Jurnal KedokleranGigi Uni\ersilasIndoresia rssN0854-364X
J KG Li! 2A03 : I A(Edi.ti K htsrs)29,1-298 Dnt,:nkan diJakafta
ANALISA URUTAN GEN I65 TRNA DARI BAKTERI ORAL YANG TIDAK DIKENAL Ariadna Djais, Futoshi N:tkazslla dan Etsuro Hoshino
NiigataUnirersitl Coursetbr life Science. DivisionofOral Ecologyin Ilealthand Disease. CraduatcSchoolof Medical and Dcntal Sciences
Urulatgen16SrRNAdarjBakteriOral Itsuro Hoshino: Analisa AriadnaDjsis.FutoshiNakazarva, -298 Indonesia.200i: l0(EdisiKhusus):294 Gigi uni\crsnas YangTidakDikenal. JurnalKedokteran
Abstract 'Ihe purpose ofthis stud] wasto idenriti five unknownbactefialslrainsby usingI6S rRNA gene pockerare culrure-difficult sequencing. Thes€sirajnsisolatedfrom endodonticlesionsand periodontal bacierjal specjes by nor be classified to an) eslablished andcould andinerlin moll biochemicallests. genomic uas exlracted tlom tlre prescnt stud). DNA melhod. In the conventional bacteriological culturedbacterialcellswith Instacene(BIO-RAD).andthc l65 rRNA Senewasamplificdby PCRwith by (27Fand 1492R)and Premix'1aq(Ex Taq version,Taka.a),thenwas s€quenced universalprin1ers Kit (Amersham)and an LabelledPrimerCycle Sequencing Fluorescent usinga ThermoSequenase (Pharmacia nucleotidesequences of 165 rDNA l,KB). The segmented AlFexpr€ssDNA sequencer program (DNASTAR).'Ihe l6S iDNA wereintegrated by usingSEQMANin LASERGFINI:compuler bacierialstrainwereappliedto GenBankb] usingBLAST programto search seque"ces ofthe unkno\\,n similarities thc iuspecledbacterialspecies. The MEGAT-lGNsearchprogramshow€dthal the scquence \l].cies. pneumosinlcs among the eslablished bacterial were89.5%-91.:l%to a iype strainofDialister presented uve unknown strains have to be a new the ph)logeneric data. it is considefed thar the Basedon asDialisrcrlikebacteriunr. bacterialspecies Ke) words Idenlify:unknownbacterialstrains:l65 rRNA gene
Pendahuluan Di alanr dapat dipasl'kaDbahrva se.jumlah besar bakteri belum dapat diklasifikasikan. bahkan belum dapat diideDtifikasi denganmetoda)ang sudah ada.Demikianjuga deDganspesiesbakteri yang merupakan flora di poketperiodontal atau lesi endodontik,banyakyang belum te.J: .r. Diperkirakan sekitar 50% dari ikroflora tersebut yang belum ' teridentifikasi.' PadapenelitianiDi. sampelberupa lima strainbakterihasil isolasidari lcsi KPPlKG XIII Temullnriah
yaDg endodontikdan poket periodontal, sulit untuk dibiak.Bakteritersebuttidak dapattombuhpadamediacair PY-glukosa. Cifi dari strain tersebut.bersifatanaerob obligat, lidak bergerak.tidak berspora. berbentukkokus kecil (0.5un) dengan susunan sendiri atau berbentuk rantai pendek. Hasil pewamaao Gram menunjukan hasilyang tidakpasti,secara benamaan tampak negatif Gram dan positifGram.negatifCram disini tampa lebih dominan.Pada agar darah lang drkcram sccara anaerobselama 7 hari, pedumbuhan berupakoloni menuniukan
Ariadna Dla$, Futo'hiNakazava dah Etsuro Hoshino
kecil (kurang dari lmm). dengaf [arakterinik bundar. menorlol atau cembuDg,keruh dan berwarnaabu-abu. oleh karena balleri tersebul sulr untuk dikultur dan juga tidak memberikan r(xk.i pada umumn)a (ri biolimia. sehiDgga untuk identifikasi bakteri yang I|dak drkc al it|i. maka digunal'anmelod:. (. Mcrodi gene .\equen, rR\A lb\ 'nolekuler ini dapat digunakan unluk menderek.i .pe.ie. balleri )ang suli lumbuh atau bahkan untuk bakteri ' a ]ang r d r ( m u n g l i n t u r r b u h( e k a l i p u n P a d a 'ddr ini. penerapandati t-henotL\ononr JdI nrelode rnole(rrler .ebagai ala. ^'arifikasrkelnrrrpoktaksonomidarr telal, unluk memperketralkat. lreunaLan berbagarspeslesyang baru, balteri berda.arkar, Cara iderrtifil,asr urLrtan l65 rDNA, merupakan cara yang pall.rgrnrrtahir dan dlLrral.oleh lare|ladald ata. urutan D\A yang pa.ti lrddrarlan Tehnik ini lebih dapal dipercaya dan lebih repal drbandingkan dengdn tehnil berdasarkan hasil metabolism. rdenlrfikasi dan morfologi secara konvensional.r'6 luJuan dan penelitianrni adalah untuL lelima balteri )ar)g sulit menCrdentrfikas' unruI dibiak ter<ebul.Unluk mencapa. r,l,'r rersebul.digunalan metoda 165 rR\iA gene sequenc€untuk mendapatkan uru6n gen l6s rDNA dari masing-masing Lelimabakteritadi.
