2008.09.26.
GÁZ- és GÁZFOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS TECHNIKÁK A LABORATÓRIUMI DIAGNOSZTIKÁBAN Dr. RÓNA KÁLMÁN Semmelweis Egyetem, Igazságügyi és BiztosításBiztosítás-orvostani Intézet, Toxikológiai Laboratórium
Aktualitások a laboratóriumi és mikrobiológiai diagnosztikában, 2008.szeptember 18.
A kromatográfia felfedezője M. Cvet botanikus, a varsói egyetem tanára volt (1906), aki szemcsés kalciumkarbonáttal töltött üvegcsövön falevél petroléteres extraktumát csurgatta át, s a levélzöld különböz alkotói egy idő után a töltött cső különböző helyein színes gyűrűket képeztek. Az elválasztás az egyes alkotóknak a kalciumkarbonát felületén történő különböző mértékű megkötődésén (adszorpcióján) alapult. Elnevezés: kromatográfia (Chroma = szín, kromatographia = színírás) T. James és A. J. Martin (1952) gázfolyadékkromatográfia-szerves vegyületek analízise. 2
1
2008.09.26.
A kromatográfia dinamikus szorpciósdeszorpciós folyamatokon alapúlú, különböző migrációs tulajdonságokat kihasználó nagy hatású elválasztási módszer. Az egyes komponensek fajlagos kötődése a szorbens réteghez (állófázishoz) nem azonos, ezért az ún. futtatás során az állófázishoz jobban kötődő komponensek „lemaradnak”.
3
A kromatogram: a kolonnáról eluálódó komponensek detektorjelének idő-függvénye. A kromatográfiás futtatás kezdetétől a komponens eluálódásáig eltelt időt retenciós (visszatartási) időnek nevezzük. A retenciós idő, a komponens anyagi minőségét jellemzi azaz kvalitatív mutató, míg a csúcs alatti terület a mennyiséggel van összefüggésben.
4
2
2008.09.26.
Felhasználhatóság: •testidegen anyagok (TDM) •endogén anyagok Állófázis geometriája szerint: •planáris- (pl.:vékonyréteg) •oszlopkromatográfia
Mozgófázis halmazállapota szerint: •folyadékkromatográfia (HPLC) •gázkromatográfia (GC) A megoszlást előidéző folyamat szerint: •adszorpciós (szilárd állófázis), •megoszlásos (folyékony állófázis), •és ioncserés (ioncserélő állófázis)
5
A VILÁGON TÖRZSKÖNYVEZETT LEGJELENTŐSEBB 50 KÉSZÍTMÉNY PLAZMASZINTJÉNEK ALAKULÁSA 100%
3
80%
30
33
47
56
60% 40%
pg/ml ng/ml mcg/ml
50 67
45
20% 17 0% 1980
2000
8 2002
40 4 2005 6
Klebovich, I.: Magyar Kémiai Folyóirat, 2005, 111(3): 129
3
2008.09.26.
7
HPLC
8
4
2008.09.26.
HPLC--UV HPLC
9
HPLC--DAD HPLC DIODA--ARRAY DETECTOR DIODA
10
5
2008.09.26.
7-amino clonazepam (peak 1), 7amino flunitrazepam (peak 2), demoxepam (peak 4), alphahydroxy triazolam (peak 6), alphahydroxy alprazolam (peak 7), oxazepam (peak 8), lorazepam (peak 9), hydroxy-ethyl flurazepam (peak 10), Internal Standard 1 (triazolam; peak 12), temazepam (peak 13), desmethyl diazepam (peak 14), Internal Standard 2 (ethyl oxazepam; peak 15).
Spectral comparison of 7amino flunitrazepam, alphahydroxy alprazolam and oxazepam. Unknown drug spectra are compared to a library of known candidates for drug identification. 11
N.sz.: 0030/08 zolpidem
cinolazepam
Gyorsteszt: BZO +
cinolazepam UV-spektrum
12
6
2008.09.26.
HPLC--ECD HPLC
13
7
2008.09.26.
