Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011
AKTIVITAS -GALAKTOSIDASE PENGHIDROLISA LAKTOSA SUSU PADA BAKTERI UNGGUL TERSELEKSI DARI BUAH Carica papaya (β-Galactosidase Activity as Milk Lactose Hydrolyzer of Selected Main Bacteria from Carica papaya Fruits) ABDUL CHOLIQ dan T. KHUSNIATI Pusat Penelitian Biologi LIPI, Jl. Raya Cibinong, Bogor
ABSTRACT The β-galactosidase enzyme is enzyme hydrolyzing milk lactose which can be produced for production of low/free lactose milk, and these milk can be consumed by human which have “lactose intolerance” Characteristic of β-galactosidase as hydrolyzing lactose milk from various bacteria species haven’t been known yet, to know β-galactosidase characteristics of various bacteria species, the activity of β-galactosidase as hydrolyzing lactose milk of selected main bacteria from Carica papaya, was researched. The growth media for bacteria isolated from fruits used MRS media. The activity of β-galactosidase, was measured by modified MARTEAU et al. (1990) method. The protein concentration for counting specific activity was measured by Bradford method. Research results show that selection results of bacteria producing β-galactosidase from Carica papaya (raw and mature in half) fruits samples found from Dieng, Wonosobo, area show that 6 (six) out of 21 bacterial isolates from Carica papaya fruits, were the main bacterial isolates producing βgalactosidase. From various growth times of selected main bacterial isolates, the highest activity of βgalactosidase as milk lactose hydrolyzer was reached on the growth time for 48 hours, with β-galactosidase activity of 6,258 U/ml, and specific activity of 8,300 U/mg. From various pH and temperature, the highest activity of β-galactosidase as milk lactose hydrolyzer reached on pH: 6.5 was 11,550 U/ml, and on temperature: 45°C, was 15,661 U/ml, respectively. Key Words: β-galactosidase, Carica papaya Fruits, Dieng-Wonosobo, Specific-Activity ABSTRAK Enzim β-galaktosidase merupakan enzim penghidrolisa laktosa susu untuk produksi susu rendah laktosa, dan produk susu ini dapat dikonsumsi oleh peminum susu yang menderita “lactose intolerance” Karakteristik β-galaktosidase penghidrolisa laktosa susu dari berbagai species bakteri belum banyak diketahui, untuk mengetahui karakteristik β-galaktosidase penghidrolisa laktosa susu dari berbagai species bakteri, aktivitas βgalaktosidase dari bakteri unggul terseleksi dari buah Carica papaya sebagai penghidrolisa laktosa susu, diteliti. Media pertumbuhan bakteri dari buah Carica papaya menggunakan media MRS. Aktivitas βgalaktosidase, diukur dengan metode MARTEAU et al. (1990) yang dimodifikasi. Kadar protein untuk penghitungan aktivitas spesifik diukur dengan metode Bradford. Hasil penelitian menunjukkan bahwa hasil seleksi bakteri penghasil β-galaktosidase dari sampel buah Carica papaya (mentah dan setengah matang) yang didapatkan dari daerah Dieng, Wonosobo, menunjukkan bahwa dari 21 isolat bakteri dari buah Carica papaya, didapatkan 6 isolat bakteri unggul penghasil β-galaktosidase. Dari berbagai waktu pertumbuhan isolat bakteri unggul terseleksi, aktivitas β-galaktosidase penghidrolisa laktosa susu tertinggi dicapai pada waktu pertumbuhan selama 48 jam, dengan aktivitas β-galaktosidase sebesar 6,258 U/ml, dengan aktivitas spesifik sebesar 8,300 U/mg. Dari berbagai pH dan suhu, aktivitas β-galaktosidase penghidrolisa laktosa susu tertinggi dicapai masing-masing pada pH 6,5 sebesar 11,550 U/ml dan pada suhu 45°C, sebesar 15,661 U/ml Kata Kunci: β-galaktosidase, Carica papaya, Dieng-Wonosobo, Aktivitas-Spesifik
398
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011
