IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI TERAKTIF DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

i digilib.uns.ac.id

perpustakaan.uns.ac.id

IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI TERAKTIF DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

Disusun oleh : RINA SEPTIANA S M0305052

SKRIPSI Ditulis dan diajukan untuk memenuhi sebagian persyaratan mendapatkan gelar Sarjana Sains Kimia

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA April, 2011 commit to user

i

ii digilib.uns.ac.id


HALAMAN PENGESAHAN Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret telah mengesahkan skripsi mahasiswa: Rina Septiana Sumadi NIM M0305052, dengan judul ” Identifikasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Teraktif Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)”

Skripsi ini dibimbing oleh: Pembimbing I

Pembimbing II

Ahmad Ainurofiq, M.Si. Apt.

Soerya Dewi Marliyana, M.Si.

NIP. 19780319 200501 1003

NIP. 19690313 199702 2001

Dipertahankan di depan Tim Penguji Skripsi pada: Hari

:

Tanggal : Anggota tim Penguji : 1. Nestri Handayani, M.Si, Apt. NIP. 19701211 200501 2001

1. ..............................

2. Dr. Sayekti Wahyuningsih, M.Si. NIP. 19711211 199702 2001

2. ..............................

Ketua Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta

Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D. commit to198601 user 1001 NIP. 19560507

ii

iii digilib.uns.ac.id


PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi saya yang berjudul “Identifikasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Teraktif Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)” adalah benar – benar hasil penelitian sendiri dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat kerja atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta, Maret 2011

Rina Septiana Sumadi

commit to user

iii

iv digilib.uns.ac.id


IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI TERAKTIF DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

Rina Septiana S

Jurusan Kimia. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sebelas Maret.

ABSTRAK Identifikasi dan uji aktivitas antibakteri fraksi teraktif daun sirih merah telah dilakukan. Pembuatan ekstrak menggunakan metode maserasi menggunakan pelarut etanol, kemudian dilanjutkan dengan heksana. Pemisahan ekstrak etanol menggunakan Kromatografi Vakum Cair (KVC) dengan pelarut organik, yaitu heksana, etil asetat, dan etanol. Uji antibakteri fraksi-fraksi dilakukan dengan metode difusi. Fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi ditentukan komponen kimianya dengan skrinning fitokimia menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan analisis Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa (GC-MS). Selanjutnya, ditentukan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan uji banding terhadap standar amoksisilin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi heksana, etil asetat dan etanol daun sirih merah mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa. Fraksi heksana memiliki aktivitas antibakteri tertinggi terhadap E. coli, B. cereus, S. aureus dan P. aeruginosa. Fraksi heksana diidentifikasi dengan analisis skrinning fitokimia dan analisis GC-MS. Hasil skrinning fitokimia menunjukkan golongan senyawa terpenoid, steroid, asam lemak dan analisis GC-MS menunjukkan 14 senyawa golongan terpenoid teridentifikasi dengan komponen utamanya antara lain trans-kariofilen (19,21%), beta-farnesen (15,18%), germakren-D (13,86%) dan ar-kurkumen (9,93%). KHM fraksi heksana terhadap E. coli adalah 10% dan terhadap B. cereus, S. aureus, dan P. aeruginosa adalah 5%. Nilai uji banding fraksi heksana terhadap B. cereus 4,7.10-3%, terhadap P. aeruginosa 6,61.10-3%, terhadap S. aureus 4,19.10-3% dan terhadap E. coli 3,51.10-3% dibandingkan dengan amoksisilin.

Kata Kunci : Piper crocatum Ruiz & Pav., identifikasi, aktivitas antibakteri.

commit to user

iv

v digilib.uns.ac.id


IDENTIFICATION AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF SELECTED FRACTION FROM Piper crocatum Ruiz & Pav. LEAVE

Rina Septiana S

Department of Chemistry. Mathematics and Natural Sciences Faculty. Sebelas Maret University.

ABSTRACT Identification and antibacterial activity of selected fraction from Piper crocatum Ruiz & Pav. leave have been done. The extracts of Piper crocatum Ruiz & Pav. were prepared by maceration using ethanol and then continued by hexane. Liquid vacuum chromatography with organic solvent; hexane, ethyl acetate, and ethanol was used to separate ethanol extract. The antibacterial activity of fractions were determined by using diffusion method. The composition of the highest active fraction was investigated by phytochemical screening method and Gass Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS) analysis. Then, the minimum inhibitory concentration (MIC) and equivalent value were evaluated. The equivalent value was compared to amoxicilin. The result of this research showed that hexane, ethyl acetate and ethanol fractions had antibacterial activity against Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. The hexane fraction was the highest antibacterial activity. This fraction was identified by phytochemical screening and GC-MS analysis. The phytochemical screenings analysis showed terpenoids, steroids, and fatty acids compounds and the GC-MS analysis contained 14 terpenoid compounds with the major compounds were trans caryophyllene (19,21%), beta-farnesene (15,18%), germacrene-D (13,86%), and ar-curcumene (9,93%). The MIC of hexane fraction against E.coli was 10%, while B.cereus, S. aureus and P. aeruginosa were 5%. The equivalent value of hexane fraction compared to amoxicilin standards was 4,7.10-3%; 6,61.10-3%; 4,19.10-3%; 3,51.10-3% for B.cereus, P. aeruginosa, S. aureus, and E.coli, respectively.

Key word : Piper crocatum Ruiz & Pav., identification, antibacterial activity.

commit to user

v

vi digilib.uns.ac.id


MOTTO “Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan” (Q.S. Al-Insyirah : 6)

“Orang yang berhenti untuk menjadi lebih baik berarti dia berhenti untuk menjadi orang yang baik” ( W. Churcil)

“maka apabila kamu telah selesai (mengerjakan urusan), kerjkanlah dengan sungguh-sungguh (urusan) yang lain, dan hanya kepada Tuhanmu-lah hendaknya kamu brharap” (Q.S. Alam Nasyrah : 7-8)

“rasa ingin tahu akan mengalahkan rasa takut, bahkan melebihi keberanian yang kita kehendaki” (H. Bergson)

“you don’t choose your family, they are God’s gift to you, as you are to them” (Desmont Tutu)

commit to user

vi

vii digilib.uns.ac.id


PERSEMBAHAN

Puji syukur kehadirat Allah SWT sehingga aku dapat menyelesaikan karya kecil ini.

Aku persembahkan karya sederhanaku ini untuk: v

Bapak (alm) yang tempatnya takkan tergantikan dihatiku

v

Ibu yang selalu menyayangiku sepanjang waktu

v

Mba yuli sekeluarga (Mas Gufron & Opang) terima kasih untuk doa, pengertian dan kesabarannya

v

Mas dodo,terima kasih untuk segalanya. Darimu aku belajar banyak hal..

v

mbri sarangeo. makasih buat dukungannya

commit to user

vii

viii digilib.uns.ac.id


KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan segala nikmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “ Isolasi dan Identifikasi Fraksi Teraktif Uji Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)” Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini tidak akan selesai tanpa adanya bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada: 1.

Bapak Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D. selaku Ketua Jurusan Kimia.

2.

Bapak Achmad Ainurofiq, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing I dan Ibu Soerya Dewi Marliyana, M.Si. selaku Dosen Pembimbing II, yang telah meluangkan waktunya dan selalu sabar memberikan arahan dalam membimbing penulis selama menyelesaikan skripsi.

3.

Bapak Patiha, MS selaku Pembimbing Akademik yang telah memberikan saran dan motivasi kepada penulis selama masa studi.

4.

Para laboran di Laboratorium Kimia dan Laboran di Sub Laboratorium Biologi terimakasih atas bantuan dan kerjasamanya dengan baik.

5.

