prediksi pada mentol kurang baik dibandingkan dengan uji prediksi eugenol. Hal ini disebabkan penggunaan semua kisaran panjang gelombang dari 400 sampai 2500 nm, sehingga terdapat lebih banyak matriks pengganggu. Prediksi yang dilakukan terhadap model kalibrasi metil salisilat menghasilkan rerata kadar sebesar 10.085% dengan nilai SD 0.137 dan nilai RSD 1.358%. Nilai rerata yang diperoleh sesuai dengan spesifikasi kadar metil salisilat, yaitu 9.18–11.7% (BMS 1997). Nilai SD tergolong baik karena mendekati nol. Begitu juga dengan nilai RSD yang kurang dari 2% (TPI 2010). Nilai SD yang dihasilkan pada uji prediksi metil salisilat ini lebih besar dibandingkan pada uji prediksi eugenol dan mentol. Demikian pula dengan nilai SEP yang diperoleh, yaitu 0.145 (Lampiran 5). Menurut Septaningsih (2008), nilai SEP ini sangat baik karena mendekati nol, tetapi karena nilai SELnya 0.030 (Lampiran 6), nilai SEP ini belum memenuhi spesifikasi EMEA (2009), yakni
harus kurang dari 1.4×SEL. Menurut Cuadrado et al. (2004), nilai SEP yang diperoleh menunjukkan presisi menengah karena besarnya 2.1 × nilai SEL (Lampiran 7). Secara keseluruhan, uji parameter prediksi pada metil salisilat menunjukkan nilai yang kurang baik dibandingkan dengan nilai uji prediksi eugenol dan mentol, kecuali untuk nilai RSD. Nilai RSD metil salisilat lebih kecil daripada nilai RSD mentol. Nilai SEP dari suatu model kalibrasi yang mendekati nol dapat diartikan sebagai kedekatan antara hasil analisis NIRS dan analisis GC. Berdasarkan nilai SEP yang diperoleh untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat, nilai analisis NIRS sangat dekat dengan nilai analisis GC. Penentuan Standar Galat Laboratorium Kebaikan nilai SEP ditentukan dengan membandingkannya dengan nilai SEL. SEL ditentukan dengan menganalisis sampel dalam 2 variasi pengukuran yang berbeda (Cuadrado et al. 2004). Variasi pengukuran dapat menggunakan analis yang berbeda, instrumen analisis yang berbeda, dan waktu analisis yang berbeda (FOSS 2009). Pengukuran SEL pada campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat dalam penelitian ini menggunakan variasi analis. Tabel 3 menunjukkan nilai SEL untuk masing-masing zat aktif beserta spesifikasinya menurut EMEA (2009), yaitu 1.4 kali nilai SEL zat aktif tersebut. Terlihat bahwa nilai SEL eugenol paling kecil dibandingkan dengan lainnya. Hal ini menunjukkan tingkat galat laboratorium untuk eugenol sangat rendah. Tabel 3 Nilai SEL dan spesifikasi-nya Zat aktif Eugenol Mentol Metil salisilat Sumber: EMEA (2009)
SEL 0.012 0.069 0.030
Spesifikasi 0.017 0.097 0.042
Uji Validasi Uji validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud tertentu terpenuhi. Selain uji prediksi, uji validasi juga dilakukan untuk membuktikan kebaikan dari model kalibrasi Hasil uji validasi eugenol, mentol, dan metil salisilat tertera pada Tabel 4.
