Antioxidační ochrana. Stárnutí. Antioxidanty v potravě MUDr. Jan Pláteník, PhD Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1.LF UK
Ionizační záření: Hydroxylový radikál vzniká ionizací vody: H2O + hν → H· + OH·
Reaktivní formy kyslíku v organismu: Jednoelektronovou redukcí kyslíku (mitochondrie, NADPH oxidasa) vzniká superoxid O2·– Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodíku: O2·– + O2·– + 2 H+ → O2 + H2O2 Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvoří z peroxidu hydroxylový radikál: H2O2 + Fe2+ → OH– + OH· + Fe3+
1
Oxidační stres • Hladina reaktivních forem kyslíku je udržována v určitých mezích mechanismy antioxidační ochrany • Oxidační stres nastává při vychýlení této rovnováhy směrem k oxidaci
Antioxidační ochrana • prevence tvorby ROS/RNS (regulace produkujících enzymů, sekvestrace přechodných kovů) • vychytávání, lapání a zhášení radikálů • reparační systémy (fosfolipasy, proteasom, enzymy opravující DNA)
2
Antioxidant v chemii potravin • Redukční činidlo schopné zastavit řetězovou reakci lipoperoxidace …“chain-breaking” ... • Např.: – Butylovaný hydroxytoluen (BHT) – Butylovaný hydroxyanisol (BHA) – Tokoferol (Vitamín E)
Antioxidační ochrana lidského těla • Anatomické uspořádání regulující hladinu kyslíku ve tkáních • Antioxidační enzymy • Sekvestrace redoxně aktivních kovů • Antioxidační substráty • Stresová reakce • (Reparace oxidačního poškození DNA, proteinů a lipidů)
3
O2 První organismus (anaerobní)
Vyvinout antioxidační ochranu ?
? Vyhynout ?
Shluknout se !
Uchýlit se do anaerobních podmínek ?
O2
O2
4
Antioxidační ochrana I
Regulace O2 ve tkáních Vdechovaný vzduch: 160 mmHg O2 Plicní kapiláry:
100 mmHg O2
Arteriální krev:
85 mmHg O2
Arterioly:
70 mmHg O2
Kapiláry:
50 mmHg O2
Buňky:
1-10 mmHg O2
Mitochondrie:
< 0,5 mmHg O2
Obr: Wikipedie
Mitochondrie jsou původně fagocytované/parazitující bakterie ...
5
Antioxidační ochrana II
Antioxidační enzymy • Superoxiddismutasa: O2·– + O2·– + 2 H+ → O2 + H2O2 • Katalasa: 2 H2O2 → 2 H2 O + O2 • Glutathionperoxidasa, peroxiredoxin: H2O2 + 2 R-SH → 2 H2O + RS-SR
Superoxiddismutasa (SOD) • Katalyzuje dismutaci superoxidu: O2·– + O2·– + 2 H+ → O2 + H2O2
• Naprosto nezbytná pro život s kyslíkem • SOD1: Cu+Zn (cytosol) • SOD2: – Mn (mitochondriální matrix) – Fe (prokaryotická)
• EC-SOD: extracelulární, Cu+Zn, – MW 135000, vazba na heparansulfát na povrchu cévního lumen
6
Glutathionperoxidasy (GPX) • Redukce peroxidů spojená s oxidací glutathionu: 2 GSH + H2O2 → GS-SG + 2 H2O (glutathion je následně regenerován glutathionreduktasami)
• Obsahují selenocystein v aktivním místě • Cytosolová glutathionperoxidasa: – redukuje H2O2 a LOOH po uvolnění z fosfolipidů
• Fosfolipidhydroperoxid-GSH-peroxidasa: – redukuje LOOH i v membránách
Glutathion (GSH/GSSG) • tripeptid, v každé buňce 1-10 mM • udržuje redukční prostředí ICT • substrát pro GPX, GST • neenzymové reakce s ROS... produkty oxidace GSH jsou toxické pro buňku • při oxidačním stresu export GSSG z buňky
7
Katalasa • Tetramer, každá podjednotka obsahuje hem s Fe • Dismutace peroxidu vodíku: 2 H2O2 → 2 H2 O + O2 • Peroxisomy, erytrocyty • Též peroxidasová aktivita: H2O2 + ROOH → H2O + ROH + O2 (ve srovnání s GPX nevýznamná)