Keluarga Pondok 18 : mbak2q (tanti, nurul, ema, maxi). Terimakasih atas hari-hari bersama yang selalu menyenangkan. “I love you all”. Pondok 18 (new) : ornella, nita, wulan, farida, tia, uun, ayu, grecia..terimakasih atas doa dan dukungannya.

6.

Teman-teman kimia’05. Terimakasih atas bantuan, doa dan dorongannya. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh

sebab itu, saran dan kritik yang membangun sangat diharapkan untuk perbaikan di masa mendatang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan berguna bagi yang membacanya. Surakarta, Maret 2011

commit to user

viii

Rina Septiana Sumadi

ix digilib.uns.ac.id


DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL ............................................................................

i

HALAMAN PENGESAHAN ...............................................................

ii

HALAMAN PERNYATAAN KEASLIAN ..........................................

iii

ABSTRAK .............................................................................................

iv

ABSTRACT ..........................................................................................

v

MOTTO .................................................................................................

vi

HALAMAN PERSEMBAHAN.............................................................

vii

KATA PENGANTAR ...........................................................................

viii

DAFTAR ISI .........................................................................................

x

DAFTAR TABEL .................................................................................

xii

DAFTAR GAMBAR .............................................................................

xiii

DAFTAR LAMPIRAN .........................................................................

xiv

BAB I. PENDAHULUAN ....................................................................

1

A. Latar belakang masalah ......................................................

1

B. Perumusan masalah .............................................................

2

1. Identifikasi masalah ......................................................

2

2. Batasan masalah ...........................................................

3

3. Rumusan masalah .........................................................

4

C. Tujuan Penelitian .................................................................

4

D. Manfaat penelitian ................................................................

5

BAB II. LANDASAN TEORI ...............................................................

6

A. Tinjauan pustaka ...................................................................

6

1. Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)......................

6

a. Klasifikasi tanaman......................................................

6

b. Deskripsi tanaman........................................................

7

c. Kandungan dan manfaat tanaman……………………

7

2. Bakteri..............................................................................

8

a. Definisi………………………………………………...

8

b. Klasifikasi Bakteri………….…...................................... commit to user

8

ix

x digilib.uns.ac.id


c. Bakteri uji……………………………………………….

9

3. Media Pertumbuhan Bakteri..............................................

11

4. Antibakteri..........................................................................

12

5. Senyawa-senyawa metabolisme sekunder yang mempengaruhi aktivitas antibakteri………………………

13

6. Ekstraksi…………………………………………………..

22

7. Kromatografi lapis tipis………………………………….....

23

8. Kromatografi vakum cair (KVC)…………………………..

24

9. GC-MS.…………………………………………………....

25

10. Metode pengujian aktivitas antibakteri……………………

28

11. Konsentrasi Hambat Minimum dan Uji banding………….

30

B. Kerangka Pemikiran...................................................................

31

C. Hipotesis.....................................................................................

32

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN.....................................................

33

A. Metode Penelitian.......................................................................

33

B. Waktu dan tempat penelitian......................................................

33

C. Alat dan bahan............................................................................

33

1. Alat.......................................................................................

33

2. Bahan....................................................................................

34

D. Prosedur penelitian ....................................................................

35

1. Persiapan sampel sirih merah……………………………...

35

2. Ekstraksi maserasi sampel daun sirih merah ......................

35

3. Pengujian golongan senyawa ekstrak etanol.......................

35

4. Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol…………….

37

5. Pemisahan ekstrak etanol………………………………….

38

6. Pengujian aktivitas antibakteri terhadap fraksi-fraksi……

39

7. Pengujian golongan fraksi teraktif antibakteri…………….

39

8. GC-MS…………………………………………………….

39

E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data ...................................

39

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................

41

A. Identifikasi sampel ...................................................................

41

B. Persiapan dan ekstraksicommit sampel ................................................. to user

41

x

xi digilib.uns.ac.id


C. Pengujian golongan senyawa ekstrak etanol……………………

42

D. Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol…………………..

43

E. Pemisahan ekstrak etanol……………………………………..… 45 F. Pengujian aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil pemisahan…..

46

G. Penetapan KHM dan Nilai Banding………………………….…. 48 a. Penetapan KHM fraksi heksana……………………………

48

b. Penetapan KHM amoksisilin……………………………….

49

c. Penetapan nilai banding fraksi heksana……….…………...

51

H. Identifikasi Fraksi Teraktif Antibakteri…………………………

52

a. Skrining fitokimia fraksi heksana……….…………..……..

53

b. Hasil analisis GC-MS………………………………………

54

BAB V. PENUTUP .....................................................................................

62

A. Kesimpulan ................................................................................

62

B. Saran ..........................................................................................

63

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................

64

LAMPIRAN .................................................................................................

68

commit to user

xi

xii digilib.uns.ac.id


DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1.

Klasifikasi terpenoid...................................................................

Tabel 2.

Hasil skrinning fitokimia senyawa kimia ekstrak etanol daun sirih merah..................................................................................

Tabel 3.

Hasil kromatografi vakum cair

57

Fragmentasi senyawa puncak 11 dibandingkan standar germakren D...............................................................................

Tabel 14.

56

Fragmentasi senyawa puncak 10 dibandingkan standar arkurkumen....................................................................................

Tabel 13.

55

Fragmentasi senyawa puncak 6 dibandingkan standar βfarnesen.......................................................................................

Tabel 12.

53

Fragmentasi senyawa puncak 5 dibandingkan standar trans kariofilen.....................................................................................

Tabel 11.

52

Hasil skrining fitokimia senyawa kimia fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)….......….…………

Tabel 10.

51

Hasil penetapan nilai banding fraksi heksana untuk keempat bakteri uji terhadap amoksisilin................................................

Tabel 9.

48

Hasil pengujian penetapan KHM amoksisilin terhadap 4 bakteri uji .................................................................................

Tabel 8.

47

Hasil pengujian penentapan KHM fraksi heksana terhadap 4 bakteri uji....................................................................................

Tabel 7.

46

Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol dan fraksi-fraksi hasil KVC terhadap 4 bakteri......................................................

Tabel 6.

43

ekstrak etanol sirih merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav.).................................................... Tabel 5.

42

Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) ...................................................

Tabel 4.

16

58

Komponen fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) .............................................................................. commit to user

xii

59

xiii digilib.uns.ac.id


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Tanaman sirih merah.............................................................

7

Gambar 2.

Senyawa-senyawa golongan flavonoid.................................

14

Gambar 3.

Struktur senyawa patuloside A.............................................

15

Gambar 4.

Struktur senyawa phytadiene dan 1,2 secocladiellan............

17

Gambar 5.

Struktur smilagenin...............................................................

17

Gambar 6.

Struktur asam glisiretat.........................................................

18

Gambar 7.

Struktur beberapa alkaloid....................................................

19

Gambar 8.

Struktur ramiflorin A dan B..................................................

19

Gambar 9.

Struktur golongan fenolik.....................................................

20

Gambar 10.

Struktur beberapa tanin.........................................................

21

Gambar 11.

Struktur epilogatekin galat....................................................

22

Gambar 12.

Skema alat GC-MS...............................................................

28

Gambar 13.

Kromatogram fraksi heksana daun sirih merah....................

54

Gambar 14.

a. Spektra massa senyawa puncak 5.....................................

55

b. Spektra massa senyawa trans kariofilen...........................

55

a. Spektra massa senyawa puncak 6.....................................

56

b. Spektra massa senyawa β-farnesen...................................

56

a. Spektra massa senyawa puncak 10...................................

57

b. Spektra massa senyawa ar kurkumen...............................

57

a. Spektra massa senyawa puncak 11...................................

58

b. Spektra massa senyawa germakren D...............................

