Marina Chimica Acta, April 2008, hal. 1-5 Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Hasanuddin
Vol.1 No.2 ISSN 1411-2132
ANALISIS SPESI MANGAN DALAM CAIRAN PHLOEM TANAMAN JARAK (RICINUS COMMUNIS L.) DENGAN METODE PNC PAGE - ICP QMS Noor Fitri1,2,3*, Björn Thiele2, Klaus Günther2 ,Buchari3, Muhammad Bachri Amran3, and Fida Madayanti Warganegara3 1
Department of Chemistry, Universitas Islam Indonesia Kampus Terpadu Jl. Kaliurang Km 14.4 Besi Sleman Yogyakarta 55584 Indonesia Phone: +62 274 895920, Fax: +62 274 896439, E-mail:
[email protected]. 2 Institute for Chemistry and Dynamics of the Geosphere: ICG-III Phytosphere Research Centre Juelich, D-52425 Juelich, Germany 3 Department of Chemistry, Institut Teknologi Bandung, Bandung, Indonesia
ABSTRAK Telah dilakukan analisis spesi mangan dalam cairan phloem tanaman jarak (Ricinus communis, L.) dengan menggunakan metode preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (PNC-PAGE) sebagai metode pemisahan dan inductively coupled plasma quadrupole mass spectrometer (ICP-QMS) untuk pendeteksian selektif unsur. Sampel cairan phloem tanaman jarak sebanyak 500 µL difraksinasi menggunakan metode PNC-PAGE dengan kondisi operasi: sistem buffer kontinyu 20 mM Tris-HCl/1 mM NaN3 pH 10; derajat polimerisasi poliakrilamid 4%T – 2,67% C, panjang gel 40 mm, pelarut 20 mM TrisHCl/ 1 mM NaN3 pH 8,0; dan temperatur analisis 4°C. Sampel difraksinasi sebanyak 74 fraksi dengan volume setiap fraksi 5 mL. Konsentrasi mangan dalam setiap fraksi kemudian dideteksi dengan ICP QMS dengan menggunakan larutan Indium 10 µg/L sebagai standar internal. Hasil penelitian menunjukkan adanya spesies utama mangan pada fraksi 24. Kata kunci : mangan, phloem, Ricinus communis L., PNC PAGE, ICP QMS
Dalam paper ini akan dibahas spesi Mn yang terdapat dalam cairan phloem tanaman jarak. Tanaman Jarak merupakan salah satu tanaman model untuk penelitian proses transport dalam phloem (Milburn, 1970). Hal ini disebabkan cairan phloemnya dapat diperoleh dalam jumlah relatif banyak dibandingkan tanaman lain. Umumnya tanaman lain mempunyai mekanisme perlindungan yang akan menutup laju alir cairan phloem ketika dilakukan pengirisan pada tabung sieve, untuk menghindari hilangnya nutrient dalam phloem. Dengan demikian jalan keluar cairan phloem akan segera tertutup dan cairan yang keluar hanya sedikit (Jongebloed, 2004). Mekanisme ini jarang terjadi pada tanaman jarak, sehingga ketika dilakukan pengirisan pada tabung sieve, cairan phloem yang keluar dapat diperoleh dalam jumlah relatif besar yang memungkinkan untuk analisis spesiasi unsur. Metode pemisahan yang digunakan adalah metode PNC-PAGE. Metode ini digunakan dalam analisis spesiasi karena dapat mempertahankan spesi yang diinginkan dalam bentuk nativnya (Chery, 2003; Kastenholz, 2004; 2006; 2007). Setelah pemisahan, ICP QMS digunakan sebagai pendeteksian selektif unsur dalam setiap fraksi. ICP QMS merupakan metode pendeteksian unsur yang sangat handal dan serbaguna untuk penentuan unsur (ultra)runut. Hal ini disebabkan ICP QMS mempunyai banyak keunggulan dibandingkan metode pendeteksian selektif unsur lain seperti AAS, AES, maupun AFS. Keunggulan tersebut antara lain: batas deteksi yang sangat rendah dengan sensitivitas tinggi, range konsentrasi analit yang dapat diukur cukup luas yaitu orde ppm sampai ppt,
