AKTIVITAS ANTITUBERKULOSIS FRAKSI FLAVONOID DARI EKSTRAK DIKLOROMETANA KULIT BATANG CEMPAKA KUNING (Michelia champaca L.) TERHADAP ISOLAT Mycobacterium tuberculosis MULTI-DRUG RESISTANT Skripsi
PUTU ANDRE ANGGA AGASTIA 1108505059
JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2015
i
Lembar Pengesahan
AKTIVITAS ANTITUBERKULOSIS FRAKSI FLAVONOID DARI EKSTRAK DIKLOROMETANA KULIT BATANG CEMPAKA KUNING (Michelia champaca L.) TERHADAP ISOLAT Mycobacterium tuberculosis MULTI-DRUG RESISTANT Skripsi Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi (S.Farm) di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana
Oleh PUTU ANDRE ANGGA AGASTIA NIM. 1108505059
Menyetujui: Pembimbing I
Pembimbing II
Ni Putu Ariantari, S.Farm., M.Farm., Apt.
I. B. N. Putra Dwija, S.Si., M.Biotech.
NIP. 198112072005022006
NIP. 197906052005011002
Mengesahkan: Ketua Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt. NIP. 196804201994021001
ii
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Aktivitas Antituberkulosis Fraksi Flavonoid dari Ekstrak Diklorometana Kulit Batang Cempaka Kuning (Michelia champaca L.) terhadap Isolat Mycobacterium tuberculosis Strain Multi-Drug Resistant” tepat pada waktunya, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi (S.Farm.) di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan, saran, dan bimbingan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Ni Putu Ariantari, S.Farm., M.Farm., Apt., selaku dosen pembimbing I yang dengan penuh perhatian telah memberikan motivasi, semangat, bimbingan dan saran dengan sabar selama penulis mengikuti pendidikan di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana, khususnya dalam penyusunan skripsi ini. 2. I. B. N. Putra Dwija, S.Si., M.Biotech., selaku dosen pembimbing II yang dengan penuh perhatian telah memberikan motivasi, semangat, bimbingan dan saran selama penulis mengikuti pendidikan di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana, khususnya dalam penyusunan skripsi ini.
iii
3. Ir. Anak Agung Gde Raka Dalem, M.Sc. (Hons), selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. 4.
Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
5.
Luh Putu Febryana Larasanty, S.Farm., M.Sc., Apt., selaku dosen pembimbing akademik penulis yang selalu memberi motivasi dan dukungan selama kuliah.
6. Seluruh dosen dan staf pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana yang telah memberikan bantuan kepada penulis selama penyusunan skripsi ini. 7. Orang tua yang sangat saya cintai dan hormati, I Wayan Widiana dan Ni Wayan Surmiani yang telah mengasuh dan membesarkan penulis, membimbing dan memberi motivasi dalam penyusunan skripsi ini. 8. Adik kandung saya yaitu I Made Dandy Adi Pradana dan keluarga besar di Desa Perean, Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan yang selalu memberi motivasi dan dukungan. 9. Ibu Adi, Pak Rai, Mbok Widi, Pak Made, Mbok Yanti dan seluruh staf Laboratorium Mikrobiologi Klinik Rumah Sakit Umum Sanglah, Denpasar atas segala bantuan dalam penyusunan skripsi ini. 10. Seluruh rekan mahasiswa Jurusan Farmasi angkatan 2011 dan Bahan Alam 2011 yang saya banggakan, khususnya Tim seperjuangan penulis: Prima, Redika, Samy, Dayu Dewi, Fatwa serta para laboran Kak Anggi,
iv
Kak Pasek dan Mbok Dwi yang banyak membantu dan memberikan semangat dalam penyusunan skripsi ini. Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada anggota dalam praktikum selama saya kuliah yaitu Sayu, Aditya, Geje, Merlina, Dwi, Krisna, Dewa, Ratu yang selalu memberi motivasi. 11. Seluruh anggota Ton 1 yaitu Nia, Tiara, Mita, Suci, Inu, Dewa yang selalu memberi semangat dan mengingatkan saya dalam berbagai hal. Kepada teman-teman yaitu Dwi, Prima, Dewa, Krisna, Sastra, Jeffry, Buntil, Indra, Agung, Dewa, Yan, Samy, Ari, Roni, Redika, West, Butet dan Yogi yang selalu menemani disaat suka maupun duka. 12. Seluruh mahasiswa Jurusan Farmasi angkatan 2010, khususnya kak Adi, kak Wida, kak Nala, kak Era, kak Maha dan kak Eca yang memberikan semangat dan dukungan dalam pembuatan skripsi ini. 13. Semua pihak yang terlibat dan telah membantu penulis dalam penyusunan skripsi ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna. Untuk itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak yang bersifat membangun sehingga di masa yang akan datang dapat menjadi lebih baik. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang memerlukan. Bukit Jimbaran, Juli 2015