PENDAHULUAN Enzim -galaktosidase adalah enzim penghidrolisa laktosa susu menjadi glukosa dan galaktosa (GEKAS dan LAIVA, 1985; PIVAMIK et al., 1995). Enzim ini dapat ditemukan pada berbagai jenis bakteri (LI et al., 2009; SALMINEN dan WRIGHT, 1998; HOOVER, 1993; HSU et al., 2005). Disamping itu, enzim ini dapat digunakan dalam produksi susu rendah/bebas laktosa sehingga dapat dikonsumsi oleh individu penderita “lactosa intollerance” (RASIC dan KURMANN, 1983; ROBINSON, 1994). Berbagai spesies bakteri yang didapatkan dari buah-buahan dilaporkan mengandung enzim -galactosidase (HOOVER, 1993; SALMINEN and WRIGHT, 1998; LI et al., 2009). Aktivitas β-galaktosidase dari bakteri beragam. Keberagaman aktivitas β-galaktosidase dari bakteri mengakibatkan adanya berbagai kondisi optimum β-galactosidase (waktu inkubasi, suhu dan pH) dari bakteri tersebut. (CHAKRABORTI et al., 2000; HSU et al., 2005; LI et al., 2009;). Karakteristik β-galaktosidase dari berbagai spesies bakteri belum banyak diketahui, untuk mengetahui karakteristik β-galaktosidase dari berbagai spesies bakteri, aktivitas βgalaktosidase penghidrolisa laktosa dari bakteri unggul terseleksi dari buah Carica-papaya, diteliti. MATERI DAN METODE Seleksi dan subculture bakteri unggul penghasil β-galaktosidase Seleksi bakteri unggul penghasil βgalaktosidase dari berbagai bakteri yang diisolasi dari buah Carica-papaya (mentah dan setengah matang) yang didapatkan dari daerah Dieng-Wonosobo dilakukan dengan menggunakan microtitter. Bakteri unggul penghasil β-galaktosidase (isolat BCPD) di sub-culture pada media agar miring. Isolasi enzim β-galaktosidase bakteri unggul terseleksi Isolasi enzim β-galaktosidase dari bakteri unggul terseleksi yang ditumbuhkan pada media MRS dilakukan dengan menggunakan sentrifus 10.000 rpm selama 15 menit pada
suhu 4°C. Pelet yang diperoleh dilarutkan dalam buffer fosfat, kemudian dilakukan pemecahan sel dengan sonikator selama 5 menit pada suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh merupakan enzim β-galaktosidase. Karakteristik β-galaktosidase bakteri unggul terseleksi Karakterisasi enzim β-galactosidase bakteri unggul terseleksi diamati pada kondisi (waktu inkubasi, suhu, pH) optimum Aktivitas βgalactosidase pada kondisi optimum diukur dengan menggunakan spektrofotometer. Aktivitas enzim β-galaktosidase Aktivitas enzim β-galaktosidase diukur dengan metode MARTEAU et al. (1990) yang dimodifikasi. Aktivitas -galactosidase dideteksi dengan metode ONPG. Sejumlah 1000 l buffer fosfat 0,1 M pH 7 dan 50 l enzim dituang kedalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Larutan yang sudah diinkubasi kemudian ditambahkan 200 l o-nitrophenyl--Dgalactoside (ONPG) 4 mg/ml dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Sesudah inkubasi, larutan ditambahkan 1000 l Na2CO3 1M. Larutan kemudian dianalisa dengan Spectrophotometer UV VIS dengan 420 nm. Aktivitas -galactosidase diukur dalam U/ml dan didefinisikan sebagai jumlah μmol oNP (onitrofenol) yang dibentuk per menit per ml enzim pada kondisi percobaan. Penentuan kadar protein Sebanyak 100 μl enzim β-galaktosidase ditambahkan 5 ml larutan coomassie brilliant blue 0,1%. Larutan di-vorteks dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya pada λ595 nm. Pembuatan kurva standar protein yang digunakan BSA dengan berbagai konsentrasi hasil dan pembahasan. Seleksi bakteri penghasil β-galaktosidase dari sampel buah Carica papaya (mentah dan setengah matang) yang didapatkan dari daerah Dieng, WONOSOBO, dideteksi dengan microtitter dan diukur nilai A420-nya ditunjukkan pada Tabel 1. Dari 10 isolat
399
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011
Tabel 1. A420 bakteri penghasil β-galaktosidase dari buah Carica papaya Isolat bakteri dari buah setengah matang
A420
0,129
11
0,329
2
0,257
12
0,183
3
0,163
13
0,468v
4
0,340
14
0,414v
5
0,433v
15
0,136
6
0,394
16
Isolat bakteri dari buah mentah
A420
1