Bahandan Cara Kerja Persiaprndari DNA Sel pellet bakleri disuspensikan l*edalamsaliD nornal steril. suspensi reEebut^kemudiandisentrifugasil2 000 rpm. 20"C, selamal5 menit. Setelah ienrrjfugasi, s€t bakteri dilisiskan menggunakan larulan Instacene, 200s1 lBio-Rad.Hercules,CA) dan DNA bakteri mengikutiprosedurstandard. diekstraksi Amplifikasi PCR dari 165 rt)NA den pengurutanDNA
; e m u I l m i a hK P P I K G X l l l
l65 rDNr' Amplilikasi dari . u a r u r e a k sr a m p u r a n merg8u||alan'ulll dati turni^Tda )ang rnergandtlng ll (Takara. Tok)o), 4p mol dari priner yang universaldan 50ng Oligonukleotida llrr,'rrr"somD\ \ dari hdkteri)ang tidak dikenaltadi. Paker primer Oligonukleotida yang dari l6S digunalanun(ul mengarnplifikasi .rdalah 2-l rD\A 15 dan AGAGITIGATCMTGGCTCAG-3') l4alr t5 I'ACGYTACCTTCTl'ACGACTT-3' ) yang n€mpunyai kaitan dengan urutan I .ampai 2- pd.ang baqa dan dari l4q2 .ampai lj'l pa.aIg ba.a pada urulangen l63 (DNA dart Escherichiacoti. Amplrfikasi dilalukan menge.ural'an I hermal t "ntr,'lL ' alat Pn'yr,unuthL ( P I C - 1 0 0 .M J R e - e a r c h\ . a t e n o t t n . M a s ' ) Inengiluli faramelef .ebatai beril'ul 15 .ycld, tahap denaturasi. 94"C selama I dua menil menir.penempelan.,l5'a.elama dan ek.tensi7:'L selama2 menit.Produk amplifikasi kemudian dianalisa dan dirarnpilkar dcngan , ara elekrr"Thor,tinrerrggunafa|l Jel Agarntc 20d temudian di$anrafdengalrFIh tun b,onidc. Ptoduk da(i Pul)n^ htse (hain Reo.Inn IPCR\ tcrsebul. \elanjulnla digunakan sebagai Dl\A !.ntLtlote Dada saat meneanali\a unrtanDNA. " Unruk metoda :equent "y,L d2Ji urutaD 165 |DNA, digunakan a l&eryo r",!u, n, c .fluote'cent lahellcd prtncr,y L hr lArner.lram PharmaciaBiotech. UK) d c n 3 a n l 4 p r r r n e ru r r r r e n a 1l . r n gd i h b e l Cl-5. delgan mengikuri pro5edur perusalraan. \lxl Ph,trnuiu AI ftxpret. r P h J f l n a c i al K B . \ $ e d e t l t d i g u n a k a n untrrl melgarralira ururan l65 rDNA. Bagian per bagiandari urulan nukleotidd lo\ rDNA lang dihasrllan dari olat terrbut. digabungldn menggrrnalan pada program komputer SEQM4N L4SERGENE (DNASTAR, Madtuon, WL) Urutan lengkap 165 rDNA dari strain e b a k e r rl a n g t i d a l d i k e n adl i a p l i k d c i k dk n G/r?B.rri'nenggunakanprogram rl-l,lf ),ang dapat membantuuntuk mcnerrtukan jerri, dari rpe'ie. bal,terr rer.ebut. Selanjutnyajarak evolusi dua korrponen dan hubungan phylogenetik diana.lisa 295
Analtsd Ljl an aen 165 |RNA ddri Bdkteti Orcltitlg
lidok Dikendl
rnenggunakan Drebda a /rrl/r/ pada I,IEGALIGN pada program kompuler E ..3 LASE RGEN
ni lingkr' dil,eirrl rc|.