EXHAUST
MECHANICAL PUMP
HI VAC PUMP
MASS SPECTROMETER
HPLC (GC)
INTERFACE
ION SOURCE
MASS FILTER
DETECTOR
CONTROLLER
15
IONFORRÁS
16
8
2008.09.26.
Electron Multiplier Detector
X-Ray Lens (0 to -218 V) Signal Out + Incoming Ion
EM Voltage (0 to -3000 V)
17
Positive Ions
+++ -+++ ----+ + -++++ ++ + ++ + + + ++ ++++ + ++ ++++++++++ + +++++ ++ + + -----
High Energy Dynode Electrons
Electron Multiplier Quadrupole Iris
Detector Focus Lens
Signal Out
18
9
2008.09.26.
19
MINTAELŐKÉSZÍTÉS
20
10
2008.09.26.
AUTOMATIZÁLT „ON--LINE” „ON MINTAELŐKÉSZÍTÉS
21
22
11
2008.09.26.
HPLC DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSA • Katekolaminok és metabolitok – Phaeochromocytoma (felnőtt) • Magas vérnyomás, fejfájás, tachycardia, látási zavar, hányás, ingerlékenység
– Neuroblastoma (gyermek) • A harmadik gyakoriság szerinti tumor gyermekkorban 23
24
12
2008.09.26.
SEROTONIN HPLC/ECD
25
ETANOL EREDMÉNYEK INTERPRETÁLÁSA Vizelet serotonin metabolitok mérése LC/MS/MS v.HPLC/ED 5-hidroxi-triptofol (5-HTOL)/ 5-hidroxi-indolecetsav (5-HIAA) arány < 15 pmol/nmol Alkohol FOGYASZTÁS esetén az arány > 15 pmol/nmol –
–
5-HTOL normál érték: < 35 ng/ml, alkohol fogyasztás után néhány órával 90902500 ng/ml 5-HTOL/5 HTOL/5--HIAA 15pmol/nmol, krónikus alkohol fogyasztás hatására eléri 1000 pmol/nmol szintet.
Pragst, F. , et al.: Forensic Sci. Int. 107 (2000) 201-223.
26
Johnson, RD. et al.: J. Chromatography B. 805 (2004) 223-234.
13
2008.09.26.
HOMOCYSTEIN
27
28
Ludányi, 2007.
14
2008.09.26.
TDM
29
Test drug 12
Reference drug
Volunteer 23
10 8 6 4 2 0 0
5
10
15
20
25
30
35
time (h)
T est drug 14
Reference drug
Mean
12
(Volunteer 1-30)
10 8 6 4 2 0 0
5
10
15
20 time (h)
25
30
35
30
15
2008.09.26.
SIROLIMUS (A) (rapamycin)
BELSŐ STANDARD (B) (32--dezmetoxi(32 dezmetoxirapamycin) 31
SIROLIMUS BIOANALITIKA (1.) •
MINTAELŐKÉSZÍTÉS (fehérjementesítés) 1. 2. 3. 4. 5.
PP csőbe 1 ml 0,2 M ZnSO4 + 2 ml aceton, mix 100 µl (20 ng) belső standard (I.St.), mix 1 ml minta (teljes vér) 30 sec vortex, centrifuga (3500 rpm, 18 ºC, 5 perc) Felülúszó másik PP csőbe + 1,5 ml bideszt.víz
32
16
2008.09.26.
SIROLIMUS BIOANALITIKA (2.) •
MINTAKINYERÉS (SPE – Baker-Speedisk/Phenyl-50mg/3ml) 1. Kondicionálás: - 2 ml metanol - 2 ml metanol : bideszt.víz (1:1) 2. Mintafelvitel 3. Mosás: - 2 ml metanol : bideszt.víz (1:1), 15’ levegő - 2 ml Cl-bután, 5’ levegő átszívás - 2 ml heptán, 5’ levegő átszívás 4. Leoldás: 500 µl aceton 5. Bepárlás: szárazra N2 alatt, 35 ºC-on 33
SIROLIMUS BIOANALITIKA (3.) •
MINTAKINYERÉS (folytatás – előkészítés) 6. A száraz maradék feloldása 300 µl mozgó fázisban 7. Kifagyasztás -20 ºC-n, 15 percig 8. 15 perc szobahőn állás 9. Centrifugálás, szűrés: (Millipore - Amicon Ultrafree-MC 0,22 µm), 15.000 rpm, szobahőn 10. Felülúszó átöntés az autosampler vial-ba.
