AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM In Vitro ESTRAK KEMBANG BULAN (Tithonia diversifolia (Hemsley) A.Gray) TERHADAP Plasmodium falciparum In Vitro ANTIPLASMODIAL ACTIVITY of KEMBANG BULAN (Tithonia diversifolia (Hemsley) A.Gray EXTRACT on Plasmodium falciparum Rul Afiyah Syarif 1), Mae Sri Hartati Wahyuningsih1), Mustofa2), Ngatidjan2), Heri Kurniawan3), Said Rival Al Hilal3) 1)
Bagian Farmasi Kedokteran Bagian Farmakologi dan Toksikologi 3) Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada 2)
ABSTRAK Kembang bulan (T.diversifolia) telah digunakan dalam pengobatan tradisional untuk berbagai tujuan diantaranya untuk mengobati malaria. Namun demikian, penggunaannya masih didasarkan pengalaman empiris daripada penelitian secara ilmiah. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui aktivitas antiplasmodium in vitro ekstrak kloroform dan metanol kembang bulan terhadap P. falciparum strain resisten klorokuin, FCR-3. Ekstrak kloroform dan metanol dibuat dari daun kembang bulan dengan cara maserasi. Uji aktivitas antiplasmodium dilakukan secara visual pada kultur P. falciparum strain resisten klorokuin, FCR-3. Jumlah parasit yang menginfeksi eritrosit per 1000 eritrosit pada apusan darah tipis dengan pewarnaan Giemsa dihitung secara mikroskopik. Persentase penghambatan pertumbuhan parasit setelah pemberian ekstrak uji dibandingkan dengan tanpa ekstrak uji yang dianggap mencapai pertumbuhan 100%. Nilai IC50 dihitung dengan analisis probit program SPSS versi 13. Ekstrak metanol dan kloroform daun kembang bulan (T. diversifolia (Hemsley) A.Gray) memiliki aktivitas antiplasmodium yang baik terhadap P. falciparum strain FCR-3 dengan IC50 sebesar 8,12 ± 0,53 µg/ml dan 10,64 ± 2,55 µg/ml. Kata kunci : Tithonia diversifolia, antiplasmodium, Plasmodium falciparum, parasitemia, herbal medicine
ABSTRACT Tithonia diversifolia is employed in traditional medicine for medical purposes including malaria. However, its use is largely based on the empirical experience rather than scientific investigation. The aim of this study is to evaluate in vitro antiplasmodial activity of chloroform and methanol extracts of T. diversifolia leaves against a choloroquine-resistant FCR-3 strain of P. falciparum. Chloroform and methanol extracts were obtained from leaves of the plant by maceration. A visual method was allowed to evaluate the in vitro antiplasmodial activity of the extracts on P. falciparum chloroquine-resistant strain, FCR-3. The number of parasites per 1000 erythrocytes on thin Giemsa stained smears was calculated microscopically. Percentage inhibition of parasite growth in the presence of extract was determined by compared with that of control without extract that referred to as 100% growth. IC50 values were determined by probit analysis of SPSS 13 program. The antiplasmodial activity of methanol and chloroform extracts of T. diversifolia leaves on P. falciparum strain FCR-3 were good with IC50 8,12 ± 0,53 and IC50 10,64 ± 2,55 µg/ml respectively. Keywords: Tithonia diversifolia, antiplasmodial, Plasmodium falciparum, parasitemia, herbal medicine
PENDAHULUAN Malaria masih merupakan masalah kesehatan utama di Indonesia terutama di Indonesia bagian timur. Terdapat 433.326 kasus dari 232 juta penduduk Indonesia pada tahun 2005 (WHO, 2007a) dan terjadi ledakan kasus malaria pada beberapa daerah yang
menyebabkan 87 kematian dari 18.812 kasus di 62 desa di Indonesia pada tahun 2005 (WHO, 2007b). Berbagai macam usaha telah dilakukan untuk mengatasi malaria antara lain dengan menghindari gigitan nyamuk Anopheles, membunuh nyamuk dewasa,