58

Gambar 15.

Gambar 16.

Gambar 17.

Gambar 18.

Gambar 19.

Struktur seskuiterpenoid daun Piper crocatum Ruiz & Pav………………………………………………………….

61

Struktur diterpenoid daun Piper crocatum Ruiz & Pav..…..

61

commit to user

xiii

xiv digilib.uns.ac.id


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Diagram alir prosedur penelitian……………..…….

Lampiran 2.

Hasil determinasi sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)……………………………………………....

Lampiran 3.

Perhitungan

rendemen

ekstrak

73

Hasil pengujian aktivitas antibakteri fraksi-fraksi hasil kromatografi vakum cair………………...…………..

Lampiran 7.

71

Analis one-way anova pengaruh variasi bakteri pada masing-masing konsentrasi ekstrak etanol……….....

Lampiran 6.

70

Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol terhadap 4 bakteri uji……………..…………………

Lampiran 5.

69

etanol

……………….................................................... Lampiran 4.

68

79

Analisa one way-anova pengaruh variasi fraksi pada masing-masing bakteri pada uji aktivitas antibakteri fraksi-fraksi

hasil

kromatografi

vakum

cair………………………………….………………

81

Lampiran 8.

Hasil pengujian penetapan KHM fraksi heksana…...

83

Lampiran 9.

Analisa one way anova pengaruh variasi bakteri pada

.

masing-masing konsentrasi fraksi pada penentuan KHM fraksi heksana……………………………...…

84

Lampiran 10.

Penentuan KHM amoksisilin…….………………….

86

Lampiran 11.

Analisa pengaruh one way anova pengaruh variasi bakteri amoksisilin pada masing-masing konsentrasi pada uji aktivitas antibakteri amoksisilin…….……..

Lampiran 12.

87

Hasil pengujian penentuan nilai banding fraksi heksana terhadap amoksisilin……………………...

90

Lampiran 13.

Hasil skrining fitokimia dengan KLT..........................

97

Lampiran 14.

Analisis GC-MS fraksi heksana daun sirih merah commit to user (Piper crocatum Ruiz & Pav........................................

98

xiv

1 digilib.uns.ac.id


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah Penggunaan tanaman untuk pengobatan telah lama dikenal oleh masyarakat. Usaha pengembangan tanaman untuk pengobatan perlu dilakukan mengingat bahwa tanaman mudah diperoleh dan murah. Tetapi penggunaan tanaman untuk pengobatan perlu ditunjang oleh data-data penelitian dari tanaman tersebut sehingga khasiatnya secara ilmiah tidak diragukan lagi dan dapat dipertanggungjawabkan. Hal ini tentu akan mendorong penggunaan tanaman sebagai obat secara meluas oleh masyarakat (Soemiati, 2002). Sebagian besar simplisia yang digunakan untuk obat tradisional adalah suku Piperaceae. Pada umumnya tanaman yang termasuk suku Piperaceae mengandung senyawa golongan alkaloid, terpenoid, flavonoid, lignin dan minyak atsiri (Sumarni, 1999). Banyak spesies dari suku Piperaceae digunakan sebagai obat tradisional dan menunjukkan fungsi aktivitas antibakteri, antijamur, insektisidal dan antitumor. Tanaman dari suku Piperaceae juga digunakan untuk pengobatan batuk, bronchitis, penyakit pernapasan dan reumatik. Sejumlah senyawa seskuiterpen telah diisolasi dari Piper cubeba (kemukus). Dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa kemukus dapat menghambat penyakit tumor, antileukimia dan aktivitas antibiotik (Bos, 2007). Secara tradisional daun sirih merah dapat digunakan untuk pengobatan berbagai macam penyakit diantaranya obat sakit gigi dan mulut, sariawan, abses rongga mulut, luka bekas cabut gigi, penghilang bau mulut, batuk dan serak, hidung berdarah, keputihan, wasir, tetes mata, gangguan lambung, gatal-gatal, kepala pusing dan jantung berdebar (Sudewo, 2005). Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) mengandung beberapa senyawa aktif, antara lain flavonoid, alkaloid, saponin, polifenolat, tanin, terpenoid dan minyak

atsiri.

Senyawa-senyawa tersebut

memiliki

aktivitas

antibakteri

(Juliantina, 2008). Kandungan kimia lainnya yang terdapat di daun sirih merah commit to user adalah minyak atsiri, hidroksikavikol, kavikol, kavibetol, allilprokatekol,

1

2 digilib.uns.ac.id


karvakrol, eugenol, p-cimene, sineol, kariofelen, kadimen estragol, terpenena dan fenil propana (Manoi, 2007). Banyak obat telah digunakan untuk melawan infeksi bakteri dan penelitian masih berlangsung sampai sekarang. Beberapa penelitian uji aktivitas antibakteri ekstrak tanaman pada tumbuhan telah banyak dilakukan. Ekstrak etanol sirih merah mempunyai kemampuan antibakteri bakteri gram positif dan bakteri gram negatif khususnya terhadap Staphylococcus aureus dengan KHM 25 % dan Eschericia coli dengan KHM 6,25 % (Juliantina, 2008). Ekstrak heksana dan petroleum eter buah tanaman Piper sp mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Eschericia coli dan Pseudomonas pseudomallei pada konsentrasi 25% (Sumarni, 1999). Minyak atsiri daun sirih merah mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Bacillus cereus dengan KHM 1% serta terhadap Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa dengan KHM sebesar 0,75% (Ngaisah, 2010). Berdasarkan informasi kandungan kimia sirih merah di atas, sirih merah mengandung golongan senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri. Adapun penelitian yang dilakukan ini untuk mengisolasi dan mengidentifikasi komponen kimia yang terdapat dalam ekstrak daun sirih merah, kemudian menguji aktivitasnya sebagai antibakteri terhadap bakteri yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa sehingga nantinya diketahui senyawa aktif antibakteri apa saja yang ada di dalam ekstrak daun sirih merah. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang pemanfaatan tanaman berkhasiat obat yaitu tanaman sirih merah.

B. Perumusan Masalah 1. Identifikasi Masalah Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) mempunyai kandungan kimia yang berbeda pada tiap bagiannya. Bagian yang biasa digunakan sebagai bahan obat adalah daunnya. Selain itu tempat pengambilan tanaman daun sirih merah juga sangat mempengaruhi kandungan kimia di dalamnya. commit to user

3 digilib.uns.ac.id


Isolasi komponen kimia dari suatu bahan alam dapat dilakukan dengan metode ekstraksi, destilasi dan kromatografi. Pada tiap metode menggunakan berbagai macam pelarut menurut kebutuhan. Pelarut yang digunakan untuk isolasi perlu diperhatikan sebagai contoh senyawa yang kurang polar dapat diisolasi dengan menggunakan pelarut heksana, petroleum eter, benzene dan toluen dan senyawa yang lebih polar dapat diperoleh dengan pelarut etil asetat, butanol, metanol, dan air. Hasil isolasi dengan pelarut yang berbeda akan menghasilkan ekstrak dengan senyawa yang berbeda sehingga akan mempengaruhi aktivitas antibakteri dari ekstrak. Dari hal diatas perlu diperhatikan cara isolasi senyawa daun sirih merah dengan pelarut yang tepat. Senyawa-senyawa antibakteri biasanya dapat diisolasi dengan pelarut organik polar yaitu metanol atau etanol. Sirih merah mengandung berbagai macam komponen senyawa kimia sehingga diperlukan suatu metode yang tepat untuk mengidentifikasi senyawa kimia tersebut. Identifikasi komponen kimia dalam bahan alam dapat dilakukan dengan berbagai metode seperti Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer Chromatography), Kromatografi Gas (Gas Chromatography), Kromatografi GasSpektrofotometer Massa (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). Pengujian aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan menggunakan metode difusi dan dilusi. Pada metode difusi dapat dilakukan dengan difusi agar yaitu dengan menggunakan lubang (perforasi) dan gores silang. Pemilihan metode pengujian aktivitas antibakteri harus tepat dan disesuaikan dengan jenis bakteri yang diuji. Jenis bakteri yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri adalah bakteri patogen. Beberapa bakteri patogen yang dapat digunakan adalah Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa.

