Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 ANALISIS KANDUNGAN ASAM LEMAK OMEGA-3 DAN 6 PADA BAGIAN KEPALA DAN BADAN IKAN LELE (CLARIAS Sp) MELALUI REAKSI ENZIMATIS Erin Ryantin Gunawan, , Dedy Suhendra, Sri Seno Handayani, Lely Kurniawati, Murniati, Nurhidayanti Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Mataram, Jl. Majapahit No. 62 Mataram, NTB Corresponding author , email: erinryantin@unram. ac. id
Abstrak.Asam lemak essensial sangat diperlukan oleh janin dan bayi untuk perkembangan otak dan daya tahan tubuh terhadap penyakit serta perkembangan indra penglihatan dan sistem kekebalan tubuh bayi dan balita. Ikan merupakan salah satu gizi yang mengandung asam lemak yang kaya akan manfaat, karena mengandung sebagian kecil asam lemak jenuh dan sebagian besar asam lemak tak jenuh. Contoh asam lemak essensial adalah asam lemak Omega-3 yaitu asam eikosapentaenoat atau EPA (C20:5) dan asam dokosaheksaetanoat atau DHA (C22:6) dan salah satu contoh asam lemak omega-6 yaitu asam linoleat (C18:2). Ikan Salmon, Tuna, Hering dan Mackerel adalah jenis ikan dengan kandungan asam lemak esensial yang tinggi akan tetapi mempunyai harga yang mahal. Sehingga suplemen makanan yang diekstrak dari ikan-ikan tersebut akan mempunyai harga yang mahal. Ada beberapa jenis ikan dengan harga ekonomis dan mengandung cukup banyak kandungan asam lemak esensial bahkan terdapat pada bagian kepala dari ikan yang biasanya jarang dikonsumsi. Kepala ikan yang biasanya tidak termanfaatkan adalah bagian kepala dari ikan Lele atau Clarias Sp. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk membandingkan kandungan asam lemak omega-3 dari bahan terbuang seperti dari kepala ikan lele dan pada bagian badan ikan lele. Tahapan penelitian meliputi ekstraksi, transesterifikasi enzimatis dan analisis menggunakan GC-MS. Dari hasil analisis didapatkan kandungan asam lemak omega-3 pada bagian kepala ikan lele berturut-turut adalah DHA 0,71% dan EPA 1,55%. Asam lemak omega-6 atau asam Linoleat 0,37%. Untuk bagian badan ikan lele terdapat DHA 0,68% dan EPA 0,43%, asam linoleat 0,39%. Dari data ini terlihat bahwa bagian yang tidak termanfaatkan yaitu bagian kepala dari ikan Lele mempunyai kandungan omega-3 dan 6 yang hampir setara dengan bagian badan, bahkan untuk kadar omega-3 pada bagian kepala ikan lele sedikit lebih tinggi daripada bagian badan ikan Lele. Kata Kunci: Clarias Sp., asam lemak omega-3, asam lemak omega-6, enzim lipase.
D-1
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 dibandingkan dengan cara kimiawi. Beberapa keunggulan dari cara enzimatik adalah jumlah enzim yang digunakan tidak dalam jumlah yang banyak dan dapat digunakan beberapa kali (reusability), ramah lingkungan dan dapat bekerja pada suasana netral daengan suhu kamar. Cara ini juga memungkinkan untuk kemudahan dalam pemurnian hasil. Berdasarkan latar belakang di atas maka telah dilakukan penelitian untuk menganalisis kandungan asam lemak esensial terutama pada ekstrak minyak ikan Lele (Clarias Sp) pada bagian kepala yang biasanya tidak dikonsumsi dan pada bagian badan. Analisis dilakukan melalui reaksi enzimatis dan dikarakterisasi dengan TLC/KLT dan GCMS.