PENDAHULUAN Mangan (Mn) merupakan salah satu unsur runut essensial bagi tanaman. Mn dalam tanaman diserap oleh akar dalam bentuk Mn2+, atau dalam bentuk kompleks organik. Mn dibutuhkan dalam proses fotosintesis dimana atom Mn berperan pada pusat katalitik oksidasi air dalam sistem fotosintesis II dan dibutuhkan sebagai kofaktor untuk beberapa enzym seperti enzym Mn-superoksida dismutase (MnSOD) (Pittman, 2005). Selain itu, Mn juga dapat mengganti ion Mg2+ dalam reaksi fosforilasi. Defesiensi Mn secara visual dapat dilihat pada titik tumbuh, terutama pada daun muda berupa klorosis antar tulang daun dan bercak-bercak warna yang tidak merata. Sebaliknya, keracunan Mn dapat terjadi pada tanah yang sangat asam, secara visual terdeteksi dengan munculnya bercak hitam atau coklat (endapan MnO2). Dalam sel, kelebihan ion Mn2+ terakumulasi umumnya dalam vakuola, kemudian sisanya dalam khloroplast serta dinding sel. Peranan, proses penyerapan, defisiensi, maupun toksisitas Mn telah diketahui, namun proses transport Mn dalam tanaman belum banyak terungkap. Proses transport Mn yang telah diketahui baru pada tahap bakteri dan pada ragi saccharomyces cerevisiae. Dengan demikian, identifikasi spesi Mn dalam cairan phloem merupakan suatu keniscayaan untuk mengetahui proses transport Mn dalam tanaman. Sebagaimana diketahui phloem merupakan jalur transportasi nutrisi dalam tanaman setelah proses fotosintesis terjadi.
1
Noor Fitri, Björn Thiele, Klaus Günther, dkk
Mar. Chim . Acta
kemampuan analisis multi unsur, spektranya sederhana dan dapat digunakan untuk analisis isotop. ICP MS telah sering digunakan dalam analisis spesiasi sebagai detektor spesifik unsur (Lobinski, 1998; Michalke, 2002; 2003; Caruso dkk, 2003; Vanhaecke, 2003; Rosen dkk, 2004; Nedham, 2005; Szpunar, 2000;2002;2005).
dan setelah polimerisasi selama 60 menit permukaan gel dicuci dengan 4 mL larutan buffer elektrolisis Tris-HCl 20 mM/ NaN3 1 mM pH 10,0 berulang kali dan terakhir ditambahkan 4 mL larutan buffer tersebut sampai permukaan gel terendam dengan larutan buffer. Proses polimerisasi dibiarkan berlangsung selama 69 jam pada temperatur ruang sebelum alat elektroforesis dijalankan.
PROSEDUR PENELITIAN
Fase pengkondisian. Perangkat PNC-PAGE diletakkan dalam lemari pendingin kaca, karena proses elektroforesis dijalankan pada temperatur 4°C. Sebelum proses elektroforesis berlangsung, sistem dibiarkan selama 80 menit pada temperatur tersebut untuk menstabilkan kondisi pompa, sumber tegangan, rekorder/pencatat peralatan elektroforesis. Hal ini dapat ditunjukkan dengan diperolehnya basislini yang stabil pada rekorder. Lampu detektor UV dihidupkan sehari sebelum fase pengkondisian. Sebagai buffer digunakan larutan MES 20 mM/ NaN3 1 mM pH 8,0.