Tabel 4 Uji parameter validasi Parameter
Eugenol
Linearitas dan kisaran R2 0.858 Kisaran (%) 67-119 Akurasi SEP 0.019 SEL 0.012 1.4×SEL 0.017 Kisaran/SEP 39.421 RPD 9.157 Presisi Keterulangan Rerata 1.412 SD 0.008 RSD 0.567 Presisi Intermediet F hitung 0.979 F tabel 2.687 Spesifisitas Sampel 1 0.696 Sampel 2 0.700 Sampel 3 0.732 Sampel 4 0.669 Sampel 5 0.691 Sampel 6 0.999 Sampel 7 0.998 Sampel 8 0.998 Sampel 9 0.998 Sampel 10 0.998
Mentol
Metil salisilat
0.973 60-110
0.891 69-120
0.090 0.030 0.042 30.222 7.768
0.145 0.069 0.097 36.386 8.435
5.444 0.037 0.680
10.233 0.030 0.293
0.686 2.687
0.497 2.687
0.696 0.700 0.732 0.669 0.691 0.999 0.998 0.998 0.998 0.998
0.696 0.700 0.732 0.669 0.691 0.999 0.998 0.998 0.998 0.998
Tabel 4 menunjukkan nilai regresi untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat berturutturut sebesar 0.858, 0.973, dan 0.891. Nilai regresi mentol paling baik karena paling mendekati satu, sehingga paling menunjukkan kedekatan antara nilai analisis NIRS dan GC. Nilai kisaran untuk ketiga zat aktif menunjukkan, hanya kisaran metil salisilat memenuhi spesifikasi 70–120%; ±2% (BMS 1997). Mentol dan eugenol tidak memenuhi spesifikasi untuk kisaran, diduga karena pada saat proses pengukuran sebagian zat atsiri tersebut menguap (USP Convention 2011). Uji akurasi ditunjukkan dengan nilai SEP dan merupakan kedekatan nilai analisis yang diperoleh dengan nilai sebenarnya (ICH 1996; USP Convention 2011). Menurut EMEA (2009), kriteria penerimaan nilai SEP sebesar 1.4×SEL. Nilai SEP yang diperoleh tidak masuk dalam kriteria tersebut, tetapi dapat dijustifikasi dengan nilai nisbah kisaran terhadap SEP serta nilai RPD (Lampiran 8). Nisbah kisaran terhadap SEP harus lebih besar dari 10 (EMEA 2009), dan hasil penelitian untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat seluruhnya memenuhi kriteria. RPD merupakan nisbah SD metode pembanding terhadap nilai SEP. Menurut EMEA (2009), kriteria penerimaan nilai RPD harus lebih besar dari 5. Nilai RPD untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat juga memenuhi kriteria tersebut.
Uji presisi terdiri atas uji keterulangan dan presisi intermediet. Uji keterulangan adalah presisi yang dihasilkan pada kondisi pengoperasian yang sama pada waktu yang pendek. Sampel dianalisis minimum 6 kali ulangan pada konsentrasi 100%. Uji keterulangan pada penelitian ini dilakukan dengan analisis sampel konsentrasi 100% sebanyak 13 kali ulangan (ICH 1996; USP Convention 2011). Nilai RSD yang diperoleh berturut-turut untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat sebesar 0.567, 0.680, dan 0.293%. Nilai ini memenuhi kriteria penerimaan RSD menurut TPI (2010). Uji presisi intermediet dilakukan dengan cara melakukan analisis NIRS untuk sampel yang sama dengan menggunakan 2 analis yang berbeda (ICH 1996). Terhadap hasil analisis yang diperoleh dilakukan uji statistika, yaitu uji F, dan dilihat perbedaan di antara kedua pengukuran tersebut. Berdasarkan uji statistika yang dilakukan, nilai F hitung lebih kecil daripada F tabel sehingga tidak ada perbedaan yang nyata di antara 2 pengukuran yang dilakukan oleh 2 analis (Lampiran 9). Spesifisitas adalah kemampuan suatu metode analitik untuk mengukur analit tanpa adanya gangguan dari komponen lainnya (ICH 1996; USP Convention 2011). Uji spesifisitas dilakukan dengan pengukuran sampel yang komposisinya mirip, tetapi berbeda zat aktifnya, yaitu sampel nomor 1–5 dan 6–10 (Lampiran 2). Spesifikasi untuk sampel yang diuji menunjukkan nilai identifikasi (ID) lebih dari 0.900, sedangkan untuk sampel yang komposisinya sama, tetapi berbeda zat aktifnya menunjukkan ID kurang dari 0.900 (FOSS 2009). Uji spesifisitas yang dilakukan pada penelitian telah menunjukkan komponen pada matriks adalah eugenol, mentol, dan metil salisilat, dengan ditunjukkan nilai ID lebih dari 0.900.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Pengukuran kandungan eugenol, mentol, dan metil salisilat dalam obat nyeri otot dapat dilakukan menggunakan NIRS FOSS Rapid Content Analyzer dengan teknik kalibrasi multivariat PLS menggunakan kurva turunan kedua. Nilai SEP yang diperoleh untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat berturutturut sebesar 0.019 (1.6×SEL), 0.09 (3×SEL), dan 0.145 (2.1×SEL). Nilai SEP yang lebih besar dari 1.4×SEL untuk eugenol, mentol, dan metil salisilat menunjukkan bahwa nilai