membunuh jentik, mengurangi tempat perindukan, mengobati penderita malaria, vaksinasi, dan pemberian pengobatan pencegahan, tetapi kasus malaria masih tetap tinggi (Gunawan, 2000). Tingginya kasus malaria ini disebabkan karena munculnya berbagai macam hambatan dalam pemberantasan malaria, diantaranya resistensi parasit terhadap obat-obat malaria. Mengingat hal tersebut diatas maka perlu dilakukan pengembangan obat baru antimalaria dengan menggunakan bahanbahan alam yang secara empiris bermanfaat sebagai antimalaria. Salah satu bahan alam yang digunakan sebagai antimalaria adalah kembang bulan (Tithonia diversifolia (Hemsley) A. Gray). Penelitian sebelumnya diketahui bahwa ekstrak metanol daun T .diversifolia (Hemsley) A. Gray memiliki aktivitas antiplasmodium pada P. falciparum strain 3D7 dengan IC50 sebesar 23,6 µg/ml (Obeleague & Wright, 2005) dan pada strain FCA dan FCB1 berturut-turut sebesar 2,16 µg/ml dan 4,36 µg/ml (Goffin et al., 2002) sedangkan penelitian dengan menggunakan P. falciparum strain FCR-3 belum dilakukan. Berdasarkan atas data-data di atas, maka penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform dan metanol daun T. diversifolia (Hemsley) A.Gray memiliki aktivitas antiplasmodium terhadap P. falciparum strain FCR-3. METODOLOGI Bahan P. falciparum strain FCR-3, daun T. diversifolia diambil dari Kecamatan Pakem, Kabupaten Sleman Daerah Istimewa Yogyakarta pada bulan November 2005 sampai Maret 2006, RPMI 1640, HEPES, NaHCO3, sorbitol, dekstrosa, giemsa, metanol, kloroform, DMSO, serum dan eritrosit manusia golongan O+, akuades steril. Jalannya Penelitian a. Pembuatan ekstrak Dua ratus gram serbuk kering daun T. diversifolia dimaserasi dengan 600 ml metanol selama 24 jam sambil diaduk-aduk, kemudian disaring, ampas dimaserasi lagi dengan cara yang sama sebanyak 3 kali kemudian
gabungan filtrat diuapkan hingga didapat ekstrak kering metanol. Ampas dianginkan sampai tidak berbau metanol kemudian dimaserasi dengan kloroform dengan cara yang sama seperti metanol. b. Pembuatan larutan stock Sejumlah 4,3 mg ekstrak kloroform dan 5 mg ekstrak metanol masing-masing dilarutkan dalam DMSO sampai volume 172 µl untuk ekstrak kloroform dan 200 µl untuk ekstrak metanol, sehingga didapatkan larutan stock kedua ekstrak adalah 25 mg/ml. Larutan stok kemudian dibuat dosis (0,5-100) µg/ml dengan cara mengencerkannya secara serial menggunakan media RPMI. c.Uji antiplasmodium Mikrokultur menggunakan microplate 96 sumuran. Setiap sumuran diisi 100 µl medium komplit yang mengandung parasitemia 2% yang disinkronisasi dengan sorbitol 5% (Contreras et al., 2004) dan hematokrit 3%. Sebanyak 100 µl ekstrak berbagai dosis dimasukkan ke dalam sumuran mulai dosis rendah ke dosis tinggi. Setiap dosis dibuat triplikat. Kontrol negatif adalah media RPMI. Mikroplate diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC selama 60 jam. Setelah masa inkubasi berakhir, tiap sampel dibuat sediaan apus dan diwarnai dengan pewarna Giemsa. Parasitemia dihitung dari sejumlah 1000 eritrosit menggunakan mikroskop. Persentase penghambatan dihitung dengan membandingkan parasitemia senyawa uji dengan kontrol. Aktivitas antiplasmodium dinyatakan dalam IC50 yang diperoleh dengan menganalisis hubungan antara konsentrasi senyawa uji dengan persentase penghambatan dengan analisa probit program SPSS versi 13. HASIL DAN PEMBAHASAN Kembang bulan (T. diversifolia (Hemsley) A. Gray merupakan perdu dengan tinggi ± 5 meter dan tumbuh pada ketinggian 1000-1500 meter di atas permukaan tanah (Sulistijawati dan Gunawan, 1999). Di Kenya Tengah (Njoroge dan Bussmann, 2006) dan Sao Tome e Principe tanaman ini secara tradisional digunakan untuk mengobati malaria (Goffin et al., 2002). Di Sao Tome e
Principe pengobatan dilakukan dengan cara 100 g bahan kering bagian tanaman yang tumbuh di atas tanah direbus dalam 1 liter air. Satu gelas rebusan tanpa penyaringan diminum setiap hari sampai gejala hilang (Goffin et al., 2002). Selain itu tanaman ini juga digunakan untuk mengobati sakit kembung, flu, dan bisul (Grace et al., 2004). Ekstraksi daun T. diversifolia Pembuatan ekstrak metanol dan kloroform penelitian in dilakukan dengan metode maserasi. Maserasi merupakan metode ekstraksi yang paling aman untuk uji karena senyawa yang terkandung di dalamnya tidak rusak selama proses. Pelarut kloroform dipilih untuk menyari senyawa-senyawa bersifat semipolar sampai nonpolar, sedangkan pelarut metanol untuk menyari senyawa-senyawa