PENDAHULUAN Ikanmerupakansalahsatugizi yang mengandungasamlemak yang kaya akanmanfaat, karenamengandungsebagian kecilasamlemakjenuhdan sebagian besar asamlemaktakjenuh. Asamlemaktakjenuhganda (polyunsaturated fatty acid/ PUFA) yang terdapat dalam ikan akanmembantu proses tumbuhkembangotak (kecerdasan), sertaperkembanganindrapenglihatandansistemk ekebalantubuhbayidanbalita. Sebagian asam lemak tak jenuh ada yang disebut asam lemak omega-3. Asam-asamlemakalami yang termasukasamlemak Omega-3 adalahasamlinolenat (C18:3 w3),asameikosapentaenoatatau EPA (C20:5 w3), asamdokosaheksaetanoatatau DHA (C22:6 w-3)[1] (Marinetti,1990) ,adapun yang lebihdominandalamminyakikanadalah DHA (asamdokosaheksaetanoat) dan EPA (asameikosapentaenoat). Omega3banyakdijumpaipadaberbagaiproduklaut, seperti alga danikanlaut.Ikanlautseperti salmon, tuna, heringdan mackerel adalahikandengankandungan omega-3 tinggiakantetapiikanikaninimerupakanikandengannilaiekonomi yang tinggi. Sehinggaminyakikan yang dihasilkanmenjadi mahalharganya. Ada beberapa jenisikandenganhargaekonomismengandungcu kupbanyakkandungan omega-3 bahkan omega-3 terdapat pada bagian kepala dari ikan yang biasanya jarang dikonsumsi. Kepala ikan yang biasanya tidak termanfaatkan adalah bagian kepala dari ikan Lele Ikan lele merupakan salah satu jenis ikan air tawar komersial yang populer sebagai ikan budidaya. Ikan lele termasuk dlam kelas Pisces dan family Claridae dengan nama spesies yakni Clarias Sp. . Kandungan lemak pada ikan lele dalam berat kering adala h sekitar 8%. [2] Khairiman, 2008 Komposisi asam-asam lemak yang terdapat dalam minyak dan lemak dapat dianalisis melalui reaksi esterifikasi secara enzimatis yang di katalisis oleh enzim lipase [3](Gunawan dan Suhendra,2008). Reaksi enzimatik mempunyai berbagai keunggulan
METODE PENELITIAN Alat Alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah Gelas kimia, Labu takar, Erlenmeyer, Corong gelas, Gelas ukur, Vakum, Rotaryevaporator, Corong pisah, Soxlet, MagneticStirrer, Buret, Pipet tetes, pipet volume, Pemanas electric, Oven, Desikator, Kolom Kromatografi, Statif dan klem, Termometer chamber, Termometer, Batang pengaduk, GCMS. Bahan Bahan Adapun bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikanlele, n-heksan, natrium sulfat anhidrat, plat KLT, dietil eter, kertas saring, enzim lipase, trigliserida standar, asam lemak standar, KOH, etanol, HCl, CCL4, Na2S2O3, KI. Larutan Hanus, Kanji. Preparasi Sampel Sampel ikan lele dicuci bersih dan untuk memudahkan ekstraksi, ikan lele tersebut di pisahkan antara kepala dan badannya. Bagian kepala dan ikan dihaluskan kemudian diukur kadar airnya. Ektraksi trigliserida/minyak ikan
D-2
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 Sampel ditimbang kemudian dibungkus dengan kertas saring dan diikat agar bungkusan tidak terlepas. Sampel yang sudah diblender ditimbang kemudian dimasukkan kedalam alat soxletasi, ditambahkan 250 ml heksan dan diekstraksi selama 6 jam berturut-turut. Hasil ekstraksi (fraksi heksan) yang berupa minyak dan heksan dipisahkan dengan menggunakan rotary evaporator. Penguapan dilakukan dengan suhu 40°C
berwarna biru tepat hilang setelah diaduk. Perlakuan dibuat sama untuk larutan blangko Transesterifikasi enzimatik Etanol absolut ditambahkan ke dalam trigliserida bagian kepala dan badan dengan perbandingan 1:2. Setelah itu masing-masing ditambahkan 0,2 gram enzim lipase dalam bentuk Lipozim dan 10 ml n-heksan.. Kemudian diletakkan dalam water bath shaker selama 24 jam pada suhu 40°C dan 150 rpm. Setelah itu dianalisis dengan alat spektrofotometer GC-MS.