analisis NIRS sangat dekat dengan nilai analisis GC. Uji validasi campuran eugenol, mentol, dan metil salisilat menghasilkan linearitas masing-masing sebesar 0.858, 0.973, dan 0.891. Nilai kisaran (%) menunjukkan nilai sebesar 67–119 untuk eugenol, 60–110 untuk mentol, 69–120 untuk metil salisilat. Uji keterulangan untuk ketiga zat aktif menghasilkan nilai RSD kurang dari 2%, yaitu 0.567% untuk eugenol, 0.680% untuk mentol, dan 0.293% untuk metil salisilat. Uji presisi intermediet dengan uji F menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata, dan uji spesifisitas menunjukkan nilai ID lebih besar dari 0.900. Saran Penelitian lebih lanjut dibutuhkan untuk menyempurnakan model kalibrasi, proses prediksi NIRS, dan proses pembandingan dengan metode pembandingnya agar diperoleh nilai linearitas yang sangat baik, yaitu antara 0.9975 dan 1.0000, nilai bias yang mendekati nol, dan nilai SEP sekitar 1– 1.5 kali nilai SEL.
DAFTAR PUSTAKA Blanco M, Alcala M. 2006. Simultaneous quantitation of five active principles in a pharmaceutical preparation: Development and validation of a near infrared spectroscopic method. Eur J Pharmaceut Sci 27: 280-286. Blanco M, Eustaquio A, Gonzales JM, Serrano D. 2000. Identification and quantitation assays for intact tablets of two related pharmaceutical preparations by reflectance near-infrared spectroscopy: Validation of the procedure. J Pharm Biomed Anal 22:13-48. BMS [Bristol Myers Squibb]. 1997. Assay for Methyl Salicylate, Eugenol, dan Menthol (GC). 1997. Jakarta: BMS. Brereton RG. 2000. Introducing to multivariate calibration in analytical chemistry. Analyst 126:2125-2154. Broad NW, Jee RD, Moffat AC, Smith MR. 2001. Application of transmission nearinfrared spectroscopy to uniformity of content testing of intact steroid tablets. Analyst 126: 2207-2211. Buchi. 2011. How NIR Can Help GMP? Jakarta: Buchi Indonesia. Cuadrado MU, Luque de Castro MD, PerezJuan PM, Garcia-Olmo J, Gomez-Nieto MA. 2004. Near infrared reflectance spectroscopy and multivariate analysis in
enology, determination or screening of fifteen parameters in different types of wines. Anal Chim Acta 527:81-88. [EMEA] European Medicines Agency. 2009. Guideline on The Use of Near Infrared Spectroscopy by The Pharmaceutical Industry and The Data Requirements for New Submissions and Variations. London: EMEA. FOSS. 2009. A Guide to Near-infrared Spectroscopic Analysis of Industrial Manufacturing Processes. Jakarta: FOSS Indonesia. Hopke Pk. 2003. The evolution of chemometrics. Anal Chim Acta 500:365377. [ICH] International Conference on Harmonisation. 1996. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2 (R1). Jenewa: ICH. Luypaert J, Massart DL, Heyden YV. Nearinfrared spectroscopy applications in pharmaceutical analysis. Talanta 72:865883. Mark H, Ritchie GE, Roller RW, Ciurczak EW, Tso C, MacDonald SA. 2002. Validation of a near-infrared transmission spectroscopic procedure, part A: Validation protocols. J Pharm Biomed Anal 28:251-260. Rajalahti T, Kvalheim OM. 2011. Multivariate data analysis in pharmaceutics: A tutorial review. Int J Pharm 417:280-90. Reich G. 2005. Near-infrared spectroscopy and imaging: Basic principles and pharmaceutical applications. Adv Drug Delivery Rev 57:1109-1143. Saragih MA. 2007. Metode analisis simultan natrium benzoat dan kalium sorbat menggunakan kombinasi spektrofotometri dan kalibrasi multivariat [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Septaningsih DA. 2008. Penentuan simultan natrium benzoat dan kalium sorbat dengan pendekatan kalibrasi multivariat secara spektrofotometri UV [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. TPI [Taisho Pharmaceutical Indonesia]. 2010. Validasi Metode Analisa. Jakarta: TPI. [USP Convention] United States Pharmacopeia Convention. 2011. United States Pharmacopeia 34-National Formulary 29. Rockville: USP.
