Állatkísérletek elmélete és gyakorlata – B szint Az állatkísérleteket helyettesítő alternatív módszerek egyetemi jegyzet Dr. Tuboly Eszter
1. Miért fontosak az alternatív módszerek? Napjainkban folyamatosan nő az igény, hogy az élő állaton végzett kísérleteket in vitro modellek és metodikák váltsák fel. A társadalom nagy többsége elfogadja, hogy szükség van állatkísérletekre, azonban szorgalmazza számuk csökkentését. A kutatók között természetesen egyetértés van abban, hogy csakis a legszükségesebb és másképpen meg nem válaszolható kérdések tisztázása történjenek állatokon. Ugyanakkor egyes állatvédő szervezetek csakis azt a megoldást tekintik ”alternatívnak”, ha a kutatás egyáltalán nem használna fel állatot kísérleti céllal. Nehéz eldönteni a kérdést, hogy vajon kinek van igaza, a radikális állatvédőknek, vagy azoknak, akik szerint egy állat élete nem sokat számít, ám az nyilvánvaló, hogy senki nem próbálna ki szívesen saját magán egy-egy új hatóanyagot, vagy eljárást, amelyet még soha nem teszteltek élő szervezetben. Mint mindenben, itt is az arany középutat kell megtalálni, amelyben a törvénykezés adja a fő támpontokat. A fejlett országokban, így az Európai Unióban is egyre szigorúbb állatvédelmi törvények születnek és minden kutatóhelynek szigorúan szem előtt kell tartania a „reduction”, azaz az élő állatok felhasználásának csökkentése alapelvet. A szabályok szigorítása mellett egyre több drasztikus lépés is sorra kerül, mint amilyen a 2013. március 11-étől hatályba lépett EU-s rendelet, miszerint a kozmetikai ipar többé nem használhat állatokat kísérletes céllal. Így a társadalmi nyomáson túl manapság már a törvényi szabályozás miatt is egyre sürgetőbb alternatív, úgynevezett in vitro módszerek és tesztrendszerek kidolgozása, amelyek élő szervezetek feláldozása nélkül működtethetők kutatási célra. Számos szervezet és program alakult az elmúlt időben, innovációs versenyeket és pályázatokat írnak ki, amelyek jutalom reményében buzdítják a szakembereket összefogásra, újabb-és újabb módszerek kidolgozására. Hiába a törvénykezés szigorodása, az orvostudománynak, vagy éppen a gyógyszer-és kozmetikai iparnak lépést kell tartania az egyre növekvő létszámú populációval, illetve fogyasztói társadalommal.
2. A legismertebb alternatív módszerek Az állatkísérletek helyettesítésére alkalmazható lehetőségek. 2.1. Teljes helyettesítés •
In vitro tesztrendszer kémiai komponensekkel: Olyan reakcióközeg, amely egy a szervezetben is lejátszódó folyamatot modellez, például szabadgyök-generáló reakciók, gázképző folyamatok, az alkohol kémiai lebontása, etc. Ezek segítségével vizsgálható maga a folyamat, annak egyes részfolyamatai, vagy alkalmasak lehetnek például gyógyszertesztelésre is. Fontos ismérvük, hogy „nagyban játszanak”, azaz egy ilyen tesztrendszerben
minden
reakció
jóval
nagyobb
mértékben
zajlik,
nagyobb
koncentrációkkal, a valóságtól gyakran eltérően nagymértékű válasszal kell számolnunk. •
In vitro tesztrendszerek biológiai komponensekkel: Ezen közegben már élő anyag, adott esetben élő sejt viselkedése, válaszreakciói vizsgálhatóak, a folyamat független a valós környezetében párhuzamosan zajló többi folyamattól, gyakran olyan alacsonyrendű organizmusban vizsgálható, amely rendkívül távol áll a kutató valódi problémájától. Fontos a homológiák keresése, s minél életszerűbb kísérleti körülmények (pl. Ph érték, hőmérséklet, sejtes homeosztázis, etc.) szimulációja. Az előző rendszerrel ellentétben minden
folyamat
esetén
jóval
alacsonyabb
koncentrációkkal,
kisebb
mértékű
sejtválasszal kell számolnunk, mintha in vivo vizsgálódnánk. Amennyiben az élő szervezet teljes egészét használjuk, úgy egysejtű élőlényekkel kell dolgoznunk. Alkalmas biológiai rendszer lehet: Mikroorganizmusok (Escherichia coli és társai) Gomba sejtek (pl. cirkadián ritmussal kapcsolatos kutatások) Növényi sejtek (biotechnológia) Metazoa parazita állatok • Az „in silico” vizsgálatok virágkorát éljük, az alternatív módszerek kidolgozásának, fejlesztésének élén az orvostudományban is a számítógépes szimulációk állnak. Szinte bármilyen
klinikai
problémát,
egy-egy
új
hatóanyag,
kezelés
lehetséges
hatásmechanizmusát, vagy éppen egy új, a természetesnél vélhetően jobban működő szervezet genetikai állományát is képesek modellezni már manapság.