Hasil
nu.ilntni'. Ana?n'.u \ u" tna?tn:fiitr gernlinatus, Megusphaera elsdenii dan jugo \epPrt. Itl"n'pol h tllonella yeillonella dispdr, yeillo ella at),pical dan l/eillon?lla parrula.
hasilyangdidapatdari Berdasarkan progran Bl.lSI mengacupadadata yang l€erdapat di GenBdnk,urutanlengkap 165 IDNA dari ke lima bakleri yang tidak
C o n t i gI ( 1 . 1 3 9 0 ) ContigLength
: li90 bases AverageLength/Sequcnce : 254 bases : 8646 bases Total SequenceLength
Top Strand BottomStrand Total
: 9 seqlLences : 25 scquences
GC,^- CCCCCl(;
GAAACCLTGAC CCACC ,\CCCC A C A A C Y T G C C T A GCGTC,,\CTGAI' i C A G G A T G G G G A G,\CG6CYYCCC GTTGT]1-{A CI' CAACAGACGCA A"ACGACI'CCI'AA C'I'G'J'CATCCGC GACGA]LdAGGC TCCI'RAAIAAGI TCCAAGAGCCGC AGAGTGCGA"AG A'I'GGCCCATGGA IIGAC](iGTACC AGA4AACGT(iC (.CICIACCTGTA A(;CTATCGCCTG cc,\cccc1,\A(' TAC(JTCCC'AGC A , ^ o A C ( i ( l ( i II I t ( i CGTCTCATTACC CCCGCCGTAA TACCTAGGTGG TOGII'G(iA(;GGG TA"ACGGCCCACC C A A C C C I T ( i T C AAG(;CGACGATC CGGAATTATTG AGTAGCCGGTCT GGCCT,dAACC]C GACACCATCA cccccAGGcG0 C6GCCACACI'GG CTTCCCAAGTC AACTGAGAC CC CCTCTHAAAAC 'I'GCGG(iGC'I'I'A
rc( r cTccA(iAc
ACGGGAGRCACC ACCCCCT{iAT(l AGI(iG(;GA-ATCT GGAAGGAAACT T C C C C , { A 1 0 C C C GOGAAGCl'CGA
GT YCC('\CAg C A A A CI ' ] ( i A A T
C'C(iCACAAGC GGTCGAGT,\I'C cccrrA(ir'(ilAG TGGTTyAATTCG C G CI ( ; A A A T G C ACCC,d{CCCGA AGAACCTTACC CIACACAII'AG CAAGAACACCG AGGTCTI'CACA CTGGCGAACGC TTCATCOCGA'T CACTHH(]TCCiA cTcuAGdAATG CGGA(iTTCTTC cc.^A,^ACt G,^C G C T C A G C C G C G TTCGCAACA((i A A A C C Ct C G C i C (I(i I(;CACGGCT T Y A C At i ^ f c ( t ' GTCGTCA(N'I(' (iqf.\c t.( ( (i (if(i fcGl GAGA C C G T A A A C C A T TGTTCOOI''IAA G G AT A C I A C ( l l G'ICCCGCAACG G T A C G G G T A T ,\ccGCA,^cccc c c ^ c c c c r c c t ' ].AfC l fIG ITA (ir(icr( c(iAt; fI. C(]A(ICACGTAA AGGTCCCC CT TATCCCCCCTC GCCGCGG,\C,1"A CCCAA(]A'I'I'AA AACTCAAAGGA GCGCGT]ACCAC (iICAAGTCATC A ItcA( (;(lc(i(;
ATGCCCCI'YAI'C
.^cctcccctAcA CACCl'ACIACAA TGCGl'CICAACA AAGAOAACCCA ACCCGCCACGRA GAGCA"d{SCTCA AA"{ACACACCCC CAGTTCMGATCC (]A(iGC'IGCAACC CGCCTGCCTGAA CTAGGAA'ICCCI' A(' I AA ICCCGGG TCAGCATACCGC C(iICAAI'ACGTT CCCGCCCCTHCT ACACACC(iCCCG ICACACTATGAG ACTCMGMA.\CA
ccccAAccc0cr GAGGTAA(CGCr\ ACGACC CAGCCGTCGA
Gbr L Urutan165rDNA daribakeri )-angtidakdikenal (1390pasangbasa).
