AKT TIVITAS S ANTIOK KSIDASII EKSTRA AK DAU UN SIRIH MERA AH (Piperr crocatum m)
MUHA AMMAD ALFARA ABI
PROGR RAM STUD DI BIOKIM MIA FAKU ULTAS MA ATEMATIIKA DAN ILMU I PEN NGETAHU UAN ALAM M INSTITU UT PERTA ANIAN BOG GOR BOGO OR 2008 8
ABSTRAK MUHAMMAD ALFARABI. Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum). Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan POPI ASRI KURNIATIN. Salah satu penyebab diabetes mellitus adanya senyawa radikal bebas yang menyerang lipid membran sel pankreas. Oleh karena itu, daun sirih merah yang telah diketahui sebagai antidiabetes perlu diketahui aktivitas antioksidasinya. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antioksidasi daun sirih merah dan dibandingkan dengan vitamin E 200 ppm. Metode yang digunakan adalah metode TBA dengan cara mengukur konsentrasi malondialdehida (MDA) sebagai salah satu produk autooksidasi asam linoleat. MDA bereaksi dengan asam tiobarbiturat membentuk warna merah muda dan diukur absorbannya pada panjang gelombang 532 nm. Hasil penelitian ini menunjukkan bobot jenis dari ekstrak daun sirih merah adalah 1.021 g/mL. Waktu inkubasi optimum asam linoleat diperoleh saat hari ke-9. Ekstrak daun sirih merah dengan konsentrasi 2, 10, dan 20 mg rebusan/10 mL larutan memiliki aktivitas antioksidasi yang tidak berbeda nyata (α = 0.05) dengan vitamin E 200 ppm, sedangkan konsentrasi 100 dan 200 mg rebusan/10 mL larutan berbeda nyata. Simpulan penelitian ini bahwa ekstrak daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidasi dan semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun sirih merah (200 mg rebusan/10 mL larutan), aktivitas antioksidasinya lebih tinggi dibandingkan vitamin E 200 ppm.
ABSTRACT MUHAMMAD ALFARABI. Antioxidant activity The Leaf Extract of Sirih Merah (Piper crocatum). Under the direction of MEGA SAFITHRI and POPI ASRI KURNIATIN. Diabetes mellitus can be caused by the existency of free radical which attacks membrane lipid of pancreatic cells. Previous research showed that the leaf extract of sirih merah have an activity as antidiabetic. Therefore, its activity as antioxidant have been known. The main target of this research is to find out the antioxidant activity of leaf extract of sirih merah and to compare it with vitamin E 200 ppm. This research used TBA method which measured the malondialdehyde (MDA) concentration as one product of linoleic acid autooxidation. Reaction of MDA with thiobarbituric acid made a complex colour and was measured at 532 nm wavelength. The result of this research showed that density of the leaf extract of sirih merah was 1.021 g/mL. Optimum incubated time of linoleic acid was 9 days. The leaf extract concentrations of sirih merah at 2, 10, 20 mg boiled water/10 mL solution were not significantly (α = 0.05) different with vitamin E, while the leaf extract concentration of sirih merah at 100 and 200 mg boiled water/10 mL solution were significantly (α = 0.05) different with vitamin E. Conclusion of the research shows that the leaf extract of sirih merah has antioxidant activity.
AKTIVITAS ANTIOKSIDASI EKSTRAK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum)
MUHAMMAD ALFARABI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
Judul Nama NIM
: Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) : Muhammad Alfarabi : G44104006
Disetujui
Mega Safithri, S.Si, M.Si Ketua
Popi Asri Kurniatin, S.Si, Apt. Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur kehadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah berjudul Potensi Antioksidan Ekstrak Daun Sirih Merah disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan mulai bulan Maret 2008 hingga Mei 2008 di Laboratorium Biokimia Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Mega Safithri, S.Si, M.Si dan Popi Asri Kurniatin, S.Si, Apt yang telah memberikan bimbingan dan saran selama berlangsungnya penelitian dan dalam penyusunan karya ilmiah. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada seluruh staf Laboratorium Biokimia terutama Pak Arya, Ibu Iis, Ibu Merry, Pak Nana, Pak Yadi, dan Eka atas bantuan teknisnya. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada ayah, ibu, dan adik atas doa dan kasih sayangnya serta kepada Arulo, Laela, Mitha, Udin, Tyas, Intan, Rangga, Kurtadji, Fitri, Aji, Hikmah Camp, Waras, Karim, dan Mas Joeyzt atas kerja samanya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2008
Muhammad Alfarabi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Juni 1986 dari ayah MZ Iqbal Moenaf dan ibu Dewi R. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Tahun 2004 penulis menyelesaikan sekolah menengah umum dari SMU Negeri 47 Jakarta. Pada tahun yang sama, penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan terdaftar sebagai mahasiswa pada program studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis melakukan praktik lapangan di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Plasma Nutfah, Pemuliaan dan Perbenihan, Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro) dari bulan Juli sampai Agustus 2007. Judul praktik lapangan penulis adalah Pertumbuhan Tanaman Nilam (Pogostemon cablin) Dengan Variasi Pengenceran Media Dasar Kultur Jaringan.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix PENDAHULUAN .................................................................................................. 1 TINJAUAN PUSTAKA Sirih Merah ......................................................................................................... 1 Radikal Bebas ..................................................................................................... 2 Antioksidan ........................................................................................................ 3 Analisis Aktivitas Antioksidan ........................................................................... 3 BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan ................................................................................................... 4 Metode Penelitian ............................................................................................... 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi daun sirih merah ................................................................................. 6 Penentuan waktu inkubasi asam linoleat ............................................................ 6 Aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah ................................................. 7 SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................... 8 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 9 LAMPIRAN .......................................................................................................... 11
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Tanaman sirih merah (Piper crocatum) ............................................................... 2 2 Beberapa senyawa antioksidan eksogenous ......................................................... 3 3 Reaksi malondialdehida dengan asam tiobarbiturat dan struktur TMP ............... 4 4 Lipid peroksidasi .................................................................................................. 6 5 Kurva kadar MDA terhadap waktu ...................................................................... 7 6 Kadar MDA ekstrak daun sirih merah ................................................................. 8