2.2. Biológiai rendszerek, amelyek alkalmazásakor a „reduction” eredeti jelentését tartjuk szem előtt, tehát az állatok számának csökkentését: •
Szöveti homogenát, ex vivo szerv vizsgálatok
•
Szerv,
szövet
vagy
leggyakrabban, minden
sejtkultúrák
(biokémiai
kutatóhelyen, ipari
kutatások
céljára):
Ezek
a
laboratóriumban használt alternatív
eljárások, szinte bármilyen vizsgálat alapjául szolgálhatnak, számos lehetőséget biztosítanak az élő szervezet minél inkább élethű helyettesítésére. Természetesen azonban elő kell állítanunk ezeket, így kezdeti lépésként mégiscsak kísérleti állatokat kell bevonnunk a vizsgálatunkba, noha egy-egy állat felhasználásával
nagy
elemszámú vizsgálati populációt kaphatunk. 3. Az alternatív módszerek előnyei és hátrányai Természetesen mindig is lesznek állatkísérletek az orvostudományban, ám manapság már minden magára valamit adó kutatóhelyen működik olyan egység, vagy laboratórium, ahol rutinszerűen alkalmaznak in vitro teszteket egy-egy vizsgálatsorozat részeként. A legnagyobb előnyök között említhetjük: •
A probléma egy-egy részletére, egy adott folyamatra fókuszálnak, tehát egy vizsgált in vitro reakciót nem befolyásol a többi folyamat.
•
Nincsenek kölcsönhatások más molekulákkal, például agonista-antagonista, szinergista, etc. hatások.
•
Költséghatékonyabbnak és kevésbé stresszesnek is tekinthetjük ezeket, ugyanis nincsen ellátási/fenntartási költség, nem kell a vizsgálat után akár több éves utánkövetést végeznünk, megspórolhatjuk a drága fájdalomcsillapítást-és, anesztéziát, ráadásul nem kell a kísérlet közben folyamatosan azon aggódnunk, vajon túlél-e az állat, legalább addig, amíg a kívánt válaszreakció lezajlik, etc.
•
Egyszerűbb kezelni ezeket, kisebb kockázatot és felelősséget vállal az a kutató, aki in vitro dolgozik.
•
Időtakarékosság, valamint az elemszámnövelés gyors és viszonylag egyszerű módja, nem véletlen, hogy egy-egy jobb publikációhoz gyakran elengedhetetlenek az in vitro kiegészítő kísérletek, bizonyítékok.
A legnagyobb előnyök azonban gyakran hátrányukra is válhatnak: •
A vizsgálat nem igazán életszerű, a reakció, vagy a vizsgált komponens alig mutat hasonlóságot egy élő fajéval, vagy az emberi szervezettel szemben. Ez a kritika természetesen jogos és mindig gyanakvásra kell, hogy okot adjon. Például, ritkán lehet egy ilyen metodika alkalmas krónikus, szisztémás reakciók vizsgálatára.
•
Nem mindig az alternatív módszer a legolcsóbb, különösen a legújabb innovációkat tekintve, amelyek különleges és ritka anyagokkal, technológiákkal és a legmodernebb számítástechnikával vannak felszerelve, gyakran nagyon igényes rendszerekről van szó, mint amilyenek például a szövettenyésztés során használt eljárások.
