AKTIVITAS SITOTOKSIK FRAKSI NON POLAR EKSTRAK ETANOLIK KULIT BATANG SIRSAK (Annona muricata Linn.) TERHADAP SEL T47D
SKRIPSI
Oleh:
AULIA HANDAYANI K 100 080 015
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA SURAKARTA 2012
1
2
AKTIVITAS SITOTOKSIK FRAKSI NON POLAR EKSTRAK ETANOLIK KULIT BATANG SIRSAK (Annona muricata Linn.) TERHADAP SEL T47D CYTOTOXIC ACTIVITY OF FRACTION NON POLAR EXTRACT ETHANOLIC SKIN STEM SOURSOP (Annona muricata Linn.) ON CELL T47D Peni Indrayudha, Haryoto dan Aulia Handayani Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta Jl. A. Yani Tromol Pos I Pabelan Kartasura, Surakarta ABSTRAK Daun sirsak (Annona muricata L.) secara empiris digunakan untuk mengobati kanker. Penelitian sebelumnya menunjukkan ekstrak etil asetat daun sirsak mempunyai efek sitotoksik pada sel U-937 dengan nilai IC50 = 7,8 ± 0,3 µg/mL. Penelusuran atau skrining kandungan kimia dan aktivitasnya pada kulit batang sangat diperlukan untuk mengetahui efek sitotoksik fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak terhadap sel T47D dan kandungan senyawa yang tersari. Ekstrak etanol diperoleh dari ekstraksi menggunakan pelarut etanol 96%, kemudian fraksi heksan diperoleh dengan metode KCV. Uji sitotoksik menggunakan metode MTT dengan berbagai seri konsentrasi fraksi sebesar 125,00; 62,50; 31,25; 15,62; dan 7,81 µg/mL. Pembacaan absorbansi menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Data yang diperoleh berupa absorbansi, digunakan untuk menghitung % sel hidup yang selanjutnya digunakan dalam menentukan nilai IC50. Analisis kualitatif kandungan senyawa dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak n-heksan PA : etil asetat PA (9 : 1). Hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan bahwa fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak tidak memiliki efek sitotoksik terhadap sel T47D. Konsentrasi tertinggi pada 125 µg/mL menunjukkan % sel hidup = 114,94%. Hasil analisis KLT menunjukkan adanya senyawa saponin, polifenol, flavonoid, dan minyak atsiri. Kata Kunci : Annona muricata L., sel T47D, metode MTT, sitotoksik, ekstrak etanolik kulit batang sirsak ABSTRACT Leaves of the soursop (Annona muricata L.) is empirically used to treat cancer. Previous research suggests ethyl acetate extract of the soursop is leaves has a cytotoxic effect on U-937 cells with IC50 values = 7.8 ± 0.3 mg/mL. Search or screening of chemical content and activities on the bark is needed to determine
1
the cytotoxic effect of non polar fraction of bark ethanolic extract to T47D cells and the soursop compound content. Ethanol extracts obtained from extraction using 96% ethanol by maceration method, then hexane fraction obtained by the method of VLC. Cytotoxic test using the MTT method with various concentrations of the fraction by 125.00: 62.50: 31.25: 15.62, and 7.81 µg/mL. Absorbance readings using an ELISA reader at a wavelength of 595 nm then was used to calculate % living cells was then used to determine IC50 values. Qualitative content analysis of compounds with thin layer chromatography (TLC) using GF254 silica gel as stationary phase and n-hexane PA : PA ethyl acetate (9 : 1) as mobile phase. The results show that the non polar fraction of ethanolic extract of the bark of the soursop was no cytotoxic effect on T47D cells. The highest concentration at 125 µg/mL showed % living cells values = 114.94%. TLC analysis results indicate the presence of saponin, polyphenols, flavonoids, and essential oils. Keywords: Annona muricata L., T47D cells, MTT method, cytotoxic, soursop bark ethanolic extract PENDAHULUAN Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang frekuensi kejadiannya paling tinggi di antara kanker-kanker jenis lain yang sering menyerang wanita. Penderita kanker payudara di Indonesia sebanyak 12,10%, terbanyak kedua setelah kanker leher rahim (19,18%) (Tjindarbumi dan Mangunkusumo, 2002). Upaya pencegahan atau pengobatan kanker lebih penting mengingat frekuensi kejadian cukup tinggi (Nurrochmad et al., 2011). Secara umum, pengobatan kanker dilakukan dengan cara pembedahan, penyinaran, kemoterapi, imunoterapi, dan hormon (Mangan, 2003). Bahan alam juga memiliki pengaruh yang sangat besar terhadap penemuan senyawa pemusnah sel kanker (Syarief et al., 2005), salah satu tanaman yang berpotensi sebagai anti kanker adalah sirsak. Fraksi kloroform ekstrak etanol dari daun srikaya yang berasal dari genus yang sama memberikan aktivitas sitotoksik dengan nilai LC50 4,5467 µg/mL terhadap sel HeLa (Djajanegara, 2009). Terdapatnya aktivitas pada ekstrak yang disari dengan pelarut non polar yaitu heksana, maka penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek sitotoksik kulit batang sirsak yang difraksinasi menggunakan pelarut heksan terhadap sel T47D dan untuk mengetahui senyawa yang tersari dalam fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak.
