Přírodní antioxidanty;

Přírodní antioxidanty;

výzkum antioxidantů v ovoci RNDr. Bílková Aneta

Co jsou antioxidanty? •

látky, které omezují aktivitu volných radikálů, snižují pravděpodobnost jejich vzniku nebo je převádějí do méně reaktivních nebo nereaktivních stavů →omezují proces oxidace v organismu

•

pomáhají ochránit imunitní systém

•

zpomalují proces stárnutí a preventivně působí proti srdečním onemocněním, infarktu a rakovině

Podle původu: přírodní, syntetické

•

přírodní antioxidanty: vitamíny A, B2, B15, C, E, karotenoidy, flavonoidy, třísloviny, polyfenoly, glutation, taurin, sloučeniny zinku, selenu, manganu, mědi, beta karoten, koenzym Q10, pyknogenol, alfa-lipoová kyselina atd.

•

syntetické antioxidanty: BHA (E320), BHT (E321) , TBHQ, galláty

Podle struktury: polyfenoly (jako jsou flavonoidy, anthokyany, fenolkarboxylové kyseliny, kumariny), karotenoidy (karoteny prekursory vitaminu A nebo xanthofyly) a tokoferoly (vitamin E)

Přírodní antioxidanty •

dostávají se do potravy z přírodních zdrojů.

•

nevýhodou - nízká odolnost proti kyslíku, a to zejména v rámci expozice světlu, vysoké teplotě a sušení

 Enzymové antioxidanty: superoxiddismutáza, glutathion, kataláza... 

Hydrofilní antioxidanty (rozpustné ve vodě), které účinkují zejména v extracelulární tekutině:

vitamín C, kyselina močová, selen, bioflavonoidy – resveratrol, jednoduché fenoly, fenolové kyseliny a jejich deriváty - thymol a karvakrol (k uzení potravin – složky kouře), kyselina chlorogenová - v kávě a v syrových bramborách, lignany - v ovesných vločkách, lněných semínkách, ječmeni či žitě, diterpeny a chinony – v extraktech rozmarýnu a čaje

Lipofilní antioxidanty (rozpustné v tucích), které účinkují hlavně na membráně a uvnitř buňky: vitamín A, E, b-karoten, karotenoidy, ubichinon Q10... 

Bioflavonoidy, flavonoidy, fenoly ZDROJE: jablka, cibule, pomeranče, grapefruity, česnek, zelí, brokolice, lesní plody, čaj, víno, káva, ořechy, sója, brambory, meruňky, hrušky, broskve VÝZNAM V ORGANISMU: prevenci nádorových onemocnění - inhibice proliferace a indukce apoptózy, prevence kardiovaskulárních chorob – antioxidační a protizánětlivý účinek, snižování exprese adhezních molekul v cévách, inhibice agregace destiček

Antioxidanty a ovoce Zajišťování chuti a barvy potravin, delší trvanlivosti zpomalují ztrátu barvy ovoce a zeleniny funkce při zabránění oxidace tuků a výrobků obsahujících tuk, ochrana některých vitaminů a aminokyselin před oxidací (tokoferol - vitamín E) Zabraňuje hnědnutí jablek přídavkem malého množství citronové šťávy Kyselina askorbová (vitamin C) obsažená v mnoha citrusových plodech, je přírodní antioxidant a je proto často užívána v mnoha potravinářských výrobcích (E300-E302)

Metody stanovení antioxidantů HPLC – UV – VIS HPLC - MS HPLC ve spojení s detektorem CoulArray GC - FID MEKC – micelární elektrokinetická chromatografie CZE – kapilární zónová elektroforéza - malá spotřeba vzorku, krátká doba analýzy či velká separační účinnost, analýza antioxidantů v kakau Celková antioxidační kapacita - TEAC metoda, ORAC metoda, FRAP metoda, Metoda s Folin-Ciocalteovým činidlem Fyzikálně-chemické metody - Elektronová spinová rezonance, stanovení redox potenciálu, chemiluminiscence

Antioxidační aktivita – celková antioxidační kapacita porovnávání antioxidačních účinků →celková antioxidační aktivita TAA (total antioxidant activity), která kvalifikuje kapacitu vzorku biologického materiálu eliminovat radikály schopnost sloučeniny (směsi látek) inhibovat oxidační degradaci různých sloučenin (např. zabraňovat peroxidaci lipidů) Jde o poměr antioxidačního účinku vzorku k roztoku Troloxu nebo kyseliny askorbové koncentrace 1 mmol/l. Stanovení: →metody chemické: založeny na použití činidel poskytujících s volnými radikály barevné produkty, jejichž vzniku brání ve vzorku obsažené antioxidanty. Intenzita zbarvení se většinou měří spektrofotometricky →fyzikálně- chemické – sledují změnu fyzikálních vlastností, které tyto procesy doprovází.