LAMPIRAN
11
Lampiran 1 Bagan alir penelititan
Analisis NIRS
Preparasi matriks dan sampel produksi
Pembuatan model kalibrasi
Sampel Produksi Prediksi model kalibrasi
Uji parameter validasi USP
Analisis GC
12
Lampiran 2 Data komposisi matriks campuran mentol, eugenol, dan metil salisilat Nomor Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Mentol (%) 70 70 70 80 80 80 80 80 90 90 90 100 100 100 100 100 100 100 100 110 110 110 120 120 120 120 120
Keterangan: Kadar mentol Kadar eugenol Kadar metil salisilat
: 5435 mg/100g : 1365 mg/100g : 10200 mg/100g
Eugenol (%) 70 90 110 100 100 110 110 110 70 100 120 80 80 100 100 100 120 120 120 80 90 90 70 70 80 100 120
Metil salisilat (%) 70 110 120 100 120 70 90 100 120 80 100 100 120 80 100 120 80 100 110 90 70 100 90 100 110 100 120
13
Lampiran 3 Data penentuan model kalibrasi eugenol, mentol, dan metil salisilat Nomor Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 1A1561 1A0761 1A1801 1A0201 1A0511 1A0811 1A1811 1A0031 1A0641 1A0741 1A0771 1A0011 1A0681 1A0691 1A1631 1A0331 1A0661 1A0711 1A0721 1A0751 1C3471 1C3831 1C3811
Peubah bebas (Spektrum NIRS) λ1
λ2
λ3
…..
λn
……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….
……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….
……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….
……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….
……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….
Peubah takbebas (Respons) Metil Eugenol Mentol salisilat 0.9700 3.7720 6.9160 1.2840 3.8470 10.6090 1.5730 3.8900 11.5590 1.4150 4.3570 9.7590 1.4420 4.3700 11.6100 1.4630 4.0510 6.3630 1.4930 4.1190 8.0750 1.5030 4.1040 8.8590 1.3220 4.2440 6.7700 0.9800 4.4440 9.6360 1.6220 4.4300 8.4470 1.1240 5.0180 8.6780 1.0880 4.7760 9.8180 1.3810 4.9940 7.0870 1.3450 4.8210 8.4450 1.3730 5.0820 10.6460 1.6530 5.3050 7.7780 1.6960 5.3740 9.7810 1.6910 5.4370 10.8210 1.1610 5.9100 8.9360 1.2710 5.9030 7.1610 1.2760 5.8770 9.7020 1.0360 6.3610 8.8140 1.0280 6.4140 9.5780 1.1540 6.4570 10.7370 1.4160 6.4070 9.7080 1.7150 6.4670 11.6010 1.4300 5.3300 9.9100 1.4500 5.4700 10.0500 1.4200 5.3100 9.9600 1.4200 5.3600 10.1800 1.4700 5.4600 10.1800 1.4300 5.4000 10.2800 1.4400 5.3700 10.1300 1.4500 5.3700 10.0800 1.4700 5.4900 10.2600 1.3900 5.2700 9.9800 1.4400 5.4700 10.0300 1.4300 5.3500 10.0300 1.4100 5.3500 10.1400 1.4200 5.3200 9.9300 1.4300 5.3500 10.0000 1.4300 5.3600 10.0500 1.4300 5.3000 9.9900 1.3900 5.2900 10.0800 1.4200 5.4200 9.9400 1.4100 5.3300 9.7400 1.4200 5.3400 9.9200 1.4300 5.4400 10.0600 1.4100 5.4000 10.1300
14
lanjutan Lampiran 3 Nomor Sampel 1C3801 1C4261 1C4111 1C4121 1C3791 1C3781 1C4031 1C3761 1C3881 1C3841 0J9721 1A1551 1A0781 1A1121 1A1771 1A1581 1A1201 1A1571
Peubah bebas (Spektrum NIRS) λ1
λ2
λ3
…..
λn
……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….
……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….
……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….
……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….
……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. ……. …….