bersifat semipolar sampai polar. Untuk melihat gambaran komponen senyawa yang terkandung dalam kedua ekstrak dapat dilihat dari profil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) pada Gambar 1. Menggunakan fase gerak petroleum eter (PE) dan etil asetat (3:1, v/v), gambaran KLT ekstrak metanol dan kloroform tampak berbeda, yang menandakan bahwa ekstraksinya telah sempurna. Dengan fase gerak tersebut ekstrak metanol tidak nampak adanya bercak-bercak senyawa. Hal ini disebabkan karena ekstrak metanol adalah senyawa semipolar sampai polar sehingga dapat divisualisasikan dengan fase gerak (etil asetat) yang bersifat polar. Dengan menggunakan fase gerak ini dapat terlihat gambaran senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol. B
A PE:Etil asetat (3:1, v/v)
Kloroform Metanol
Etil asetat (100%)
Metanol
Gambar 1. Profil KLT Ekstrak Kloroform dan Metanol Kembang bulan (T.diversifolia) Fase diam : Silika gel F254 Fase gerak : PE: Etil asetat (3:1, v/v) Etil asetat (100%)
Uji Aktivitas antiplasmodium Rata-rata persentase parasitemia dan persentase penghambatan dari setiap dosis ekstrak disajikan pada Tabel 1, sedangkan grafik yang meggambarkan hubungan antara konsentrasi ekstrak dengan persentase penghambatan pertumbuhan P. falciparum disajikan pada Gambar 2. Pada Tabel 1 terlihat bahwa semakin tinggi dosis ekstrak semakin besar penghambatan pertumbuhan terhadap P. falciparum. Persentase penghambatan pertumbuhan P. falciparum pada dosis terendah (0,5 µg/ml) untuk ekstrak kloroform dan metanol secara berturut-turut adalah 7,7±6,86 dan 10,54±4,45%, pada dosis sedang (12,5 µg/ml) adalah 58,49±9,48 dan 82,08±3,03%, dan pada dosis tinggi (100 µg/ml) adalah 89,85±3,35 dan 89,49±1,54%. Dengan analisa probit didapatkan masing-masing nilai IC50 untuk ekstrak kloroform dan metanol adalah 10,64 ± 2,55 dan 8,12 ± 0.53 µg/ml (Gambar 3). Bila dilihat nilai IC50 ini, tampak bahwa ekstrak bersifat polar (metanol) mempunyai aktivitas antiplasmodium yang lebih baik daripada estrak non polar (kloroform). Hal ini berbeda sengan penelitian yang dilakukan oleh JenettSiems et al. (1999). Peneliti tersebut mengekstraksi 5 tanaman obat dengan pelarut polar dan non polar untuk diuji aktivitas antiplasmodiumnya dan diperoleh hasil bahwa semua tanaman yang diekstraksi dengan pelarut non polar (petroleum eter/etil asetat, 1:1, v/v) menunjukkan aktivitas antiplasmodium sedangkan yang diekstraksi dengan pelarut bersifat polar (metanol/air, 8:2, v/v) tidak menunjukkan aktivitas antiplasmodium meskipun sebenarnya pelarut
polar lebih dekat dengan pelarut yang sering dipakai oleh masyarakat dalam pengobatan yaitu pelarut air. Jenett-Siems et al. (1999) melaporkan bahwa ekstrak dan fraksi dari tanaman obat dinyatakan tidak mempunyai aktivitas antiplasmodium bila mempunyai IC50 > 50 µg/ml, sedangkan Munoz et al. (2000) menyatakan bahwa bila IC50 suatu ekstrak kurang dari 5 µg/ml, berarti aktivitas antiplasmodiumnya sangat baik, IC50 5-10 µg/ml aktivitasnya baik, dan IC50 > 10 µg/ml adalah tidak aktif. Peneliti lain (Rosoanaivo, 2004 cit. Rain et al., 2007) menggolongkan suatu ekstrak tanaman berefek antiplasmodium sebagai berikut : aktivitas antiplasmodium sangat baik bila nilai IC50 kurang dari 0,1 µg/ml; baik (aktif) bila IC50 0,1-1 µg/ml; cukup sampai baik bila IC50 1,110 µg/ml; lemah bila IC50 11-25 µg/ml; sangat lemah bila IC50 26-50 µg/ml, dan tidak aktif bila IC50 > 100 µg/ml. Dari berbagai pernyataan para peneliti tersebut maka dapat dikategorikan bahwa kedua ekstrak tersebut mempunyai aktivitas antiplasmodium yang baik. Untuk mengetahui adanya perbedaan rata-rata IC50 antara kedua ekstrak dilakukan uji statistik dengan t-test (p = 0,05). Hasil uji t didapatkan bahwa tidak ada perbedaan ratarata IC50 antara ekstrak kloroform dan metanol (p = 0,22). Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antiplasmodium kedua ekstrak tidak berbeda dan kemungkinan senyawa yang mempunyai aktivitas antiplasmodium adalah senyawa yang bersifat semipolar.
