AKTIVITAS ANTIBAKTERI KOMBINASI EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz and Pav.) DAN SIPROFLOKSASIN TERHADAP Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, DAN Klebsiella pneumoniae BESERTA BIOAUTOGRAFINYA
NASKAH PUBLIKASI
Oleh:
MEILY MEGA WILADATIKA K100090131
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA SURAKARTA 2013 1
2
AKTIVITAS ANTIBAKTERI KOMBINASI EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz and Pav.) DAN SIPROFLOKSASIN TERHADAP Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, DAN Klebsiella pneumoniae BESERTA BIOAUTOGRAFINYA ANTIBACTERIAL ACTIVITIES ETHANOL EXTRACT COMBINATION RED BETLE LEAF (Piper crocatum Ruiz and Pav.) AND CIPROFLOXACIN SENSITIVE TO Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, AND Klebsiella pneumoniae ANTIBIOTICS WITH BIOAUTOGRAPHY Meily Mega Wiladatika, Peni Indrayudha Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta Jl. Ahmad Yani, Tromol Pos I, Pabelan Kartasura Surakarta 57102 *Email:
[email protected] ABSTRAK Daun sirih merah terbukti secara tradisional memiliki potensi antibakteri. Siprofloksasin merupakan antibiotik bersifat bakterisidal berspektrum luas. Untuk mengetahui ada atau tidaknya efek sinergis dilakukan uji kombinasi ekstrak etanol daun sirih merah dengan siprofloksasin terhadap bakteri S.aureus, P.aeruginosa dan K.pneumoniae serta dilakukan analisis KLT dan bioautografi untuk mengetahui senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri. Uji kombinasi ekstrak etanol daun sirih merah dan siprofloksasin menggunakan metode difusi (Kirby-Bauer) dengan mengukur diameter zona hambat. Pada kombinasi, digunakan ekstrak etanol daun sirih merah konsentrasi 70% dengan pelarut DMSO 100% dan konsentrasi siprofloksasin 0,001% dan 0,025% dengan pelarut aqua p.i serta dibuat 3 perbandingan, yaitu : 25:75; 50:50; dan 75:25 dengan volume total 20 µL. Analisis senyawa menggunakan KLT dengan fase gerak metanol:kloroform (1:39 v/v) dan untuk mengetahui senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri menggunakan metode bioautografi tipe kontak. Kombinasi ekstrak etanol daun sirih merah dan siprofloksasin memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri S.aureus, P.aeruginosa, dan K.pneumoniae tetapi tidak berefek sinergis, melainkan berefek indeferen. Hasil analisis KLT menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah mengandung senyawa alkaloid dan fenol. Berdasarkan hasil bioautografinya, senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri ialah senyawa fenol pada Rf 0,21. Kata kunci: Piper crocatum; Siprofloksasin; Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; Klebsiella pneumoniae. ABSTRACT Red betel leaf has traditionally proven antibacterial potency. Ciprofloxacin is a broad-spectrum antibiotic is bactericidal. To determine whether or not to test the synergistic effect of the combination of ethanol extract of red betel leaf with ciprofloxacin against bacteria S. aureus, P. aeruginosa and
1
K. pneumoniae and TLC analysis and bioautografi to determine the potential as an antibacterial compound. Test combinations of red betel leaf ethanol extract and ciprofloxacin diffusion method (Kirby-Bauer) by measuring the diameter of inhibition zone. In the combination, used red betel leaf extract ethanol concentration of 70% to 100% and solvent DMSO concentration of ciprofloxacin 0.001% and 0.025% with solvent aqua pi and made 3 comparisons, namely: 25:75; 50:50, and 75:25 by volume total of 20 mL. Analysis of compounds by TLC with a mobile phase of methanol: chloroform (1:39 v / v) and to determine the potential as an antibacterial compound bioautografi using contact type. The combination of red betel leaf ethanol extract and ciprofloxacin have antibacterial activity against bacteria S.aureus, P.aeruginosa, and K.pneumoniae but no synergistic effect, but the effect indifference. TLC analysis of the results showed that the ethanol extract of red betel leaves contain alkaloids and phenolic compounds. Based on the results bioautografinya, potentially as an antibacterial compound is phenol compounds at Rf 0.21. Keywords: Piper crocatum; Ciprofloxacin; Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; Klebsiella pneumoniae. PENDAHULUAN Infeksi merupakan penyakit yang disebabkan oleh banyak faktor. Faktor penyebab penyakit infeksi yang sering dijumpai secara medis adalah bakteri (Brooks et al., 2001). Terapi untuk penyakit infeksi biasanya menggunakan antibiotik, salah satunya siprofloksasin. Mardiatuti et al (2007) memaparkan bahwa Staphylococcus aureus resistensinya pada siprofloksasin mencapai 37 %, sedangkan Pseudomonas aureginosa kepekaannya menurun hingga 50 % terhadap ofloksasin maupun siprofloksasin (Kumala et al., 2010). Resistensi
terhadap
siprofloksasin juga ditunjukkan pada Klebsiella sp. hingga 48,8 % (Refdanita, 2004). Tingkat resistensi bakteri pada antibiotik tidak seimbang dengan penemuan antibiotik baru (Rai et al., 2011). Di sisi lain terdapat potensi pada banyak tanaman untuk pengobatan penyakit infeksi (Datta et al., 2011). Sirih merah memiliki khasiat yang beragam (Wherdany et al., 2008), salah satunya sebagai antibakteri. Pengatasan resistensi adalah dengan mengkombinasikan antibiotik dengan ekstrak tanaman. Aiyegoro dan Okoh (2009) memaparkan bahwa suatu tanaman apabila dikombinasikan dengan antibiotik dapat
2
menimbulkan efek sinergis dan aktivitas antibakteri. Berdasarkan penelitian tersebut dilakukan uji aktivitas kombinasi ekstrak etanol daun sirih merah dan siprofloksasin terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Pseudomonas aureginosa, dan Klebsiella pneumoniae. METODE PENELITIAN Alat Autoklaf (My Life), oven, inkubator shaker (New Brunswick), inkubator (Memmert), mikroskop (Olympus), alat timbang (Precisa), mikropipet (Socorex), Laminar Air Flow (Astari Niagara International), alat vorteks, dan kompor listrik. Bahan Bakteri yang digunakan : Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan Klebsiella pneumoniae yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta. Bahan yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri : ekstrak etanol daun sirih merah, etanol 70%, siprofloksasin, akuades, disc blank (Oxoid), disc antibiotic Kloramfenikol (Oxoid), Eritromisin (Oxoid), Ampisilin (Oxoid), Siprofloksasin (Oxoid), dan Tetrasiklin (Oxoid), media cair BHI (Oxoid), media MH (Oxoid), cat Gram A, cat Gram B, cat Gram C, cat Gram D, DMSO 100 %, media KIA (Oxoid), media LIA (Oxoid), media MIO (Oxoid), media MSA (Oxoid), NaCl (Merck), dan reagen Kovac. Jalannya Penelitian Identifikasi Bakteri Identifikasi bakteri dilakukan dengan cara pengecatan Gram dan uji biokimiawi. Uji sensitivitas antibiotik Bakteri di uji dengan menggunakan beberapa antibiotik standar, yaitu Ampisilin, Kloramfenikol, Tetrasiklin, dan Siprofloksasin. Uji Pendahuluan Pembuatan stok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 705 dengan seri konsentrasi 40%, 50%, 60%, dan 70% serta stok konsentrasi siprofloksasin 3