Penelitian ini dilakukan pada Institute for Chemistry and Dynamics of the Geosphere: ICG-III Phytosphere, Research Centre Juelich, Germany pada kurun waktu 2003 – 2004. Bahan dan alat penelitian Biji Jarak (Ricinus communis L.) kualitas tinggi yang digunakan diperoleh dari perusahaan pembibitan terakreditasi Jelitto Staudensamen GmbH (Hamburg, Jerman). Biji Jarak dari perusahaan ini telah diakui kualitasnya dan telah banyak digunakan untuk penelitian Jarak ( Stephan dkk., 1994; Brauer dkk., 1998; Zhong dkk., 1993; 1998; Schmidke dan Stephan, 1995). Spesifikasi bahan kimia umumnya dalam kualitas tinggi (supra pure, sp) dari Merck, Jerman, dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut kecuali HNO3 65 % (supra pure, Merck) diredestilasi untuk meminimalisasi kontaminan terutama untuk destruksi sampel dan persiapan sampel ICP MS. Bahan yang digunakan antara lain gliserol; akrilamid/N,N-metilen bis akrilamid; ammonium persulfat (APS); N,N,N,Ntetrametilen-etilen-diamin (TEMED); 2-propanol; ditiotreitol (1,4-ditio-DL-treitol); HNO3 sp; NH4HCO3 pa; larutan buffer induk Tris-HCl 200 mM/ NaN3 10 mM pH 10,0; larutan induk MES 200 mM/ NaN3 10 mM pH 8,0; dan aquadest yang telah dimurnikan lagi dengan sistem millipore. Alat yang digunakan adalah satu set sistem elektroforesis PNC PAGE model 491 Prep Cell dari Bio Rad, Jerman untuk proses pemisahan spesi Mn dan ELAN 6100 ICP-QMS (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) untuk pendeteksian unsur.
Fase elektroforesis. Setelah prerun selama 75 menit, tegangan diturunkan dan sampel cairan phloem yang telah dicampur dengan gliserol (9:1) sebanyak 500 µL diinjeksikan secara hati-hati dan merata ke dalam larutan buffer di atas permukaan gel. Kemudian tegangan diaktifkan kembali. Sampel difraksinasi sebanyak 74 fraksi dengan volume setiap fraksi 5 mL. Parameter sistem elektroforesis yang dijalankan dapat dilihat pada tabel 1. Penentuan konsentrasi mangan Konsentrasi mangan dalam fraksi ditentukan dengan menggunakan ICP QMS ELAN 6100 (Perkin Elmer, USA). Kalibrasi eksternal dengan perhitungan regressi melalui titik nol digunakan untuk menentukan konsentrasi Mn dalam setiap fraksi. Larutan baku Mn 1000 mg/L (Perkin Elmer, USA) diencerkan secara bertahap pada setiap hari analisis dengan berbagai variasi konsentrasi. Tiga buah larutan blanko juga dianalisis dengan prosedur yang sama seperti pada sampel. Untuk menghindari perbedaan matriks, larutan blanko diambil dari larutan buffer yang telah melewati gel elektrolisis setelah proses pemisahan terjadi. Indium dalam larutan asam nitrat digunakan sebagai larutan standar internal dengan konsentrasi akhir 10 µg/L.
Kultur tanaman Jarak dan sampling cairan phloem Kultur tanaman jarak mulai dari penyemaian biji sampai tahap sampling cairan phloem telah dideskripsikan sebelumnya dalam Fitri-Arifudin N, dkk (2004). Kultur tanaman Jarak dilakukan di dalam rumah kaca yang terkontrol kondisinya secara automatis sehingga perbedaan cuaca selama 4 musim yang berbeda dapat diminimalisasi.
Tabel 1. Kondisi operasional PNC PAGE Daya sumber tegangan Power PAC 1000 (Bio Rad) Pompa peristaltik model EM-1 Econo Pump
Pemisahan PAGE Pembuatan gel. Gel dibuat dengan mencampurkan 4 mL larutan induk Tris-HCl 200 mM/ NaN3 10 mM pH 10,0, 4 mL larutan induk akrilamid/bis 40%, 20 µL TEMED, 200 µL APS 10%, dan 32 mL aquadest millipore. Sebelum digunakan semua larutan dibiarkan terlebih dahulu pada temperatur ruang dan dihomogenkan dengan menggunakan pengaduk magnet. Larutan APS 10% dan gel dibuat baru setiap kali percobaan. Larutan gel ditambahkan 3 mL 2-propanol
Pengumpul fraksi model 2110 (Bio Rad) Detektor UV (Pharmacia LKB Uvicord SII) Rekorder (Pharmacia LKB Rec 102) Pompa resirkulasi buffer (Bio
2
1 – 250 W (5 W konstan, 8 jam) Tegangan 1 – 1000 V, arus 80 Laju alir buffer: 1,0 mL/min Volume perfraksi: 5 mL Jumlah fraksi: 74 mL Volume elusi prerun: 80 mL Jumlah maksimum fraksi 80 Range AU: 0,05 Panjang gelombang: 280 nm Time constant: 2 Range : 10 mV Chart speed : 2 mm/min Pump dial setting: 70 Laju alir: 95 mL/min
Vol. 1 No. 2
Analisis Spesi Mangan dalam Cairan ...