Peubah takbebas (Respons) Metil Eugenol Mentol salisilat 1.4100 5.4500 10.2300 1.4400 5.4800 10.0800 1.4200 5.3100 10.0000 1.4300 5.3300 10.0400 1.4300 5.4400 10.2300 1.4200 5.3400 10.0700 1.4100 5.4100 10.0700 1.4200 5.4000 10.0100 1.4200 5.3200 10.0400 1.4100 5.4500 10.1400 1.4800 5.3600 9.9100 1.4400 5.4400 10.2100 1.4300 5.4800 10.0300 1.4400 5.3700 10.2200 1.4300 5.4200 10.1700 1.4200 5.3200 9.9000 1.4100 5.3700 10.0400 1.4400 5.3900 10.1300
15
Lampiran 4 Data dan grafik nilai PRESS eugenol, mentol, dan metil salisilat 1. Data nilai PRESS eugenol Faktor Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3 Faktor 4 Faktor 5 Faktor 6 Faktor 7 Faktor 8 Faktor 9 Faktor 10 Faktor 11 Faktor 12 Faktor 13 Faktor 14 Faktor 15
R2 0.143 0.3219 0.4702 0.6157 0.6842 0.7841 0.8358 0.8512 0.8584 0.8651 0.8821 0.8912 0.908 0.9191 0.9301
SEC 0.1516 0.1357 0.1206 0.1034 0.0943 0.0785 0.0689 0.066 0.0648 0.0636 0.0599 0.058 0.0537 0.0507 0.0474
PRESS 2.2058 2.0542 1.4236 1.1414 1.0944 0.746 0.5803 0.4895 0.4822 0.5273 0.6074 0.6218 0.6728 0.6642 0.7255
SECV 0.1602 0.1546 0.1287 0.1152 0.1128 0.0931 0.0821 0.0754 0.0749 0.0783 0.084 0.085 0.0884 0.0879 0.0919
Faktor 16
0.9408
0.044
0.7645
0.0943
2. Grafik nilai PRESS eugenol
16
lanjutan Lampiran 4 3. Data nilai PRESS mentol Faktor Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3 Faktor 4 Faktor 5 Faktor 6 Faktor 7 Faktor 8 Faktor 9 Faktor 10 Faktor 11 Faktor 12 Faktor 13 Faktor 14 Faktor 15
R2 0.5388 0.6154 0.8839 0.9137 0.9355 0.9559 0.9606 0.9659 0.9732 0.9787 0.9808 0.985 0.9868 0.9893 0.9906
SEC 0.456 0.4192 0.2319 0.2012 0.1751 0.1458 0.1388 0.13 0.1161 0.1044 0.0997 0.0888 0.084 0.0763 0.072
PRESS 18.901 16.9265 6.2581 4.6088 4.1203 2.9195 2.2737 2.1832 1.8709 2.0147 2.0327 2.3638 2.49 2.6741 2.878
SECV 0.4891 0.4629 0.2815 0.2415 0.2284 0.1922 0.1697 0.1662 0.1539 0.1597 0.1604 0.173 0.1775 0.184 0.1909
Faktor 16
0.9919
0.0672
3.055
0.1966
4. Grafik nilai PRESS mentol
17
lanjutan Lampiran 4 5. Data nilai PRESS metil salisilat Faktor Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3 Faktor 4 Faktor 5 Faktor 6 Faktor 7 Faktor 8 Faktor 9 Faktor 10 Faktor 11 Faktor 12 Faktor 13 Faktor 14 Faktor 15 Faktor 16
R2 0.6014 0.831 0.8738 0.8796 0.8913 0.9005 0.9098 0.92 0.9322 0.9394 0.9484 0.9582 0.9638 0.9682 0.972 0.9746
SEC 0.7247 0.4751 0.4134 0.4067 0.3893 0.3751 0.3599 0.3414 0.3167 0.3017 0.2807 0.2545 0.2387 0.2257 0.2136 0.2052
6. Grafik nilai PRESS metil salisilat
PRESS 40.7506 19.3365 15.8261 13.8619 13.5974 13.854 16.3679 16.5219 18.1416 18.8636 19.6363 21.1569 22.4458 21.444 21.9123 24.1636