Identifikasi trigliserida/minyak ikan Diatas plat KLT, minyak ikan yang diperoleh di bandingkan dengan standar minyak ikan. Minyak yang di peroleh dari hasil ekstraksi dan standar minyak ikan di totol masing masing pada plat KLT pada jarak ± 1 cm dari bagian bawah plat KLT. Kemudian plat dicelupkan dalam chamber yang berisi eluen n-heksan dan dietil eter dengan perbandingan 8,5 : 1,5. Selanjutnya ditentukan harga Rf dari sampel dan standar.
Analisis dengan GC-MS Analisis asam lemak omega 3 dan 6 yang terkandung dalam trigliserida/minyak ikan dengan menggunakan GC-MS produksi Shimadzu Model GCMS-QP2010 Ultra ( Jepang), kolom Rt-X 5 ms 30 m crossbond 5% diphenil/dimethyl polysiloxane 0,25 mm ID (restek). HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Bilangan Penyabunan Minyak sebanyak ± 2 gram dimasukkan kedalam labu alas bulat 500 ml yang dihubungkan dengan pendingin. Kemudian ditambahkan 25 ml KOH dalam etanol 0,5 N dan batu didih. Campuran direfluks selama 60 menit. Setelah campuran dingin kemudian dititrasi dengan menggunakan larutan HCL 0,5 N hingga warna jingga dari indikator hilang. Perlakuan dibuat sama untuk larutan blangko
Preparasi Sampel Sampel ikan lele dipisahkan Bagiankepala dan badan ikan lele dan dibersihkan kemudian dihaluskan dan diukur kadar airnya. Metode penentuan kadar air yang digunakan ini adalah metode gravimetri Hasil penentuan kadar air menunjukkan rata-rata kadar air kepala ikan lele (60%) lebih kecil dibandingkan badan ikan lele (74%). Ini dikarenakan bagian kepala ikan sebagian besar terdiri dari bagian yang keras/batok kepala yang kurang mengandung air. Pada ikan secara umum biasanya kandungan air ditambah lemak sama dengan 80% dan apabila kadar lemak semakin tinggi maka kadar air semakin rendah [4](Sudarmaji, 2003)
Uji Bilangan Iod Minyak sebanyak 2 gram dimasukkan kedalam labu alas bulat yang dihubungkan dengan pendingin. Ditambahkan 15 ml CCL4 untuk melarutkan minyak dan 25 ml hanus (10 gram iodin monobromide dalam 500 ml asam asetat), aduk hingga bercampur semua. Campuran dibiarkan dalam tempat gelap selama 60 menit. Setelah itu tambahkan 20 ml larutan KI 15% dan ditambahkan 100 ml aquades yang telah didihkan dan segera dititrasi dengan larutan Na2S2O3 0,1 N sampai larutan berwarna kuning pucat, kemudian ditambahkan 4 ml larutan kanji dan dititrasi kembali sampai larutan
Ektraksi trigliserida/minyak ikan Pada ekstraksi minyak dan badan ikan lele digunakan metode soxhletasi. Pemilihan metode soxhletasi dilakukan berdasarkan keunggulan metode ini jika dilihat dari waktu serta jenis pelarut yang digunakan. Waktu yang D-3
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 digunakan relatif singkat dan pelarut yang digunakan juga lebih sedikit jika dibandingkan dengan metode maserasi perkolasi serta proses yang terjadi merupakan proses berkesinambungan [5](Sarker et al , 2005). Minyak/trigliserida secara umum mempunyai sifat non polar, karena banyaknya rantai panjang dalam asam lemaknya. Sehingga untuk dapat melarutkannya digunakan pelarut yang bersifat non polar dan mudah larut dengan polaritas yang sama. Pelarut yang digunakan untuk mengekstrak minyak pada ikan lele adalah n-heksan yang bersifat non polar. Dari hasil ektraksi minyak kepala dan badan ikan lele di peroleh kadar minyak kepala yang lebih tinggi yaitu 21,75% sedangkan kadar minyak badan sebesar 15,94%. Perbedaan kadar minyak yang didapatkan dipengaruhi oleh adanya perbedaan kadar air pada kepala dan badan lele. Semakin tinggi kadar air yang terdapat pada sampel maka semakin kecil kadar minyaknya. Berdasarkan uji kadar air yang diperoleh pada kepala ikan lele lebih kecil dibandingkan dengan kadar air yang terdapat pada badan ikan lele sehingga kemungkinan minyak yang terdapat pada badan ikan lele akan sulit terekstrak dibandingkan dengan minyak yang terdapat pada kepala ikan lele.