Oxidace dlouhých mastných kyselin v peroxisomech:
8
O2·– Superoxiddismutasa
GS-SG Oxidovaný
H2O2
glutathion (GS-SG)
Glutathion peroxidasa
NADP+ NAD+
Glutathion reduktasa
H2 O
Transhydrogenasa
GSH Redukovaný glutathion (GSH)
NADPH+H+ Pentosový cyklus
NADH+H+
ATP
Základní systém pro odstraňování peroxidu vodíku v lidském těle není glutathionperoxidasa, ale:
Peroxiredoxin/thioredoxin
9
O2·– Superoxiddismutasa
NADPH+H+
H2O2 Peroxiredoxin RED
Thioredoxin RED
SH HS
SH HS
Peroxiredoxin GSH OX
Thioredoxin OX
S
S
S
S
Thioredoxin reduktasa RED FADH2 (Se)
Thioredoxin reduktasa OX FAD (Se)
H2 O
NADP+
Antioxidační ochrana III
Sekvestrace železa a mědi • Redoxně aktivní přechodné kovy (Fe, Cu) přijímají/dávají jeden elektron snadno – ... obcházejí spinovou restrikci kyslíku – ... kovy jsou v aktivních centrech všech proteinů pracujících s kyslíkem
• Ale, tytéž vlastnosti Fe, Cu jsou škodlivé pokud nejsou kontrolovány – Fentonova reakce: H2O2 + Fe2+ → OH– + OH· + Fe3+ oxidativní poškození biomolekul
10
Antioxidační ochrana III
Sekvestrace železa a mědi • Proteiny zacházející s železem a/nebo mědí: – transferin: váže 2 atomy Fe3+ (transport) – laktoferin: analogický transferinu, ale Fe neuvolňuje (... jen sekvestrace), leukocyty – feritin: H a L podjednotky, H je ferroxidasa, skladování Fe (až 4500 atomů Fe3+) – haptoglobin: váže hemoglobin v cirkulaci – hemopexin: váže hem v cirkulaci – ceruloplasmin: obsahuje Cu, funkce: ferroxidasa (export Fe z buněk) – albumin: transport Cu
ICT Superoxid Peroxid
ECT Fe/Cu
Superoxid Peroxid
Fe/Cu
Superoxiddismutasa Glutathionperoxidasa Katalasa
Antioxidační enzymy & hladiny glutathionu velmi nízké
Glutathion Tokoferol Askorbát
Tokoferol Askorbát Karotenoidy, kyselina močová, albumin, glukosa, bilirubin...
Redoxně aktivní Fe přítomno (LIP ‚labile iron pool‘)
Sekvestrace železa a mědi: - transferin, laktoferin - hemopexin - haptoglobin - ceruloplasmin (ferroxidasa) - Cu vázáno na albumin
11
Antioxidační ochrana IV
Nízkomolekulární antioxidační substráty • THIOLY:
– Glutathion – Thioredoxin
• DALŠÍ ENDOGENNÍ METABOLITY: – Bilirubin – Kyselina močová – Kyselina lipoová
• Z DIETY:
– Askorbát (Vitamín C) – α-Tokoferol (Vitamín E) – Karotenoidy – Rostlinné fenoly
Tokoferoly (Vitamin E) • skupina 8 isomerů, nejúčinnější αtokoferol • antioxidant membrán (lipofilní) • “chain-breaking” ... zastavuje řetězovou reakci lipoperoxidace
12
Askorbát (Vitamín C)
• • • •
Redoxně aktivní derivát sacharidů U většiny živočichů syntetizován z kyseliny glukuronové Pro člověka, primáty, netopýry a morčata vitamín Deficit způsobuje onemocnění zvané kurděje (skorbut)
Askorbát v těle: • Hlavní funkce je pro-oxidační: kofaktor hydroxylas – Hydroxylace Pro a Lys při syntéze kolagenu – Syntéza noradrenalinu z dopaminu – Syntéza karnitinu (… úloha v oxidaci tuků) – Aktivace hypotalamických peptidových hormonů amidací (CRH, GRH, oxytocin, vasopresin, substance P) • Reduktant pro železo: podpora jeho vstřebávání • Při poruše sekvestrace Fe (hemochromatosa) může být nebezpečný pro-oxidant (?) • Denní potřeba 70-100 mg, vyšší dávky p.o. se vyloučí močí (renální práh cca 200 mg/24 hod.)