4. Sejttenyésztés A szerv-, szövet- és sejttenyésztés olyan in vitro technikák, amikor mesterséges, azaz laboratóriumi körülmények között tartjuk fenn és/vagy szaporítjuk az állati vagy növényi eredetű mintákat. A minta származhat az általunk választott kísérleti állatból, műtét során, vagy közvetlenül a halál után eltávolított anyagból, vagy biopsziából. Természetesen ugyanez igaz az emberi szervezetből származó sejtekre is. A szövettenyésztés valójában csak a szervet alkotó sejtek túlélésének biztosítása, legtöbbször a megfelelően kisméretű, embrionális szervek esetén alkalmazzák, itt korlátozott sejtszaporodás és differenciálódás is megfigyelhető.A szövettenyésztés során egy kisebb, a szervezetből eltávolított, szövetminta fenntartásáról, és sejtjeinek korlátozott szaporításáról van szó. A legáltalánosabban alkalmazott eljárás a sejttenyésztés, amikor egy szövetből (egészséges vagy tumoros) izolált sejteket tartanak fenn és szaporítanak. A sejttenyésztés módszerét egy adott sejttípus tisztán, vagy kevert kultúrában történő előállítására alkalmazzák. Ezek a sejtek élő környezetükből kiragadva, az őket körülvevő sejtektől, az immun- és hormonrendszertől megfosztva csak egy adott, szűk tudományterület számára jelentenek megfelelő alternatívát. 4.1. Sejt és szövettenyésztés céljai •
Magának a sejtnek a vizsgálata (sejtanalízis)
•
A sejt-sejt kölcsönhatás (sejtkommunikáció) vizsgálata
•
A sejtek különböző kémiai anyagokra adott válaszának analízise
•
Különböző sejt-eredetű fehérje termékek előállítására (biotechnológia ipar)
•
Klinikai alkalmazás: szerv, vagy szövet pótlása, sejt/vagy szövet bejutatása terápiás célzattal
•
Élelmiszeripar: mesterséges hús, jobb tulajdonságokkal bíró alapanyagok
4.2. A sejttenyészetek típusai ●
Primer sejttenyészetek: készülhetnek embrionális ill. felnőtt szövetből. Minden egyes preparátum kicsit eltér egymástól, teljesen homogén idegen sejtet nem tartalmazó tiszta tenyészetről nem beszélhetünk. Előnyük, hogy a sejteket más hatás, mint a tenyésztés kezdő lépéseként alkalmazott enzimatikus, vagy mechanikus disszociáció nem érte, a sejtek nem tekinthetők módosított ill. transzformált sejteknek. Hátrányuk, hogy ezek a kultúrák korlátozott ideig tarthatók csak fenn, élettartamuk tehát véges (hetek, néhány hónap).
●
Sejtvonalak: abnormális, gyakran transzformált sejtek, élettartamuk korlátlan.
5. A sejttenyésztés módszerei és feltételei 5.1. A sejttenyésztő laboratórium legfontosabb eszközei •
Tiszta, lehetőleg frissen meszelt, ablaktalan helyiség, amely csak a sejttenyésztő laboratóriumban használt eszköztárral van felszerelve. Az ajtóban UV védelem ajánlott.
•
Laminaris fülke (”laminar box”): a steril munka, azaz a steril oldatok készítése, szűrése, összeállítása, a sejtek preparálása, tehát maga a sejttenyésztési folyamat minden lépése kizárólag itt, a steril levegő-áramot biztosító fülkék alatt történik. Két fajtája van, a vertikális, valamint a horizontális típusú lamináris box (a steril levegő másként áramlik bennük). A vertikális box-ban (biology safety cabinet) a steril levegő a fülke tetejéről, tehát fentről lefelé, vertikálisan áramlik; veszélyes anyagokkal való munkára ez a legalkalmasabb típus. A horizontális box veszélyes anyagokkal való munkára nem alkalmas, de a tenyészetek számára legbiztonságosabb feltételeket nyújtja. A steril levegő horizontálisan, a tenyésztő irányába, kifelé áramlik. Mindkét steril tenyésztő fülke típus esetében a levegő folyamatosan kicserélődik szűrt, steril levegőre, ugyanis ezek a steril fülkék el vannak látva ún. HEPA (high efficiency particle) filterrel, amely a nemkívánatos partikulákat kiszűri. A steril fülkék természetesen fel vannak szerelve rövid-hullámhosszú UV lámpákkal, hogy a munka szünetében a fülkét sterilizálni lehessen.