Aktivitas β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi dari sampel buah Carica papaya di daerah Dieng, Wonosobo, di berbagai waktu pertumbuhan (U/ml) ditunjukkan pada Tabel 2. Tabel 2. Aktivitas β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi dari sampel buah “Carica papaya” diberbagai waktu pertumbuhan (U/mL) Aktivitas β- Total Volume galaktosidase unit (ml) (U/ml) (U)
Waktu (jam)
A420
0,184
0
0,076
1,00
0,061
0,061
0,840
1,00
0,191
0,191
7
0,219
17
0,000
6
8
0,451v
18
0,524v
12
1,273
1,00
0,386
0,386
9
0,427v
19
0,052
18
1,587
1,00
0,706
0,706
1,724
1,00
1,547
1,547
10
0,148
20
0,162
24
Kontrol
0,000
21
0,176
48
1,841
1,00
6,258
6,258
0,000
72
1,909
1,00
5,845
5,845
Kontrol v: bakteri unggul penghasil β-galaktosidase
bakteri dari buah Carica papaya mentah didapatkan 3 isolat bakteri penghasil βgalaktosidase dengan nilai A420 masing-masing 0,433; 0,451 dan 0,427 (Tabel 1); sedangkan isolat bakteri dari buah Carica papaya setengah matang, dari 11 isolat bakteri didapatkan 3 isolat bakteri penghasil β-galaktosidase dengan nilai A420 masing-masing 0,468; 0,414 dan 0,524 (Tabel 1). A420 bakteri penghasil βgalaktosidase dari buah Carica papaya ditunjukkan pada Tabel 1. Waktu pertumbuhan isolat bakteri unggul penghasil β-galaktosidase, dari sampel buah Carica papaya dari daerah Dieng, Wonosobo, dilaporkan.
Dari berbagai waktu pertumbuhan isolat bakteri unggul terseleksi penghasil βgalaktosidase dari sampel buah Carica papaya di daerah Dieng, Wonosobo, aktivitas βgalaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi penghasil β-galaktosidase dari sampel buah Carica papaya tertinggi, dicapai pada waktu pertumbuhan selama 48 jam, dengan aktivitas β-galaktosidase sebesar 6,258 U/ml (Tabel 2). Aktivitas β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi dari sampel buah Carica papaya di daerah Dieng, Wonosobo, di berbagai waktu pertumbuhan (U/mg) ditunjukkan pada Tabel 3. Dari berbagai waktu pertumbuhan isolat bakteri unggul terseleksi penghasil β-galaktosidase dari sampel buah
Tabel 3. Aktivitas spesifik β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi dari sampel buah Carica papaya di berbagai waktu pertumbuhan (U/mg) Waktu (jam)
Total unit (U)
Protein (mg/ml)
Total protein (mg)
Aktvitas spesifik(U/mg)
0
0,061
0,000
0,000
0,000
6
0,191
0,053
0,053
3,604
12
0,386
0,080
0,080
4,825
18
0,706
0,103
0,103
6,854
24
1,547
0,188
0,188
8,229
48
6,258
0,754
0,754
8,300
72
5,845
0,624
0,624
7,093
400
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011
Carica papaya di daerah Dieng, Wonosobo, aktivitas spesifik β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi penghasil β-galaktosidase dari sampel buah Carica papaya tertinggi, dicapai pada waktu pertumbuhan selama 48 jam, dengan aktivitas β-galaktosidase sebesar 8.300 U/mg (Tabel 3). Perbedaan aktivitas spesifik β-galaktosidase bakteri unggul terseleksi di berbagai waktu pertumbuhannya dan pencapaian aktivitas spesifik maksimum pada waktu pertumbuhan 48 jam, menunjukkan adanya pengaruh waktu pertumbuhan terhadap aktivitas spesifik βgalaktosidase bakteri unggul terseleksi, dan aktivitas spesifik maksimumnya dicapai pada waktu 48 jam. Dilaporkan bahwa waktu pertumbuhan bakteri akan berpengaruh terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase yang dihasilkannya (CHAKRABORTI et al., 2000; BAI dan ELEDGE, 1996). Aktivitas β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi dari sampel buah Carica papaya di daerah Dieng, Wonosobo,. diberbagai pH ditunjukkan pada Tabel 4.
papaya di daerah Dieng, Wonosobo, di berbagai suhu ditunjukkan pada Tabel 5. Dari berbagai suhu isolat bakteri unggul terseleksi penghasil β-galaktosidase dari sampel buah Carica papaya di daerah Dieng, Wonosobo, aktivitas β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi penghasil β-galaktosidase dari sampel buah Carica papaya tertinggi, dicapai pada suhu: 45°C, dengan aktivitas βgalaktosidase sebesar 15,661U/ml (Tabel 5).