2. Batasan Masalah Berdasarkan identifikasi masalah tersebut maka dibuat batasan masalah sebagi berikut: a.

Daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) didapat dari daerah Magelang commit to user air laut. dengan ketinggian 500 m di atas permukaan

4 digilib.uns.ac.id


b.

Isolasi ekstrak polar daun sirih merah dari daerah Magelang dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol dilanjutkan dengan ekstraksi partisi menggunakan pelarut heksana kemudian dilanjutkan dengan pemisahan dengan Kromatografi Vakum Cair (KVC) menggunakan pelarut secara berurutan yaitu heksana, etil asetat, dan etanol.

c.

Identifikasi komponen senyawa kimia daun sirih merah dari fraksi hasil pemisahan yang aktif antibakteri dilakukan dengan menggunakan analisis skrining fitokimia dan analisis data GC-MS.

d.

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan terhadap empat bakteri patogen, yaitu bakteri gram positif: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, dan bakteri gram negatif: Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa.

3. Rumusan Masalah Rumusan masalah penelitian ini adalah sebagai berikut: a.

Apakah ekstrak etanol dan fraksi hasil pemisahan mempunyai aktivitas antibakteri?

b.

Komponen senyawa kimia apa sajakah yang terkandung dalam ekstrak etanol dan fraksi hasil pemisahan yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi pada empat bakteri uji?

c.

Bagaimanakah potensi fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dilihat dari nilai uji bandingnya terhadap pembanding amoksisilin?

C. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah: a.

Mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol dan fraksi hasil pemisahan daun sirih merah.

b.

Mengetahui komponen senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak etanol dan fraksi hasil pemisahan yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi.

c.

Mengetahui potensi fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dibandingkan dengan amoksisilin dilihat dari nilai uji bandingnya. commit to user

5 digilib.uns.ac.id


D. Manfaat Penelitian Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah: a.

Dapat memberikan informasi mengenai komposisi kimia daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang aktif antibakteri sebagai salah satu tanaman obat.

b.

Dapat memberikan sumbangan tentang manfaat daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) dan membuka kemungkinan pembudidayaan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) sebagai sumber obat yang dapat digunakan sebagai obat alternatif dalam pengobatan moderen.

commit to user

6 digilib.uns.ac.id


BAB II LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka 1. Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Sirih merah adalah salah satu tanaman obat potensial yang diketahui secara empiris memiliki khasiat untuk menyembuhkan berbagai jenis penyakit dan memiliki nilai spiritual tinggi. Sirih merah termasuk dalam satu elemen penting yang harus disediakan dalam setiap upacara adat, khususnya Yogyakarta (Juliantina, 2008). a. Klasifikasi Tanaman Tanaman sirih merah merupakan famili Piperaceae. Kedudukan tanaman sirih merah dalam taksonomi tumbuhan adalah sebagai berikut: Kingdom

: Plantae

Sub Kingdom

: Tracheobionta

Super Divisio

: Spermatophyta

Divisio

: Magnoliophyta

Kelas

: Magnoliopsida

Sub Kelas

: Magnolidae

Ordo

: Piperales

Familia

: Piperaceae

Genus

: Piper

Species

: Piper crocatum Ruiz & Pav.

(www.plantamor.com) b. Deskripsi Tanaman Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) termasuk dalam famili Piperaceae. Sirih merah merupakan tanaman merambat yang berbatang bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung hati dan bagian ujung daun meruncing. Daun tumbuh berselang-seling dari batangnya, dan daun berwarna merah keperakan dengan permukaan daun commit to user dengan sirih hijau adalah selain mengkilap dan tidak merata. Yang membedakan

6

7 digilib.uns.ac.id


daunnya berwarna merah keperakan, bila daunnya disobek maka akan berlendir serta aromanya lebih wangi (Manoi, 2007). Tanaman sirih merah menyukai tempat teduh, berhawa sejuk dengan sinar matahari 60-75%, sehingga dapat tumbuh subur dan bagus di daerah pegunungan. Bila tumbuh pada daerah panas, sinar matahari langsung, batangnya cepat mengering. Selain itu, warna merah daunnya akan pudar (Juliantina, 2008). Tanaman sirih merah dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Tanaman Sirih Merah

c. Kandungan dan Manfaat Tanaman Dalam daun sirih merah terkandung senyawa fitokimia yakni alkaloid, saponin, polifenolat, tanin dan flavonoid. Kandungan kimia lainnya yang terdapat di daun sirih merah adalah minyak atsiri, hidroksikavikol, kavikol, kavibetol, allilprokatekol, karvakrol, eugenol, p-cimene, sineol, kariofelen, kadimen estragol, terpenena dan fenil propada. Karena banyaknya kandungan zat atau senyawa kimia bermanfaat inilah, daun sirih merah memiliki manfaat yang sangat luas sebagai bahan obat. Karvakrol bersifat desinfektan, anti jamur, sehingga bisa digunakan untuk obat antiseptik pada bau mulut dan keputihan. Eugenol dapat digunakan untuk userdigunakan untuk mengobati sakit mengurangi rasa sakit, sedangkancommit tanin to dapat

8 digilib.uns.ac.id


perut. Banyak pengalaman bahwa menggunakan sirih merah dalam bentuk segar, simplisia maupun ekstrak kapsul dapat menyembuhkan penyakit diabetes melitus, hepatitis, batu ginjal, menurunkan kolesterol, mencegah stroke, asam urat, hipertensi, radang liver, radang prostat, radang mata, keputihan, maag, kelelahan, nyeri sendi dan memperhalus kulit (Sudewo, 2005).

2. Bakteri a. Definisi Bakteri merupakan mikroba prokariotik uniseluler, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Berdasarkan komposisi dan struktur dinding sel, maka bakteri dibagi ke dalam dua golongan yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam teikoat yang mengandung alkohol. Ada dua asam teikoat, yaitu asam lipoteikoat yang merentang di lapisan peptidiglikon dan terikat pada membran plasma dan asam teikoat dinding yang terikat pada lapisan peptidiglikon. Sedangkan dinding sel bakteri gram negatif mengandung satu atau beberapa lapis peptidoglikan dan membaran luar (outer membrane). Peptidoglikan terikat pada membran luar dan periplasma terdapat diantara membran plasma dan membran luar (Pratiwi, 2008). Beberapa bakteri gram negatif adalah Enterobacter cloacae, Legionella pneumophila, catarrhalis,

Proteus

mirabilis,

Haemophilus

Pseudomonas

parainfluenzae,

aeruginosa,

Escherichia

coli,

Moraxella Klebsiella

pneumoniae, sedangkan bakteri gram positif adalah Enterococcus faecalis, Bacillus

subtilis,

Staphylococcus

aureus,

Streptococcus

pneumoniae,

Streptococcus pyogenes. b. Klasifikasi bakteri Berdasarkan bentuknya bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu: 1) Kokus (Coccus) adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola dan mempunyai beberapa variasi antara lain Mikrococcus, Diplococcus dan commit to user Tetracoccus.