Metody stanovení polyfenolických látek HPLC- UV – VIS  - Vit. C - šípky, citronová šťáva , čerstvá a tepelně upravená zelenina (brambory, brokolice, kapusta, pór, petržel, paprika, rajčata…) a ovoce.  Kyselina chlorogenová- šípky, citronová šťáva , čerstvá a tepelně upravená zelenina (brambory, brokolice, kapusta, pór, petržel, paprika, rajčata…) a ovoce.  (-)-Katechin, kyselina gallovájahodník, maliny, borůvky, brusinky  katechin, epikatechin, resveratrol, kvercetin, rutin, antokyany a antokyanidiny – vzorku červ. a bílého vína  BHA, BHT, TBHQ, galláty

HPLC ve spojení s detektorem CoulArray  - jedna z nejcitlivějších metod pro stanovení přírodních antioxidantů  k separaci se využívá systému obrácených fází, kdy stacionární fáze je nepolární a mobilní fází je polární rozpouštědlo. Vodivost mobilní fáze se zvyšuje přídavkem soli(pufry)  citlivost, selektivita, možnost práce s gradientovou elucí a využití poměru signálů z cel s různými vloženými potenciály k identifikaci látek.  Meze detekce CoulArray detektoru se pohybují řádově až v mg.l-1 v závislosti na typu sledované elektroaktivní látky

Přírodní antioxidanty v ovoci - jablka Metody stanovení fenolických sloučenin v jablkách

• Nejčastěji konzumované ovoce

• HPLC – DAD

• Vysoké nutriční hodnoty, vysoká dostupnost, moderní metody skladování – prodloužení trvanlivosti ovoce až na 6 měsíců

(+) - katechin a (-) - epikatechin (flavan-3-oly nebo flavanoly), phloridzin (DIHYDROCHALKON glykosidy), quercetin (flavonoly), cyanidiny

• Není ovocem s největší antioxidační kapacitou

(anthokyanidiny), kyanidin-3-O-galaktosid (antokyany), chlorogenová kyselina fenolové kyseliny) a deriváty hydroxaskořicové kyseliny(kumarová kyselina)

• variabilita polyfenolového profilu je ovlivněna odrůdou (kultivarem),dobou zrání, etapou vegetačního období, environmentálními faktory, geografickou oblastí, výrobní technologií a podmínkami skladování

• LC – MS • GC – MS Obecně: obsah polyfenolických sloučenin:

Účinky: phlorethin, phloridzin, quercetin – vliv na hormony ŠŽ, katecholaminy, steroidy

19,6 a 55,8 (flavan-3-olů), 17.7-33.1 (flavonoly) a 10.6-80.3 (chlorogenová) mg na 1 plod

antimutagenní, protizánětlivé účinky procyanidinů

nejnižší hodnoty byly zaznamenány pro phloridzin (1.0-9.3 mg na plod) a anthocyaninu 0,1 až 6,5 mg na 1 plod

- Vyšší koncentrace i výskyt polyfenolických sloučenin ve slupce než v dužnině

Stanovení individuálních polyfenolických látek Instrumentace a podmínky:

- Agilent Technologies Infinity 1260 Kolona: Kinetex Core Shell Technology C18 (150 x 4,6 mm) 5µm Phenomenex, 35 0C, Gradientová eluce: voda : ACN s 0,1% HCOOH, pH = 3

Detekce a kvantifikace: 255, 280 nm, 320 a 365 nm Standardy: chlorogenová kyselina galová kyselina kávová kyselina kumarová kyselina syringová kyselina ferulová kyselina hesperidin phloridzin phloretin quercetin myricetin katechin epikatechin resveratrol rutin

Obr 1: Chromatogram separace směsného vzorku vybraných standardů fenolických látek

Stanovení individuálních polyfenolických látek v reálných vzorcích LC - DAD Příprava vzorku: v rámci optimalizace vyzkoušeny různé varianty extrakce: 100% MeOH, 50% MeOH, 50% ACN a 100% ACN Nejvyšší výtěžnost extrakce: extrakce v 100% MeOH Závěr: vyvinuta metoda pro stanovení obsahu antioxidantů, založena na stanovení vybraných standardů pomocí kapalinové chromatografie s DAD Provedena optimalizace metody pro stanovení reálných vzorků a využití pro následnou validaci metody

Chromatogramy separace vybraných antioxidantů v reálných vzorcích Obr. 2: LC – DAD chromatogram slupky odrůdy Golden Delicious při 255, 280, 325 a 360 nm

Obr. 3: LC –DAD chromatogram slupky odrůdy Lady Sylvia při 255, 280, 325 a 360 nm