2
METODE PENELITIAN I.
Bahan dan Alat 1) Bahan a. Kulit batang sirsak yang diambil dari tanaman sirsak yang terdapat di Desa Lopait Kecamatan Tuntang Semarang, Jawa Tengah. b. Heksan c. Sel T47D (koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM), RPMI (Gibco), FBS, antibiotik penicillin-streptomisin dan fungizone,
akuades,
natrium
bikarbonat,
larutan
MTT
(3-(4,5
dimethytiazol-2-yl), 2,5-diphenyl tetrazolium bromide), PBS, SDS 10% (Sigma), HCl 1N, DMSO 100%. d. Bahan untuk uji kualitatif kandungan senyawa secara kromatografi lapis tipis, pelat silika gel GF254 (fase diam), n-heksan PA, etil asetat PA (fase gerak), FeCl3 (deteksi polifenol), sitroborat (deteksi flavanoid), vanilin H2SO4 (deteksi minyak atsiri), dragendrof (alkaloid), dan libermanbourchad (deteksi steroid saponin dan terpenoid saponin). 2) Alat a. Peralatan dalam pembuatan serbuk: kain hitam, blender, dan pengayak serbuk b. Peralatan yang digunakan dalam penyarian: peralatan gelas, penangas air, alat timbang, seperangkat alat maserasi, dan rotary evaporator c. Alat yang digunakan dalam uji sitotoksik: tangki nitrogen cair, mikroskop fase kontras (Olympus), sentrifuge, inkubator CO2, Laminair Air Flow, ELISA reader, haemocytometer, tabung conical steril, tissue culture flask, plate micro 96 sumuran, mikropipiet, vorteks, timbangan elektrik, kamera digital Sony DSC-W130 (8,1 megapixel). d. Peralatan dalam uji kualitatif kandungan senyawa secara kromatografi lapis tipis : kertas saring, cawan porselin, lampu UV, pipa kapiler, bejana elusi, dan alat gelas.
3
II.
Jalan Penelitian
1). Determinasi Tanaman Determinasi tanaman sirsak dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi UMS, untuk memastikan tanaman yang diteliti adalah tanaman yang dimaksud dengan mencocokkan keadaan morfologi tanaman berdasarkan kunci-kunci determinasi dalam buku Flora of Java karangan Backer dan Van den Brink (1965). 2). Pengumpulan Bahan dan Pembuatan Serbuk Simplisia kulit batang sirsak yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari tanaman yang sehat dan segar dari Desa Lopait Kecamatan Tuntang Semarang yang diambil pada bulan Desember 2010. Kulit batang tersebut dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung dengan ditutupi kain hitam, setelah kering simplisia tersebut diblender dan diayak. 3). Preparasi Ekstrak dan Fraksinasi Serbuk kering simplisia kulit batang sirsak ditimbang sebanyak 1,72 kg kemudian dimasukkan ke alat maserasi dan dimaserasi dengan pelarut etanol 96% sebanyak 7,5 kali simplisia dalam wadah tertutup rapat dan terlindung cahaya, disimpan selama 1 x 24 jam sambil sesekali diaduk. Kemudian ekstrak disaring menggunakan corong buchner. Maserasi dilakukan berulang sebanyak 2 kali. Filtrat etanol yang didapatkan dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator dan dilanjutkan dengan penangas air sehingga diperoleh ekstrak kental yang kemudian difraksinasi. Fraksinasi ekstrak etanol kulit batang sirsak dilakukan dengan metode kromatografi cair vakum (KCV) dengan fase diam silica GF 60 254 yang telah diaktifkan 1500C selama 1 jam. Fase diam dimasukkan ke dalam kolom ± 175 gram. Pada bagian atas fase diam, dituangkan sampel yang telah diimpregnasi menggunakan silika impreg yang telah diaktifkan 1500C selama 1 jam. Sampel diimpregnasi dengan cara mencampurkan sampel dengan silika dengan perbandingan 1 : 2. Selanjutnya dimasukkan kertas saring pada bagian atasnya, dengan tujuan untuk menjaga agar fase diam