Gambar 1. A. Spot minyak kepala ikan, B. Spot minyak badan ikan, C. Spot standar Bilangan Penyabunan Bilangan penyabunan digunakan untuk mengetahui ukuran atau panjang rantai C asam lemak dan menunjukkan secara relatif besar kecilnya molekul asam lemak yang terkandung dalam minyak. Minyak yang disusun oleh asam lemak berantai C pendek berarti mempunyai berat molekul relatif kecil akan mempunyai angka penyabunan yang besar dan sebaliknya minyak yang tersusun oleh asam lemak berantai C panjang berarti mempunyai berat molekul besar dengan angka penyabunan yang relatif kecil (Sudarmadji dkk, 2007). Dari hasil penelitian yang dilakukan didapatkan bilangan penyabunan untuk ikan lele sebesar 158,4 mg KOH/gr.. Angka penyabunan ikan lele relatif kecil dibandingkan dengan minyak ikan patin [6] (Almunady dkk, 2011) hal ini disebabkan kemungkinan karena ikan lele kandungan asam lemak penyusunnya mempunyai rantai C yang lebih panjang.
Identifikasi trigliserida/minyak ikan Dari hasil identifikasi dengan kromatografi tipis (KLT), nilai faktor retemsi (Rf) trigliserida standar sebesar 0,77, sedangkan nilai R f untuk minyak ikan lele kepala dan badan ikan lele sebesar 0,68 dan 0,82 (gambar 1). Dari harga Rf yang relatif sama maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak kepala dan badan ikan lele mengandung trigliserida.
Bilanagan Iod Bilangan iod dinyatakan sebagai jumlah gram iod yang diikat oleh 100 gram minyak atau lemak. Bilangan iod mencerminkan ketidakjenuhan asam lemak penyusun minyak atau lemak. Asam lemak tidak jenuh mampu mengikat sejumlah iod dan membentuk senyawa yang jenuh. Banyaknya iod yang dapat diikat menunjukkan banyaknya ikatan rangkap. (Sudarmadji et al, 2007). Angka iod yang tinggi menunjukkan banyaknya ikatan D-4
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 rangkap. Semakin banyak jumlah iod yang terabsorbsi oleh suatu minyak maka semakin sedikit pula ikatan tidak jenuh yang di kandung minyak tersebut. Ikatan rangkap yang terdapat dalam asam lemak tidak jenuh akan bereaksi dengan iod atau senyawa-senyawa iod. Minyak yang mengandung asam lemak dengan ketidakjenuhan tinggi, akan mengikat iod dalam jumlah yang lebih besar[7] (Ketaren, 2005). Dari hasil yang didapat, bilangan iod untuk ikan lele yaitu 158,64 gr/100gr minyak. Semakin besar nilai bilangan iodium maka semakin tinggi ketidak jenuhannya pada asam lemaknya.
aminolisis, dan transesterifikasi (acidolisis, interesterifikasi, alkoholisis) [9](Mala & Takeuchi, 2008). Pada reaksi ini, proses pemutusan asam lemak dari trigliserida dan mengubahnya menjadi ester lemak berlangsung dalam satu tahap. Dari reaksi transesterifikasi dihasilkan senyawa ester asam lemak. Ester asam lemak yang telah didapat sebelum dianalis dengan GC-MS terlebih dahulu diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis dengan membandingkan dengan standar ester asam lemak. Eluen yang digunakan sama seperti pada identifikasi trigliserida yaitu n-heksan dan dietik eter dengan perbandingan (8,5 : 1,5). Dari nilai Rf yang didapat baik hasil trasnesterifikasi badan maupun kepala menunjukan Rf yang hampir sama yaitu untuk standar 0,43; kepala 0,4 dan badan 0,33. Hal ini menandakan reaksi transesterifikasi telah berjalan dengan baik. Gambar berikut memperlihatkan kromatogram hasil reaksi transesterifikasi.