34
17
2008.09.26.
SIROLIMUS BIOANALITIKA (4.) • FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA 1. Oszlop: SPHERISORB ODS-2, 250X4.6 mm, 5 µ (Thermo Hypersil-Keystone) 2. Előtétoszlop: SPHERISORB ODS-2 cartridge, 4 X 4.6 mm (Thermo Hypersil-Keystone) 3. Mozgófázis: metanol – acetonitril - bideszt.víz = (30:45:25, v/v) 4. Detektálás: UV, 278 nm (SPD-10A, Shimadzu LC-10) 5. Injektált minta térfogat: 100 µl 6. Áramlási sebesség: 1 ml/perc 7. Oszloptermosztát: 65 ºC 8. Automata injektor mosófolyadék: i-propilalkohol 35
BLANK
No.#133.01 Sirolimus vérkoncentráció: 19,4 ng/ml 36
18
2008.09.26.
K o n c e n t r á c i ó (ng/ml)
3 nap, 5 párhuzamos
r
a
b
átlag
0,9966
40,5116
-0,185
2,68
5,24
±S.D.
0,0019
2,7214
0,081
0,19
0,23
7,09
4,38
4,1
3,8
4,4
7,2
4,8
-6,6
2,5
-3,7
R.S.D. (%)
2,5
6,72
Torzítás(%)
QC
5,0
10,0
20,0
50,0
9,34
20,5
48,15
0,41
0,78
2,12
Napon belüli (n=6)
Napok közötti (n=18)
Mért koncentráció
Mért koncentráció
(ng/ml)
(ng/ml)
RSD(%)
(ng/ml)
RSD(%)
3,75
3,84 ± 0,30
7,81
3,52 ± 0,25
7,10
11,25
11,05 ± 0,79
7,14
12,12 ± 0,89
7,34
37,5
36,17 ±1,60
4,42
38,59 ± 1,80
4,66
% QC
n
SIR
I.St.
3,75
5
81,9 ± 3,6
60,4 ± 2,8
11,25
5
82,5 ± 1,6
64,3 ± 2,1
37,5
5
80,3 ± 7,6
63,3 ± 5,8
81,5 ± 4,3
62,7 ± 3,6
átlag±S.D.
37
NEMZETKÖZI KÖRKISÉRLET 1
44 •
Bioanalytical R&D, Analytical Unit, St. George’s Hospital Medical School, London 5+12
•
International Sirolimus Proficiency Testing Scheme (ISPTS): 72 centrum (ca 50% HPLC/UV, 50% HPLC/MS)
3
•
„Belépő”: 3+78 sikeres meghatározás (5 batch)
•
Havonta 9 mérés: 3 koncentrációban 3 párhuzamos
2
1
3
1
38
19
2008.09.26.
ANYAGCSERE BETEGSÉGEK SZŰRÉSE
39
Vékey, K.: Magyar Kémiai Folyóirat, 2006, 112(1): 29.
HEADSPACE--GC HEADSPACE
HS-GC/FID
Oszlop: Rtx®-BAC2 (RESTEK, Blood Alcohol Column), 30 m x 0,54 mm x 2 µm HS paraméterek: 15 min rázatás 80 º C-on 40 Injektálás: 220 ºC, FID: 240 ºC Hőfokprogram: 35 ºC (2 perc) → 10 ºC/min → 80 ºC (2,5 min)
20
2008.09.26.