4
tidak berubah letak karena penuangan eluen. Adapun eluen yang digunakan dalam fraksinasi ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel 1. Eluen yang digunakan dalam fraksinasi
Eluen
Volume eluen (mL)
Jumlah elusi
Heksan
Etil asetat
Etanol
9
1
-
150
3X
8
2
-
150
4X
7
3
-
150
4X
6
4
-
150
3X
-
-
10
150
2X
Kemudian eluen dituangkan, dan proses kromatografi dijalankan. Hasil elusi (eluen) ditampung dalam botol flakon. Tiap eluen ditotolkan pada KLT dan dikembangkan dengan menggunakan eluen n-heksan PA : etil asetat PA (8 : 2), diamati profil yang terbentuk, eluen dengan profil yang sama disatukan sebagai satu fraksi, fraksi-fraksi diuapkan dari pelarutnya dengan rotary evaporator, fraksi heksan diuji aktivitas antikankernya. 4). Sterilisasi Sterilisasi laminar air flow cabinet
a.
Sterilisasi LAF dilakukan dengan menyalakan lampu ultraviolet 30 menit sebelum digunakan. Permukaan tempat kerja disterilkan terlebih dahulu dengan disemprot etanol 70%. b.
Sterilisasi alat Sterilisasi alat-alat gelas yang akan digunakan dalam penelitian ini
disterilkan dengan autoclave 1210C selama 15-20 menit. 5). Preparasi Sel Kanker Payudara (T47D) Sel yang cukup, mediumnya dibuang kemudian ditambah PBS, ditambah tripsin 0,05%, setelah itu diinkubasi. Selanjutnya ditambah media secukupnya, dipindah dalam tabung konikal. Kepadatan sel T47D dapat diketahui dengan cara mengambil 10 µL suspensi sel dan dihitung menggunakan haemocytometer.
5
6). Pembuatan Larutan Uji Fraksi non polar ekstrak etanolik 96% kulit batang sirsak sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 100 µL DMSO sehingga diperoleh sampel induk sebesar 100.000 µg/mL. Selanjutnya dibuat 7 seri kadar dari larutan sampel induk dalam media RPMI. 7). Uji Sitotoksik menggunakan Metode MTT Stok yang telah dibuat tujuh seri konsentrasi yaitu 1000 µg/mL; 500 µg/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62,5 µg/mL; 31,25 µg/mL; 15,625 µg/mL dimasukkan ke dalam microplate 96 sumuran, dengan volume 100 µL/sumuran. Sel diinkubasi dalam inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 370C. Kemudian ditambah MTT pada masing-masing sumuran sebanyak 110 µL selanjutnya diinkubasi selama 3,5 jam. Setelah itu reaksi dihentikan dan penambahan SDS 10% sebanyak 100 µL/sumuran untuk melarutkan formazan. Hasilnya dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. 8). Uji Kandungan Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis Fraksi non polar kulit batang sirsak dilarutkan dalam pelarut yang sesuai. Larutan sampel ditotolkan pada plat KLT, kemudian totolan dielusi dengan berbagai fase gerak yang sesuai, kemudian dikeringkan. Setelah itu di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Tahap akhir uji KLT, permukaan plat disemprot dengan berbagai pereaksi semprot. 9). Analisis Data Data uji sitotoksik yang didapat dihitung dengan menggunakan rumus :
% sel hidup =
Abs perlakuan – Abs kontrol media
x100%
Abs kontrol sel – Abs kontrol media % sel hidup yang diperoleh dari masing-masing konsentrasi dibuat persamaan regresi linier yang berasal dari log konsentrasi vs % sel hidup. Hasilnya kemudian disubstitusi ke dalam persamaan y = Bx + A dengan nilai y = 50 dan dianti-logaritma untuk mendapatkan nilai IC50.
6
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 1.