CO2 inkubátorok: a sejtek 5-10% CO2 tartalmú, közel 100%-os páratartalmú légtérben
•
növekednek. A tenyésztő médium nátriumbikarbonát/szénsav puffer rendszerrel van az optimális fiziológiás pH értékre beállítva. Ezeket a feltételeket szigorúan be kell tartani és folyamatosan ellenőrizni. A megfelelő, folyamatos gázcserét a tenyésztőflaskák sapkáinak meglazításával biztosítani kell a tenyésztés folyamán. Mikroszkóp: a tenyészetek vizualizálására fáziskontraszttal ellátott inverz mikroszkópot
•
használunk. Saját hűtő-és fagyasztószekrény, vízfürdő, centrifuga, a cél, hogy ne kelljen ki-be járkálni a
•
laboratóriumból 70%-os alkohol a kéz és a munkafelület fertőtlenítéséhez
•
5.2. Sejtpreparálás szövettenyésztés céljából Az egyes lépések az alábbiak: 1.
A szövettenyésztéshez szükséges oldatok elkészítése.
2.
A tenyésztés céljára felhasználandó szövet előkészítése.
3.
Sejtdisszociálás: •
Mechanikus disszociáció a sejtek enzimatikus kezelés nélküli szétválasztása mechanikus úton:
a szövet megfelelő átmérőjű tűn keresztül fecskendőbe történő fel-le
szívogatásával (pl. lágy, könnyen diszpergálható agyszövet esetén); •
a szövet megfelelő pórusméretű műanyag szitán történő átpréselésével.
Enzimatikus disszociáció enzimatikus kezeléssel, kollagenáz, tripszin, tripszin-EDTA, diszpáz, proteáz enzimek alkalmazásával történik.
4.
A sejtszuszpenzió steril nylon szűrőn át történő szűrése a sikeresen diszpergált sejtek és a megmaradt, nagyobb szövetdarabok szétválasztása céljából.
5.
A sejtek alacsony fordulaton történő ülepítése.
6.
A sejtüledék reszuszpendálása, a felülúszót ekkor friss tápfolyadékra cseréljük.
7.
Sejtszámolás (az össz-sejtszámot ill. az élő sejtek számát mikroszkóp alatt, hemocitométer segítségével határozzuk meg és beállítjuk a kívánt sejtsűrűséget a tenyésztéshez. Trypánkéket használunk az ún. festék-kizárásos tesztben, hogy meg tudjuk határozni az elpusztult sejtek számát. Az ilyen sejtek nem festődnek, nem veszik fel a festéket. A tenyészetek morfológiai változását, növekedését naponta ellenőrizzük. Tápfolyadékot általában hetente két alkalommal cserélünk a sejtkultúrákon. Ha elérték a megfelelő
sejtsűrűséget, szubkultúrákat készítünk belőlük, ill. tartós tárolásra lefagyaszthatjuk, amint azt a feladat megkívánja. 5.3. Sejtadhéziós molekulák, a sejtek letapadását segítő faktorok Ezeket az anyagokat a tenyésztőedények felületének kezelésére használjuk: •
Kollagén
•
Fibronektinek (sejtfelszíni és plazmafehérjék)
•
Laminin (heteromer glikoprotein)
•
Poly-L-Lizin (polikationos természetű poliaminosav, 70.000-150.000 kDa MW
•
Poly-L-Ornitin (polikationos természetű poliaminosav, 30.000-70.000 kDa MW)
5.4. A sejttenyésztő oldatok alapvető komponensei •
Szervetlen sók (nátrium, kálcium, kálium, magnézium klorid, szulfát, ill. foszfát sói)
•
Szénhidrátok (glukóz, fruktóz)
•
Aminosavak
•
Vitaminok
•
Zsírsavak és lipidek
•
Fehérjék és peptidek
•
Szérum
•
fetális borjúsavó (FCS), újszülött borjúsavó, lószérum, az alap tenyésztőoldathoz leggyakrabban hozzákevert komponensek. A sejtnövekedéshez nélkülözhetetlen nutritív anyagokat ill. növekedési faktorokat (growth factor) tartalmazzák. Sejttípusonként változó, hogy melyik szérumfajta kedvez az adott sejt növekedésének.