0,2% dengan seri konsentrasi 0,001%, 0,003%,0,006%, 0,0125%, 0,0025%, 0,05%, 0,1%, dan 0,2%. Uji aktivitas antibakteri kombinasi ekstrak etanol daun sirih merah dan siprofloksasin Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah yang digunakan ialah 70%, sedangkan konsentrasi siprofloksasinnya 0,001% dan 0,025%. Kombinasi ekstrak daun sirih merah:siprofloksasin dibuat perbandingan 25:75 ; 50:50 ; dan 75:25 dengan volume total 20 µL/disk. Suspensi bakteri diambil 200 µL dan ratakan pada media MH. Kombinasi ekstrak etanol daun sirih merah dan siprofloksasin sesuai perbandingan dan kontrol, diteteskan pada disk antibiotik 6 mm kosong, kemudian diletakkan pada media yang telah berisi bakteri 20, dipreinkubasikan pada suhu kamar selama 20-30 menit, setelah itu diinkubasi selama 18-24 jam pada 37ºC. Uji KLT Ekstrak etanol daun sirih merah sebanyak 350 mg dilarutkan dalam 0,5 mL etanol sebagai pelarut. Larutan sampel ditotol menggunakan pipa kapiler pada fase diam Silika GF254 yang diaktifkan dulu dengan cara dipanasi pada suhu 105º C - 110º C selama 1 jam kemudian dielusi dengan fase gerak metanol:kloroform (1:39) v/v. Hasil kromatogram diamati pada UV254 nm. Bercak dideteksi dengan pereaksi semprot FeCl3 (Fenol), sitroborat (Flavonoid), Dragendroff (Alkaloid), dan Vanilin H2SO4 (Terpenoid). Uji bioautografi Bioautografi digunakan untuk mendeteksi senyawa aktif yang mempunyai aktifitas sebagai antibakteri. KLT yang telah dielusi dengan fase gerak metanol:kloroform (1:39) v/v diangin-anginkan dan diletakkan selama 20 menit pada permukaan media MH dalam cawan petri yang telah diinokulasi dengan 200 µL bakteri yang telah dibuat setara dengan 1,5x108CFU/ mL.
4
Teknik Analisis Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah dan Siprofloksasin Teknik analisis dilakukan dengan membandingkan besarnya diameter zona hambat ekstrak etanol daun sirih merah, siprofloksasin, kombinasi ekstrak etanol sirih merah:siprofloksasin, dan DMSO 100 % serta dianalisis menggunakan data anova. Kromatografi Lapis Tipis Teknis analisis dilakukan dengan mengamati hasil deteksi KLT menggunakan sinar UV, visual, dan berbagai reagen semprot dianalisis berdasarkan pustaka “Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan’ karangan J. B. Harborne (1987), “Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas” karangan Wagner dan Bladt (1996), dan “Cara Mengidentifikasi Flavonoid” karangan Markham (1988). Bioautografi Analisis bioautografi dilakukan dengan mengamati bercak yang menunjukkan zona jernih, dihitung Rf nya kemudian dibandingkan dengan hasil deteksi KLT pada Rf tersebut. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Identifikasi Bakteri Identifikasi dilakukan dengan pewarnaan cat gram dan uji biokimiawi. Berdasarkan hasil pada Tabel 1, Tabel 2, dan Tabel 3, maka bakteri yang digunakan sebagai bahan uji ialah benar Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan Klebsiella pneumoniae yang berasal dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah. Berdasarkan hasil Tabel 2 dan Tabel 3, ada beberapa ketidaksesuaian dari sifat bakteri. Kemungkinan hal ini disebabkan oleh sedikitnya koloni bakteri yang dimasukkan kedalam media uji, sehingga tidak memperlihatkan hasil yang kurang optimum dan sesuai.
5
Tabel 1. Hasil Teknik Pengecatan Gram Bakteri Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa
Pengamatan Bentuk Bulat, bergerombol Batang, bergerombol Batang, bergerombol
Warna Ungu Merah Merah
Pustaka (Jawetz dkk., 1991) Bentuk Warna Bulat, bergerombol Ungu Batang, bergerombol Merah Batang, bergerombol Merah