SECV 0.7371 0.5078 0.4594 0.4299 0.4258 0.4298 0.4672 0.4694 0.4918 0.5015 0.5117 0.5311 0.5471 0.5347 0.5405 0.5676
18
Lampiran 5 Data prediksi eugenol, mentol, dan metil salisilat Nomor
Eugenol
Eugenol
Mentol
Metil salisilat
NIRS
GC
NIRS
GC
NIRS
GC
1
1A1541-1
1.427
1.440
5.366
5.410
9.819
10.020
2
1A0501-1
1.410
1.490
5.397
5.460
9.929
10.200
3
1A1181-1
1.452
1.430
5.460
5.400
10.119
10.080
4
1A0791-1
1.426
1.430
5.394
5.490
10.122
10.040
5
1A0651-1
1.430
1.470
5.423
5.460
10.230
10.220
6
1A1151-1
1.425
1.420
5.459
5.390
10.168
10.080
7
1A1101-1
1.431
1.430
5.473
5.360
10.214
10.200
8
1A1171-1
1.433
1.410
5.472
5.380
10.166
10.060
9
1A1161-1
1.452
1.420
5.414
5.440
10.124
10.160
10
1A0671-1
1.401
1.430
5.348
5.390
10.112
10.200
11
1A1141-1
1.423
1.430
5.423
5.390
10.158
10.260
12
1A1131-1
1.445
1.430
5.447
5.360
10.196
10.210
13
1A1211-1
1.442
1.440
5.439
5.400
10.039
10.280
14
1A0801-1
1.453
1.430
5.408
5.470
10.144
10.020
15
1A1111-1
1.433
1.440
5.461
5.380
10.058
10.250
16
1A1191-1
1.445
1.420
5.466
5.410
10.085
10.080
17
1A1231-1
1.439
1.410
5.383
5.360
10.031
10.030
18
1A1531-1
1.434
1.420
5.514
5.400
10.160
10.080
19
1A0021-1
1.412
1.460
5.282
5.340
9.855
10.140
20
1A1241-1
1.442
1.420
5.403
5.310
9.944
10.060
21
1B2361
1.423
1.440
5.440
5.460
9.684
10.200
22
1B2331
1.430
1.420
5.475
5.450
10.194
10.180
23
1B2351
1.445
1.430
5.317
5.380
10.308
10.060
24
1B2601
1.455
1.410
5.418
5.420
10.165
10.140
25
1B2341
1.438
1.420
5.421
5.400
10.049
10.060
26
1B1961
1.434
1.420
5.416
5.300
9.989
10.090
27
1B2151
1.419
1.410
5.205
5.210
10.203
10.070
28
1B1951
1.435
1.410
5.439
5.320
10.162
10.130
29
1B2281
1.430
1.420
5.471
5.360
10.229
10.080
30
1B2161
1.428
1.420
5.518
5.410
10.160
10.000
31
1A1821
1.407
1.400
5.333
5.250
9.924
9.960
32
1B1881
1.397
1.430
5.346
5.350
10.042
10.140
33
1B1891
1.408
1.410
5.402
5.300
10.155
10.040
34
1B2291
1.422
1.420
5.481
5.410
10.232
10.090
35
1B2131
1.420
1.430
5.453
5.390
10.214
10.110
36
1B2621
1.435
1.420
5.575
5.400
10.228
10.070
37
1B2631
1.423
1.420
5.286
5.450
9.975
10.140
19
lanjutan Lampiran 5 Nomor
Eugenol
Eugenol
Mentol
Metil salisilat
NIRS
GC
NIRS
GC
NIRS
GC
38
1B2371
1.426
1.420
5.508
5.410
10.201
10.130
39
1B2611
1.414
1.410
5.441
5.410
10.099
10.120
40
1B2591
1.395
1.420
5.442
5.340
10.036
9.890
41
1B2621
1.404
1.420
5.424
5.400
9.911
10.070
42
1B2321
1.388
1.410
5.313
5.340
10.179
10.030
43
1B2141
1.435
1.420
5.539
5.390
10.281
10.130
44
1B2381
1.425
1.410
5.394
5.330
10.215
10.020
45
1B2811
1.408
1.430
5.403
5.370
9.894
10.120
46
1B2641
1.427
1.430
5.537
5.570
10.403
10.220
47
1B2841
1.435
1.440
5.549
5.420
10.279
10.270
48
1B2651
1.436
1.420
5.504
5.460
10.179
10.050
49
1B2781