Mintaelőkészítés: 20 ml HS vial 4 ml víz, 2 g NaCl, 200 µl minta Készülék: Agilent 6890N GC, Agilent 5973 inert quadrupole MS , EI, Scan: 20-150 amu Mintaadagoló: Gerstel MPS2 Oszlop: Supelco SPB-624, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm HS paraméterek: 10 min rázatás 80 º C-on, 250 µl inj. Injektálás: T inj: 220 ºC Split: 1:20 Hőfokprogram: 40 ºC (4 min) → 10 ºC/min → 120 ºC (5 min)
ESET #1. (N.sz.: 0492/07)
TOLUOL
41
ESET #6. (N.sz.: 0487/07) Több napos hulla vérének GC/MS, vér: 2,708 ‰ Halál ok: Májzsugor, kivérzés, légzési elégtelenség
aceton
1-propanol etil-acetát
3-metil-butanal
etanol
1-butanol
dimetil-diszulfid
2-propanol
42
21
2008.09.26.
GYÓGYSZEREK ÉS ABÚZUSSZEREK HAJBÓL TÖRTÉNŐ IGAZSÁGÜGYI TOXIKOLÓGIAI VIZSGÁLATA •
A haj olyan egyedülálló biológiai mátrix, mely lehetőséget ad az abúzus retrospektív vizsgálatára –
1858 - Casper : Praktisches Handbuch der Gerichtlichen Medizin •
11 év után exhumált személy hajából As
– Keats hajából 170 évvel a halála után ópiátok – 2-3000 éves chilei és perui múmiák: benzoilekgonin
•
Szegmentanalízis: abúzustörténet felderítése a haj hosszától függően hónapokra visszamenőleg
•
Igazságügyi toxikológiai szempontból fontos szerek – – – – – –
alkohol fogyasztás markerei gyógyszerek (club drugs, drug-facilitated sexual assault) ópiátok, kokain amfetamin származékok kannabinoidok 43
44
Auwärter V. et al: Forensic Science International 145 (2004) 149-159.
22
2008.09.26.
45
DRUG FACILITATED SEXUAL ASSAULT • • •
Gyógyszer hatással elkövetett szexuális bűncselekmények – 90.941/2001 FBI „date rape drug” – pl: flunitrazepam: bódultság, csökkent ellenállás, amnesia kromatográfiás módszer - csak a 90’-es évek végén
*
** 46
*Goullé J-P., Anger J-P.: Ther Drug Monit 26(2) (2004) 206-210. **Chéze M. et al.: Forensic Science International 153 (2005) 3-10.
23
2008.09.26.
NESCAFE „4 in 1” ESET #10: GC/MS, SIM 219, 235 és 307 m/z HP5-MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm Injektálás: T inj: 290 ºC Splitless: 1 µl inj. Hőfokprogram: 280 ºC (6,5 min)→ 20 ºC/min → 320 ºC (1,5 min)
1. 21 éves lány, kávé kórházban, DFSA, 6 nappal később rendőrség, 4 héttel később hajanalízis LC-MS/MS = 4,4 pg/mg 2. 37 éves nő, DFSA a barátjától, vér 9 órával az esemény után LC-MS/MS=390 ng/ml vér (terápiás szint 50-200 ng/ml) 4 héttel később 8 cm haj segment analízis: (22, 47, 67 és 9 pg/mg...)
47
Villain M. et al.: Forensic Science International 143 (2004) 157-161
GHB GC/MS/MS HP5-MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm Injektálás: T inj: 270 ºC Splitless: 1 µl inj. Hőfokprogram: 100 ºC (1 min)→ 30 ºC/min → 295 ºC (5 min) ESET #11.: 19 éves lány, „soft drink”, DFSA, 5 nappal késöbb rendőrség Kintz P. et al.: J Forensic Sci. 48 (2003) 1-6.
48
24
2008.09.26.
TOXIKOGENOMIKA TOXIKO GENOMIKA
Farmakogenetika: egyes gyógyszerek azonos dózisú adása után – bizonyos örökletes faktorok következtében, jelentős eltérés az egyének terápiás és vérszint válaszában. válasz 49
ESET #12. (N.sz.: 0068/08) SPME-GC/MS metamfetamin
MDMA
PMMA (4metoximetamf etamin amfetamin
50
25