9 digilib.uns.ac.id


2) Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder dan mempunyai variasi antara lain Diplobacillus dan Streptobacillus. 3) Spiril (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi yaitu Vibrio dan Spiral. (Pratiwi, 2008) c. Bakteri uji 1)

Staphylococcus auerus Klasifikasi Staphylococcus auerus adalah sebagai berikut: Divisi

: Protophyta

Kelas

: Schizomycetes

Bangsa

: Eubacteryales

Suku

: Mycrococcaceae

Marga

: Staphylococcus

Jenis

: Staphylococcus aureus (Salle, 1961)

Staphylococus aureus merupakan bakteri gram positif yang berasal dari genus Staphylococcus. Staphylococcus aureus merupakan agen infeksi yang dapat menyerang setiap jaringan dan organ tubuh. Timbulnya penyakit dengan tanda-tanda yang khas yaitu peradangan, nekrosis dan pembentukan abses. 2)

Bacillus cereus Klasifikasi Bacillus cereus adalah sebagai berikut: Kingdom

: Bacteria

Fillum

: Firmicutes

Kelas

: Bacilli

Order

: Bacillales

Famili

: Bacillaceae

Genus

: Bacillus

Spesies

: Bacillus cereus commit to user

10 digilib.uns.ac.id


Bacillus cereus merupakan bakteri gram-positif, aerob fakultatif, dan dapat membentuk spora. Selnya berbentuk batang besar dan sporanya tidak membengkakkan sporangiumnya. Bacillus cereus dapat tumbuh dalam makanan dan menghasilkan enterotoksin yang menyebabkan keracunan makanan. Bakteri ini juga merupakan penyebab infeksi mata, keratis berat, endoftalmitis dan panoftalmitis (Jawetz, et al, 2005). 3)

Escherichia coli Klasifikasi Escherichia coli adalah sebagai berikut: Divisi

: Protophyta

Subdivisi

: Schizomycetea

Kelas

: Schizomycetes

Bangsa

: Eubacteriales

Suku

: Enterobacteriaceae

Marga

: Escherichia

Jenis

: Escherichia coli

Escherichia coli adalah bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek, berderet seperti rantai, dapat memfermentasi glukosa dan laktosa membentuk asam dan gas (Pelczar dan Chan, 1998). Bakteri ini dapat menyebabkan penyakit seperti diare, infeksi saluran kemih, pneumonia, meningitis pada bayi yang baru lahir dan infeksi luka (Jawetz, et al, 2005). 4)

Pseudomonas aeroginosa Klasifikasi pseudomonas aeruginosa adalah sebagai berikut: Kingdom

: Bacteria

Fillum

: Proteobacteria

Kelas

: Gamma Proteobacteria

Order

: Pseudomonadales

Famili

: Pseudomonadaceae

Marga

: Pseudomonas

Spesies

: Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif yang commit to user berbentuk batang, berukuran sekitar 0,6 x 2 µ. Bakteri ini terlihat sebagai



bakteri tunggal, berpasangan dan kadang-kadang membentuk rantai yang pendek, tidak mempunyai spora, tidak mempunyai selubung serta mempunyai flagel monotrik (flagel tunggal pada kutub) sehingga selalu bergerak (Mayasari, 2005). Bakteri ini bersifat oksidase positif dan tidak meragikan karbohidrat. Tetapi banyak strain yang mengoksidasi glukosa. Pengenalan biasanya berdasarkan morfologi, sifat oksidase positif, adanya pigmen yang khas dan pertumbuhan pada suhu 42°C. Untuk membedakan P. aeruginosa dari Pseudomonas yang lain berdasarkan pada aktivitas biokimiawinya yang membutuhkan berbagai substrat (Jawetz et al., 2005). Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri patogen oportunistik, yaitu memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi. Bakteri ini dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, infeksi saluran pernapasan, dermatitis, infeksi jaringan lunak, bakteremia, infeksi tulang dan sendi, infeksi saluran pencernaan dan bermacam-macam infeksi sistemik, terutama pada penderita luka bakar berat, kanker dan penderita AIDS yang mengalami penurunan sistem imun (Mayasari, 2005). Pseudomonas aeruginosa lebih resisten terhadap disinfektan dari pada kuman lain. Kebanyakan antibiotik dan antimikroba tidak efektif terhadap kuman ini. Fenol dan β-glutaradelhid biasanya merupakan disinfektan yang efektif. Selain itu, air mendidih juga dapat membunuh kuman ini (Syahruracman et al., 1994).

3. Media Pertumbuhan Bakteri Media adalah bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Selain untuk menumbuhkan mikroba, media dapat digunakan untuk mengisolasi mikroba, memperbanyak mikroba, pengujian sifatsifat fisiologi mikroba dan perhitungan jumlah populasi mikroba. Pembuatan media harus memenuhi syarat antara lain harus steril, commit to user mikroba, mempunyai tekanan mengandung semua nutrisi yang diperlukan



osmosa, tekanan permukaan, dan pH yang sesuai. Berdasarkan keadaan isi, media dapat dibedakan menjadi dua, yaitu: a. Media basal Media ini digunakan sebagai bahan dasar untuk membuat media lain yang lebih komplek. Media basal dibedakan menjadi 2, yaitu: 1) Media basal padat: kaldu agar, TSA (Tryptone Soya Agar). 2) Media basal cair: air peton, kaldu pepton, NA (Nutrien Agar). Komposisi dari Nutrien Agar adalah ekstrak beef, pepton, agar, NaCl, air desitilat dan berada pada PH 6,8-7,0. b. Media campuran Media campuran adalah media selain media basal juga ditambahkan berbagai macam zat baik organik maupun anorganik sesuai dengan kebutuhan bakteri.

4. Antibakteri Antibakteri adalah zat yang membunuh atau menekan pertumbuhan atau reproduksi bakteri (Dorland, 2002). Secara umum, mekanisme kerja antimikroba dapat dibagi menjadi lima cara, yaitu: a. Denaturasi protein Struktur protein dalam keadaan tiga dimensi ditentukan oleh ikatan disulfida kovalen intramolekuler dan sejumlah ikatan hidrogen. Keadaan ini mudah terganggu oleh sejumlah unsur fisik atau kimia sehingga protein mengalami denaturasi. b. Gangguan selaput atau dinding sel Selaput sel berguna sebagai penghalang yang selektif meloloskan zat terlarut lain. Konsentrasi beberapa zat yang diangkut secara aktif melalui sel menjadi tinggi dalam sel. Zat-zat yang terkonsentrasi pada permukaaan mungkin merubah sifat-sifat fisik normalnya serta membasmi dan menghambat sel. Dinding sel sebagai struktur pemberi bentuk pada sel, melindungi terhadap lisis osmotik. Dengan demikian, bila ada unsur yang merusak dinding sel atau menghalangi sintesis normalnya akan menyebabkan lisis sel. commit to user



c. Pemindahan gugus sulfihidril bebas Protein-protein enzim yang mengandung sistein memiliki rantai samping yang berakhir dalam gugus sulfihidril. Enzim yang terpenting terdiri dari gugus sulfhidril bebas seperti koenzim A memerlukan sulfihidril untuk pemindahan gugus etil. Enzim dan koenzin tidak dapat berfungsi kecuali jika gugus sulfihidril dalam keadaan bebas dan dalam bentuk tereduksi. Zat pengoksidasi mengganggu metabolisme dengan mengikat sulfihidril yang berdekatan dengan ikatan disulfida. d. Antagonis kimiawi Antagonis kimiawi adalah bahan kimia yang menggunakan reaksi normal antar enzim spesifik dengan menggabungkan bagian-bagian holoenzim yang dapat mencegah pertambahan hasil metabolisme secara normal. Beberapa holoenzim memasukkan salah satu mineral sebagai jembatan antar enzim dan substrat. Bahan atau senyawa kimia yang bergabung dalam mineral-mineral ini akan mencegah penambahan enzim atau substrat lagi. e. Degradasi DNA Sejumlah unsur antimikroba bekerja dengan merusak DNA. Unsur ini meliputi radiasi pengion, sinar UV dan zat kimia reaktif DNA. Kerusakan DNA yang ditimbulkan karena penyinaran atau secara kimiawi akan mematikan sel terutama karena mengganggu replikasi DNA. (Jawetz, et al, 2005)