Transesterifikasi enzimatik Transesterifikasi merupakan proses pengubahan trigliserida menjadi metil ester dan gliserol. Reaksi ini biasanya juga disebut dengan reaksi alkoholisis kerena melibatkan alcohol selama reaksinya. Pada penelitian digunakan reaksi transesterifikasi enzimatis menggunakan katalis enzim lipase dalam bentuk Lipozim.Reaksi yang terjadi selama proses transesterifikasi berlangsung adalah sebagai berikut : O H2 C HC H2C
O O O
C C
R2
C
O R3
Trigliseri da
O
R1 O
2HC
OH
HC
OH
H2C
OH
Lipase
C2H5OH
Etanol
R
C
O
C2H5
Ester lemak
Gliserol
Gambar 2. Kromatogram lapis tipis, A=standar ester asam lemak, B. Ester asam lemak bagian kepala, C. Ester asam lemak bagian badan
Reaksi transesterifikasi dilakukan secara enzimatis menggunakan lipozim atau enzim yang sudah diimobilisasi karena memiliki keunggulan yaitu kondisi reaksi yang tidak ekosterem, sedikitnya hasil samping reaksi, dan spesifik [8](Villeneuve, et al., 2000). Selain itu dengan adanya katalis ini mampu mempercepat terjadinya kesetimbangan., ramah lingkungan dan mudah memisahkan enzim nya serta serta tidak membutuhkan pencucian berulang untuk pemurnian. Enzim lipase ini merupakan enzim yang digunakan sebagai biokatalis untuk berbagai reaksi seperti hidrolisis, esterifikasi,
Analisis Asam Lemak dengan GC-MS .Asam lemak (dalam bentuk ester lemak) yang dihasilkan melalui proses transesterifikasi dianalisis menggunkan Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS). Hal ini bertujuan untuk mengetahui kandungan asam lemak esensial kepala dan
D-5
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 badan lele.Berikut ini adalah kromatogram standar asam lemak.
Gambar
3.
Kromatogram Standar linoleat, Rf =12,985 menit
Gambar 6. Kromatogram asam lemak dalam kepala lele (Rf puncak 12, Rf=12,866 menit,puncak 13, Rf=13,122, Rf puncak 14 Rf= 14,448, puncak 16 Rf=14,795 menit).
Asam
Gambar 4. Kromatogram Standar EPA, Rf=13,058
Gambar 7. Kromatogram asam lemak dalam badan ikan lele (puncak 12, Rf=12,861 menit, puncak 13 Rf=13,070 menit, Rf puncak 17, Rf =14,773 menit). Pada hasil kromatogram antara standar dengan hasil tranesterifikasi ikan lele, dapat disimpulkan bahwa kedua sampel tersebut antara kepala dan badan lele mengandung asam lemak esensial sesuai dengan standar yang digunakan yaitu, asam linoleat (omega 6), EPA (omega 3) dan DHA (omega ). Hal tersebut dapat diketahui dari puncak dengan waktu retensi yang sama antara sampel dan standarnya. Berdasarkan data kromatogram diatas, berikut dapat dilihat perbandingan kandungan asam linoleat, EPA dan DHA pada bagian kepala dan badan minyak ikan lele.
Gambar 5. Kromatogram Standar DHA, Rf=14,552 menit
D-6
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 Tabel1. Jenis dan Kompisis Asam Lemak N o
JenisAsamLemakEsens ial
Komposisi Asam lemak (%) Kepal Bada a n
1.
Linoleat
0,37
0,39
2.