Tabel 2. Hasil Uji Biokimiawi Bakteri Klebsiella pneumoniae dan Pseudomonas aeruginosa Kliger Iron Agar (KIA) Pustaka Bakteri (http://www.sigmaaldrich.com) Miring Dasar H2S Gas Miring Dasar H2S Gas K.pneumoniae Kuning Kuning Kuning Kuning + P.aeruginosa Merah Merah Merah Merah LIA (Lysine Iron Agar) Pustaka Bakteri (http://www.sigmaaldrich.com) Miring Dasar H2S Miring Dasar H2S K.pneumoniae Ungu Ungu Ungu Ungu P.aeruginosa Ungu Ungu Ungu Ungu MIO (Motility Indol Ornithine) Pustaka Bakteri (http://www.sigmaaldrich.com) Motilitas Ornitin Indol Motilitas Ornitin Indol K.pneumoniae P.aeruginosa + + Tabel 3. Hasil Uji Biokimiawi Bakteri Staphylococcus aureus Bakteri Hasil Pengamatan Pada Pustaka Media (http://www.sigmaaldrich.com) Manitol Salt Agar Manitol Salt Agar (MSA) (MSA) Perubahan warna media menjadi Perubahan warna media menjadi Staphylococcus aureus kuning. kuning
Hasil Uji Sensitivitas Uji sensitivitas bertujuan untuk melihat tingkat sensitivitas dan resistensi bakteri terhadap antibiotik. Antibiotik yang digunakan dalam uji sensitivitas ialah Tetrasiklin, Ampisilin, Kloramfenikol, dan Siprofloksasin. Hasil uji menunjukkan bakteri S.aureus bersifat resisten terhadap antibiotik Tetrasiklin dan Ampisilin, bersifat intermediate terhadap antibiotik kloramfenikol, serta sensitif terhadap antibiotik Siprofloksasin. Lain halnya dengan bakteri P.aeruginosa dan K.pneumoniae yang menunjukkan sifat sensitif terhadap antibiotik Tetrasiklin dan Siprofloksasin, bersifat intermediate terhadap antibiotik kloramfenikol serta resisten terhadap antibiotik Ampisilin (Tabel 4).
6
Penyebab suatu bakteri sensitif terhadap siprofloksasin, karena sifatnya menghambat DNA girase, suatu enzim yang menekan DNA bakteri untuk menjadi superkoil. Untuk masuknya DNA untai ganda kedalam sel bakteri, DNA diatur dalam loop yang menyebabkan DNA terelaksasi dan kemudian diperpendek oleh proses superkoil, dan sifat bakterisida yang dimiliki oleh siprofloksasin akan menghambat lepasnya untai DNA yang terbuka pada proses superkoil (Neal, 2005). Tabel 4. Hasil Uji Sensitivitas Bakteri S.aureus, P.aeruginosa, dan K.pneumoniae Terhadap Antibiotik Bakteri
S.aureus
P.aeruginosa
K.pneumoniae
Disc Antibiotic Tetrasiklin ( 30 µg ) Ampisilin ( 10 µg ) Kloramfenikol ( 30 µg ) Siprofloksasin ( 5 µg ) Tetrasiklin ( 30 µg ) Ampisilin ( 10 µg ) Kloramfenikol ( 30 µg ) Siprofloksasin ( 5 µg ) Tetrasiklin ( 30 µg ) Ampisilin ( 10 µg ) Kloramfenikol ( 30 µg ) Siprofloksasin ( 5 µg )
Standar resistensi zona hambat bakteri (mm) Resisten Intermediate Sensitif ≤ 11 ≤ 13 ≤ 12 ≤ 15 ≤ 11 ≤ 13 ≤ 12 ≤ 15 ≤ 11 ≤ 13 ≤ 11 ≤ 13
12-14 14-16 13-17 16-20 12-14 14-16 13-17 16-20 12-14 14-16 12-14 14-16
≥ 15 ≥ 17 ≥ 18 ≥ 21 ≥ 15 ≥ 17 ≥ 18 ≥ 21 ≥ 15 ≥ 17 ≥ 15 ≥ 17
Diameter zona hambat (mm)
Keterangan
8 8 14 22 17 8 15 23 28 12 13 22
Resisten Resisten Intermediate Sensitif Sensitif Resisten Intermediate Sensitif Sensitif Resisten Intermediate Sensitif
Hasil Uji Pendahuluan Pembuatan Stok dan Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah Mpila et al (2012) cit Davis and Stout (1971) memaparkan bahwa diameter zona hambat memiliki kriteria yang berbeda, yaitu 5 mm atau <5 mm dikategorikan lemah, zona hambat berkisar 5-10 mm termasuk kategori sedang, zona 10-20 mm dikategorikan kuat, sedangkan zona hambat 20 mm atau lebih termasuk kategori sangat kuat. Berdasarkan hasil tersebut, maka konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah yang digunakan ialah konsentrasi maksimal yakni 70% dengan diameter zona hambat kategori sedang untuk bakteri Staphylococcus aureus (9 mm) dan Pseudomonas aeruginosa (9 mm), serta kategori kuat untuk bakteri Klebsiella pneumoniae (13 mm) (Tabel 5).