1.412
1.440
5.429
5.320
9.981
10.080
50
1B2771
1.417
1.440
5.369
5.410
10.095
10.130
51
1B2801
1.429
1.420
5.351
5.390
10.036
10.080
52
1B2791
1.460
1.440
5.388
5.380
10.220
10.210
53
1B2761
1.426
1.410
5.479
5.470
10.304
10.140
54
1B3121
1.436
1.420
5.425
5.350
10.067
10.080
55
1B2831
1.425
1.440
5.367
5.390
10.149
10.220
56
1B2821
1.440
1.430
5.346
5.430
10.283
10.250
57
1B3111
1.434
1.430
5.305
5.350
10.117
10.070
58
1C3351
1.434
1.400
5.484
5.370
10.283
10.040
59
1C3231
1.426
1.410
5.373
5.300
10.116
9.920
60
1C3391
1.429
1.440
5.340
5.350
10.090
10.130
61
1C3381
1.408
1.430
5.304
5.350
9.998
10.130
62
1C3211
1.447
1.440
5.559
5.330
10.320
10.120
63
1C3241
1.431
1.410
5.417
5.340
10.056
10.060
64
1C3221
1.440
1.420
5.468
5.320
10.231
10.060
65
1C3361
1.444
1.420
5.384
5.310
10.112
10.020
66
1C3881
1.420
1.420
5.360
5.320
10.161
10.040
67
1C3841
1.407
1.410
5.415
5.450
10.152
10.140
68
1C4141
1.408
1.420
5.276
5.360
10.040
10.030
69
1C3871
1.399
1.400
5.360
5.320
10.079
9.920
70
1C3371
1.431
1.440
5.349
5.410
9.913
10.090
71
1C3771
1.413
1.430
5.456
5.330
10.169
10.090
72
1C3821
1.407
1.420
5.315
5.440
10.086
10.210
73
1C4271
1.433
1.430
5.413
5.410
10.285
10.040
74
1C4181
1.408
1.430
5.510
5.400
10.137
10.060
20
lanjutan Lampiran 5 Nomor
Eugenol
Eugenol
Mentol
Metil salisilat
NIRS
GC
NIRS
GC
NIRS
GC
75
1C4171
1.450
1.440
5.600
5.450
10.322
10.140
76
1C4161
1.414
1.440
5.390
5.410
10.157
10.070
77
1C4151
1.438
1.450
5.306
5.410
10.040
10.030
78
1C4281
1.425
1.420
5.431
5.360
10.196
10.010
79
1C4291
1.443
1.430
5.536
5.380
10.187
10.040
80
1C4301
1.407
1.420
5.384
5.360
9.982
10.000
81
1D4601
1.422
1.450
5.405
5.370
10.185
9.990
82
1D4611
1.411
1.410
5.413
5.310
10.153
9.960
83
1D4631
1.403
1.430
5.350
5.460
10.240
10.030
84
1C3811
1.418
1.410
5.487
5.400
10.108
10.130
85
1C3781
1.441
1.420
5.554
5.340
10.280
10.070
86
1A1221
1.410
1.420
5.462
5.350
10.222
10.040
87
1D4621
1.393
1.430
5.332
5.480
10.081
10.070
88
1C4121
1.454
1.430
5.616
5.350
10.096
10.040
89
1D4691
1.402
1.430
5.509
5.390
10.266
9.920
90
1D4701
1.408
1.470
5.341
5.340
10.168
9.980
91
1D4731
1.402
1.420
5.367
5.360
10.078
10.040
92
1C3761
1.451
1.420
5.279
5.400
10.158
10.010
93
1C3831
1.432
1.430
5.483
5.440
10.142
10.060
94
1C4261
1.382
1.440
5.458
5.480
9.974
10.080
95
1D5101
1.409
1.420
5.355
5.480
10.164
10.020
96
1C3471
1.426
1.420
5.388
5.340
10.150
9.920
97
1C4111
1.429
1.420
5.458
5.310
10.059
10.000
98
1C4131
1.411
1.430
5.533
5.380
10.094
10.060
99
1C3801
1.419
1.410
5.425
5.450
10.078
10.230
100 1C3791 Contoh perhitungan:
1.423
1.430
5.386
5.440
9.948
10.230
( √
)
(
)
√
(
(
)
)
(
(
)
)
21