EPA
1,55
0,43
3.
DHA
0,71
0,68
Gambar 7. Fragmentasi Asam linoleat
Gambar 8. Fragmentasi EPA
Berdasarkan tabel diatas, untuk sampel minyak ikan lele memiliki kandungan yang sama antara kepala dan badan ikan lele, yakni baik kepala maupun badan ikan lele sama-sama mengandung asam lemak esensial omega 3 dan omega 6 berupa DHA, EPA dan linoleat (ALA), namun dengan kadarnya yang berbeda. Kandungan asam lemak omega 3 terbesar ada pada bagian kepala yaitu jenis EPA sebanyak 1,55% dan Kandungan asam lemak omega 3 terbesar ada pada bagian badan yaitu DHA sebanyak 0,68%. Tetapi secara total kandungan asam lemak omega 3 terdapat lebih banyak pada bagian kepala (2,26%). Sedangkan untuk jenis omega-6, kandungan di bagian badan dan kepala relatif tidak jauh berbeda..
Gambar 8. Fragmentasi DHA PENUTUP Simpulan 1.
Corak Pragmentasi Fragmentasi dibuat berdasarkan berat molekul yang didapatkan dari hasil GC-MS pada lampiran IV yang bertujuan untuk lebih meyakinkan kita bahwa hasil yang didapatkan berdasarkan waktu retensi (Rf) adalah benar senyawa yang kita inginkan dengan melihat fragmentasinya. Berdasarkan hasil berat molekul (mass spect) yang terdapat pada lampiran antara standar dengan sampel baik transesterifikasi maupun esterifikasi kepala dan badan ikan lele hasil analisis GCMS dapat buat fragmentasi untuk ekstrak minyak ikan kepala dan badan lele adalah sebagai berikut:
2.
Dari hasil analisis menggunakan alat Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) kepala dan badan ikan lele baik melalui transesterifikasi enzimatik mengandung asam lemak esensial berupa omega-3 yakni DHA, EPA dan asam lemak omega-6 berupa asam linoleat. Bagian kepala dari ikan lele yang tidak dimanfaatkan dapat digunakan sebagai sumber asam lemak esensial, omega 3 dan omega 6.
Saran Perlu dilakukan penelitian tentang penyeimbangkan ratio omega-3 dan omega-6 yang diperlukan tubuh manusiapada minyak ikan dari kepala ikan Lele atau sumber lain yang belum termanfaatkan. DAFTAR PUSTAKA 1. Marinetti, G.V., 1990, Disorders of Lipid Metabolism, Plenum Press, New York and London Netherlands: Wageningen University D-7
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3 Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014 2. Khairuman, K, Amri, Sihombing, T., 2008. Budidaya lele Dumbo di Kolam Terpal, PT. Agromedia Pustaka, Depok.
Minyak Ikan Patin (Pangasius pangasius) dengan metoda Kromatografi Gas. Jurnal Penelitian Sains, Vol.14. 7. Ketaren, S. (2005). Pengantar Teknologi Minyak dan Lemak Pangan. Jakarta: UI Press. 8. Villeneuve, P., Muderhwa, J., Graille, J., & Haas, M. (2000). Customizing lipases forbiocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches. Journal of molecular catalysis B: enzymatic, 9, issues 4-6, , 113-148
3. Gunawan, E.R. dan Suhendra, D. (2008). Wax Ester Production by Alcoholysis of Palm Oil Fractions. Indonesian Journal of Chemistry,8 (3): 356 – 362 4. Sudarmadji, S., Haryono, B., Suhardi. 2007.analisis bahan makanan dan pertanian. Liberty:Yogyakarta.
5. Sarker, H., Latif, Z., Gray., 2005. Natural Products Isolasi Second Edition, Human Press 6. Almunady, T. P., Yohadini H., Gultom, J.U., 2011, Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Asam lemak tak jenuh Omega 3 dari
9. Mala, J. G., & Takeuchi, S. (2008). Understanding Structural Features of Microbial Lipases-An Overview. Analytical Chemistry Insights, 9-19.
D-8