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahapan umum penelitian .................................................................................. 12 2 Ekstraksi daun sirih merah ................................................................................. 12 3 Bobot jenis larutan ekstrak sirih merah.............................................................. 12 4 Pembuatan kurva standar TMP .......................................................................... 13 5 Penentuan waktu inkubasi optimum asam linoleat ............................................ 13 6 Analisis aktivitas antioksidasi ............................................................................ 14 7 Perhitungan bobot jenis ...................................................................................... 14 8 Perhitungan pembuatan konsentrasi ................................................................... 14 9 Hasil absorban larutan standar dan kurva standar .............................................. 15 10 Hasil absorban waktu inkubasi optimum asam linoleat ................................... 15 11 Konsentrasi MDA dan daya hambat ekstrak daun sirih merah ........................ 16 12 Analisis statistik waktu inkubasi optimum dan aktivitas antioksidasi ............. 17 13 Hasil-hasil inkubasi optimum asam linoleat, aktivitas antioksidan, dan kurva standar .................................................................................................... 18
1
PENDAHULUAN Radikal bebas merupakan senyawa yang reaktif karena mempunyai elektron yang tidak berpasangan. Senyawa ini dapat berasal dari hasil metabolisme, polutan pabrik, asap, makanan, dan sinar UV. Bila jumlah senyawa ini banyak terdapat di dalam tubuh, maka akan dapat mengoksidasi senyawa lemak, merusak protein, dan DNA (Murray 2003). Kondisi tersebut dapat menyebabkan berbagai macam penyakit seperti kanker, jantung koroner, stroke, dan diabetes mellitus. Oleh karena itu diperlukan senyawa yang dapat menstabilkan radikal bebas, yaitu antioksidan. Antioksidan adalah senyawa yang dapat melengkapi kekurangan elektron pada senyawa radikal bebas sehingga senyawa tersebut stabil. Sumber antioksidan ini dapat berasal dari dalam tubuh (endogen) atau luar tubuh (eksogen). Senyawa antioksidan eksogen dapat berupa senyawa bioaktif yang banyak terdapat di tumbuhan. Senyawasenyawa tersebut dapat berupa golongan flavonoid, alkaloid, tanin, dan glikosida. Oleh karena itu, tumbuhan dapat dijadikan sebagai sumber antioksidan alami. Penggunaan tumbuhan sebagai senyawa antioksidan secara tradisional sudah banyak dilakukan oleh masyarakat karena lebih praktis, murah, dan relatif aman. Salah satu tumbuhan Indonesia yang dapat memiliki potensi untuk menangkal radikal-radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh adalah sirih merah. Sirih merah (Piper crocatum) merupakan jenis sirih yang merambat dan banyak tumbuh di daerah tropis khususnya Indonesia. Sirih jenis ini sebelumnya terkenal sebagai tanaman hias, kemudian berubah menjadi tanaman obat sejak diperkenalkan oleh produsen obat di Bulnyaherjo (Duryatmo 2005). Kegunaannya di masyarakat selain antiseptik, daun sirih merah dapat digunakan untuk mengobati diabetes mellitus, maag, tekanan darah tinggi, asam urat, batu ginjal, dan ambeien dengan cara memakan daunnya (Sudewo 2005). Secara ilmiah, daun sirih merah memiliki potensi antihiperglikemia (Safithri dan Fahma 2005). Keadaan hiperglikemia ini dapat terkait dengan adanya gangguan kerja enzim di dalam tubuh yang berfungsi sebagai antioksidan oleh senyawa radikal bebas sehingga jumlah radikal bebas di dalam tubuh meningkat yang mengakibatkan terjadinya oksidasi lipid di membran sel pankreas (Suryawanshi 2006). Keadaan tersebut menyebabkan pankreas tidak optimal mensekresikan insulin. Menurut Safithri dan
Fahma (2005), daun sirih merah mengandung senyawa bioaktif flavonoid, alkaloid, dan tanin dalam ekstrak air. Oleh sebab itu, daun sirih merah dapat berpotensi membentuk efek antioksidasi karena senyawa-senyawa flavonoid, tanin, alkaloid, dan glikosida dapat memberikan efek antioksidasi (Aqil 2006). Berdasarkan data ilmiah tersebut, daun sirih merah perlu diteliti aktivitas antioksidasinya karena penelitian mengenai aktivitas antioksidasi daun sirih merah secara in vitro di Indonesia masih belum dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah secara in vitro menggunakan metode TBA dan membandingkan dengan vitamin E. Hipotesis penelitian ini adalah ekstrak daun sirih merah berpotensi sebagai antioksidan melalui penghambatan oksidasi asam linoleat secara in vitro dan aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah lebih besar dibandingkan dengan vitamin E. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai potensi antioksidasi daun sirih merah secara in vitro dan dapat dijadikan dasar pengembangan produk fitofarmaka sirih merah sebagai antioksidan.
TINJAUAN PUSTAKA Sirih Merah (Piper crocatum) Tumbuhan sirih dikenal sebagai antiseptik sejak 600 SM. Sirih termasuk famili Piperaceae yang merambat dan bersandar di batang pohon lain (Duryatmo 2005). Salah satu jenis sirih adalah sirih merah. Klasifikasi ilmiah dari sirih merah ini adalah divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Monochlamydeae, bangsa Piperales, suku Piperaceae, genus Piper, spesies Piper crocatum. Sirih merah tumbuh menjalar seperti sirih hijau, batangnya bersulur dan beruas dengan jarak buku 5-10 cm dengan setiap buku tumbuh bakal akar. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, mengkilap atau tidak berbulu, dan mempunyai warna yang khas yaitu permukaan atas hijau gelap berpadu dengan tulang daun berwarna merah hati keunguan, daun berasa pahit, berlendir, serta mempunyai bau tidak khas seperti sirih. Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu banyak kena sinar matahari. Jika terlalu sering kena sinar matahari maka warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram, kurang menarik dan batangnya cepat mengering karena sirih
2
merah akan tumbuh baik jika mendapatkan 60-75% cahaya matahari sehingga tempat tumbuh yang paling cocok untuk sirih merah adalah lingkungan berhawa dingin (Gambar 1). Sirih merah (Piper crocatum) merupakan salah satu jenis sirih yang banyak dimanfaatkan sebagai tanaman hias pada tahun 1900-an namun sekarang mengalami perubahan fungsi menjadi tanaman obat sejak dikenalkan oleh Bambang Sudewo, seorang produsen tanaman obat di Bulnyahrejo (Duryatmo 2005). Daun sirih merah ini dapat digunakan untuk mengobati diabetes mellitus, maag, tekanan darah tinggi, asam urat, batu ginjal, dan ambeien. Selain itu sirih merah dapat digunakan secara bersama dengan tanaman obat lainnya untuk mengobati penyakit (Sudewo 2005). Secara ilmiah, air rebusan daun sirih merah dengan dosis pemberian 20 g/kg bobot badan dapat sebagai antihiperglikemia (Safithri dan Fahma 2005), tidak memiliki efek toksik (Salim 2006), dapat memperbaiki pankreas terhadap tikus hiperglikemia (Permata 2006), dan memiliki potensi sebagai hepatoprotektor (Windyagiri 2006).