Lampiran 6 Data SEL eugenol, mentol, dan metil salisilat Eugenol
Mentol
Metil salisilat
Sampel 1
Ulangan 1 1.6545
Ulangan 2 1.6680
Ulangan 1 6.3465
Ulangan 2 6.4030
Ulangan 1 11.3570
Ulangan 2 11.4525
2
1.1615
1.1745
5.7750
5.8010
8.9840
9.0315
3
1.4035
1.3860
5.3155
5.3250
9.7420
9.6380
4
1.4340
1.4280
4.2655
4.2330
7.3155
7.2435
5
1.2970
1.3000
3.8865
3.8820
10.3805
10.3995
6
0.9670
0.9775
3.7245
3.7425
6.9295
6.9525
Contoh Perhitungan: ( √
)
(
)
(
)
= 0.012 Lampiran 7 Kriteria nilai SEP dan R2 1. Kriteria nilai SEP SEP Kriteria 1–1 .5 SEL Presisi sangat baik 2–3 SEL Presisi baik 4 SEL Presisi menengah 5 SEL Presisi rendah Sumber: Cuadrado et al. 2004 2. Kriteria nilai R2 R2 Kriteria ≥ 0.90 Presisi sangat baik 0.70–0.89 Presisi baik 0.59–0.69 Pemisahan yang baik di antara nilai rendah, tengah, dan tinggi 0.30–0.49 Pemisahan yang baik di antara nilai rendah dan tinggi 0.05–0.29 Lebih baik daripada tidak menganalisis Sumber: Cuadrado et al. (2004) Lampiran 8 Data akurasi Zat aktif Eugenol Mentol Metil salisilat
Konsentrasi Minimum 0.970 3.765 6.3570
Contoh perhitungan:
Konsentrasi Maksimum 1.719 6.485 11.633
Kisaran 0.749 2.720 5.276
SEP 0.019 0.090 0.145
SD 0.174 0.699 1.223
Kisaran /SEP 39.421 30.222 36.386
RPD 9.157 7.768 8.435
22
Lampiran 9 Data uji presisi 1. Data uji keterulangan Sampel
Eugenol (%)
Mentol (%)
Metil salisilat (%)
P1
1.4052
5.5024
10.2601
P2
1.4014
5.3961
10.1891
P3
1.4131
5.4479
10.2268
P4
1.4158
5.4181
10.2479
P5
1.4139
5.4836
10.2537
P6
1.4056
5.3790
10.1624
P7
1.3996
5.5020
10.2176
P8
1.4132
5.4516
10.1923
P9
1.4163
5.4379
10.2118
P10
1.4117
5.4505
10.2437
P11
1.4141
5.4451
10.2461
P12
1.4209
5.4393
10.2488
P13
1.4270
5.4231
10.2035
23
lanjutan Lampiran 9 2. Data uji presisi intermediet Eugenol No Analis A Analis B 1 1.4052 1.4172
Mentol Analis A Analis B
Metil salisilat
5.5024
5.3549
Analis A 10.2601
Analis B 10.2546
2
1.4014
1.4157
5.3961
5.3858
10.1891
10.2717
3
1.4131
1.4230
5.4479
5.3224
10.2268
10.2088
4
1.4158
1.4141
5.4181
5.3642
10.2479
10.1920
5
1.4139
1.4250
5.4836
5.4246
10.2537
10.2267
6
1.4056
1.4293
5.3790
5.3833
10.1624
10.2313
7
1.3996
1.4221
5.5020
5.3302
10.2176
10.1864
8
1.4132
1.4042
5.4516
5.3781
10.1923
10.2185
9
1.4163
1.4103
5.4379
5.3856
10.2118
10.1737
10
1.4117
1.4129
5.4505
5.3509
10.2437
10.1609
11
1.4141
1.4124
5.4451
5.3339
10.2461
10.1380
12
1.4209
1.4044
5.4393
5.4083
10.2488
10.2137
13
1.4270
1.4194
5.4231
5.4124
10.2035
10.2021
3. Data uji statistika presisi intermediet Uji F Zat Aktif F Hitung F Tabel Eugenol 0.9787 2.6870 Mentol 0.6862 2.6870 Metil salisilat 0.4965 2.6870
Kesimpulan Tidak berbeda nyata Tidak berbeda nyata Tidak berbeda nyata