Stabilita fenolických látek v jablku během sklizně a skladování Kultivar, zrající etapa, vegetační období, agrotechnické zásahy, geografická oblast Závislost: doba a teplota skladovacích prostor – plody skladované při teplotě 10C po dobu 60 dní snížení obsahu polyfenolů ve slupce o 20% a v dužnině až o 50% Skladování při pokojové teplotě 200C - obsahy polyfenolů se téměř nemění Skladování při teplotě 40C: dochází pouze k nepatrnému poklesu individuálních polyfenolů • Vitamín C: při pokojové výrazný pokles koncentrace vitamínu C než při skladování při teplotě 40C • Kyselina chlorogenová patří k nejvýznamnějším a nejvíce zastoupeným antioxidantům flavonoidní povahy přítomným v plodech jablek - její pokles může být způsoben podobně jako u askorbátu postupnými negativními změnami plodů spojenými s dlouhodbým skladování, může dojít k postupnému rozkladu nebo i k vyčerpání vlivem mobilizace antioxiačních systémů plodu. • Hodnoty celkových polyfenolů – se při teplotě skladování 4, 8, 200C liší se pouze minimálně. V průběhu skladování ve všech prostředích nejprve obsah celkových polyfenolů vzrůstá, pak dochází k mírnému poklesu a ke konci uchovávání hodnoty opět mírně stoupají. Souvislost se změnou koncentrace kyslíkupři uchovávání, případně i s teplotou a stupněm zrání.

Stanovení individuálních polyfenolických látek v reálných vzorcích LC - Coularray  Ve srovnání s jinými detektory je výrazně selektivnější a citlivější, odezva je málo ovlivňována přítomností interferujících látek →odpadá zdlouhavá a náročná úprava vzorku  Identifikace látek: • na základě retenčních časů • poměrů odezvy signálu detektoru při různých vložených potenciálech na elektrody, zejména z poměru ploch prea postdominantních píků k ploše píku dominantního  Charakteristika látky: pokud se oxiduje při nízkém potenciálu je silnějším antioxidantem

Chromatogramy fenolických látek v reálných vzorcích Obr. 4: LC - Coularray chromatogram jablečné šťávy odrůdy Florina

Obr. 5: LC - Coularray chromatogram jablečné šťávy odrůdy Gala

Přírodní antioxidanty v ovoci - meruňky  ovoce s vysokým obsahem přírodních antioxidantů – vitamín A (beta karoten), vitamín C  Bohaté na polyfenolické antioxidanty – flavonoidy (chlorogenová kyselina, quercetin, proanthocyanidiny, katechin, epikatechin, hydroxyskořicová kyselina, galová kyselina, kávová kyselina, kumarová kyselina, ferulová kyselina) Pro vysoký obsah zdraví prospěšných látek se meruňky začínají vysoce atraktivním konzumovaným ovocem (antimutagenní, antikarcinogenní, protizánětlivé a antibakteriální účinky)

Přírodní antioxidanty v ovoci – třešně, višně Zrání souvisí se změnou barvy, kumulací polyfenolických sloučenin, anthokyanů a degradací chlorofylu Odlišná koncentrace polyfenolů v částech plodů – ve slupce vyšší koncentrace – souvisí s organoleptickými vlastnostmi (chuť, svíravost) anthokyany: cyanidin 3-glucosid, cyanidin 3-rutinosid, cyanidin 3sophorosid, pelargonidin 3-glucosid, pelargonidin 3- rutinoside, 3glucosid, peonidin 3-rutinosid Fenolické kyseliny: neochlorogenová a p-kumaroylquinic. kyselina • Flavonoly, flavan-3-ol: katechin, epikatechin, quercetin 3-glukosid, quercetin 3-rutinosid, kaempferol 3-rutinosid Zdravotní benefity: Vysoký obsah anthokyanů a polyfenolů – působí proti onemocnění srdce, diabetes a protirakovinné účinky

Přírodní antioxidanty v ovoci OVOCE, produkty

OBSAHOVÉ ANTIOXIDANTY

jablečný džus

chlorogenová kyselina, phlorethin glycosid, vitamin C

jablečné výlisky

epikatechin (dimer procyanidin B2), quercetin glucosid, chlorogenová kyselina, phloridzin, 3- hydroxyphloridzin

jablka

chlorogenová kyselina, phlorethin glycosid, vitamin C

broskvoně

chlorogenová kyselina, neochlorogenová kyselina

hrušně

chlorogenová kyselina

slivoně

chlorgenová kyselina, neochlorogenová kyselina

třešně

neochlorogenová kyselina, anthokyany, katechin, epikatechin

meruňky

chlorogenová kyselina, quercetin, hydroxyskořicová kyselina, galová kyselina, kávová kyselina, kumarová kyselina, ferulová kyselina, vitamín A, C

borůvky

anthocyany, deriváty kyseliny hydroxyskořicové, flavonoidy

Budoucnost Stanovení zdraví prospěšných látek v ovoci – antioxidanty, vitamíny, alergeny Výzkum a šlechtění odrůd ovoce s vysokým obsahem těchto látek Propagace a metodika stanovení zdraví prospěšných látek v různých druzích ovoce

Děkuji za pozornost Kontakt:

RNDr. Bílková Aneta Oddělení genetiky a šlechtění Výzkumný a šlechtitelský ústav Holovousy s.r.o

Email: [email protected] +420 777 588 826