5. Senyawa-Senyawa Metabolisme Sekunder yang Mempunyai Aktivitas Antibakteri Senyawa-senyawa metabolisme sekunder yang mempunyai aktivitas antibakteri, antara lain: a. Flavonoid Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar yang ditemukan di alam (Kristanti, 2008). Dalam tumbuhan flavonoid pada umumnya merupakan pigmen-pigmen yang tersebar luas dalam bentuk senyawa glikon dan aglikon. Flavonoid-flavonoid yang terdapat di alam antara lain adalah flavon, commit user (Rusdi, 1988). isoflavon, antosianin, leuko-antosianin dantokalkon



Sifat fisika dan kimia senyawa flavonoid antara lain adalah larut dalam air, sedangkan dalam bentuk glikosida yang termetilasi larut dalam eter. Sebagai glikosida maupun aglikon, senyawa flavonoid tidak dapat larut dalam petroleum eter. Dari tumbuhan, glikosida dapat ditarik dengan pelarut organik yang bersifat polar (Rusdi, 1988). Flavonoid memiliki kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon dan digambarkan sebagai deretan senyawa C6-C3-C6. Artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 yang dihubungkan dengan rantai alifatik tigakarbon. Susunan ini dapat menghasilkan tiga jenis struktur, yaitu 1, 3-diarilpropan atau neoflavonoid, 1, 2-diarilpropan atau isoflavon, dan 1, 1-diarilpropan atau neoflavonoid. Contoh golongan senyawa flavonoid dapat dilihat pada Gambar 2.

O

O

OH

flavan

flavonol (katecin)

O O

OH O O

flavanonol

flavon

Gambar 2. Senyawa–senyawa golongan flavonoid (Kristanti, 2008)

Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, dan biru, serta sebagian zat warna kuning yang terdapat dalam tanaman. Sebagai pigmen bunga, flavonoid jelas berperan dalam menarik serangga untuk membantu proses penyerbukan. Beberapa kemungkinan fungsi flavonoid yang lain bagi tumbuhan adalah sebagai zat pengatur tumbuh, pengatur proses fotosintesis, sebagai zat antimikroba, antivirus dan antiinsektisida. Beberapa flavonoid sengaja dihasilkan commit to user jaringan tumbuhan sebagai respon terhadap infeksi atau luka yang kemudian



berfungsi menghambat fungi penyerangnya. Telah banyak flavonoid yang diketahui memberikan efek samping fisiologi tertentu. Oleh karena itu, tumbuhan yang mengandung flavonoid banyak dipakai dalam pengobatan tradisional (Kristanti, 2008). Patuloside A adalah senyawa glikosida xanton yang diisolasi dari tanaman famili Piperaceae yaitu Peperomia pellucid. Patuloside A mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram positif maupun gram negatif, dimana penghambatan terhadap bakteri gram positif lebih baik dibandingkan dengan penghambatan terhadap bakteri gram negatif (Khan, 2010). Struktur kimia patuloside A dapat dilihat pada Gambar 3.

O

OH

O

OH

CH2OH OH

O O

H H OH

H H

OH H

OH

Gambar 3. Struktur senyawa Patuloside A (Khan, 2010)

b. Terpenoid Terpenoid adalah kelompok senyawa metabolit sekunder yang terbesar dilihat dari jumlah senyawa maupun variasi kerangka dasar strukturnya. Terpenoid ditemukan berlimpah dalam tanaman tingkat tinggi, meskipun demikian, dari penelitian diketahui bahwa jamur, organisme laut, dan serangga juga menghasilkan terpenoid. Selain dalam bentuk bebasnya, terpenoid di dalam juga dijumpai dalam bentuk glikosida, glikosil ester dan iridoid. Terpenoid juga merupakan komponen utama penyusun minyak atsiri (Kristanti, 2008). Terpenoid adalah senyawa yang mengandung karbon dan hidrogen, atau commit to user karbon, hidrogen dan oksigen yang tidak bersifat aromatis. Terpenoid merupakan



senyawa-senyawa yang mudah menguap terdiri dari 10 atom C dan penyusun minyak atsiri (Achmad, 1986). Senyawa terpenoid tersusun atas karbon-karbon dengan jumlah kelipatan atom lima. Diketahui juga bahwa sebagian besar terpenoid mempunyai kerangka karbon yang dibangun oleh dua atau lebih unit C5 yang disebut unit isoprene (Kristanti, 2008). Senyawa terpenoid terdiri atas beberapa unit isoprene, mempunyai struktur siklik dengan satu atau lebih gugus fungsional berupa gugus hidroksil dan gugus karbonil (Rusdi, 1988). Klasifikasi terpenoid dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Klasifikasi Terpenoid Kelompok Terpenoid Monoterpen Seskuiterpen Diterpen Triterpen Tetraterpen Politerpen

Jumlah atom C 10 15 20 30 40 >40 (Kristanti, 2008)

Secara kimia terpenoid larut dalam lemak dan terdapat di dalam sitoplasma sel tumbuhan. Biasanya terpenoid diekstrasi dari jaringan tumbuhan dengan memakai eter atau kloroform, dan dapat dipisahkan secara kromatografi pada silika gel atau alumina menggunakan pelarut eter atau kloroform (Harborne, 1996). Kebanyakan peneliti berpendapat bahwa fungsi terpenoid rendah dalam tumbuhan, lebih bersifat ekologi daripada fisiologi. Banyak senyawa ini yang menghambat pertumbuhan tumbuhan pesaingnya dan dapat bekerja sebagai insektisida atau berdaya racun terhadap hewan tinggi (Robinson, 1991). Penelitian Gunawan (2007) terpenoid yang diisolasi dari herba meniran (Phyllanthus niruri Linn), yaitu jenis phytadiene dan 1,2-seco cladiellan menunjukkan penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri S. aureus dan E.coli. Struktur kimia phytadiene dan 1, 2-seco cladiellan dapat dilihat pada Gambar 4. commit to user



(i) OCH3

OH

O O

(ii) Gambar 4. Struktur senyawa (i) phytadiene dan (ii) 1, 2-seco-cladiellan (Gunawan, 2007)

c. Saponin Saponin adalah senyawa aktif permukaan yang menimbulkan busa jika dikocok dalam air dan pada konsentrasi yang rendah sering menyebabkan hemolisis sel darah merah. Dalam larutan yang sangat encer, saponin sangat beracun untuk ikan, dan tumbuhan yang mengandung saponin telah digunakan sebagai racun ikan selama beratus-ratus tahun. Beberapa saponin juga bekerja sebagai antimikroba (Padmawinata, 1995). Contoh senyawa saponin yang dapat bertindak sebagai antibakteri adalah smilagenin. Adapun strukturnya dapat dilihat pada Gambar 5.