)96
TenruIlmiahKPPIKGXItl
Ariodna Dldis Futoshi Ndkaruva dan Etsuro Hashino
I abelL Mairix kemiripanl65 rDNA bakleritidakdikonalterhadap ripcstrainDialistcrpneumosntes Nama bakteri
2 89.5
I
2 5
1.5
9l.l q6.5
7.3 I
S a m D €l - l Samoel-2
2
Hasil analisa kemiripafl menggunakan MEGALIGNdaJiur$an 163 rDNA dafi kelrma balleri yang tidal dikenaldibandingkan dergar Urutanl65 rDNA strain tipe dari Dialister pneunh,.\tnt(r. rnemperlihatlan persentasi lemiripan)anBierendah adalah89.5on dan )angteninggi9l.3%.
Diskusi Kelima bakteri sampel yang tidak pada hasil biakan dikenal ini memperlihatkan ciri ciri sebagaiberikut. \lcreka tidakdapattumbuhpadamediacarr Pl-giukosadaI derajatleasaman(plrrdalturunselelah inl,ubasi selamal4 hari. Tidak ada bahantambahanyang mampu merstimulasi perlumbuhan padamediacarr reaebut.OIeh larenanyakelima bal'leri fang tidak dikenal ini, dapat disebul iebagaibakteriyang sulit dibiak.Unt k mengidentifikasi bakleriyangtidakdikenal ddn juga sulir dibiak ini. "arrgatcocok rnenggunakan meloda l6S rRNA g?,?. seq ence.Telah banyakdilaporkanbahwa umumn)abakteri)ang sulit dibiak araridak dapatdibiak haDyadapatdikenal .ecaraanalisaututanseL.ara lengkdpIos rRNA geDe-' Reaksibiokimiadari lelirnabakrerr \ang tidak dilenal ini memperlihatl,a rer:1'nrasi Larbohidralnegalii Hidrolsa Jari Eskulin.srarcl. gelarindaneggprorein negatii Katalase, DNAse, lipase dan recithinase tidak dapatdideteksi.Balteri rersebutjuga tidak memproduksiAmonia llt.ln'ttn ttlliJt. aceloin.indolalauEa\. TrdakadareduksiNitrat.Infbrmasi
TemuIlmiahKPPIKGxlll
Dialister 2
informasi ini memperliharkan bah|raposi!. hksonomidafl bakrenbalteri ini sangar tidakpasti.MerekaumumnyanegalifGram letapi tidak menghasillanlallal arau piruvatdantidakmereduksi nitrat Secara prinsip dapat dijelaskan, metoda 165 |RNA gene sequence berdasarlanhasil analisa pada urutan rrrrkleotida dari I6s rRNA genedari isolal tidak dikenal tersebut.Hasil dari )ants isola\i DNA. dilalulan amplifikasi terhadap 165 rDNA secara PCR menggunakanprimer universal. Urutan lengkap dariprodukPCR{ l65 rDNA)dari isolatradi Lernudian dibandingLan dengan uruta'r l6S rDNA dari bakteri laiD yang tersirnpan dalambai)l dara.'MetodaloS rRNA gs"e sequencing tel^h diket^hu dalam$aktu relarifsingkarmampuunluk menanganii\olat dalam jumlah be'ar. Kelemahan dari metodaini, adalahwalau identifilasi berdasarkan penBururan lomponeD DNA .angal efcltif urrul rrnglalanger)ui.retapiridal dapatdipakai padaltngkatspesiej u|llukmcngidenrifika\i bila dua ataulebihspesies )ang berlaitan menunjukan kemiripaDleh;hdari9'/o/o.' Metoda dasar un(uk menganalrsa urulan165 rDNA berdasarkan atasnretoda, yang enzymatic, menggunaKan Lltcleonnbonuc tcot ide t ipho:phares.ta Parz ahli taksonomimemanfaatkan pengetahuan jenis bakteri diatasuntukmemperkenalkan baru misalnya pelaporan Actinomyces europaeusdari spesimenklinik' atau nerevisi posisi dari kelompok bakteri, seperti yang dilaporkan untuk bakteri Eubacteriunti idum.'' Satu patokanuntuk membuatatau genusyang baru, bila hasil |lreneDtukar] kemiripandari urutan l65 rRNA gene straiI]yangdicarid€ngankelompokbakteri yanB terdekatyang terdata di GenBank 29' 7
lnahra Litlidn gen l65 tRNA ddti BokterLOral rdnq Tindk Dikenal
kurangdari 97%.r PadapeneUtianini. kinriripanurutan dari 165 rDNA dan kelima bakteri yang tidak dikenal k€seluruhannya kurang dari 97%, denganseluruhbakleriyanlr dibandingkaD Hasil pclacakan di GenBdnk rcrd?ra pada program metode ,vrGlZlGN Lompuler l,4SFnulVf mernperlhatldn bahwa urutaD 165 rDNA dari kelima hakreri\ang tidak .likenal mempunlai kerniripanlang lerdekatberlisar anlara (89.5%-91.3%) terhadap Dialister pneunnsintes ATCC 11048 diantara bakteri]ang terdata. keseluruh spesies Kesimpulan Berdasarkandata data diatas dan lra\rl allali.a phllogewrtk. dapal a a r i lu r u l d rl 6 S r D N A d i s r m p u l kbaa| lh t r h dari kelinrabakteriyang tidak dikenal ler'chur. mempunlai Lemiripan )ang rurtlr)ggilerhadaf .lrain lipe DldlA/c. (89.5yo-9 1.3%)dibandingkan pneumosintes jenis bakteriyangterdata dengantipe strain Iainn)a selanjurn\r.rntul kelimabakleri )ang ridak dilcnal ter5ebul. dapal .ebagaispe.ie.bakleribarrl diperkenall,a|l dengannamabakteriDialisterlike.