7
Tabel 5. Hasil Uji Pendahuluan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah terhadap Bakteri S.aureus, P.aeruginosa, dan K.pneumoniae Bahan uji dan Diameter Zona Hambat (mm) Bakteri
Ekstrak etanol Daun Sirih Merah 40 %
Ekstrak etanol Daun Sirih Merah 50 %
Klebsiella penumoniae Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus
10*±0 9±0,16 7±0
11*±0 9±0 7±0,07
Ekstrak etanol Ekstrak etanol Daun Sirih Merah Daun Sirih Merah 60 % 70 % 11,3*± 9±0,14 7±0
13*0,19 9±0,07 9±0
DMSO 100 %
6±0# 6±0# 6±0#
Keterangan : *=irradikal ; # = diameter zona hambat termasuk diameter disk
Pembuatan Stok dan Seri Konsentrasi Siprofloksasin Dibuat stok konsentrasi Siprofloksasin 0,2% dan dilakukan pengenceran konsentrasi mulai dari 0,001%, 0,003%, 0,006%, dan 0,0125% untuk bakteri Klebsiella pneumoniae, 0,025%, 0,05%, 0,1%, dan 0,2% untuk bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus. Hasil uji menunjukkan bahwa tiap konsentrasi siprofloksasin yang diuji dapat menghambat bakteri K.pneumoniae, P.aeruginosa, dan S.aureus. Berdasarkan hasil tersebut (Tabel 6), konsentrasi siprofloksasin yang digunakan untuk uji kombinasi ialah konsentrasi 0,001% untuk bakteri K.pneumoniae, dan konsentrasi 0,0025% untuk bakteri P.aeruginosa dan S.aureus yang akan digunakan dalam uji kombinasi. Tabel 6. Hasil Uji Pendahuluan Konsentrasi Siprofloksasin terhadap Bakteri S.aureus, P.aeruginosa, dan K.pneumoniae. Bahan uji dan Diameter Zona Hambat (mm)
Bakteri Siprofloksasin 0,001%
Siprofloksasin 0,003%
Siprofloksasin 0,006%
Siprofloksasin 0,0125%
Siprofloksasin 0,025%
Siprofloksasin 0,05%
Siprofloksasin Siprofloksasin 0,1% 0,2%
K.penumoniae
17±0,07
18±0,07
24±0,07
27±0
30,3±0,70
3,13±0,02
32±0,07
34±0,14
P.aeruginosa
*
*
*
*
18±0,04
19±0
19±0,24
20±0
S.aureus
*
*
*
*
17±0
18±0,07
21±0,07
21±0,14
Keterangan : * = tidak dilakukan; diameter zona hambat termasuk diameter disk
Hasil Aktivitas Kombinasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah dan Siprofloksasin Berdasarkan hasil pada Tabel 7, kombinasi antara ekstrak etanol daun sirih merah dengan pelarut DMSO 100% dan siprofloksasin terhadap tiap bakteri uji memiliki aktivitas antibakteri, yang ditandai dengan adanya zona jernih disekitar disk tetapi tidak berefek sinergis melainkan berefek indeferen yakni hasil diameter 8
zona hambat rata-rata yang didapatkan tidak lebih baik dibandingkan tanpa kombinasi. Data diameter zona hambat kombinasi ekstrak etanol daun sirih merah dan siprofloksasin terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa dan Klebsiella pneumoniae terdistribusi tidak normal, kemudian hasil analisis statistik KruskalWallis memberikan hasil tidak signifikan yaitu tidak memberikan pengaruh terhadap diameter zona hambat. Sedangkan pada bakteri Staphylococcus aureus, hasil data terdistribusi normal, sehingga hasil analisis statistik dengan Anova signifikan yaitu memberikan pengaruh terhadap diameter zona hambat (Tabel 8). Tabel 7. Hasil Uji Kombinasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah 70% dan Siprofloksasin 0,001% Terhadap Bakteri K.pneumoniae, 0,025% Terhadap Bakteri P.aeruginosa, dan S.aureus Bahan uji dan Diameter Zona Hambat (mm) Ekstrak etanol Daun Sirih Merah 70 %
