11/11/13
Ontwikkeling van sneldiagnos0ek m.b.v indicator-‐organismen voor het aantonen van anastomose lekkage na darmopera0es
Claudia Orelio, PhD
Lectoraat Innova9eve Moleculaire Diagnos9ek Hogeschool Leiden
Anastomose van de darm Anastomose = verbinding tussen twee structuren
Colorectale anastomose: bij pa9ënten bij wie een stuk darm verwijderd wordt: • Darmtumoren • colitus ulcerosa/ Morbus Crohn (ziekte van Crohn)
1
11/11/13
Anastomose; problemen die kunnen optreden • In ca 3-‐19% van de pa9enten treedt na de opera9e naadlekkage op (‘colorectal anastomosis leakage’; CAL) • naadlekkage=> darm-‐bacteriën/ feces in de buikholte •
van CAL en bijkomende Mortaliteit/Morbiliteit als gevolg
infec9es/complica9es kan oplopen tot 15% – Peritoni9s – Sepsis – Abces-‐vorming in buikholte
Huidige diagnos9ek van AL
48 hr
Monitoren pa9ent • Analyse drainvocht m.b.v. microbiologische technieken Iden9fica9e (Vitek); • Klinische symtomen (o.a. koorts) 24uur • Bloedwaarden (o.a. ontstekingsmediatoren) • Aanvullend CT/ radiologisch onderzoek =>diagnose van AL kan dus pas na 72 uur worden vastgesteld
2
11/11/13
Is sneldiagnos9ek mogelijk? • Monitoring drainagevocht op de aanwezigheid van indicator organismen/ biomarkers met moleculaire technieken levert een 9jdsbesparing op. Er kan sneller medisch ingegrepen worden in geval van AL.
• Tijdsbesparing van de diagnos9ek zorgt voor een betere prognose voor de pa9ënt en een lager risico op mor9liteit/ morbiliteit • Biomarkers/ indicator-‐organismen: darmbacteriën (E.Coli, E.Faecalis)
Moleculaire diagnos9ek • qPCR analyse voor de aanwezigheid darmbacteriën E.coli en E.faecalis in drainvocht 1-‐5 dagen na opera9e • Voordelen moleculaire diagnos9ek:
Sneller (uitslag in enkele uren i.p.v dagen) Kwan9ta9ef Specifiek voor bepaald type bacterie Minder gevoelig voor contamina9e omdat er 1-‐2 bacteriën worden geanalyseerd • Detecteert ook dode bacteriën, waardoor beter de omgeving rond de anastomose gemonitord kan worden • • • •
3
11/11/13
© C.Orelio 2013
Interne controle als technische PCR controle
Pilot study Onderzoeksvraag: zijn E.coli en E. faecalis geschikte biomarkers (indicator organismen) voor de diagnos9ek van anastomose lekkage? • 17 drainage monsters – kweek-‐posi9eve monsters (n = 10) – kweek-‐nega9eve monsters (n = 7)
4
11/11/13
qPCR curves en smeltpieken E.coli nega9eve controle Cq= 35,9 posi9eve controle Cq= 26,3
monsters Cq= 34,2-‐ 37,7
Resultaten
N. Komen et al. 2009. J.Microbiol. Methods • Geen van de pa9ënten heeg klinische anastomose lekkage ontwikkeld • Wel lage hoeveelheid E.coli of E.faecalis in kweek en qPCR te detecteren
5
11/11/13
Discussie • qPCR is gevoeliger of minstens net zo gevoelig als de gouden standaard, de microbiologische kweek. qPCR is dus geschikt als diagnos9sche test. • Voordeel qPCR: snellere uitslag
• Bacterie aanwezigheid kan worden veroorzaakt door intra-‐ opera9eve verontreiging/ post-‐opera9eve wondinfec9e => hoeg niet te ontwikkelen in AL