Rad) Diameter dalam kolom gel (Bio rad) Panjang gel Derajat polimerisasi poliakrilamid
tersebut akan dipisahkan berdasarkan titik isoelektriknya tanpa mengalami denaturasi. Sebagaimana diketahui bahwa dua biomolekul yang mempunyai aktivitas fungsional biologis berbeda dapat memiliki berat molekul dan struktur kimia yang sama. Tidak seperti metode elektroforesis SDS-PAGE, penerapan metode PNC PAGE memungkinkan differensiasi biomolekul tersebut berdasarkan perbedaan mobilitas elektroforetiknya. Muktiono (2006) dan Kastenholz (2007) telah memisahkan spesi Cd dengan berat molekul tinggi (high molecular mass Cd species, HMM-Cd-SP) dari tanaman Arabidopsis thaliana. Mereka melakukan pemisahan spesi Cd dengan dan tanpa prekonsentrasi pengendapan protein menggunakan ammonium sulfat. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa spesi tanpa perlakuan prekonsentrasi terelusi pada fraksi 24 sedangkan spesi dengan perlakuan prekonsentrasi terelusi pada fraksi 27. Berdasarkan hasil penelitian tersebut, disimpulkan perlakuan prekonsentrasi dapat merubah karakteristik elektroforetik spesi yang kemungkinan disebabkan transformasi spesi. Oleh karena itu, dalam penelitian ini tidak dilakukan prekonsentrasi spesi walaupun konsentrasi Mn dalam sampel kecil. Metode pemisahan PNC PAGE yang diterapkan diadopsi dari Kastenholz (2004) namun menggunakan eluent yang berbeda. Pada penelitian ini digunakan eluent MES sedangkan kastenholz menggunakan eluent Tris-HCL. Dalam paper sebelumnya (Fitri-Arifudin dkk, 2004) telah dikemukakan minimal ada 3 spesi Mn dalam cairan phloem tanaman jarak (tabel 3). Ketiga spesi Mn berkorelasi positif dengan serapan aktif UV cairan phloem. Spesi Mn-1 terdeteksi pada void volum kolom dengan berat molekul relatif > 30 kDa. Kelimpahan spesi ini sangat kecil yaitu sekitar 0,16 – 0,40 % relatif terhadap spesi lainnya. Hal ini menunjukkan keunggulan metode ICP QMS yang diterapkan karena dapat mendeteksi spesi Mn-1 walaupun kelimpahannnya kecil dari 0,5 % dengan konsentrasi 0,10 – 0,15 µg/L perfraksi. Kedua spesi Mn lainnya (Mn-2 dan Mn-3) teridentifikasi pada daerah berat molekul rendah. Berat molekul spesi Mn-2 sekitar 1150 Da dan spesi Mn-3 kurang lebih 420 Da. Van Goor dan Wiersma (1976) juga telah mengidentifikasi adanya spesi Mn dalam cairan phloem dengan berat molekul 1 kDa yang kemungkinan adalah spesi Mn-2. Namun Van Goor tidak menyatakan adanya spesi dengan berat molekul besar dari 30 kDa. Hal ini menunjukkan bahwa penelitian yang dilakukan telah berhasil mendeteksi spesi Mn-1 yang belum pernah teridentifikasi sebelumnya. Tabel 3. Distribusi Spesi Mn dalam cairan phloem tanaman Jarak (Ricinus communis L.). Pemisahan dilakukan dengan menggunakan metode size exclusion chromatography (SEC) pada kolom Sephadex G-50 SF, buffer 20 mM MES/ 1 mM NaN3 pH 8,0. Pendeteksian selektif unsur dilakukan menggunakan ICP QMS (Fitri-Arifudin dkk, 2004).