Daftar Pustaka. Ci.rntarV. sprdrtDA. \e(man IiN dan granLlosd \\ il.or Nn Crpnoc)rophdea dnd Capnocytophaga haemolyiica: novel 'pecie' in 'ubpingi!al pldque / C/,, Periadantalogy. 2001. 28: 70l-5 2. FunkeG, SlubbsS. GraevenitzA. et al Assrgnmenrol Human-Deri!edCD. uroup I corlnelormBactenJdnd ( Da to ,hc Croup l-hle ConneformBacrefld GenusActinomycesas Actjnomycesneur subsp.Neuii sp. Nov., subsp.Nov., and Actinomycesneuii subsp.Anitratussubsp No\ lht J "f SF Backtrclog lqoa 44(t):161-t1l \ quera rl . Roca, lN i Draliner tnc'rmo!rnre\ !an be a su\peLre\ endodonticpathogen. Oral Sutg O/al ll{ed I
298
(rul Patholordl Rahol Enlol 20i2 91: 494-8. J P, Vos PD.Slvings GillisM. Vandamme dan KeNrcrs K. Berget s. ManMI 4 Slrlendtk Bdctetiotog 2"r edition.New New York. Inc. Yo*. Springer'Verlag l 0 0 l : 4 18 . Hall V. O'Neill GL. MageeJT. €t al. of Amplified l65 Ribosomal Development DNA restrictionAnalysisfor ldenlification of ActinomycesSpeciesand Comparjson with Pyrolysis-MassSpecirometryand BiochemicalTests.J ol C/d Conventional . ltl Lrab)alogr.1999. 37 (1): 2255-2261 HashimuraT. Sato M, Nakaz2waF dan Analysisof 165 HoshinoE. Phyogen€tic rDNA ol Eubacteriumexiguum and the Speciesspeciuc Regions for Prim€r .l Orul Btal. 2000. 421 Designation.Jp, 555,562. NakazawaF. Salo M. Poco SE. et al. pumilum Description of Mogibacter'um gennov.Sp.nov. and Mogibacterium vescunrgen.nov., sp, and reclassification timidum (Holdemaner al. of Eubacterium timidumge. nov., 1980)as Mogibacterium comb.Nov. /r/ J. ofsrst and Evolutionary 11icrabialog. 2000. 50i 679-688. Willems A, Coolins MD. Phylogenelic Placement of Dialister pneumosintes (formerly Bacieroides pneumosintet wilhin the SporomusaSubbranchof lhe Clostridium Subphylum of the CrarnpositiveAacteria. 1,r Jol Slst Bactetiolag,, 403-40s. 1995.45(2): 9 . Alberts B, Bray D. JohnsonA, et al. EssentidlCell aiolop. l'' edition. New Inc. York & Iondon.CaflandPublishing. 1998:ll9 7 1 0 .Funke C. Al!'arez N, PascualC, et al. Actinomyceseufopaeussp.nov..lsolated 1rl J o/ from HumanClinical Specimens. S,-stBactenalos. 1991.4't(3\:687-692 l l . NakazawaF, Poco SE, Ikeda T. et al. curtum gen.nov.,a new Cryptobacterium gcnus of cram-positive anaerobicrod isolatedfrom humanOral Cavrries./rr J ofSyn Bdcteriolag!.1999.49: I193-1200 12. Jung LY. Choi B.k, Kum K.Y, et al. MolecularEpidemiologyand Associaiion of Putatitive Pathogensin Root Canal lnfe.tiotl..l of Endadontt.i.2000.26(10): 599-604.
TemuIlmiahKPPIKGXIII