Contoh akibat adanya radikal bebas dari luar tubuh adalah lemak yang memproduksi asam butanoat, berbau tengik setelah bereaksi dengan udara. Selain itu, sinar UV B merangsang melanosit memproduksi melanin berlebihan dalam kulit, yang tidak hanya membuat kulit lebih gelap, melainkan juga berbintik hitam. Sinar UV A merusak kulit dengan menembus lapisan basal yang menimbulkan kerutan (Gitawati 1995). Beberapa kerusakan di dalam tubuh yang dapat timbul akibat serangan radikal bebas dari luar tubuh antara lain kerusakan protein, DNA, peroksidasi lipid, kerusakan membran sel terutama penyusun membran sel berupa asam lemak. Kerusakan tersebut akan menyebabkan penyakit yang umumnya bersifat kronis, yaitu dibutuhkan waktu bertahun-tahun untuk penyakit tersebut menjadi nyata (terjadi akumulasi dalam tubuh). Radikal bebas yang biasa terdapat di dalam tubuh dan dapat merusak berasal dari turunan oksigen reaktif. Contoh oksigen reaktif ini mencakup superoksida (O2`), hidroksil (`OH), peroksil (ROO`), hidrogen peroksida (H2O2), singlet oksigen (O`), oksida nitrit (NO`), peroksinitrit (ONOO`) dan asam hipoklorit (HOCl) (Murray 2003). Sumber radikal bebas, baik dari dalam maupun luar tubuh terjadi melalui tahap-tahap mekanisme reaksi dan menimbulkan reaksi berantai sehingga radikal bebas yang terbentuk semakin banyak. Tahap pertama adalah pembentukan awal radikal bebas (inisiasi), lalu perambatan atau terbentuknya radikal baru (propagasi), dan tahap terakhir (terminasi), yaitu pemusnahan atau pengubahan menjadi radikal bebas stabil dan tak reaktif (Hart 1983). Mekanisme reaksinya dapat dituliskan sebagai berikut :
Gambar 1 Tanaman sirih merah Inisiasi Radikal Bebas Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron sehingga molekul tersebut tidak stabil dan sangat reaktif berusaha mengambil elektron dari molekul atau sel lain. Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh seperti hasil oksidasi enzimatik, fagositosis dalam respirasi, transpor elektron di mitokondria, oksidasi ion-ion logam transisi, atau melalui ischemik. Selain itu, radikal bebas dapat berasal dari luar tubuh seperti asap rokok, asap kendaraan bermotor, hasil penyinaran sinar ultra violet, bahan kimia dalam makanan, dan polutan lainnya.
RH + OH
R+ + H2O
Propagasi R+ + O2 ROO- + RH
ROOROOH + R+
Terminasi ROO- + ROOROO- + R+ R+ + R+
ROOR + O2 ROOR RR
3
Antioksidan Antioksidan adalah senyawa yang dapat menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas terhadap sel normal, protein, dan lemak dengan cara melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas sehingga senyawa radikal bebas tersebut stabil dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukkan radikal bebas. Berdasarkan sumbernya, antioksidan terbagi menjadi antioksidan dari dalam tubuh (endogen) dan dari luar tubuh (eksogen). Antioksidan endogen contohnya seperti superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase (GSH.Prx). Enzimenzim ini bekerja menetralkan senyawasenyawa radikal bebas hasil metabolisme tubuh atau radikal bebas dari luar tubuh. Antioksidan eksogen contohnya berupa vitamin dan senyawa bioaktif dari tumbuhan, seperti α-tokoferol (vitamin E), beta karoten (vitamin A), dan asam askorbat (vitamin C) (Murray 2003). Senyawa antioksidan eksogenous yang umum digunakan adalah vitamin E yang digunakan sebagai kontrol positif dalam penelitian ini. Vitamin ini diketahui berfungsi sebagai antioksidan terutama untuk asam lemak tak jenuh pada fosfolipid di membran sel (Linder 2006). Selain itu, vitamin E dapat melindungi kulit dari kerusakan dari sinar ultraviolet dengan mengurangi lipid peroksida dan degradasi DNA (Nakayama et al. 2003). Beberapa mekanisme kerja dari senyawa antioksidan eksogenus saling membantu dengan senyawa antioksidan endogenus, seperti vitamin E akan menangkap radikal bebas tetapi vitamin E itu lalu berubah menjadi vitamin E radikal sehingga perlu pertolongan vitamin C. Setelah menangkap vitamin E radikal, vitamin C menjadi radikal juga. Akhirnya, barulah glutation yang mampu menetralkan vitamin C radikal menjadi senyawa netral tanpa menjadikan glutation turut radikal. Telah dilaporkan juga bahwa pemberian vitamin E yang dikombinasikan dengan selenium di kuda meningkatkan ketahanan sel darah merah dari stress peroksidasi dan meningkatkan aktifitas glutation peroksidase di limposit (Avellini et al. 1999). Selain itu senyawa turunan dari vitamin E juga dapat menurunkan radikal bebas yang terjadi akibat sinar UV (Jurkiewicz et al. 1995). Selain vitamin, senyawa antioksidan eksogenous dapat berasal dari esktrak tumbuhan berupa senyawa-senyawa bioaktif yang umumnya
merupakan hasil metabolit sekunder (Gambar 2). Senyawa bioaktif tumbuhan yang memiliki efek antioksidasi dapat terdiri dari alkaloid, flavonoid, glikosida, dan tanin yang kemudian membentuk efek antioksidasi terhadap radikal bebas (Aqil et al. 2006). Senyawa-senyawa aktif tersebut banyak terdapat di bagian tumbuhan seperti akar, daun dan buah. Berdasarkan hasil penelitian Zin tahun 2002 yang menggunakan akar, daun, dan buah mengkudu yang mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, dan turunannya menghasilkan efek antioksidasi yang sama baiknya antara akar, daun, dan buah mengkudu di dalam pelarut etil asetat. Selain itu, makanan yang mengandung flavonoid dapat menjadi antioksidan untuk mencegah penyakit kanker dan jantung, seperti teh hijau dan anggur merah (Hans dan Heldt 2005). Menurut Duarte (2001), flavonoid dapat menurunkan tekanan darah dan menurunkan status oksidasi.