Siprofloksasin: Ekstrak etanol Daun Sirih Merah 70% (25:75)
Siprofloksasin: Ekstrak etanol Daun Sirih Merah 70% (50:50)
Siprofloksasin: Ekstrak etanol Daun Sirih Merah 70 % (75:25)
DMSO 100 %
Siprofloksasin
Klebsiella penumoniae
8±0,02
8±0,01
7±0,03
10±0
6±0*
17±0,07
Pseudomonas aeruginosa
8±0,02
9±0
7±0,63
15±0,19
6±0*
18±0,04
12±0,07
6±0*
17±0
Bakteri
8±0,07 15±0,07 16±0,03 Staphylococcus aureus Keterangan : *=diameter zona hambat termasuk diameter disk
Tabel 8. Hasil Analisis Statistik Kombinasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah dan Siprofloksasin Terhadap Bakteri Bakteri Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus
Analisis Kruskal-Wallis Kruskal-Wallis Anova
Signifikansi 0,196 0,077 0,037
Keterangan Tidak signifikan Tidak signifikan Signifikan
Keterangan : Signifikan <0,05
Hasil Kromatografi Lapis Tipis dan Bioatografi Analisis kromatografi lapis tipis terhadap ekstrak etanol daun sirih merah konsentrasi 70% dilakukan dengan menggunakan fase diam Silika GF254 dan fase gerak metanol:kloroform (1:39) v/v. Totolan ekstrak etanol daun sirih merah pada plat silika menggunakan pipa kapiler. KLT merupakan metode yang digunakan untuk mengetahui kandungan suatu senyawa yang terdapat pada ekstrak tanaman, seperti alkaloid,
9
antraglikosida, arbutin, glikosida jantung, zat pahit, flavonoid, saponin, dan minyak atsiri (Depkes RI, 1987). Bercak yang dihasilkan pada plat KLT lalu dideteksi dengan sinar tampak, sinar UV254, sinar UV366. Agar bercak pada lempeng KLT terlihat lebih jelas dan menentukan senyawa yang terkandung pada ekstrak tanaman dapat digunakan beberapa larutan pereaksi semprot (Depkes RI, 1987). Senyawa fenol dapat dideteksi dengan pereaksi semprot FeCl3 yang secara visual dapat menimbulkan warna hijau, merah, ungu, biru, atau hitam yang kuat (Harborne, 1996). Hasil pengamatan menunjukkan ekstrak etanol daun sirih merah mengandung senyawa fenol ditandai dengan hijau kecoklatan (Tabel 9). Untuk senyawa alkaloid dapat dideteksi dengan pereaksi semprot dragendorff apabila dilihat secara visual akan menunjukkan warna coklat, orange hingga coklat (Wagner & Bladt, 1995). Hasil pengamatan menunjukkan ekstrak etanol daun sirih merah mengandung senyawa alkaloid yang ditandai dengan warna hijau kecoklatan dan coklat. Senyawa terpenoid, dideteksi menggunakan pereaksi semprot Vanilin-H2SO4 yang ditandai dengan adanya warna biru, merah hingga merah tua secara visual (Depkes RI, 1987). Hasil menunjukkan ekstrak etanol daun sirih merah tidak mengandung senyawa terpenoid (Tabel 9). Tabel 9. Hasil KLT ekstrak etanol daun sirih merah 70% dengan fase gerak metanol:kloroform (1:39) v/v dengan jarak pengembangan 6 cm. Bercak Sebelum Di semprot
Rf
Perkiraan Senyawa
(cm)
0,21 0,41 0,53 0,61 0,75 0,8 0,88 0,96
Deteksi Pereaksi Semprot
254
366
Vis
Vis
Vanilin H2SO4 Vis
Pem Pem Pem -
F. Coklat F. Me-Co F. Merah F. Me-Co F. Merah F. Coklat F. Coklat
Hi-Co Hi-Co
Hijau Hi-Co Coklat
Hi-Ku Hi-Ku Hi-Ku
Sinar UV (nm)
Keterangan: Pem : Pemadaman F: Fluoresensi Vis: Visual
FeCl3
Dragendorf
Fenol Alkaloid Fenol, Alkaloid
Hi-Co: Hijau ke Coklatan Hi-Ku: Hijau ke Kuningan Me-Co: Merah kecoklatan
Dalam penelitian ini digunakan bioautografi tipe bioautografi kontak, yaitu meletakkan lempeng KLT hasil elusi dengan fase gerak diatas media yang telah 10