Tabel 4. Aktivitas β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi dari sampel buah Carica papaya di-berbagai variasi pH
Adanya perbedaan aktivitas β-galaktosidase yang dihasilkan, dari isolat bakteri unggul terseleksi penghasil β-galaktosidase dari sampel buah “Carica papaya” di berbagai pH (Tabel 4) dan suhu (Tabel 5), kemungkinan disebabkan karena tercapainya aktivitas optimum β-galaktosidase dari isolat bakteri BCPD terjadi pada pH dan suhu tertentu. Dilaporkan bahwa aktivitas optimum βgalaktosidase bakteri terjadi pada suhu dan pH tertentu (CHAKRABORTI et al., 200; LI et al., 2009).
pH
A rerata
µmol ONP
Aktivitas (U/ml)
4,5
0,034
0,272
0,545
5,0
0,259
1,960
3,920
5,5
0,458
3,453
6,906
6,0
0,721
5,430
10,860
6,5
0,767
5,775
11,550
7,0
0,726
5,464
10,927
7,5
0,645
4,856
9,712
8,0
0,482
3,637
7,274
Dari berbagai pH isolat bakteri unggul terseleksi penghasil β-galaktosidase dari sampel buah Carica papaya di daerah Dieng, Wonosobo, aktivitas β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi penghasil βgalaktosidase dari sampel buah Carica papaya tertinggi, dicapai pada pH: 6.5, dengan aktivitas β-galaktosidase sebesar 11.550 U/ml (Tabel 4). Aktivitas β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi dari sampel buah Carica
Tabel 5. Aktivitas β-galaktosidase isolat bakteri unggul terseleksi dari sampel buah Carica papaya di berbagai variasi suhu A rerata
µmol ONP
Aktivitas (U/ml)
25
0,627
4,725
9,449
30
0,770
5,797
11,595
35
0,860
6,469
12,938
40
0,966
7,264
14,528
45
1,041
7,830
15,661
50
0,942
7,088
14,176
Suhu (°C)
KESIMPULAN Seleksi bakteri penghasil β-galaktosidase dari sampel buah Carica papaya (mentah dan setengah matang) yang didapatkan dari daerah Dieng-Wonosobo, menunjukkan bahwa dari 21 isolat bakteri dari buah “Carica papaya”, didapatkan 6 isolat bakteri unggul penghasil β-galaktosidase. Dari berbagai waktu pertumbuhan isolat bakteri unggul terseleksi, aktivitas β-galaktosidase penghidrolisa laktosa susu tertinggi dicapai pada waktu pertumbuhan selama 48 jam, pH 6.5 dan suhu 45°C.
401
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2011
DAFTAR PUSTAKA BAI, C. and S.J. ELLEDGE. 1996. Methods of Enzymology 273: 331 – 347. CHAKRABORTI, S., R.K. SANI, U.C. BANERJEE and R.C. SOBTI. 2000. Purification and characterization of a novel β-galactosidase from Bacillus sp. MTCC-3088. J. Industrial Microbiol. and Biotechnol 24: 58 – 63. HOOVER, D.G. 1993. Bifidobacteria: Research and Development in Japan. Food Technol. 47, 126 – 135. GEKAS, V. and M.L. Laiva. 1985. Hydrolysis of Lactose: a Literature review. Process Biochem. 20: 1 – 12. LI, L., M. ZHANG, Z. JIANG, L. TANG and Q. CONG. 2009. Characterization of a thermostable family 42 -galactosidase from Thermotoga maritima. Food Chemistry 112: 844 – 850.
402
PIVAMIK, L.F., A.G. SENERCAL and A.G. RAND. 1995. Hydrolytic and transgalactosylic activities of commercial -galactosidase (lactase) in food processing. Adv. Food and Nutr. Res. 381 – 102. SALMINEN, S., & A.V. WRIGHT. 1998. Lactid Acid Bacteria. Macell Decker Inc., New York. RASIC, J.L. and J.A. KURMANN, 1983. The Health Potential of Products Containing Bifidobacteria. In: ROBINSON, R.K. (Eds). Therapeutics Properties of Fermented Milks. Elsevier Applied Science, London and New York. ROBINSON, R.K. 1994. Modern Dairy Technology. Vol 1. Chapman & Hall, London.