α-tokoferol
Isoflavon: Daidzein (R = H) Genistein (R = OH) Gambar 2 Beberapa senyawa antioksidan eksogenous Analisis Aktivitas Antioksidasi Radikal bebas dengan reaksi berantai lebih mudah menyerang asam lemak suatu membran sel terutama asam lemak tak jenuh, seperti asam linoleat, asam linolenat, dan asam arakidonat. Kerentanan asam lemak tak jenuh diserang radikal bebas karena mempunyai ikatan ganda yang mudah putus dibandingkan asam lemak jenuh dengan ikatan tunggalnya yang lebih stabil (Adawiyah et al 2001). Reaksi peroksidasi lipid menghasilkan suatu senyawa produk akhir malondialdehida (MDA). Senyawa MDA ini dapat dijadikan komponen yang diukur untuk
4
menentukan aktivitas antioksidasi. Analisis aktivitas antioksidasi dapat diukur melalui beberapa cara, yaitu metode asam tiobarbiturat (TBA), metode DPPH, uji kreis, uji masa simpan, dan rancimat (Adawiyah et al 2001). Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode asam tiobarbiturat (TBA) karena metode ini menggunakan proses autooksidasi asam lemak dengan asam lemak yang terdapat di tubuh manusia, yaitu asam lemak linoleat. Pengukuran MDA telah digunakan sebagai indikator kerusakan oksidatif asam lemak tak jenuh di sel hidup yang dapat menyebabkan perubahan struktural dan fungsi. Prinsip metode ini adalah pengukuran serapan dengan spektrofotometer dari reaksi produk oksidasi asam lemak, yaitu MDA dengan asam 2-tiobarbiturat yang berwarna merah muda pada λ 532 nm (Ottolenghi 1959 dalam Kikuzaki dan Nakatani 1993). Metode TBA ini menggunakan larutan standar 1,1,3,3tetrametoksipropana (TMP). Larutan ini lebih stabil dan memiliki kesamaan struktur serta dapat bereaksi dengan baik dengan TBA seperti MDA. Oleh karena itu, larutan TMP dapat sebagai standar MDA (Gambar 3).
TBA
MDA
Produk
Air
(a)
pembuatan kurva standar menggunakan adalah buffer fosfat 0.1 M pH 7, asam linoleat (Sigma L 1376 – 5G) 50 mM, etanol absolut, α-tokoferol (Sigma T 3634 10G), TCA (asam trikloroasetat) 20%, TBA (asam tiobarbiturat) 1%, asam asetat 50%, dan 1,1,3,3tetrametoksipropana (Sigma 066113ME-237 100 mL). Alat-alat yang digunakan untuk membuat rebusan daun sirih merah adalah pemanas, gelas piala, dan urinometer. Alat-alat untuk penentuan waktu inkubasi asam linoleat, analisis potensi antioksidasi, dan pembuatan kurva standar adalah pipet tetes, autopipet, tabung reaksi, penangas air, gelas ukur, batang pengaduk, labu Erlenmeyer, kain kasa, sudip, corong, pemanas, termometer, neraca analitik Ohaus GA 200, gelas piala, botol gelap berulir, vorteks, kuvet, spektrofotometer Genesys 10 UV (190-1100 nm), sentrifus Hettich Universal (0-6000 rpm), dan tabung sentrifus. Metode Penelitian Pembuatan Rebusan Daun Sirih Merah (Safithri dan Fahma 2005) Daun sirih merah segar ditimbang sebanyak 10 gram kemudian ditambahkan akuades sebanyak 50 mL. Daun tersebut direbus di dalam gelas piala dengan air mendidih 100 °C sampai volumenya menjadi 5 mL. Penentuan Bobot Jenis Air rebusan daun sirih merah dimasukkan ke dalam densitometer kemudian dibaca meniskus cairan. Suhu cairan diukur lalu dihitung dengan faktor koreksi untuk mendapatkan nilai bobot jenisnya. Rumus penentuan bobot jenis sebagai berikut: Bj terkoreksi = Bj terbaca ± faktor terkoreksi
(b) Gambar 3 (a) Reaksi malondialdehida dengan asam 2-tiobarbiturat, (b) struktur TMP
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat rebusan daun sirih merah adalah daun sirih merah dan akuades. Bahan-bahan untuk penentuan waktu inkubasi asam linoleat, analisis potensi antioksidasi, dan
Faktor koreksi = T1 – T2 x 10-3 (T1>T2) 3 Keterangan: - Bj terbaca ditambah faktor terkoreksi (Tcairan>Talat) - Bj terbaca dikurang faktor terkoreksi (Tcairan
5
ion dicampurkan. Sebanyak 1 mL campuran ditempatkan di botol gelap kemudian campuran diinkubasi pada suhu 40 °C. Pengukuran intensitas serapannya dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL campuran asam linoleat yang telah diinkubasi ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Kemudian panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Pengukuran dilakukan setiap hari hingga tercapai serapan maksimum. Larutan blanko digunakan 1 mL campuran 3 mL etanol 99.8 % dan 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7.0, kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1 % dalam asetat 50 %. Larutan blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit.
Larutan blanko digunakan 1 mL campuran 3 mL etanol 99.8 % dan 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7.0, kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1 % dalam asetat 50 %. Larutan blamko tersebut diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan 1,1,3,3tetrametoksipropana (TMP) dengan konsentrasi 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 µM. Tiap larutan dipipet 1 mL dan ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Kemudian serapannya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Larutan blanko menggunakan 1 mL akuades yang diberi perlakuan seperti larutan konsentrasi TMP lainnya (konsentrasi 0 TMP).
Analisis Aktivitas Antioksidasi dengan Metode TBA (Ottolenghi 1959 dalam Kikuzaki dan Nakatani 1993)
Analisis Data
Air rebusan daun sirih merah sebagai larutan sampel dibuat dalam konsentrasi 2, 10, 20, 100, dan 200 mg rebusan/10 mL larutan. Masing-masing sampel diambil sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%. Larutan kontrol positif digunakan 1 mL α-tokoferol, 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%, sedangkan larutan kontrol negatif ditambahkan 1 mL air bebas ion, 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%. Semua larutan ini kemudian dimasukkan dalam botol gelap dan diinkubasi di penangas 40°C selama waktu inkubasi optimum dari metode TBA. Pada hari waktu inkubasi optimum, dilakukan pengukuran MDA melalui metode TBA dengan mengambil 1 mL dari setiap larutan, kemudian ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Kemudian panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm.