13
membránový kompartment:
Tokoferol
LH
hydrofilní kompartment:
Semidehydroascorbát
LOO·
-e-
řetězová reakce lipoperoxidace
Dehydroascorbát
GSSG
LOOH L·
+e-
dehydroascorbát reduktasa
Tokoferyl radikál
Aktivované neutrofily akumulují dehydroaskorbát (DHA)
Ascorbát
2GSH
DHA GLUT1 GSH
Glutaredoxin
GSSG
Askorbát Ochrana membrány neutrofilu před oxidací vlastními ROS...
14
• Selen: – stopový prvek (denní potřeba 55 µg), možnost deficitu i intoxikace – Součást řady antioxidačních enzymů (glutathionperoxidasy, thioredoxinreduktasy) a také např. 5‘-dejodasy (T4→T3)
• Karotenoidy: – β-karoten (provitamín A) je prekursor pro syntézu: • Retinal … vidění • Kyselina retinová …regulátor genové exprese, růstu a diferenciace buněk
– Antioxidační ochrana kůže a oka
Rostlinné (poly)fenoly • Tisíce látek (quercetin, resveratrol, katechiny…) • Ovoce, zelenina, čaj, červené víno, sojová omáčka, káva, čokoláda, koření… • Výborné antioxidanty (reduktanty) in vitro • In vivo situace složitější: – Resorpce v trávicím traktu? – Konverze na jiné deriváty? – Další specifické biologické účinky? Obr.:http://www.justaboutskin.com
15
Antioxidační ochrana V
Stresová reakce Oxidace nebo nitrosylace kritických -SH skupin
Transkripční faktory (NFκB, Nrf-2…): aktivace, translokace do jádra
Indukce genové exprese: • chaperony (heat shock proteiny) •enzymy antioxidační ochrany •metalothionein …→ vyšší odolnost vůči •hemoxygenasa 1 dalšímu oxidačnímu stresu
Apoptosa jako “extrémní antioxidační ochrana”?
16
Volné radikály v patogenesi lidských onemocnění • Příčina chorobného stavu, např.: • cancerogenese v důsledku expozice ionizačnímu záření • retinopatie novorozenců (fibroplasia retrolentalis)
• Významný podíl na patogenesi, např.: • • • • • • • • •
aterosclerosa diabetes mellitus hypertenze některé typy rakoviny mozkové trauma/hemoragie ischemicko-reperfusní poškození srdce a jiných orgánů Parkinsonova nemoc Alzheimerova nemoc stárnutí
• Jen epifenomenon (obecný důsledek tkáňového poškození)
Co je to stárnutí • U různých živočichů vypadá stejně, ale probíhá různě rychle … musí být univerzální děj • Stochastický proces, na rozdíl např. od embryogenese není přímo programováno genomem (I když geny hrají roli!) • Na molekulární úrovni: neschopnost obnovovat správnou strukturu biomolekul neomezeně dlouho „systemic molecular disorder“ (Hayflick)
17
Radikálová/mitochondriální teorie stárnutí • Hromadění oxidačního poškození s věkem (Denham Harman, 1956) • Později formulována mitochondriální teorie • …mitochondrie jsou hlavní zdroj ROS v organismu • Ale: nedaří se jednoznačně prokázat, že mito DNA je více poškozována ROS, ani že dramaticky hromadí mutace s věkem • Model dle Kirkwooda a Kovalda: – Určité množství ROS uniká z mitochondrií a poškozuje ostatní buněčné struktury – Prevence tvorby ROS a systémy opravující poškození nejsou nikdy 100 % účinné – Mírně poškozené mitochondrie produkují méně energie, než buňka potřebuje