d diinokulasi dengan bakkteri uji. A Adanya senyyawa antibaakteri ditanddai dengan a adanya daerah jernih yang tidak dituumbuhi baktteri (Kusumaaningtyas ett al., 2008). D Dalam uji bioautografi b i kontak terrhadap baktteri S.aureuss, K.pneumooniae, dan P P.aeruginos a diharap menghasilkan m n zona jern nih dan disesuaikan deengan hasil a analisis KLT T berdasarkaan nilai Rf attau hRfnya. Bioauutografi meerupakan carra mendetek ksi apakah senyawa yaang diteliti m memiliki ak ktivitas antiimikroba daan merupakkan metodee yang muddah ketika d dijalankan, serta tidak membutuhka m an peralatann yang banyaak (Patil et al., 2013). D Dalam Pennelitian ini menggunakkan bioauto ografi kontaak, yaitu meletakkan m l lempeng KL LT hasil elusi dengan faase gerak diiatas media yang telah diinokulasi d d dengan baktteri uji. Adaanya senyaw wa antibakteeri ditandai dengan d adan nya daerah j jernih yang tidak ditum mbuhi bakterri (Kusuman ningtyas et al., 2008). Dalam uji b bioautografi i kontak terhhadap bakterri S.aureus, K.pneumonniae, dan P.a aeruginosa d diharap mennghasilkan zona jernihh dan disesuuaikan denggan hasil anaalisis KLT nilai Rf atauu hRfnya. b berdasarkan Berddasarkan hasil bioautogrrafi, pada baakteri S.aureeus terlihat zona z jernih p pada Rf 0,21, 0,41, dan 0,75. Pada bakteri K.pn neumoniae ddan P.aerugginosa zona j jernih terlih hat pada Rff 0,21 dan 0,41. Nilai Rf 0,41 paada semua bakteri uji m merupakan senyawa s den ngan ikatan rangkap r terkkonjugasi yaang berefek antibakteri, a s sama halnyaa dengan nillai Rf 0,75 ppada bakteri S.aureus, tetapi t belum m diketahui g golongan seenyawa terseebut. Senyaw wa yang beerpotensi sebbagai antibaakteri ialah s senyawa feenol pada Rf 0,21 ppada bakteeri S.aureuss, P.aerugin nosa, dan K K.pneumoni iae. K Kontrol
Kontrol
Rf = 0,75 Rf = 0,41
Rf = 0,41 Rf = 0 0,21
(A)
Rf = 0,,41 Rf = 0 0,21
Rf = 0,21
(B)
(C)
Gambar 8. Hasill Bioautografi Ek G kstrak Etanol Daaun Sirih Merah 70% dengan fase gerak (1:39) v/v v (A) S.aureus, (B) K K.pneumoniae, da an (C) P.aerugino osa .
11
Menurut Nurmilah (2009) cit Prindle (1983) senyawa fenol mampu memutuskan ikatan peptidoglikan dalam usahanya menerobos dinding sel sehingga dapat menyebabkan kebocoran nutrien sel dengan cara merusak ikatan hidrofobik komponen dai membran sel serta larutnya komponen yang berikatan secara hidrofobik yang berakibat meningkatnya permeabilitas membran. Terjadinya kerusakan pada membran sel inilah yang mengakibatkan terhambatnya aktivitas dan biosintesis enzim-enzim spesifik yang diperlukan dalam reaksi metabolisme. Tidak terdeteksinya senyawa lain yang terkandung didalam ekstrak etanol daun sirih merah dapat disebabkan oleh
beberapa faktor yang dapat
mempengaruhi kualitas ekstrak sebagai bahan baku ialah jenis pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi, metode ekstraksi, suhu proses ekstraksi, metode pemurniannya menurut Hernani et al (2007) cit (Endardo, 1999: Wahono, 200; Windono & Sutarjadi, 2002), serta berkurangnya kualitas dari pereaksi semprot sehingga tidak dapat memberikan warna yang baik dan sesuai untuk deteksi senyawa lain yang terkandung dalam ekstrak etanol daun sirih merah.