Pengukuran potensi antioksidasi sampel dilakukan dengan rancangan percobaan acak lengkap (RAL). Kelompok pertama adalah ekstrak daun sirih merah dengan konsentrasi 2, 10, 20, 100, dan 200 mg rebusan/10 mL larutan dan setiap konsentrasi dilakukan dua kali ulangan. Kelompok kedua adalah vitamin E (kontrol positif) dengan konsentrasi 200 ppm dan dilakukan dua kali ulangan. Kelompok ketiga adalah akuades (kontrol negatif) dengan dua kali ulangan. Pengukuran dilakukan pada hari waktu inkubasi optimum. Data kompleks MDA-TBA dianalisis secara statistik dengan menggunakan metode rancangan acak lengkap (RAL). Model rancangan tersebut adalah: Yij = μ + λ + εij keterangan: μ = Pengaruh rataan umum λi = Pengaruh perlakuan ke-I, i = 1,2,3,..,6 εij= Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j = 1,2,3 i = 1 kontrol negatif tanpa antioksidan i = 2 ekstrak 2 mg rebusan/10 mL larutan i = 3 ekstrak 10 mg rebusan/10 mL larutan i = 4 ekstrak 20 mg rebusan/10 mL larutan i = 5 ekstrak 100 mg rebusan/10 mL larutan i = 6 ekstrak 200 mg rebusan/10 mL larutan i = 7 pembanding atau kontrol positif α-tokoferol 200 ppm
6
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Daun Sirih Merah Ekstraksi merupakan salah satu cara pemisahan suatu komponen dari suatu campuran sehingga menjadi komponenkomponen yang terpisah (Harborne 1987). Komponen yang polar akan larut dalam pelarut polar, sedangkan komponen non polar akan larut dalam pelarut non polar. Senyawa– senyawa bioaktif dari daun sirih merah dalam ekstrak air adalah flavonoid, alkaloid, dan tanin (Safithri dan Fahma 2005). Senyawasenyawa tersebut yang diperkirakan berperan sebagai antioksidan dari sirih merah. Flavonoid dan tanin merupakan senyawa fenolik. Golongan flavonoid merupakan senyawa fenolik terbesar dalam tumbuhan. Flavonoid memiliki aktivitas biologis seperti antibakteri, antioksidan, antifungal (Hans dan Heldt 2005). Ekstrak daun sirih merah ini perlu ditentukan bobot jenisnya terlebih dahulu. Penentuan bobot jenis bertujuan untuk memudahkan menentukan konsentrasi perlakuan. Bobot jenis air rebusan sirih merah dalam percobaan ini adalah 1.021 g/mL. Pelarut untuk ekstraksi daun sirih merah adalah air. Pemilihan air sebagai pelarut bertujuan untuk mempermudah aplikasi dalam masyarakat. Selain itu, berdasarkan informasi ilmiah bahwa air rebusan sirih merah dapat sebagai antihiperglikemia (Safithri dan Fahma 2005), memperbaiki pankreas terhadap tikus hiperglikemia (Permata 2006), memiliki aktivitas sebagai hepatoprotektor (Windyagiri 2006), dan tidak ada efek toksik pada dosis 20 g/kg BB (Salim 2006). Selain air, pelarut lain seperti etanol dapat digunakan untuk mengekstrak senyawa bioaktif dari daun sirih merah.
Penentuan Waktu Inkubasi Asam Linoleat Malondialdehida merupakan salah satu produk hasil oksidasi asam linoleat. Tahap awal dari reaksi radikal, asam linoleat akan kehilangan pasangan elektron pada ikatan ganda. Reaksi ini terjadi secara bertahap sehingga terjadi penataan ulang struktur asam linoleat sebagai diena terkonjugasi. Tahap selanjutnya adalah asam linoleat sudah banyak terbentuk menjadi radikal dengan reaksi lanjut senyawa radikal asam linoleat terdekomposisi menjadi senyawa yang lebih sederhana dan relatif stabil, yaitu malondialdehida (MDA) (Gambar 4). Kadar MDA adalah komponen yang diukur dalam penelitian ini. Kadar MDA dapat ditentukan dengan metode TBA (Ottolenghi 1959 dalam Kikuzaki dan Nakatani 1993). Reaksi antara MDA dan TBA menghasilkan senyawa kompleks MDA-TBA berwarna merah. Absorbansi dari senyawa tersebut diukur tiap 24 jam pada panjang gelombang 532 nm untuk melihat pembentukkan MDA maksimum. Faktor-faktor yang mempengaruhi proses oksidasi asam linoleat adalah panas, cahaya, oksigen, dan ion logam (Schultz 1962). Percobaan ini mengkondisikan campuran asam linoleat, larutan buffer fosfat, dan akuades diinkubasi dalam botol gelap dengan suhu 40 °C. Oleh karena itu, faktor panas dan oksigen saja yang mempengaruhi oksidasi asam linoleat. Hasil percobaan menunjukkan kadar MDA dari hari ke-0 hingga hari selanjutnya mengalami peningkatan. Pembentukkan MDA sebagai produk hasil oksidasi asam linoleat terjadi maksimum di hari ke-9. Proses ini dapat ditentukan karena ada lonjakan tinggi kadar MDA dari hari sebelumnya dan hari berikutnya tidak terjadi lonjakkan yang tinggi.
Gambar 4 Lipid peroksidasi (Murray 2003)
7
Oleh karenaa itu dapat diassumsikan di hari h ke-9 semua asam m linoleat yaang diinkubasi telah terdekomposisi menjadi MDA M sehinggga untuk analisis poteensi antioksiddan dilakukann di hari ke-9 (Gambar 5). Waktu inkubasi i optiimum asam linoleat dalam percoobaan lebih lam ma bila dibanddingkan dengan meenggunakan metode yanng lain seperti metoode FTC (Ferii Tiosianat) daan diena terkonjugasii. Prinsip dasar d metodee FTC adalah m mengukur kadar s senyawa hidroperoksida yang terbentuk hingga mencapai kaadar maksimuum (Chen et al a 1996), sedangkan metode diena d terkoonjugasi mengukur absorban dari d ikatan diena terkonjugasii yang terbenntuk di asam linoleat yang menggalami penataaan ulang dii ikatan rangkapnya.. Secara umum, u kadar maksimum senyawa s hidroperoksida (metode FTC) dan ikatan diena terkoonjugasi terjjadi di harri ke-6 (Martsolich 2007). Dua hari h berikutnyya dapat diasumsikann bahwa asam linoleatt telah terdekomposisi menjaddi MDA sehingga analisis akktivitas anttioksidasinya dapat dilakukan di d hari ke-8 atau a dua hari setelah kadar hidroperoksida dann diena terkoonjugasi maksimum menggunakann metode TBA A. Oleh karena itu, perbedaan p komponen yangg diukur menyebabkaan perbedaan lama waktu innkubasi. Selain itu, dengan menngukur MDA A secara langsung, dapat diketahuui secara tepaat waktu terbentuknya MDA makksimum dan kualitas asam linoleaat yang digunaakan.