28 mm 4 cm 4%
Profil distribusi Mn setelah proses pemisahan ditentukan dengan membuat grafik hubungan konsentrasi unsur perfraksi versus nomor fraksi. Kondisi operasional ICP MS dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2. Kondisi operasional ICP QMS Parameter Pendinginan kevakuman Power Tegangan lensa Sistem detektor Laju gas plasma (Argon) Laju gas Auxiliary (Argon) Laju gas nebulizer (Argon) Laju sampel analit Pengolahan sinyal Sweeps/reading Reading/replicate Replicate Sample flush Read delay Wash time Standar internal
Kondisi 10 – 18oC; 1,7 L/min (245 – 420 kPa) < 2 x 10-5 Torr 880 – 1200 Watt (optimasi bulanan) Autolensa (optimasi harian) Dual ( pulsa dan Analog, optimasi bulanan) 20 L/min, 350 kPa 14 L/min 0,90 – 0,98 (optimasi harian) 1,2 mL/min 55 Mn Peak hopping 35 / 5 1 5 45 s 15 s 60 s 115 In (10 µg/L)
HASIL DAN PEMBAHASAN Salah satu hal penting dalam analisis spesiasi adalah mempertahankan spesi target tetap dalam keadaan nativnya. Sehingga strategi pemisahan dan pendeteksian sejak awal mulai dari pengambilan sampel, pengawetan sampel, pengolahan sampel sampai proses pemisahan spesi haruslah dirancang sebaik mungkin (Cornelis, 2003). Dalam penelitian ini, sampling cairan phloem dilakukan pada saat transpirasi dan dilaksanakan di dalam rumah kaca. Selain itu, untuk mencegah terjadinya perubahan komposisi dan spesi dalam cairan phloem, sampel tersebut langsung dibekukan menggunakan nitrogen cair. Sampel cairan phloem dicairkan dalam lemari pendingin bertemperatur 4°C sesaat sebelum dianalisis. Dengan demikian diharapkan tidak terjadi perubahan spesi selama proses pemisahan. Pemisahan spesi Mn dalam cairan phloem tanaman jarak dengan menggunakan metode PNC PAGE diamati dengan detektor UV untuk melihat serapan senyawa aktif UV dalam sampel dan ICP QMS untuk pendeteksian selektif mangan dalam setiap fraksi PNC PAGE. Dalam paper ini yang akan dibahas hanyalah pemisahan spesi Mn dengan menggunakan metode PNC PAGE – ICP QMS. Metode PAGE digunakan untuk memisahkan biomolekul bermuatan dalam medan listrik. Biomolekul
3
Noor Fitri, Björn Thiele, Klaus Günther, dkk
Mar. Chim . Acta
1)
Spesi
Berat molekul relatif (Da)1)
Kelimpahan relatif (%)
Identifikasi lebih lanjut keberadaan spesi Mn dalam cairan phloem dilakukan dengan menggunakan metode PNC PAGE. Pada Gambar 1 dapat dilihat profil spesi Mn setelah pemisahan PNC PAGE dan pendeteksian selektif unsur ICP QMS. Pada gambar tersebut terdeteksi satu puncak dimulai pada fraksi 18 sampai fraksi 35. konsentrasi tertinggi Mn sebesar 2,489 µg/L pada fraksi 24. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang dterapkan telah berhasil memisahkan spesi Mn dalam cairan phloem tanaman jarak dengan baik dan sukses sebagaimana spesi Boron (Fitri-Arifudin dkk, 2006). Telah dilakukan juga analisis spesiasi untuk unsur Zn, Ca, dan Mg dengan menggunakan metode yang sama, namun tidak diperoleh hasil yang menunjukkan adanya puncak spesi. Hal ini mengidentifikasikan spesi Mn dapat dipisahkan dengan baik dan cukup stabil dengan menggunakan metode PNC PAGE- ICP QMS sedangkan unsur Zn, Ca, dan Mg tidak stabil walaupun dapat dipisahkan juga dengan menggunakan metode SEC (Fitri-Arifudin, 2004)
Mn1
> 30000
0,16 - 0,40
Mn2
1150 ± 160
72,18 - 77,81
Mn3
420 ± 60
22,03 – 22,44
berat molekul relatif ditentukan dengan menggunakan kurva kalibarasi standar protein dan volume elusi ditentukan dari fraksi SEC yang mengandung konsentrasi Mn tertinggi.