•
Növekedési faktorok
•
Inzulin
•
Transzferrin
•
Szérum albumin
6. Mesterséges szövetek létrehozása („tissue engineering”) Az utóbbi évtizedekben forradalom zajlott a biológiai tudományok területén, létrejött a biotechnológia új, multidiszciplináris területe, a humán “tissue engineering”. Ez a kifejezés összekapcsolja a medicina, a sejt-és molekuláris biológia, anyag, valamint a mérnöki
tudományok („engineering”) különféle aspektusait, Célja, hogy szövetpótló anyagokat hozzon létre, melyek segítségével a károsodott humán szövet regenerálható, funkciója megtartható, illetve javítható lehet. Napjainkban már rutinszerűen alkalmaznak
különféle mesterségesen előállított
szöveteket, pl. véredényeket bypass műtétek során, bőrszövetet traumás sérülést szenvedett betegeken, de történt már hasnyálmirigy β sejtek, porckorongok, vagy éppen májlebenyek pótlása is ezzel az eljárással. A módszer létjogosultságát indokolják a rendkívül hosszú kórházi transzplantációs várólisták, illetve a szervkilökődés, mint gyakori komplikáció előfordulása. 6.1 Alkalmazási területei: •
A tissue engineering (regeneratív medicina) javítja, vagy pótolja a károsodott, illetve kiesett strukturális szöveti (pl. csont, porc, erek, hólyag, stb.) funkciót.
•
A szövet transzplantáció (pl. őssejtet használva) specifikus biokémiai funkciót ellátó sejtek (pl. mesterséges máj ill. pancreas) transzplantációját jelenti.
•
A biológiai engineering egy szélesebb területet jelent, mely magába foglalja a magát a tissue engineering-et és más, rokon területeket, mint pl. a bioanyagok létrehozását, alkalmazását.
6.2 Alkalmas sejttípusok származás alapján •
Autológ sejtek nyerhetők ugyanabból az egyedből, mely a reinplantáció alanya, melybe a reinplantáció történik. Autológ sejtek inplantációja okozza a legkevesebb problémát a rejekció illetve a patogén transzmisszió tekintetében.
•
Allogén sejtek: ugyanannak a fajnak a donorjától származnak.
•
Szingén vagy izogén sejteket genetikailag azonos organizmusból (ikrek, klónok, ill. ún. beltenyésztett, “inbred” kísérleti állat modellek) izolálják.
•
Primer sejtek: egy adott organizmusból származnak.
•
Szekunder sejtek: sejtbankból vagy többszörösen passzált primer kultúrákból származnak.
•
Xenogén sejtek: egy másik faj egyedeiből lettek izolálva. Pl. kardiovaszkuláris implantatumok létrehozására irányuló kutatásokban állati sejteket (elsősorban sertés eredetű sejteket) használnak.
6.3. Alkalmas sejíttípusok differenciálódási állapot szerint •
Mind az érett, differenciálódott sejtek, a köztes előalakok (progenitorok) alkalmazása megtalálható a különféle technikákban, hiszen sokszor relevánsabb felnőtt sejtet használni, mint embrionális, vagy őssejtet. A sejtek dediffrenciálódása sok esetben úgy érhető el, hogy az izolált sejteket hagyományos 2 dimenziós módszerrel tenyésztik in vitro, ahol elvesztik eredeti differenciáltsági állapotukat. Gyakran felhasznált sejtek közé tartoznak a fibroblasztok, keratinociták, oszteoblasztok, endothel sejtek, pre-adipociták és zsírsejtek.
•
Mindemellett, leggyakrabban mégis az őssejteket választják erre a célra, hiszen ezek a sejtek még bármely fejlődési irányba elkötelezhetőek, immortalizált sejtek, amelyek megfelelő tápanyagellátás és mikorkörnyezet mellett bármely nagyon gyorsan képesek osztódni, szöveteket alkotni.
6.4. Leggyakrabban alkalmazott típusaik: •
Felnőtt őssejtek. A felnőtt vagy szomatikus őssejtek minden szervben jelen vannak, mint például a csontvelő, bőr, gyomor- és bélrendszer, vázizomzat, agy, stb ahol a szövetspecifikus mikrokörnyezet megtalálható számukra, így ezek a sejtek képezik szöveti sérülés esetén az adott szerv regenerációs tartalékait.