K kadar MDA M terhadapp waktu Gambar 5 Kurva Aktivitas Antioksidasi A E Ekstrak Daun n Sirih Meraah Salah saatu produk daari autooksidaasi asam linoleat addalah senyaw wa malondiaaldehida
(MDA) yangg merupakan senyawa aldehida berkarbon tigga. Keberadaan MDA ini dapat dicegah apabbila reaksi okssidasi asam liinoleat dihambat. Senyawa aantioksidan dapat menghambat proses ooksidasi beerlanjut tersebut denngan melenggkapi elektro on ke senyawa asam linoleat radikal. Adanya A senyawa antiioksidan dari ekstrak daun n sirih merah (flavoonoid, alkalooid, dan tanin) di dalam larutann inkubasi aasam linoleat dapat dengan muddah melengkaapi elektron asam linoleat radikkal. Oleh kaarena itu, seenyawa MDA tidak terbentuk ataau terbentuk dalam jumlah j yangg kecil karenna proses ok ksidasi asam linoleat terhambaat dengan adanya a senyawa antiooksidan. Secara mekanisme, m antioksidan dapat dibagi mennjadi dua kelompok, yaitu antioksidan preventif p dan aantioksidan peemutus reaksi beranttai (Murray 22003). Antioksidan preventif berfungsi b uuntuk meng gurangi kecepatan dimulainya reaksi raadikal. Contohnya enzim-enzim m yang berrfungsi sebagai anttioksidan seeperti superroksida dismutase (S SOD) dan gluutation peroksidase. Senyawa antiioksidan pemu mutus reaksi beerantai berfungsi unntuk memutuuskan perban nyakan reaksi. Contoohnya adalahh senyawa-seenyawa fenol. Salah satu senyaw wa yang terrmasuk golongan fenol fe dari tumbuhan adalah flavonoid yaang memilikii efek antiok ksidasi untuk kuat mem miliki kem mampuan memodifikasii ikatan lem mak membran n yang telah diinduuksi menjadii radikal, bahkan b mampu berinnteraksi dan mempenetrasi lipid dwi lapis (Saija ( A et al 1995). Selain flavonoid, berberine ((senyawa tu urunan alkaloid) memiliki m kem mampuan sebagai antioksidan (Shirwaikkar, Shirw waikar, d Punitha 22006). Aqil (2006) Rajendran, dan menyatakan Allium sativvum L., Cich horium intybus L., dan d Terminallia bellerica Roxb. memiliki seenyawa bioaaktif tanin yang memiliki aktiivitas antioksidasi. Inkubasi dalam d percobaaan dilakukan n 9 hari (berdasarkan waktu innkubasi optimum), setelah itu kadar MDA A diukur dengan d spektrofotom meter dengan ppanjang gelom mbang 532 nm denggan warna laarutan merah muda. Kurva standaar yang digunnakan adalah larutan l 1,1,3,3-tetram metoksipropanna (TMP) dengan d berbagai konnsentrasi. Perssamaan garis linear yang didapat adalah y = 00.03675x - 0..00296 dengan nilai R2 = 99,61%. Percobaan ini menggunakann alfa tokoferol (vitam min E) sebagai pembbanding (konttrol positif) analisis a aktivitas antioksidasi ekkstrak daun sirih merah. Pem milihan vitaamin E sebagai
8
pembanding karena vitamin ini banyak digunakan sebagai antioksidan alami dan larut dalam lemak. Konsentrasi yang digunakan untuk vitamin E adalah 200 ppm karena konsentrasi tersebut merupakan batas maksimum antioksidan yang diperbolehkan dalam makanan (Hernani dan Rahardjo 2005). Konsentrasi ekstrak daun sirih merah yang digunakan adalah 2, 10, 20, 100, 200 mg rebusan/10 mL larutan. Pemilihan konsentrasi ini berkaitan aktivitas air rebusan daun sirih merah sebagai antihiperglikemia, hepatoprotektor, dan dapat memperbaiki sel pankreas dengan dosis 20 g/kg bobot badan. Nilai pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 532 nm berbanding lurus dengan jumlah MDA yang terbentuk dan berbanding terbalik dengan konsentrasi ekstrak. Hasil percobaan menunjukkan setiap konsentrasi ekstrak daun sirih merah (2-200 mg rebusan/10 mL larutan) memiliki aktivitas antioksidasi dan aktivitas tersebut sebanding dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak daun sirih merah (Gambar 6). Persentase inhibisi (54.51-81.78 %) menunjukkan berbanding lurus dengan konsentrasi ekstrak (Tabel 1). Pada konsentrasi 200 mg rebusan/10 mL larutan, pembentukkan MDA dihambat 81.78 %. Hasil ini didukung oleh analisis statistik yang menunjukkan bahwa ekstrak daun sirih merah berbeda nyata dengan kontrol negatif. Konsentrasi ekstrak daun sirih merah 2, 10, dan 20 mg rebusan/10 mL larutan aktivitas antioksidasinya tidak berbeda nyata (α = 0.05) dengan vitamin E, sedangkan konsentrasi ekstrak daun sirih merah 100 dan 200 mg rebusan/10 mL larutan berbeda nyata (α = 0.05) dengan vitamin E sehingga aktivitas antioksidasinya lebih baik.
k a d a r M D A (μ M )
8 7.536 (d) 6 3.428 (c) 2.979 (bc) 2.448 (abc) 2.015 (abc) 1.55 (ab)1.373 (a)
4 2 0 k-
k+
2
10
20
100 200
konsentrasi ekstrak (mg rebusan/10 mL larutan) Gambar 6 Kadar MDA ekstrakdaun sirih merah
Selain dengan vitamin E, aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah ini dapat dibandingkan dengan tumbuhan lainnya yang memiliki aktivitas antioksidasi, contohnya dengan mengkudu dan Physalis peruviana. Kemampuan antioksidasi ekstrak daun sirih merah dengan pelarut air ini lebih baik karena di setiap konsentrasinya tidak menunjukkan efek prooksidan bila dibandingkan dengan buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) yang diekstrak dengan pelarut metanol (Zin et al. 2001). Namun aktivitas antioksidasinya lebih rendah bila dibandingkan dengan ekstrak etanol 95 % Physalis peruviana konsentrasi 100 µg/mL (100 ppm) yang sudah memiliki daya hambat pembentukkan lipid peroksida sebesar 82.3 % (Wu et al 2005) karena ekstrak daun sirih merah mencapai daya hambat 81.78 % di konsentrasi 200 mg rebusan/10 mL larutan. Tabel 1 Persentase inhibisi ekstrak daun sirih merah Perlakuan % Inhibisi Kontrol negatif 0 (d) Kontrol positif 54.51 (c) 2 mg rebusan/10 mL larutan 60.47 (bc) 10 mg rebusan/10 mL larutan 67.52 (abc) 20 mg rebusan/10 mL larutan 73.26 (abc) 100 mg rebusan/10 mL larutan 79.43 (ab) 200 mg rebusan/10 mL larutan 81.78 (a)
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak daun sirih merah berpotensi sebagai antioksidan secara in vitro pada konsentrasi 200, 1000, 2000, 10000, 20000 ppm. Konsentrasi ekstrak daun sirih merah 200, 1000, dan 2000 ppm memiliki aktivitas yang sama dengan vitamin E 200 ppm, sedangkan ekstrak daun sirih merah 10000 dan 20000 ppm aktivitasnya lebih baik dari vitamin E. Saran Perlu diketahui aktivitas antioksidasi daun sirih merah dengan menggunakan pelarut selain air dan penelitian antioksidasi secara in vivo. Selain itu, perlu diteliti senyawa bioaktif dari daun sirih merah yang berperan sebagai antioksidan.