Penulis
v
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL...................................................................................... i LEMBAR PENGESAHAN ........................................................................... ii KATA PENGANTAR .................................................................................. iii DAFTAR ISI .................................................................................................. vi DAFTAR SINGKATAN DAN ISTILAH ..................................................... x DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xvi ABSTRAK ..................................................................................................... xvii ABSTRACT ................................................................................................... xviii BAB I
PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang........................................................................ 1 1.2. Rumusan Masalah .................................................................. 4 1.3. Tujuan Penelitian .................................................................... 5 1.4. Manfaat Penelitian .................................................................. 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Cempaka Kuning (Michelia champaca L.) ............................ 6 2.1.1. Klasifikasi tanaman ....................................................... 6 2.1.2. Deskripsi tanaman ......................................................... 7 2.1.3. Khasiat .......................................................................... 7
vi
2.1.4. Kandungan kimia dan bioaktivitas M. champaca L ..... 8 2.2. Ekstraksi ................................................................................. 10 2.3. Metode Pemisahan Bahan Alam ............................................ 11 2.3.1. Kromatografi vakum cair (KVC) .................................. 11 2.3.2. Kromatografi kolom lambat .......................................... 13 2.4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT). ........................................... 14 2.5. Metabolit Sekunder Tanaman Sebagai Antituberkulosis ...... 17 2.5.1. Golongan terpenoid ....................................................... 18 2.5.2. Golongan flavonoid....................................................... 19 2.6. Tuberkulosis ........................................................................... 20 2.6.1. Etiologi ......................................................................... 20 2.6.2. Epidemiologi. ............................................................... 21 2.6.3. Mycobacterium tuberculosis ........................................ 21 2.7. Metode Uji Antituberkulosis .................................................. 22 2.7.1. Metode BMM (Broth Microdilution Method) ............. 23 2.7.2. Metode MABA (Microplate Alamar Blue Assay). ...... 23 2.7.3. Metode Proporsi ........................................................... 23 BAB III METODE PENELITIAN 3.1. Jenis dan Rancangan Penelitian.............................................. 24 3.2. Tempat dan Waktu Penelitian ............................................... 26 3.3. Bakteri Uji .............................................................................. 27 3.4. Bahan Penelitian .................................................................... 27 3.4.1. Bahan tanaman .............................................................. 27
vii