Jak se buňky zbavují nepotřebných proteinů a organel • Kalpainy, proteasom (proteiny s krátkým poločasem) • Autofagie (proteiny s dlouhým poločasem, organely): – Makroautofagie (celé organely) – Mikroautofagie (makromolekuly, malé organely) – Chaperony zprostředkovaná autofagie (KFERQ proteiny)
Obr.: http://cpmcnet.columbia.edu/dept/gsas/anatomy/Faculty/Kessin/autophagy.html
18
Stárnutí jako katabolické selhání Nekompletní degradace v lysosomech, uvolnění Fe z mito, ROS, lipoperoxidace, cross-linking, agregace a polymerace zoxidovaných proteinů a lipidů
+ ↑ LIPOFUSCIN (v lysosomech) V cytosolu defektní mito a proteinové agregáty
Deficit hydroláz dodávaných do defektních lysosomů Poškozené a hypertrofované (obří) mito nelze odbourat Méně ATP, více ROS, poškozené mito a lysosomy mohou iniciovat apoptosu.. Obr.: http://www.uni-mainz.de/FB/Medizin/Anatomie/workshop/EM/EMtLyso.html
Antioxidační ochrana V
Stresová reakce Oxidace nebo nitrosylace kritických -SH skupin
Transkripční faktory (NFκB, Nrf-2…): aktivace, translokace do jádra
Indukce genové exprese: • chaperony (heat shock proteiny) •enzymy antioxidační ochrany …→ vyšší odolnost vůči dalšímu •metalothionein oxidačnímu stresu •hemoxygenasa 1 …→ propagace zánětu
19
Stresová reakce se ve stáří stává chronickou
Nick Lane: Oxygen. The Molecule that made the World. Oxford University Press 2002
Disposable soma theory: Jak dlouho má tělo vydržet ? • V přírodě se většina živočichů stárnutí nedožije – selekční stín pro mutace s negativním vlivem v pozdních fázích života
• V přírodním výběru je rozhodující úspěch v reprodukci ! – … geny prodlužující post-reprodukční období nejsou k ničemu
• Omezené množství metabolické energie se musí dělit mezi údržbu těla a reprodukci (trade-off)
(T.B.L.Kirkwood & S.N. Austad, Nature 408 (2000), 233-238)
20
Antioxidanty jako elixíry mládí ? • Vitamín E (tokoferol) • Vitamín C (askorbát) • β-karoten • Selen
Obr.: http://www.osel.cz
Antioxidační potravní doplňky mohou dokonce škodit ! • Recentní meta-analýza celkové mortality v 68 studiích s podáváním antioxidačních potravních doplňků (232 606 účastníků, 385 publikací): – β-karoten, vitamín A a vitamín E signifikantně zvyšují mortalitu – Vitamín C a selen nemají vliv (Bjelakovic G et al., JAMA 2007; 297: 842-857)
21
Proč antioxidanty nepomáhají nebo dokonce škodí ??? • Ve vyšších dávkách už nedělají nic • Působí tam kde nemají – Inhibice stresové reakce – Brání boji proti infekci, nádorovým buňkám, oprávněné apoptose ?
• Mají i jiné účinky než antioxidační – tokoferoly: protizánětlivé – β-karoten: ko-karcinogen (dohromady s kouřením nebo environmenálními toxiny)
?
http://www.calpoly.edu/~lcimarel/know.htm
Dieta bohatá na ovoce a zeleninu (optim. 5x 80 g denně) je spojena s nižším rizikem kardiovaskulárních chorob, diabetu a některých typů rakoviny (plíce, ústa/hltan) (ale nevíme proč)
22