9
DAFTAR PUSTAKA Adawiyah DR, Sarastani D, Fardiaz D. 2001. Kajian aktivitas antioksidan biji buah atung (Parinarium glaberimum Hassk.). Laporan akhir penelitian. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Jurkiewicz BA, Bissett DL, Buettner GR. 1995. Effect of topically applied tocopherol on ultraviolet radiationmediated free radical damage in skin. Journal Invest Dermatol 104:484-488. Kikuzaki H, Nakatani N. 1993. Antioxidant effect of some ginger constituents. Journal of Food Science 58(6):1407-1410.
Aqil F, Ahmad I, Mehmood Z. 2006. Antioxidant and free radical scavenging properties of twelve traditionally used Indian medicinal plants. Turk J Biol 30:177-183.
Linder MC. 2006. Biokimia Nutrisi dan Metabolisme dengan Pemakaian Secara Klinis. Aminuddin Parakkasi, Penerjemah; Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Nutritional Biochemistry and Metabolism.
Avellini L, Chiaradia E, Gaiti A. 1999. Effect of exercise training, selenium and vitamin E on some free radical scavengers in horses (Equus caballus). Comparative Biochemistry and Physiology Part B 123: 147-154.
Martsolich KA. 2007. Potensi antioksidasi ekstrak air dan ekstrak etanol 70 % daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.). [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Chen HM, Muramoto K, Yamaguchi F, Nokihara K. 1996. Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of soybean protein. J Agric Food Chem 44:2619-2623
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper Edisi 25. Hartono, penerjemah. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry.
Duarte J et.al. 2001. Antihypertensive effects of the flavonoid quercetin in spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology 133:117-124. Duryatmo S. 2005. Dulu hiasan kini obat. Trubus. 427:37. Duryatmo S. 2006. Wajah ganda sirih merah. Trubus. 434:92-93. Gitawati R. 1995. Radikal Bebas, Sifat dan Peran dalam Menimbulkan Kerusakan atau Kematian Sel. Cermin Dunia Kedokteran 102:33-36. Hans, Heldt W. 2005. Plant Biochemistry Third Edition. San Diego: Elsevier Academic Press. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Jilid 2. Iwang S, penerjemah. Bandung: ITB Press. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Hart H. 1983. Kimia Organik Suatu Kuliah Singkat.. Edisi 11. Achmadi S, Penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry. Hernani, Rahardjo M. 2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Jakarta: Penebar Swadaya.
Nakayama S, Katoh EM, Tsuzuki T, Kobayashi S. 2003. Protective effect αtocopherol-6-O-phosphate against ultraviolet B-induced damage in cultured mouse skin. The Journal Investigative Dermatology 121:406-411. Permata DA. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) terhadap perbaikan pankreas tikus putih hiperglikemia. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Safithri M, Fahma F. 2005. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) Sebagai senyawa antihiperglikemia pada tikus putih galur sprague dawley. Laporan penelitian. Bogor: LPPM IPB. Saija A et al. 1995. Flavonoids as antioxidant agents: importance of their interaction with biomembranes. Free Radic Biol Med. 19:481-486. Salim A. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai senyawa antihiperglikemia pada tikus putih galur Sprague-Dawley. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Schultz HW, editor. 1962. Symposium on Food: Lipid and Their Oxidation. Di
10
dalam: Sofianti D. Potensi antioksidasi daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.). [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Shirwaikar A, Shirwaikar A, Rajendran K, Punitha SIR. 2006. In vitro antioxidant studies on the benzyl tetra isoquinoline alkaloid berberine. Biol. Pharm. Bull. 29(9):1906-1910. Sudewo B. 2005. Basmi Penyakit dengan Sirih Merah. Jakarta: Agromedia Pustaka. Suryawanshi NP, Bhutey AK, Nagdeote AN, Jadhav AA, Manoorkar GS. 2006. Study of lipid peroxide and lipid profile in diabetes mellitus. Indian Journal of Clinical Biochemistry 21(1):126-130. Windyagiri A. 2006. Potensi hepatoprotektor air rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) pada tikus putih hiperglikemia. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Wu JS et al. 2005. Antioxidant activities of Physalis peruviana. Biol. Pharm. Bull. 28(6):963-966. Zin MZ, Hamid AA, Osman A. 2002. Antioxidative activity of extracts from mengkudu (Morinda citrifolia L.) root, fruit, and leaf. Food Chemistry 78:227231.
1
LAMPIRAN
12
Lampiran 1 Tahapan umum penelitian Daun sirih merah Penentuan bobot jenis ekstrak daun sirih merah
Ekstrak daun sirih merah (2, 10, 20, 100, 200 mg rebusan/10 mL larutan) Penentuan inkubasi optimum asam linoleat (metode TBA) Analisis aktivitas antioksidasi metode TBA
Analisis Statistika
Lampiran 2 Ekstraksi daun sirih merah 10 gram daun sirih merah ditambah akuades 50 mL direbus volume akhir 5 mL
konsentrasi perlakuan (2, 10, 20, 100, 200 mg rebusan/10 mL larutan)
Lampiran 3 Bobot jenis larutan ekstrak sirih merah Bj terkoreksi = Bj terbaca ± faktor terkoreksi
Keterangan:
Faktor koreksi = T1 – T2 x 10-3 (T1>T2) 3 - Bj terbaca ditambah faktor terkoreksi (Tcairan>Talat) - Bj terbaca dikurang faktor terkoreksi (Tcairan
13
Lampiran 4 Pembuatan kurva standar TMP 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 6 M
1 μM
5 μM
10 μM
20 μM
30 μM
40 μM
50 μM
Masing-masing diambil 1 mL 2 ml TCA 20% 2 ml TBA 1 % dalam asam asetat 50 % Larutan Inkubasi 100 °C selama 10 menit, dinginkan, sentrifus 3000 rpm selama 15 menit diukur serapannya pada λ 532 nm Lampiran 5 Penentuan waktu inkubasi optimum asam linoleat 6 ml asam linoleat dalam etanol 99,8 % 6 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7 3 mL akuades
Campuran dipipet ke dalam botol gelap (terdapat 11 botol dan 1 mL campuran untuk setiap botol), dinkubasi 40 °C 1 mL diambil setiap 24 jam 2 mL TBA 1 % dalam asetat 50 % 2 mL TCA 20 % Larutan diinkubasi 100 °C, dinginkan Sentrifus 3000 rpm 15 menit diukur serapannya pada λ 532 nm
14
Lampiran 6 Analisis aktivitas antioksidasi Rebusan daun sirih merah (2, 10, 20, 100, 200 mg rebusan/10 mL larutan), vitamin E 200 ppm, dan akuades
Inkubasi 40 °C.