Tabel 1. Rata-rata persentase parasitemia dan penghambatan pertumbuhan P. falciparum pada pemberian ekstrak metanol dan kloroform daun kembang bulan (T.diversifolia (Hemsley) A.Gray) Dosis (µg/ml)
Ekstrak kloroform
Ekstrak metanol
Rata-rata % parasitemia ± SD
Rata-rata % penghambatan ± SD
Rata-rata % parasitemia ± SD
Rata-rata% Penghambatan ± SD
14,63
0
13,39
0
0,5
13,50±1,03
7,70±6,86
11,98±1,02
10,54±4,45
2,5
13,34±0,53
8,85±3,59
12,05±0,68
9,98±5,07
5,0
12,47±1,86
14,78±12,69
10,74±1,29
19,77±9,64
12,5
6,07±1,38
58,49±9,48
2,40±0,40
82,08±3,03
25
2,19±1,11
85,00±7,54
1,85±0,45
86,20±3,36
50
1,53±0,05
89,56±0,32
1,94±0,12
85,51±0,89
100
1,48±0,49
89,85±3,35
1,41±0,21
89,49±1,54
Kontrol (-)
Gambar 2. Persentase penghambatan ekstrak metanol dan kloroform daun kembang bulan terhadap P. falciparum strain FCR-3
Sebagai perbandingan, pada penyari polar Obeleague dan Wright (2005) mendapatkan bahwa pemberian ekstrak metanol daun kembang bulan pada P. falciparum strain 3D7 memiliki aktivitas antiplasmodium dengan IC50 sebesar 23,6 µg/ml, sedangkan penelitian yang dilakukan oleh Goffin et al., (2002) mendapatkan bahwa pada strain FCA ekstrak metanol tanaman ini memiliki aktivitas antiplasmodium dengan IC50 sebesar 2,16 µg/ml. Pada penyari nonpolar Goffin et al. (2002) mendapatkan
bahwa ekstrak eter kembang bulan mempunyai IC50 sebesar 0,75 µg/ml pada strain FCA dan 0,83 µg/ml pada strain FCB1. Dari penelitian yang sudah dilakukan, nampak bahwa ada perbedaan nilai IC50 penelitian ini dengan peneliti lain. Ini terjadi kemungkinan antara lain karena perbedaan strain P. falciparum yang dipakai; bagian tanaman yang diambil sebagai contoh Goffin et al. (2002) mengambil bagian tanaman yang tumbuh di atas tanah sebagai sampel uji, sedangkan penelitian ini dan Obeleague dan
Wright (2005) mengambil daun saja; tempat pengambilan sampel dan metode pembuatan ekstrak. Goffin et al. (2002) juga mendapatkan bahwa senyawa aktif yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antiplasmodium dalam ekstrak eter tanaman ini adalah seskueterpen lakton tagitinin C, tetapi Goffin juga menyebutkan bahwa komponen-komponen
minor lainnya kemungkinan memiliki aktivitas antiplasmodium. Untuk mengetahui lebih jelas jenis senyawa yang paling berefek sebagai antiplasmodium diperlukan penelitian lebih lanjut sehingga dapat lebih meningkatkan efektivitas ekstrak daun kembang bulan sebagai antiplasmodium.