Hasil Fraksinasi Ekstrak Etanol Kulit Batang Sirsak Fraksinasi dilakukan terhadap ekstrak etanol dengan rendemen sebesar 4,04%. Hasil fraksinasi diperoleh fraksi non polar (Gambar 1). A
1
A
B
2
S
C
B
3
4
5
C
Gambar 1. Fraksi non polar (A) ekstrak etanolik kulit batang sirsak diperoleh dari penggabungan dua kali fraksinasi. B dan C menunjukkan fraksi semi polar dan polar.
2.
Deteksi Kandungan Senyawa dalam Fraksi Non Polar Ekstrak Etanolik Kulit Batang Sirsak Deteksi dilakukan terhadap senyawa saponin, polifenol, flavonoid, minyak atsiri, dan alkaloid. Hasil deteksi menunjukkan adanya kandungan senyawa saponin, polifenol, flavonoid, dan minyak atsiri. Hasil tersebut tidak menunjukkan adanya senyawa alkaloid (Gambar 2).
7
Rf = 0,33
A B C D E F G Gambar 2. Hasil KLT Fraksi Non Polar Ekstrak Etanolik Kulit Batang Sirsak dengan Fase Gerak n-Heksan:Etil Asetat (9:1) dan Fase Diam Silika Gel GF. Hasil Deteksi Menunjukkan Kandungan Saponin, Polifenol, Flavonoid, dan Minyak Atsiri Keterangan : A : Deteksi UV 254 nm B : Deteksi UV 366 nm C : Deteksi pereaksi semprot Liberman-Bourchad di bawah UV 366 nm (deteksi saponin) D : Deteksi pereaksi semprot FeCl3 secara visual (deteksi polifenol) E : Deteksi pereaksi semprot Sitroborat di bawah UV 366 nm (deteksi flavonoid) F : Deteksi pereaksi semprot Vanilin-H2SO4 secara visual (deteksi minyak atsiri) G : Deteksi pereaksi semprot Dragendroff di bawah UV 366 nm (deteksi alkaloid)
3.
Hasil Uji sitotoksik
A B Gambar 3. Sel kontrol (A) dan sel perlakuan fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak konsentrasi 125 µg/mL (B). Hasil menunjukkan sel relatif hidup. ( sel hidup sel mati )
Hasil
menunjukkan
perubahan
konsentrasi
tidak
mempengaruhi
perubahan % sel hidup karena kemungkinan terjadi kontaminasi dan memicu pertumbuhan sel T47D. Salah satu faktor yang dapat menyebabkan kontaminasi
8
yaitu kurangnya menjaga sterilitas dalam melakukan uji sitotoksik sehingga bakteri dan jamur dapat tumbuh di dalam media. Hal ini menunjukkan bahwa fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak tidak mempunyai efek sitotoksik terhadap sel T47D. Hasil relatif berbeda dengan hasil sebelumnya. Pengujian bullatacin yang merupakan salah satu Annonaceous acetogenin diperoleh % sel hidup sebesar 0,15% pada konsentrasi 1 µg/mL dan 1% pada konsentrasi 1 x 10-9 µg/mL terhadap sel MCF-7/Adr. Kenaikan konsentrasi ekstrak berbanding terbalik dengan % sel hidup (McLaughlin et al., 1999). Tabel 1. Hasil uji sitotoksik fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak terhadap sel T47D
Konsentrasi (µg/mL) 125,00 62,50 31,25 15,62 7,81
Log konsentrasi
% sel hidup
2,09 1,79 1,49 1,19 0,89
114,94 116,63 112,21 108,84 109,68
Konsentrasi Fraksi vs % Sel Hidup 118 116,63
% Sel Hidup
116
114,94
114 112,21
112 110
109,68
108
108,84
% sel hidup
106 104 7,81
15,62
31,25
62,5
125
Konsentrasi Fraksi µg/mL Gambar 4. Grafik Hubungan Konsentrasi Fraksi Non Polar Ekstrak Etanolik Kulit Batang Sirsak dengan Persentase Sel Hidup T47D
Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang dikenal memiliki aktivitas antikanker yang berperan dalam mekanisme sitotoksik dengan menginduksi program kematian sel (apoptosis) (Srisadono, 2008).