3.4.2. Bahan kimia .................................................................. 27 3.5. Alat Penelitian ....................................................................... 28 3.6. Prosedur Kerja ....................................................................... 28 3.6.1. Pengumpulan dan preparasi sampel .............................. 28 3.6.2. Penetapan susut pengeringan serbuk kulit batang M. champaca L .................................................................. 28 3.6.3. Pembuatan ekstrak diklorometana kulit batang M. champaca L ................................................................... 29 3.6.4. Pemisahan ekstrak diklorometana kulit batang M. champaca L. dengan metode KVC .............................. 29 3.6.5. Identifikasi senyawa golongan flavonoid pada fraksi hasil pemisahan ekstrak diklorometana kulit batang M. champaca L. dengan KLT-pereaksi pendeteksi H2SO4 dan NH3 ............................................................. 31 3.6.6. Uji aktivitas antituberkulosis ........................................ 31 3.7. Analisis Data Hasil Uji Aktivitas Antituberkulosis Fraksi Hasil Pemisahan Ekstrak Diklorometana kulit batangn M. champaca L ............................................................................ 34 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Penetapan Susut Pengeringan Serbuk Kulit Batang M. champaca L ............................................................................ 35 4.2. Pembuatan Ekstrak Diklorometana Kulit Batang M. champaca L.............................................................................................. 36
viii
4.3. Pemisahan
dan
Penentuan
Kandungan
Kimia
Ekstrak
Diklorometana Kulit Batang M. champaca L. dengan Metode KVC ........................................................................................ 36 4.4. Uji Aktivitas Antituberkulosis Fraksi Hasil Pemisahan Ekstrak Diklorometana Kulit Batang M. champaca L. ....................... 41 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan ............................................................................. 53 5.2. Saran ...................................................................................... 53 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 54 LAMPIRAN ................................................................................................... 62
ix
DAFTAR SINGKATAN DAN ISTILAH
Arthralgia
: nyeri pada persendian.
Basil
: bakteri berbentuk batang.
CFU
: Colony Forming Unit, yaitu satuan mikroba yang membentuk sebuah koloni.
DCCP
: Disease Control Priority Project
DMSO
: Dimetil Sulfoksida.
Etnomedicine
: studi tentang praktek medis tradisional yang berkaitan dengan interpretasi budaya kesehatan dan penyakit.
Epileptic Seizure
: kejang yang disertai gangguan kesadaran pada kasus gangguan aktivitas elektrik otak.
Hepatitis
: peradangan pada hati.
HIV
: Human Immunodeficiency Virus.
Infeksi
: invasi dan pembiakan mikroorganisme pada jaringan tubuh, terutama yang menyebabkan cedera selular lokal akibat
kompetisi
metabolisme,
toksin,
replikasi
intraselular atau respon antigen-antibodi. INH
: Isonikotinilhidrazid.
Inspisator
: pembuat tebal, kering atau kurang cair dengan evaporasi.
Isolat
: kelompok individu yang dipisahkan oleh batasan geografis, genetik, ekologis, sosial atau buatan yang
x
mencegah perkawinan dengan individu lain di luar batasan tadi. Kelainan psikiatrik
: kelainan
mental
atau
penyakit
yang
dapat
mempengaruhi cara seseorang berperilaku, berinteraksi dengan orang lain, dan fungsi dalam kehidupan seharihari. Kemotaksonomi
: kegiatan mengklasifikasikan, mencirikan serta memberi nama organisme berdasarkan kandungan kimia yang dimiliki.
L-J
: Lowenstein-Jensen.
MIC
: Minimum Inhibitory Concentration, yaitu konsentrasi terendah
antimikroba
yang mampu
menghambat
pertumbuhan mikroorganisme. Mono-resistant
: kebal terhadap salah satu obat OAT lini pertama.
OAT
: Obat Anti Tuberkulosis.
Ototoksik
: bersifat toksik pada telinga.
Pandemi
: penyakit epidemik yang tersebar luas.
Patogen
: agen atau mikroorganisme penyebab penyakit.
Resisten
: mikroorganisme yang mampu menahan efek obat yang mematikan terhadap sebagian besar anggota spesiesnya.
Resistensi
: kemampuan alami suatu organisme untuk menjadi tidak terpengaruh oleh agen berbahaya yang ada pada lingkungannya.
xi
Resolusi
: kemampuan untuk memisahkan dua zona/pita/bercak.
Rf
: Retardation factor merupakan perbandingan jarak pusat kromatografik dari titik awal dengan jarak pergerakan pelarut dari titik awal.
Strain
: kelompok organisme dalam suatu spesies yang ditandai dengan beberapa sifat yang khas.