APPEAL-‐studie
Analysis of Predic9ve Parameters for Evident Anastomo9c Leakage
• 259 pa9ënten in de studie
– 35 pa9ënten (13.6%) met ontstekings-‐gerelateerde ziektes – 220 pa9ënten (84.9%) met maligniteiten – 4 pa9ënten (1.5%) met ischemische coili9s
– 19 van de 259 pa9ënten (7.3%) kregen anastomose lekkage (9 pa9ënten sepsis; 7 pa9ënten peritoni9s, 3 pa9ënten abces, 8 pa9ënten CT-‐scan, 7 pa9ënten nieuwe opera9e, 4 pa9ënten feces in drainvloeistof) Komen et al. Int. J. Colorectal Disease; in press
6
11/11/13
Methode • Dag 0-‐5 na de opera9e zorgt een drain voor afvoeren van drainagevloeistof van het wondgebied. Dit versnelt het genezingsproces – Analyse drainvloeistof d .m.v. qPCR – Analyse drainvloeistof d.m.v. microbiologische kweek (aantal bacteriën in CFU/ml), iden9fica9e (VITEK 2)
Resultaten kweek
7
11/11/13
Sensi9viteit en specificiteit
Posi9ef en nega9ef voorspellende waarde
8
11/11/13
Resultaten kweek ```` ``
Op dag 1 is er in 5 pa9ënten met AL een posi9eve kweek gevonden
```` ``
Op dag 1 is er in 12 pa9ënten zonder AL ook een posi9eve kweek gevonden
Resultaten kweek ```` ``
Op dag 1 zijn er in 12 pa9ënten met AL geen bacteriën in de kweek gevonden
```` ``
Op dag 1 zijn er in 197 pa9ënten zonder AL ook geen bacteriën in de kweek gevonden
9
11/11/13
Resultaten kweek
• • • •
hoge specificiteit = grote kans op een nega9eve uitslag bij gezonde pa9ënt lage sensi9viteit =lage kans op posi9eve uitslag bij zieke pa9ënt Lage posi9ef voorspellende waarde (PPV) hoge nega9ef voorspellende waarde (NPV)
Resultaten qPCR
• gemiddeld-‐hoge specificiteit = grote kans op een nega9eve uitslag bij gezonde pa9ënt • gemiddelde sensi9viteit = gemiddelde kans op posi9eve uitslag bij zieke pa9ënt • Lage posi9ef voorspellende waarde (PPV) => als de qPCR posi9ef is, dan wil dat niet zeggen dat de pa9ënt AL heeg, maar is verder onderzoek gewenst • hoge nega9ef voorspellende waarde (NPV) =>als de PCR nega9ef is, dan is de kans groot dat de pa9ent geen AL heeg
10
11/11/13
Samenvanng resultaten en conclusie kweek
qPCR
Sensi9viteit
13-‐37%
50-‐75%
specificiteit
75-‐97%
75-‐95%
PPV
11-‐29%
27-‐50%
NPV
93-‐94%
94-‐96%
• Vergelijking testen: de qPCR is minstens zo goed als de ‘gouden standaard’ (de kweek) • Dus de qPCR kan ingezet worden als snelle screeningsmethode om aan te tonen dat de pa9ënt geen AL heeg • Alle pa9ënten met een posi9eve qPCR uitslag komen sneller in aanmerking voor aanvullende onderzoeken zoals een CT-‐scan
Aan deze studie hebben bijgedragen: • • • •
N. Komen P. Willemsen E. van der Harst J.F. Lange
• • • • • • •
M. Morsink S. Beiboer A. Miggelbrink C. van Heerinkhuizen H. Dekter C.Orelio W.B. van Leeuwen
11
11/11/13
qPCR E.faecalis nega9eve controle Cq= 35,8 posi9eve controle 23,4 Cq=
monsters Cq= 31,8-‐ 36,4
Smeltcurves en smeltpieken E.faecalis
12
11/11/13
qPCR PhHV
posi9eve controle
Nega9eve controle en monsters
Smeltcurves en smeltpieken PhHV
13