•
A leggyakrabban alkalmazott sejttípusok a zsírszövetben és a csontvelőben levő mezenchimális őssejtek (MSC). Ezek viszonylag könnyen hozzáférhetőek (pl. zsírleszívás), és többfajta sejt/szövettípussá képesek differenciálódni, például csont-,porc,zsír-, és idegszövetté. A csontvelői őssejtek további előnye, hogy strómális (endotheliális és mezenchimális) valamint hemopoetikus (vérképző) őssejt-vonalakat is létre lehet hozni segítségükkel. Mindegyik őssejt-típus tisztán kinyerhető a csontvelőből a sejtfelszíni markermolekulák különbsége alapján.
•
A regeneratív orvoslásban a leggazdagabb őssejtforrás, amit jelenleg is elterjedten alkalmaznak, a köldökzsinórvérben levő őssejtek. Ez nem meglepő, ha az évente születő mintegy 130 millió újszülöttet tekintjük. A köldökzsinórvért azonnal, születés után nyerik ki, és az őssejteket sejtfelszíni markerek alapján tisztítják, vagy tisztítás nélkül fagyasztják le a sejteket folyékony nitrogénben, DMSO hozzáadásával.
•
Csontvelői őssejtek. A csontvelői őssejtek tovább oszthatóak strómális (endotheliális és mezenchimális) valamint hemopoetikus (vérképző) őssejt-vonalakra. Mindegyik őssejttípus tisztán kinyerhető a csontvelőből a sejtfelszíni markermolekulák különbsége
alapján. A csontvelői mikrokörnyezet fenntartásában mind a stróma mind pedig az őssejtek
és
különféle
előalakok
kölcsönösen
részt
vesznek;
az
őssejt-niche
fennmaradásához szükséges ezen sejtek interakciója. 7. A “scaffold” technika A mesterséges szövet létrehozása egy új, feltörőben lévő területe a biotechnológiának, mely magában hordozza a lehetőségét a jelenleginél korszerűbb orvosi terápiás eljárások létrejöttének. A technika magában foglalja az ún. 3-D biokompatibilis scaffoldok létrehozását amelyek megfelelő mennyiségben hordozzák az implantálandó sejtet (ld. alább), valamint az így létrehozott “mesterséges” szövet in vivo implantációját E technikával a sejteket egy mesterségesen létrehozott struktúrába implantálják, ill. tenyésztik (ezt nevezik állványzatnak - scaffold-nak), ami támogatja a háromdimenziós szöveti struktúra létrejöttét, és legalább egynek megfelel az alábbiakban felsorolt három cél közül: 1.
biztosítja a sejtkitapadást és migrációt,
2.
szállítja és visszatartja a sejteket és biokémiai faktorokat,
3.
biztosítja a sejtek vitális tápanyagainak és a sejtek által expresszált anyagok diffúzióját. A sejtnövekedést hatékonyan támogató biológiai scaffoldokat természetes anyagokból
állítják elő, alapanyagként elsősorban az extracelluláris mátrix (ECM) komponensek szolgálnak. Az ECM a mikrokörnyezet vitális komponense, mely a sejtek ill. a szövetek számára a sejtnövekedéshez és fejlődéshez megfelelő 3-D architektúrát biztosítja. Ami azonban az in vivo milieu visszaállítását illeti, ezek a scaffoldok ma még gyakran tökéletlenek. Nem képesek olyan körülményeket teremteni, amely lehetővé teszi, hogy a sejtek befolyásolni tudják saját mikrokörnyezetüket. Az anyagok biológiai lebomlása (biodegradabilitása) is lényeges elem. A scaffoldokat a körülöttük lévő szövet abszorbeálja, eltűnteti, ha már betöltötték szerepüket, így sebészeti eltávolításukra nincs szükség. A scaffold technika nagy ígéret a medicina számos területén, azonban még hosszabb időnek kell eltelnie ahhoz, hogy ez a módszer emberi használatra szélesebb körben elérhetővé váljon. 7.1. scaffold típusok •
Protein scaffoldok (kollagén vagy fibrin-alapú). A kollagén alapú biológiai scaffoldok előnye, hogy a kollagén gél matrix a tenyésztést követően megtartja formáját, permeabilis, és szöveti inplantatumként a rekonstruktív és kozmetikai sebészet alkalmazhatja implantatumként (pl. gerincvelői repair).
•
Poliszacharid polimer scaffoldok (glukozaminoglikánok, pl. hialuronsav).