O O

OH

Gambar 5. Struktur smilagenin commit to user



Saponin dapat dibedakan menjadi dua jenis yaitu glikosida triterpenoid dan glikosida struktur steroid tertentu yang mempunyai rantai samping spiroketal. Kedua jenis saponin ini larut dalam air dan etanol tetapi tidak larut dalam eter. Contoh senyawa yang termasuk saponin adalah asam glisiretat. Adapun strukturnya dapat dilihat pada Gambar 6. Saponin mempunyai bagian utama berupa turunan triterpen dengan sedikit steroid. Residu gula dihubungkan oleh satu gugus –OH biasanya C3-OH dari aglikon (monodesmoside saponin) dan jarang dengan dua gugus OH atau satu gugus –OH dan gugus karboksil (bis-desmiside saponin) (Wagner, 1983). COOH

O

OH

Gambar 6. Struktur asam glisiretat (Padmawinata, 1995)

d. Alkaloid Alkaloid adalah suatu golongan senyawa organik yang terbanyak ditemukan di alam. Hampir seluruh alkaloid berasal dari tumbuh-tumbuhan dan tersebar luas dalam berbagai jenis tumbuhan. Ciri khas alkaloid adalah bahwa semua alkaloid mengandung paling sedikit satu atom N yang bersifat basa dan pada umumnya merupakan bagian dari cincin heterosiklik. Alkaloid dapat ditemukan dalam berbagai bagian tumbuhan, tetapi sering kali kadar alkaloid kurang dari 1% (Kristanti, 2008). Senyawa alkaloid diklasifikasikan menurut jenis cincin heterosiklik nitrogen yang merupakan bagian dari struktur molekul. Menurut klasifikasi ini, alkaloid dapat dibedakan atas beberapa jenis, seperti alkaloid piridin, pirolidin, indol, piperidin, kuinolin dan isokuinolin (Kristanti, 2008). Struktur dari senyawacommit to user senyawa tersebut dapat dilihat pada Gambar 7.



N H

N H

Pirolidin

N

Piridin

Piperidin

N

N

N

H

isokuinolin

kuinolin

indol

Gambar 7. Struktur beberapa alkaloid (Kristanti, 2008)

Semua alkaloid mengandung paling sedikit satu atom nitrogen yang biasanya bersifat basa dan dalam sebagian besar atom nitrogen ini merupakan cincin aromatis (Achmad, 1986). Berdasarkan penyusun asam aminonya alkaloid dibedakan menjadi alkaloid asiklis yang berasal dari asam amino ornitin dan lisin. Alkaloid aromatis jenis fenilalanin berasal dari fenilalanin, tirosin dan 3, 4dihidroksifenilalanin (Achmad, 1986). Salah satu senyawa alkaloid yang aktif antibakteri adalah ramiflorin A dan ramiflorin B. Struktur ramiflorin A dan B dapat dilihat pada Gambar 8.

H3CO N

N H H H

HN

H17

H N

H-17α, ramiflorin A H-17β, ramiflorin B

Gambar 8. Struktur ramiflorin A dan ramiflorin B (Tanaka, 2006) commit to user



e. Senyawa fenol Senyawa-senyawa fenol yang terdapat dalam tumbuhan dapat merupakan senyawa monohidroksi atau polihidroksi fenolik. Terikat sebagai senyawa glikosida dimana terikat dengan protein, alkaloid atau terdapat sebagai senyawa terpenoida. Senyawa ini pada proses ekstraksi akan dapat ditemukan dalam fraksi air ataupun dalam fraksi pelarut-pelarut polar lainnya. Jika murni, senyawa fenol berupa zat padat tak berwarna tetapi biasanya teroksidasi dan berwarna gelap jika terkena udara. Kelarutan dalam air bertambah jika gugus hidroksil makin banyak, tetapi kelarutan dalam pelarut organik yang polar umumnya tinggi. Fenol yang kelarutannya dalam air kecil mudah larut dalam natrium hidroksida encer, tetapi dalam suasana basa laju oksidasi sangat meningkat, sehingga pada setiap perlakuan penggunaan basa kuat dihindari (Padmawinata, 1995). Senyawa fenolik mempunyai aktivitas antiinflamasi, karena senyawa ini menghambat sintesis prostaglandin (Padmawinata, 1995). Tingkatan gugus fungsi hidroksil

pada

golongan

fenol

berhubungan

dengan

toksisitas

pada

mikroorganisme, dengan bukti bahwa bertambahnya hidroksilasi menghasilkan penambahan toksisitas. Semakin tinggi fenol teroksidasi semakin kuat menghambat pertumbuhan organisme. Mekanisme yang berhubungan dengan toksisitas fenol terhadap mikroorganisme adalah penghambatan enzim oleh senyawa teroksidasi kemungkinan lewat reaksi dengan gugus sulfihidril atau dengan interaksi yang tidak spesifik oleh protein (Cowan, 1999). Contoh struktur senyawa fenol dapat dilihat pada Gambar 9. H

OH

COOH

Asam Benzoat

COOH

Asam Salisilat

Gambar 9. Senyawa-senyawa golongan fenol (Padmawinata, 1995) commit to user



f. Tanin Tanin merupakan senyawa kimia komplek, terdiri dari beberapa senyawa polifenol. Tanin tersebar luas pada seluruh bagian tumbuhan, terutama pada daun, buah yang belum masak dan kulit kayu. Tanin berbentuk amorf dan tidak dapat dikristalkan. Dalam air membentuk larutan kolodial, bereaksi asam dan mempunyai rasa sepat (Rusdi, 1988). Berta molekul tanin antara 500 sampai 28000 dan ditemukan pada bagian tanaman kuncup, batang, daun, buah dan akar (Cowan, 1999). Tanin dibagi menjadi dua yaitu tanin terkondensasi dengan berat molekul besar (1900-28000) dan tanin terhidrolisis yang mempunyai berat molekul rendah (500-3000) (Padmawinata, 1995). Contoh senyawa tanin dapat dilihat pada Gambar 10. OH

HO

O

OH OH

OH

OH

OH

O

CHOH

OH CHOH

OH

katekin/epikatekin OH

OH

Leukoantosianin

Gambar 10. Struktur beberapa tanin (Cowan, 1999)

Contoh senyawa tanin yang mempunyai aktivitas antibakteri antara lain katekin dan epigalotekin galat. Kedua senyawa ini diisolasi dari daun teh hijau (Camellia sinensis) dan dapat menghambat pertumbuhan bakteri H. pylori dan E. coli (Funatogawa et al., 2004)). Struktur epigalotekin galat dapat dilihat pada Gambar 11.

commit to user



OH OH

HO

O OH

HO

OH

OCO

OH

OH OH

Gambar 11. Struktur epigalotekin galat (Funatogawa et al, 2004)

6. Ekstraksi Ekstraksi merupakan salah satu metode pemisahan kimia berdasarkan atas kelarutan komponen dengan pelarut yang digunakan. Ekstraksi pada padatan digunakan untuk memisahkan senyawa hasil alam dari jaringan kering tumbuhan, nikroorganisme dan hewan. Metode ekstraksi yang tepat ditentukan oleh tekstur, kandungan air bahan-bahan yang akan diekstrak dan senyawa-senyawa yang akan diisolasi. Jika substansi yang akan diekstrak terdapat di dalam campurannya yang berbentuk padat, maka dilakukan proses ekstraksi padat-cair (Rusdi, 1988). Maserasi merupakan contoh metode ekstraksi padat-cair bertahap yang dilakukan dengan jalan membiarkan padatan terendam dalam suatu pelarut. Proses perendaman dalam usaha mengekstraksi suatu substansi dari bahan alam ini bisa dilakukan tanpa pemanasan (temperatur kamar), dengan pemanasan atau bahkan pada suhu pendidihan. Salah satu keuntungan metode maserasi adalah cepat, terutama jika maserasi dilakukan pada suhu didih pelarut. Waktu rendam bahan dalam pelarut bervariasi antara 15-30 menit tetapi terkadang bisa sampai 24 jam. Jumlah pelarut yang diperlukan juga cukup besar, berkisar antara 10-20 kali jumlah sampel (Kristanti, 2008). Ekstraksi biasanya dimulai dengan menggunakan pelarut organik secara berurutan dengan kepolaran yang semakin meningkat. Digunakan pelarut heksana, eter, petroleum eter atau kloroform untuk mengambil senyawa yang kepolarannya rendah. Selanjutnya digunakan pelarut lebih polar seperti alkohol dan etil commityang to user



asetat untuk mengambil senyawa-senyawa yang lebih polar. Pemilihan pelarut berdasarkan kaidah “like dissolve like“, yang berarti suatu senyawa polar akan larut dalam pelarut polar dan juga sebaliknya, senyawa non polar akan larut dalam pelarut non polar. Pada proses maserasi, jika dilakukan dengan pelarut air, maka diperlukan proses ekstraksi lebih lanjut, yaitu ekstraksi fasa air yang diperoleh dengan pelarut organik (Padmawinata, 1995). Jika maserasi dilakukan dengan pelarut organik maka filtrat hasil ekstraksi dikumpulkan menjadi satu kemudian dievaporasi atau didestilasi. Selanjutnya dapat dilakukan proses pemisahan dengan kromatografi atau rekristalisasi langsung (Kristanti, 2008).