KESIMPULAN Simpulan dari penelitian ini adalah : 1.
Ekstrak etanol daun sirih merah 70% memiliki aktivitas antibakteri dengan atau tanpa kombinasi dengan antibiotik siprofloksasin dan tidak memberikan efek yang sinergis setelah dikombinasi.
2.
Ekstrak etanol daun sirih merah 70% mengandung senyawa fenol yang berpotensi sebagai antibakteri.
SARAN 1.
Perlu dilakukan identifikasi dan isolasi lebih lanjut terhadap ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz and Pav.) untuk menentukan senyawa yang berpotensi dalam aktivitas antibakteri.
2.
Perlu dilakukan uji kombinasi ekstrak etanol daun sirih merah dan antibiotik lain dengan menggunakan metode dilusi.
12
DAFTAR ACUAN Aiyegoro, O. A., & Okoh, A. I., 2009, Use of bioactive plant products in combination with standart antibiotics : Implications in antimikrobial chemotherapy, Journal of Medicinal Plant Research, 3 (13), 1147. Brooks, G. F., Butel, J. S., & Morse, S. A., 2001, Mikrobiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh Mudihardi, E., Kuntaman., Wasito, E. B., Mertaniasih, N. M., Harsono, S., & Alimsardjono, L., 318 & 374, Salemba Medika, Jakarta. Datta, A., Ghoshdastidar, S., and Singh, M., 2011, Antimicrobial Property of Piper betle Leaf against Clinical Isolates of Bacteria, International Journal of Pharma Sciences and Reseacrh, 2 (3), 104-109. DepKes RI, 1987, Analisis Obat Tradisional, Jilid 1, 57-67, Direktorat Jendral Pengawasan Obat Dan Makanan, Jakarta. Kumala, S., Pasanema, D. A. M., & Mardiastuti., 2010, Pola Resistensi Antibiotik Terhadap Isolat Bakteri Sputum Penderita Tersangka Infeksi Saluran Nafas Bawah, Jurnal Farmasi Indonesia, 5 (1), 24-32. Kusumaningtyas, E., Astuti, E., & Darmono., 2008, Sensitivitas Metode Bioautografi Kontak dan Agar Overlay dalam Penentuan Senyawa Antikapang, Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 6 (2), 75-79. Mardiastuti, H. W., Karuniawati, A., Kiranasari, A., Ikaningsih., & dan Kadarsih, R., 2007, Emerging Resistance Pathogen : Situasi kini di Asia, Eropa, Amerika Serikat, Timur Tengah dan Indonesia., Artikel Penelitian Majalah Kedokteran Indonesia, 57 (3), 75-79. Mpila, D. A., Fatimawali., & Wiyono, W. I., 2012, Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Mayana (Coleus atropurpureus [L] Benth) Terhadap Staphylococcus aureus, Eschericia coli, dan Pseudomonas aeruginosa secara In Vitro (online) (http://ejournal.unstrat.ac.id/index.php/pharmacon/article/view/440/351) (diakses tanggal 10 Mei 2013) Neal, M. J., 2005, At a Glance Farmakologi Medis Edisi 5., 80, Penerbit Erlangga, Jakarta. Rai, M. P., Thilakchand, K. R., Palatty, P.L., Rao, P., Rao, S., Bhat, H. P., et all, 2011, Piper Betel Linn (Betel Vine) the Maligned Southeast Asian Medicinal Plant Possesses Cancer Preventive Effects: Time to Reconsider the Wronged Opinion, Asian Pacific Journal Cancer Preview,12, 2149-2156.
13
Refdanita., R. Maksum., A. Nurgani., & P. Endang., 2004, Pola Kepekaan Kuman Terhadap Antibiotika Di Ruang Gawat Intensif Rumah Sakit Fatmawati Jakarta Tahun 2001-2002, Makara Kesehatan, 8 (2), 41-48. Wagner, H. and Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, second edition, 6-7, Springer, New York. Wherdany, W. I., S. S. A. Marton., & W. Setyorini., 2008, Sirih Merah, 1-3, Balai Pengkajian Teknologi Pertanian, Yogyakarta.
14