TDR
: Totally Drug Resistant, yaitu bentuk resistensi M. Tuberculosis XDR
yang sudah resisten terhadap
seluruh obat OAT lini pertama dan lini kedua. XDR
: Extensively Drug Resistant, yaitu bentuk resistensi M. tuberculosis
MDR
disertai
resistensi
terhadap
fluorokuinolon, dan setidaknya satu dari 3 obat antituberkulosis injeksi (amikasin, kanamisin, atau kapreomisin). UV
: Ultra Violet
WHO
: World Health Organization
xii
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 2.1. Sistem Pelarut yang Digunakan dalam Penentuan Profil Kandungan Kimia Tumbuhan .................................................... 15 Tabel 2.2. Beberapa Sistem Pemisahan dengan KLT .................................. 16 Tabel 2.3. Beberapa jenis Pereaksi Semprot untuk Deteksi Senyawa Bahan Alam pada Plat KLT ........................................................ 17 Tabel 3.1 Fase Gerak yang Digunakan Dalam Pemisahan Ekstrak Diklorometana Kulit Batang M. champaca L. dengan Metode KVC ............................................................................................ 30 Tabel 4.1 Hasil Penetapan Susut Pengeringan Serbuk Simplisia Kulit Batang M. champaca L. dengan Metode Gravimetri ................. 35 Tabel 4.2 Hasil Pengamatan Bercak Pada Pemeriksaan Kandungan Kimia Fraksi Hasil Pemisahan Ekstrak Diklorometana Kulit Batang M. champaca L. dengan KLT ..................................................... 39 Tabel 4.3 Hasil Pengamatan Jumlah Koloni Rata-Rata pada Media tiap Perlakuan dari Minggu III-VI pada Pengujian Aktivitas Antituberkulosis
Fraksi
Hasil
Pemisahan
Ekstrak
Diklorometana Kulit Batang M. champaca L. ........................... 42 Tabel 4.4 Hasil Perhitungan Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis tiap Perlakuan dari Minggu III-VI pada Pengujian
xiii
Aktivitas Antituberkulosis Ekstrak Diklorometana Kulit Batang M. champaca L. .............................................................. 45
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 2.1 Daun, Bunga, Kulit Batang M. champaca L...............................
7
Gambar 2.2 Grafik pertumbuhan M. tuberculosis selama 21 hari yang terdiri atas fase lag dan fase eksponensial ..................................
7
Gambar 3.1 Rancangan pengujian aktivitas antituberkulosis fraksi hasil pemisahan ekstrak diklorometana kulit batang M. champaca L. terhadap isolat M. tuberculosis MDR .........................................
25
Gambar 3.2 Skema kerja umum penelitian uji aktivitas antituberkulosis fraksi hasil pemisahan ekstrak diklorometana kulit batang M. champaca L. terhadap isolat M. tuberculosis MDR ...................... 26 Gambar 4.1 Kromatogram hasil pemisahan KVC ekstrak diklorometana kulit batang M. champaca L. dengan fase diam plat silika gel GF254 dan fase gerak kloroform:metanol (9,5 : 0,5 v/v) ............... 37 Gambar 4.2 Kromatogram
fraksi-fraksi
hasil
pemisahan
ekstrak
diklorometana kulit batang M. champaca L. dengan fase diam plat silika gel GF254 dan fase gerak kloroform:metanol (9,5:0,5 v/v). ............................................................................................... 38 Gambar 4.3 Diagram perbandingan persentase hambatan pertumbuhan M. tuberculosis dengan pemberian fraksi dengan konsentrasi 0,1 mg/mL (A); 1 mg/mL (B) dan 10 mg/mL (C) ............................... 48
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1.
Surat Keterangan Ethical Clearance dari Unit Penelitian dan Pengembangan
(LITBANG)
Fakultas
Kedokteran
Universitas Udayana. ................................................................ 62 Lampiran 2. Jumlah Koloni pada Media tiap Perlakuan dari Minggu III-VI pada Pengujian Aktivitas Antituberkulosis Fraksi Hasil Pemisahan
Ekstrak
Diklorometana
Kulit
Batang
M.
champaca L. ............................................................................. 63 Lampiran 3.