2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7 2 mL asam linoleat 50 mM 1 mL akuades Lama inkubasi pengukuran
optimum
hasil
Masing-masing diambil 1 mL
Larutan
2 ml TCA 20% TBA 1% dalam asetat 50 % 2 2mlmL TBA 1% dalam asam asetat 50 % 2 mL TCA 20 % Inkubasi 100 °C selama 10 menit, dinginkan, sentrifus 3000 rpm selama 15 menit
diukur serapannya pada λ 532 nm
Lampiran 7 Perhitungan bobot jenis Suhu cairan: 29 °C Suhu alat: 20 °C Faktor koreksi: 29-20 x 10-3 = 0.003 3 Bj terbaca di urinometer: 1.018 Bj terkoreksi = 1.018 + 0.003 = 1.021 g/mL Lampiran 8 Perhitungan pembuatan konsentrasi Volume yang dibutuhkan dari larutan ekstrak daun sirih merah untuk membuat konsentrasi 2 mg rebusan/10 mL larutan: 1.021 g = 2 x 10-3 g 1 mL a a
= 0.00196 mL = 1.96 µL
15
Lampiran 9 Hasil absorban laruttan standar dan kurva standar s P Absorbanssi larutan sttandar TMP Konsentraasi (µM)
Serapan
0
0
1
0.102
5
0.213
100
0.348
200
0.609
300
1.059
400
1.489
500
1.889
Kuurva standaar TMP
Lampiran 10 Hasil abbsorban waaktu inkubassi optimum asam linoleeat Nilai absoorbansi MDA A pada λ 5332 nm Hari
S Serapan 1
Serapan2
[MDA]1 (µM)
DA]2 (µM) [MD
MDA] ± SD D Rerata [M
0
0.042
0.040
1.223
1.169
1.196 ± 0.038
1
0.055
0.058
1.557
1.659
1.618 ± 0.072
2
0.058
0.059
1.659
1.686
1.673 ± 0.019
3
0.100
0.120
2.802
3.346
3.074 ± 0.385
4
0.115
0.138
3.210
3.836
3.523 ± 0.443
5
0.923
0.756
6 25.196
20.652
4 ± 3.213 22.924
6
0.872
0.542
23.808 8
14.829
19.319 9 ± 6.349
7
1.103
0.953
30.094 4
26.013
28.052 2 ± 2.886
8
1.346
0.723
36.706 6
19.754
28.230 ± 11.984
9
1.470
1.480
40.081 1
40.353
40.217 7 ± 0.192
10
1.453
1.532
39.618 8
4 41.768
40.693 3 ± 1.520
Contoh peerhitungan: Hari ke-9 (Serapan1)
03675x y = -0.00296 + 0.0 1.470 = -0.000296 + 0.0 03675x x = 40..081
16
Lampiran 11 Konsentrasi MDA dan daya hambat ekstrak daun sirih merah Sampel
A1 hari
A2 hari
Rerata A
[MDA]
Rerata
ke-9
ke-9
(µM)
[MDA]
K - (1)
0.389
0.114
0.251
6.910
K - (2)
0.389
0.204
0.297
8.162
K + (1)
0.101
0.104
0.103
2.883
K + (2)
0.147
0.139
0.143
3.972
E1 (1)
0.091
0.089
0.090
2.530
E1 (2)
0.124
0.122
0.123
3.427
E2 (1)
0.067
0.072
0.070
1.985
E2 (2)
0.109
0.099
0.104
2.910
E3 (1)
0.052
0.055
0.052
1.500
E3 (2)
0.086
0.093
0.090
2.530
E4 (1)
0.048
0.049
0.049
1.414
E4 (2)
0.058
0.060
0.059
1.686
E5 (1)
0.045
0.048
0.047
1.359
E5 (2)
0.050
0.045
0.048
1.387
SD
% inhibisi
7.536
0.885
0.00
3.428
0.770
54.51
2.979
0.634
60.47
2.448
0.654
67.52
2.015
0.728
73.26
1.550
0.192
79.43
1.373
0.020
81.78
keterangan: (K) kontrol, (E) ekstrak, (E1) 2 mg rebusan/10 mL larutan, (E2) 10 mg rebusan/10 mL larutan, (E3) 20 mg rebusan/10 mL larutan, (E4) 100 mg rebusan/10 mL larutan, (E5) 200 mg rebusan/10 mL larutan Contoh perhitungan: Kadar MDA (kontrol positif 1)
y = -0.00296 + 0.03675x 0.103 = -0.00296 + 0.03675x x = 2.883
% inhibisi (kontrol positif 1): (rerata kontrol negatif – rerata sampel) x 100 % rerata kontrol negatif (7.536-3.428) x 100 % = 54.512 % 7.536
17
Lampiran 12 Analisis statistik waktu inkubasi optimum dan aktivitas antioksidasi Waktu inkubasi optimum ANOVA Sum of Squares 4969.782 205.345 5175.127
Between Groups Within Groups Total
df 10 11 21
Mean Square 496.978 18.668
F 26.622
Sig. .000
Duncan N
Subset for alpha = .05 1 1.1960 1.6180 1.6725 3.0740 3.5230
Hari 2 3 0 2 1 2 2 2 3 2 4 2 6 2 19.3185 5 2 22.9240 7 2 28.0535 8 2 28.2300 9 2 40.2170 10 2 40.6930 Sig. .630 .081 .914 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.
Aktivitas antioksidasi ANOVA Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
Between Groups
53.537
6
8.923
22.511
.000
Within Groups
2.775
7
.396
Total
56.311
13
Duncan N Subset for alpha = 0.05 Perlakuan 1 200 mg rebusan/10 mL larutan 2 1.3730 100 mg rebusan/10 mL larutan 2 1.5500 20 mg rebusan/10 mL larutan 2 2.0150 10 mg rebusan/10 mL larutan 2 2.4475 2 mg rebusan/10 mL larutan 2 Kontrol positif 2 Kontrol negatif 2 Sig. .151 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.
2 1.5500 2.0150 2.4475 2.9785 .070
3
4
2.0150 2.4475 2.9785 3.4275 .072
7.5360 1.000
18
Lampiran 13 Hasil-hasil inkubasi optimum asam linoleat, aktivitas antioksidan, dan kurva standar
Larutan standar TMP (dari kiri ke kanan: 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0 µM)
Inkubasi optimum hari ke-9
Aktivitas antioksidan (dari kiri ke kanan: K-, K+, 2, 10, 20, 100, 200 mg rebusan/10 mL larutan)