9
Menurut Pinto (2005), sari buah sirsak menghasilkan tannins. Tannins merupakan salah satu jenis polifenol. Polifenol menghambat terjadinya karsinogenesis dengan cara menghambat faktor pertumbuhan, aktifasi AP (activator protein) -1, dan MAP (mitogen-activated protein) kinase sehingga menurunkan perkembangbiakan dari sel kanker. Selain itu polifenol juga menghambat metabolisme asam arakidonat yang menyimpang dari kebiasaan sehingga meningkatkan apoptosis (Lambert, 2005). Tidak semua flavonoid dan polifenol di kulit batang sirsak bersifat aktif, sehingga fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak tidak toksik terhadap sel T47D. Hal ini mungkin disebabkan juga karena minyak atsiri yang terkandung dalam fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak mengandung minyak atsiri yang tidak berefek sitotoksik antara lain β-caryophyllene, epi-α-cadinol, αcadinol yang berasal dari ekstrak etanol daun sirsak (Sausa, 2010). Tidak tersarinya alkaloid pada fraksi non polar dimungkinkan menjadi penyebab tidak aktifnya fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak sehingga tidak memiliki aktivitas sitotoksik. Alkaloid-alkaloid dalam tanaman sirsak seperti aporphine dan (-) roemerine merupakan senyawa yang telah dibuktikan bertanggung jawab terhadap aktivitas sitotoksik (Pinto, 2005).
KESIMPULAN DAN SARAN KESIMPULAN 1.
Fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang Annona muricata L. tidak memiliki efek sitotoksik poten terhadap sel T47D.
2.
Hasil komatografi lapis tipis (KLT) menunjukan bahwa fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang Annona muricata L. terdapat senyawa saponin, polifenol, flavonoid, dan minyak atsiri.
SARAN 1.
Penelitian dengan menjaga sterilitas dalam melakukan uji sitotoksik.
2.
Penelitian dengan fraksinasi yang berbeda untuk memperoleh hasil yang lebih baik.
10
UCAPAN TERIMA KASIH Kepada LPPM melalui Program Hibah Penelitian Kompetitif. DAFTAR ACUAN Backer, C. A. D. & Brink, R. C. B. D. D., 1965, Flora of Java (Spermatophytes Only), NVP Noordhaff, Groningen the Netherlands. Djajanegara, I. & Wahyudi, P., 2009, Pemakaian Sel HeLa dalam Uji Sitotoksitas Fraksi Kloroform dan Etanol Ekstrak Daun Annona sqamosa. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, Vol. 7, No. 1, hal. 7-11. Lambert, J. D., Hong, J., Yang, G., Liao, J., & Yang, C. S., 2005, Inhibition of carcinogenesis by polyphenols: evidence from laboratory investigations, Am J Clin Nutr, 81(suppl):284S–91S. Mangan, Y., 2003, Cara Bijak Menaklukan Kanker, 3-6, Agro Media Pustaka, Jakarta. McLaughlin, J. L., Alali, F. Q., & Liu, X. X., 1999, Annonaceous Acetogenins : Recent Progress, Journal of Natural Products, 62, 504-540. Nurrochmad, A., Lukitaningsih, E., & Meiyanto, E., 2011, Anti cancer activity of rodent tuber (Thyphonium flagelliforme (lodd.) Blume on human breast cancer t47d cells, International Journal of Phytomedicine, Vol. 3, 138146. Pinto, A. C. Q., Cordiero, M. C. R., Andrade, S. R. M., Ferraira, F. R., Filgueiras, H. A. C., Alves, R. E., & Kinpara, D. I., 2005, Annona spesies, International Centre for Underutilized Crops, University of Southampton, Southampton. Sausa, O. V., Vieira, G. D. V., Pinho, J. J. R. G., Yamamoto, C. H., & Alves, M. S., 2010, Antinociceptive and Anti-Inflammatory Activities of the Ethanol Extract of Annona muricata L. Leaves in Animal Models, International Journal of Molecular Sciences, 11, 2067-2078. Srisadono, 2008, Skrining Awal Ekstrak Etanol Daun Sirih (Piper betle Linn) Sebagai Antikanker dengan Metode Brine Shrimp Lathaly Test (BLT), Karya Ilmiah, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro. Syarief, W. R., Aisyah, C., Elviana, E., & Fidiasari, E. R., 2005, Farmakognosi dan Fitoterapi, EGC, Jakarta.
11
Tjindarbumi, D. & Mangunkusumo, R., 2002, Cancer in Indonesia, Present and Future, Jpn J Clin Oncol., 32 (Supplement 1), S17-S21
12