Gambar Koloni Mycobacterium tuberculosis MDR pada pengamatan ke-10 .................................................................... 67
xvi
ABSTRAK Kulit batang cempaka kuning (Michelia champaca L.), suku Magnoliaceae, digunakan secara tradisional oleh masyarakat berdasarkan etnomedisin ayurveda untuk mengobati batuk. Penelitian sebelumnya melaporkan ekstrak kloroform kulit batang M. champaca L. memiliki aktivitas antituberkulosis dengan persentase hambatan sebesar 91,73% pada konsentrasi 10 mg/mL dan pada konsentrasi 100 mg/mL ekstrak tersebut memiliki persentase hambatan sebesar 100%. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antituberkulosis fraksi flavonoid dari ekstrak diklorometana kulit batang M. champaca L. terhadap isolat Mycobacterium tuberculosis MDR. Serbuk kulit batang M. champaca L. diekstraksi secara bertingkat dengan n-heksana dan diklorometana. Ekstrak diklorometana dipisahkan lebih lanjut dengan KVC menghasilkan 9 fraksi. Fraksi tersebut diuji aktivitas antituberkulosisnya dengan metode proporsi menggunakan media L-J, dengan 3 seri konsentrasi fraksi (0,1; 1; dan 10 mg/mL). Pengamatan koloni dilakukan mulai minggu ke-III sampai ke-VI. Flavonoid ditemukan pada fraksi 3, 4, 5, 6, 7, 8 dan 9. Bercak flavonoid paling intensif adalah bercak dengan Rf 0,74 yang mengarah pada flavonol, terutama dominan muncul pada Fraksi 9. Diantara kesembilan fraksi tersebut, fraksi 9 memiliki aktivitas antituberkulosis yang paling aktif. Pada akhir pengamatan, persentase hambatan fraksi 9 pada konsentrasi 10 mg/mL sebesar 90,08%. Flavonoid yang merupakan bercak mayor pada Fraksi 9 kemungkinan memberikan kontribusi besar pada aktivitas antituberkulosisnya.
Kata Kunci : Michelia champaca L., ekstrak, flavonoid, antituberkulosis, Mycobacterium tuberculosis MDR.
xvii
ABSTRACT Michelia champaca L. stem bark, Magnoliaceae, was traditionally used to treat cough based on ayurveda. Previous research reported that chloroform extract of M. champaca L. stem bark had anti-tuberculosis activity against isolate Mycobacterium tuberculosis strain MDR with inhibition of 91,73% at 10 mg/mL and 100% inhibition at 100 mg/mL. This study aims to determine antituberculosis activity of flavonoid fractions obtained from separation of dichloromethane extract of M. champaca L. stem bark against isolate of M. tuberculosis MDR. Powder of M. champaca L. stem bark was extracted with n-hexane and dichloromethane. Dichloromethane extract was separated by vacuum liquid chromatography and produce 9 fraction. All fractions were tested for its antituberculosis activity by proportion method on Lowenstein Jansen (LJ) media at series concentration of 0,1; 1; and 10 mg/mL. Growth of bacterial colonies were counted on the 3rd until 6th week.
Flavonoids were found in fractions 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9. The most intensive flavonoids was spot with Rf 0.74 which leads to a flavonol, which was mainly detected in fraction 9. Among the nine factions, fraction 9 showed the highest activity against M. tuberculosis MDR. At the end of observation, percentage inhibition of fraction 9 at concentration 10 mg/mL was 90,08%. Flavonoids which is appeared as major spot in Fraction 9 might be have greatest contribution to antituberculosis activity of this fraction. Kata Kunci : Michelia champaca L., extract, flavonoid, antituberculosis, Mycobacterium tuberculosis MDR
xviii