SEC terdeteksi 3 spesi Mn. Hal ini menunjukkan kemungkinan hanya ada satu spesi Mn yang bermuatan atau ketiga spesi tersebut terelusi pada fraksi yang berdekatan. KESIMPULAN Spesi mangan dalam cairan tanaman Jarak telah berhasil diisolasi dengan sukses dengan menggunakan metode PNC PAGE – ICP QMS pada orde konsentrasi 0,1 – 3 µg/L. Spesi tersebut tedeteksi pada fraksi 17 sampai 35 dimana puncak spesi pada fraksi 24 dengan konsentrasi 2,489 µg/L. Hal ini menunjukkan bahwa spesies ini cukup stabil pada kondisi pemisahan yang dilakukan. Analisis lebih lanjut untuk mengungkap struktur molekul spesi Mn dapat dilakukan dengan menggunakan metode LC-MS/MS, MALDI-TOF-MS dan/atau ESI MS. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta dan Institute for Chemistry and Dynamics of the Geosphere: ICG-III Phytosphere, Research Center Juelich, Germany, yang telah mendanai penelitian ini.
3.0 Mn 55
konsentrasi Mn/fraksi (µg/L)
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
Nomor fraksi
Gambar 1. Khromatogram PAGE cairan phloem Ricinus communis (eluent 20 mM MES/1 mM NaN3 pH 8.0). Konsentrasi Mn dalam setiap fraksi ditentukan dengan menggunakan ICP QMS. Batas kuantifikasi (LOQ) 0,863 µg/L, dihitung dari nilai rata-rata larutan blanko + 10 SD)
Pada Gambar 1 terdeteksi hanya ada satu puncak Mn sedangkan dengan menggunakan metode DAFTAR PUSTAKA Brauer, M., Zhong, W.J., Jelitto, T., Schobert, C., Sanders, D., dan Komor, E. (1998): Free calcium ion concentration in the sieve-tube sap of Ricinus communis L. seedlings, Planta, 206, no. 1, 103-107. Caruso, J. A., Klaue, B., Michalke, B., dan Rocke, D.M. (2003): Group assessment: elemental speciation, Ecotoxicology and Environmental Safety, 56, no. 1, 32-44. Chery, C.C. (2003): Gel Electrophoresis for Speciation Purposes, 224-239 dalam Cornelis, R., Caruso, J., Crews, H., dan Heumann, K., Eds, Handbook of Elemental Speciation: techniques and Methodology, Wiley, England. Cornelis, R., Caruso, J., Crews, H., dan Heumann, K. (2003): Introduction, 1-6 dalam Cornelis, R., Caruso, J., Crews, H., dan Heumann, K., Eds, Handbook of Elemental Speciation: techniques and Methodology, Wiley, England. Fitri-Arifudin, N, B. Thiele and K. Guenther, 2004, Elemental fractionation of phloem sap from Castor bean on Sephadex G-50 SF column, Proceedings of 9th ISSM 2004 (ISSN 0855-8692), Aachen, Germany Fitri-Arifudin, N., Thiele, B., Guenther, K., Buchari, dan Amran, M.B. (2006): Analysis of boron species in phloem sap of castor bean (Ricinus communis L.) using PNC PAGE-ICP MS, Oral presented on Seminar Nasional Himpunan Kimia Indonesia 2006, IPB, Bogor, Indonesia and will be published in the Proceedings of HKI Ji, G. (1997): Charakterisierung hochmolekularer Cadmiumspezies in kontaminierten pflanzlichen Lebensmitteln, 2
Vol. 1 No. 2
Analisis Spesi Mangan dalam Cairan ...