•
Hidrogél
7.2. A scaffolddal szemben támasztott követelmények •
Természetes v. szintetikus polimerek pl.:proteinek poliszacharidok
•
Nem válthat ki immunreakciót
•
Az ECM és a sejtek könnyen kapcsolódhassanak egyenletesen oszoljanak el a scaffold
•
felületén (migráció)
•
Biztosítsa a megfelelő tápanyag, és oxigénellátástellátást (pórusok)
•
Biodegradálhatóság
•
Biokompatibilitás
•
3D-s szerkezete legyen
8. Bioreaktorok A scaffold technika mellett ma már főként bioreaktorok tervezésével és alkalmazásával lehet minél hatékonyabbá tenni egy mesterségesen növesztett szövet előállítását, kiváltképp, ha klinikai alkalmazás a célunk. Ezek a szerkezetek képesek a sejtek élettani környezetének szimulálására abból a célból, hogy a sejtek növekedését és megfelelő differenciációját serkentse. Az élettani környezetet többféle paraméter alapján lehet definiálni, ebbe beletartozik a megfelelő hőmérséklet, oxigén és szén-dioxid koncentráció, de kiterjedhet mindenfajta fizikai, (bio)kémiai és mechanikai stimulusra. Éppen emiatt, jelenleg rendelkezésre állnak olyan rendszerek, amelyek képesek 2- és 3-dimenzióban húzó vagy nyomóerő kifejtésére. Jelenleg speciális bioreaktorok kaphatóak a kereskedelemre, melyek mind kutatási, mind pedig klinikai célú „tissue engineering”-re alkalmasak. Manapság már ilyen biorektorokban történik porcszövet, vagy szívbillentyű előállítása, de szervátültetés során is alkalmazzák őket, például a transzplantálni kívánt szerv, vagy szövet hosszabb időre történő tartósítására is (pl. ha a donor szerv messze helyezkedik el a recipienstől, vagy napokkal előbb történik a mintavétel, mint amikor a műtét kivitelezhető). 8.1. A bioreaktorok alapvető típusai •
Elsősorban keverő, illetve forgó bioreaktorokat ismerünk, amelyek egy kevertető segítségével, vagy forgó mozgással segít a sejteknek, szöveteknek egyenletes tápanyag-és oxigénellátásban részesülni, a megfelelő fiziko-kémiai paraméterek megtartása végett.
•
Kompressziós bioreaktor, amely leggyakrabban porcszövet előállításához használatos és mind statikus mind dinamikus nyomóerő (kompressziós erő) kifejtésére alkalmas.
•
Perfúziós bioreaktorok alkalmazása csontszövet előállításában, ahol a sejtek egyenletes kiültetésére szivacsszerű scaffolodokat alkalmaznak.
•
Kétkamrás bioreaktort alkalmaznak abban az esetben, ha két különböző sejttípussal kell létrehozni az új képletet. Ilyen esetekben egy interface választja el a külső és belső kamrát, a két térrész egymással nem kommunikál, tápanyagcsere nem lehetséges.
•
Transzplantációs bioreaktorok
8.2. A jelenlegi bioreaktorok hátrányai A jelenlegi „tissue engineering” módszerek rendkívül laborintenzív folyamatok, speciálisan képzett szakemberek tudják elvégezni ezeket a feladatokat. A mostani bioreaktorok nagyon speciális berendezések, bonyolult a szét- és összeszerelésük. A megfelelő számú sejt növesztése lassú és nem túl hatékony. Ezen kívül a bioreaktorban fejlődő szövet szerkezetének és más tulajdonságainak valós idejű monitorozása nem megoldott. A másik gond az alkalmazott „scaffold” minősége: a szövetkonstrukciónak ki kell bírnia a mechanikai nyomást, stimulációt. 9. Bioprinting •
Feltaláló: Forgách Gábor (Missouri Egyetem)
•
Hidro-gél alapú vázra élő sejtek felvitele
•
Tintasugaras nyomtatófej juttatja rá a sejteket, több rétegben, körben is (3D)
•
Két nyomtatófejet használ: sejtek nyomtatása+gélszerű, tápanyagokban gazdag médium adagolása
•
Kalibráció: lézerrel történik, szoftver irányít
•
Létező alkalmazási terület: véredények by-pass műtétekhez, pár éven belül bőr, retina nyomtatása
Forrás: Dr. Bartis Domokos, Dr. Pongrácz Judit (2011): Háromdimenziós szövettenyésztés Dr. Torday Csilla (2007): Állatkísérletek az Orvostudományban, in vitro módszerek