10.64 +/- 2.55
12 10
8.12 +/- 0.53
8 IC50 (ug/ml) 6 4 2 0 Metanol
Kloroform Nama ekstrak
Gambar 3. Nilai IC50 ekstrak daun Kembang bulan (T. diversifolia (Hemsley) A.Gray) pada P. falciparum strain FCR-3
KESIMPULAN Ekstrak metanol dan kloroform daun kembang bulan (T. diversifolia (Hemsley) A.Gray) memiliki aktivitas antiplasmodium yang baik terhadap P. falciparum strain FCR-3 dengan IC50 sebesar 8,12 ± 0,53 µg/ml dan 10,64 ± 2,55 µg/ml. UCAPAN TERIMA KASIH Peneliti mengucapkan terimakasih kepada Badan Litbangkes Depkes RI yang telah memberikan dana penelitian melalui Dana Risbin Iptekdok 2006 sehingga penelitian ini dapat dilaksanakan. DAFTAR PUSTAKA Contreras, C.E., Rivas, M.A., Dominguez, J., Charris, J., Palacios, M., Bianco, N.E., and Blanca, I. 2004. Stage-specifics Activity of Potential Antimalarial Compounds Measured in vitro by Flow Cytometry in Comparison to Optical
Microscopy and Hypoxanthine Uptake. Mem Inst Cruz. 99(2):179-84. Goffin, E., Ziemons, E.,de Mol, P., de Madureira Mdo, C., Martins, A.P., da Cunha, A.P., Phillippe, G., Tits, M., Angenot, L., and Frederich, M. 2002. In Vitro Antiplasmodial Activity of Tithonia diversifolia and Identification of Its Main Active Constituent : Taginin C. Planta Med. 68(6):543-5. Grace, N.N., Rainer, B.W., Barbara, G, Erie, N.L., and Victoris, N. 2004. Utilization of Weed Species as Sources of Traditional Medicines in Central Kenya. Lyonia., 7(2) : 71-87. Gunawan, S. 2000. Epidemiologi Malaria (in) P.N. Harijanto. (ed): Malaria, Epidemiologi, Patogenesis, Manifestasi Klinis dan Penanganan. EGC. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.1-13.
Jenett-Siems, K., Mockenhaupt, F.P., Bienzle, U., Gupta, M.P., and Eich, E. 1999. In Vitro Antiplasmodial Activity of Central American Medicinal Plants. Trop. Med. Intl. Health., 4(9): 611-615. Muñoz, Sauvain, Bou rdy, Callapa, Bergeron. Rojas, Bravo, Balderrama, Ortiz, Gimenez, and Deharo. 2000. A search for natural bioactive compounds in Bolivia through a multidisciplinary approach. Part I. Evaluation of the antimalarial activity of plants used by the Chacobo Indians. J. Etnopharmacol. 69(2):12-37 Njoroge, G.N. and Bussmann, R.W. 2006. Diversity and Utilization of Antimalarial Ethnophytotherapeutic Remedies among the Kikuyus (Central Kenya). J. Ethnobiol. Ethnomed., 2:8 Obeleague, C.S. and Wright, C.W. 2005. Antiplasmodial Activity of Some Nigerian Plants Used in the Treatment of Malaria. JPP.57 (Suplement):70-71. Rain, N., A., Khozirah, S., Mohd Ridzuan, M.A.R., Ong, B.K., Rohaya, C., Rosilawati, M., Hamdino, I., Amin, B., and Zakiah, I. 2007. Antiplasmodial properties of some Malaysian medicinal plants. Tropical Biomedicine 24(1): 29–35 Sulistijowati, A. & Gunawan, D. 1999. Efek Ekstrak Daun Kembang bulan (Tithonia diversifolia A. Gray) terhadap Candida Albicans serta Profil Kromatografinya. Media Litbangkes Edisi Khusus ”Obat Asli Indonesia” Volume VIII no 3 dan 4. WHO. 2007a. Malaria Situation in SEAR Countries : Indonesia in Malaria. WHO. Regional Office for South-East Asia. Last updated: 27 Februari 2007. WHO. 2007b. Malaria Epidemics / Outbreaks in SEA Region in Malaria. WHO. Regional Office for South-East Asia. Last updated: 9 Januari 2007.