Dissertation ISBN 3-89588-981-4, Cuviller Verlag, Göttingen. Jongebloed, U., Szederkenyi, J., Hartig, K., Schobert, C., dan Komor, E. (2004): Sequence of morphological and physiological events during natural ageing and senescence of a castor bean leaf: sieve tube occlusion and carbohydrate back-up precede chlorophyll degradation, Physiologia Plantarum, 120, no. 2, 338-346. Kastenholz, B., 2004, Preparative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (PNC-PAGE): An efficient method for isolating Cd cofactors in biological systems, anal. Letters, 37 No.4: 657-66 Kastenholz, B., 2006, Comparison of the elektrochemical behavior of the high molecular mass cadmium proteins in Arabidopsis thaliana and in vegetable plants on using Preparative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (PNC-PAGE), Electroanal., 18 No.1: 103-106 Kastenholz, B., 2007, New hope for the diagnosis and therapy of Alzheimer’s disease, Protein & Peptide Letters, 14: 389-393 Michalke, B. (2004): Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry, J.Chromatog.A, 1050, 69-76. Michalke, Bernhard. (2002): The coupling of LC to ICP-MS in element speciation: I. General aspects, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 21, no. 2, 142-153. Michalke, Bernhard. (2003): Element speciation definitions, analytical methodology, and some examples, Ecotoxicology and Environmental Safety, 56, no. 1, 122-139. Milburn, J.A. (1970): Phloem exudation from castor bean: induction by massage, Planta, 95, 272-276. Muktiono, B., 2006, Multielementspeziation in pflanzlichen Lebensmitteln mittels offline Kopplung von SepharcylS400-HR Gelpermeationschromatographie (GPC) und Induktiv gekoppelten Plasma QuadrupolMassenspektrometrie (ICP-QMS), Dissertation, Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Willhelms-Universität Bonn, Germany Mullins, G.L., Sommers, L. E. dan Housley, T.L. (1986): Metal spesiation in xylem and phloem exudates, Plant & Soil, 6, 377-391. Needham, L. L., D. G. Patterson, D. B. Barr, J. Grainger, dan A. M. Calafat. (2005): Uses of speciation techniques in biomonitoring for assessing human exposure to organic environmental chemicals, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 381, no. 2, 397-404 Pittman, J. K. (2005): Managing the manganese: molecular mechanisms of manganese transport and homeostasis. New Phytologist 167, no. 3, 733-742. Rosen, A. L. dan G. M. Hieftje (2004): Inductively coupled plasma mass spectrometry and electrospray mass spectrometry for speciation analysis: applications and instrumentation, Spectrochimica Acta Part B-Atomic Spectroscopy, 59, no. 2, 135-146. Schmidke, I. dan Stephan, U.W. (1995): Transport of Metal Micronutrients in the Phloem of Castor Bean (RicinusCommunis) Seedlings, Physiologia Plantarum, 95, no. 1, 147-153. Schmidke, I., Kruger, C., Frommichen, R., Scholz, G., dan Stephan, U.W. (1999): Phloem loading and transport characteristics of iron in interaction with plant-endogenous ligands in castor bean seedlings, Physiologia Plantarum, 106, no. 1, 82-89 Stephan, U. W., Schmidke, I., dan Pich, A. (1994): Phloem Translocation of Fe, Cu, Mn, and Zn in Ricinus Seedlings in Relation to the Concentrations of Nicotianamine, An Endogenous Chelator of Divalent Metal-Ions, in Different Seedling Parts. Plant and Soil, 165, no. 2, 181-188. Szpunar, J. (2000): Trace element speciation analysis of biomaterials by high-performance liquid chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 19, no. 2-3, 127-137. Szpunar, J. (2005): Advances in analytical methodology for bioinorganic speciation analysis: metallomics, metalloproteomics and heteroatom-tagged proteomics and metabolomics. Analyst, 130, no. 4, 442-465. Szpunar, J. dan Lobinski, R. (2002): Hypenated techniques in speciation analysis, Royal society of chemistry, Cambridge, 149-161. Van Goor, B. J. dan Wiersma, D. (1976): Chemical forms of manganese and zinc in phloem exudates, Physiol.plant., 36:213-216. Vanhaecke, F. dan köllensperger, G. (2003): Detection by ICP MS, 281-312 dalam Cornelis, R., Caruso, J., Crews, H., dan Heumann, K., Eds, Handbook of Elemental Speciation: techniques and Methodology, Wiley, England. Zhong, W. J., Schobert, C. dan Komor, E. (1993): Transport of Magnesium ions in the Phloem of Ricinus-Communis L. Seedlings, Planta, 190, no. 1, 114-119.
5