7. Kromatografi Lapis tipis Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen dalam suatu sampel dimana komponen tersebut didistribusikan di antara dua fasa yaitu fasa gerak dan fasa diam. Fasa gerak adalah fasa yang membawa cuplikan, sedangkan fasa diam adalah fasa yang menahan cuplikan secara efektif (Sastrohamidjojo, 2004). Ditinjau secara fisik, kromatografi lapis tipis merupakan salah satu jenis kromatografi planar. KLT memiliki banyak kesamaan dengan kromatografi kertas dalam penotolan sampel, pengembangan kromatogram dan cara deteksinya, tapi proses pemisahan yang terjadi pada KLT dan kromatografi kertas berbeda. Pada KLT, pemisahan yang terjadi secara adsorpsi sedangkan dalam kromatografi kertas proses pemisahan terjadi secara partisi. Fase diam dalam KLT berupa padatan penyerap yang dihasilkan pada sebuah plat datar dari gelas, plastik atau alumina sehingga membentuk lapisan tipis dengan ketebalan tertentu. Fase diam atau penyerap yang bisa digunakan sebagai pelapis plat adalah silika gel (SiO2), selulosa, alumina (Al2O3) dan kieselgur (tanah diatome). Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel, dimana telah tersedia plat yang siap pakai (Stahl, 1985). Pelarut sebagai fasa gerak atau eluen merupakan faktor yang menentukan gerakan komponen-komponen dalam campuran. Pemilihan pelarut tergantung commit to user pelarut yang digunakan. Fasa pada sifat kelarutan komponen tersebut terhadap



gerak yang bersifat lebih polar digunakan untuk mengelusi senyawa-senyawa yang adsorbsinya kuat, sedangkan fasa gerak yang kurang polar digunakan untuk mengelusi senyawa yang adsorbsinya lemah (Sastrohamidjojo, 2004). Analisis suatu senyawa dalam KLT biasanya dilakukan dengan dibandingkan terhadap senyawa standarnya. Pengamatan yang lazim berdasarkan pada kedudukan noda relatif terhadap batas pelarut yang dikenal sebagai Rf (Retardation factor) yang didefinisikan sebagai berikut :

Rf = Jarak komponen yang bergerak Jarak pelarut yang bergerak

Identifikasi senyawa pada kromatogram dapat dilakukan dengan melihat warna noda di bawah sinar UV atau dengan menyemprotkan pereaksi warna sesuai dengan jenis atau kelas senyawa yang dianalisis (Stahl, 1985).

8. Kromatografi Vakum Cair (KVC) Kromatografi vakum cair merupakan salah satu kromatografi kolom khusus yang biasanya juga menggunakan silika gel sebagai adsorben (silika gel G60 62-200 µm). Alat yang digunakan adalah corong Buchner atau pompa vakum dengan diameter yang cukup besar untuk mempercepat laju alir fasa gerak selama proses pemindahan zat terlarut. Pada kromatografi vakum cair, fraksi-fraksi yang ditampung biasanya bervolume jauh lebih besar dibandingkan dengan fraksifraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom biasa (Kristanti, 2008). Prinsip kerja dari Kromatografi Vakum Cair (KVC) adalah adsorpsi atau serapan, sedangkan pemisahannya didasarkan pada senyawa-senyawa yang akan dipisahkan terdistribusi di antara fasa diam dan fasa gerak dalam perbandingan yang berbeda-beda (Sastrohamidjojo, 2004). Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Pompa vakum dihentikan dan pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penyerap lalu divakumkan kembali. Kolom dihisap sampai kering dan to user setelah itu siap dipakai. Sampel commit dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimulai



dengan pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan. Kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi. Oleh karena itu, kromatografi vakum cair menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerak (Pedersen, 2001)

9. Kromatografi Gas – Spektroskopi Massa (GC-MS) Perkembangan teknologi instrumentasi menghasilkan alat yang merupakan gabungan dari dua sistem dengan prinsip dasar yang berbeda satu sama lainnya tetapi dapat saling melengkapi, yaitu gabungan kromatografi gas dan spektrofotoskopi massa. Peubah utama dalam GC adalah sifat fasa diam dalam kolom dan suhu kerja. Keduanya diubah menurut keatsirian senyawa yang dipisahkan. Pada fasa diam terjadi pemisahan komponen-komponen dan cuplikan. Dasar kerjanya adalah partisi antara fase diam dan fase gerak (gas). Jadi untuk pemisahan senyawa-senyawa organik berlaku aturan “like dissolve like”. Polaritas dari komponen cuplikan harus sama dengan fase diam untuk memperoleh pemisahan terbaik, sehingga senyawa polar akan terpisah pada fasa diam yang polar dan senyawa non polar akan terpisah pada senyawa diam yang non polar (Sudjadi, 1988). Analisis kualitatif yang dilakukan dalam Kromatografi Gas adalah analisa terhadap waktu retensi (tR) yaitu jarak dalam cm sepanjang garis dasar antara titik penyuntikan sampel dan titik proyeksi puncak kurva yang dihasilkan oleh standar internal yang tertera pada kromatogram, sedangkan analisis kuantitatif dengan perhitungan luas puncak (Sastrohamidjojo, 2004). Spektroskopi massa tidak seperti metode spektroskopi lainnya, tidak melibatkan interaksi antara cahaya dengan materi. Spektroskopi massa dikembangkan berdasarkan prinsip dengan memutus sesuatu menjadi bagianbagiannya untuk dilihat dari apa suatu materi tersusun. Pada spektroskopi massa, sampel pada keadaan uap diionisasi dengan bombardir elektron yang berenergi tinggi (10-70 eV). Elektron bertumbukan dengan materi sampel dan menyebabkan pelepasan elektron dari kulit terluar suatu sampel. commit to user



Molekul yang kekurangan satu elektron akan menjadi kation radikal yang mengandung semua atom dari molekul awalnya, dan dinamakan ion molekul. Sebagai akibat dari tumbukan elektron berenergi tinggi membuat ion molekul mempunyai kelebihan energi yang memungkinkan untuk terjadinya pemutusan ikatan menghasilkan kation yang lebih kecil, radikal, dan molekul netral. Kation yang dibebaskan pada peristiwa ini dipisahkan dan dianalisis berdasarkan perbandingan massa terhadap muatan (m/z) dengan menggunakan kombinasi medan magnet dan medan listrik. Molekul tidak terpecah secara acak, tetapi mengikuti beberapa prinsip. Kemudian hanya fragmen tertentu saja yang dapat diberikan ion molekul. Senyawa yang menguap dalam ruang hampa di dalam MS ditembak dengan elektron sehingga elektron dalam molekul akan terlempar keluar dan akan didapat kation molekul bermuatan positif tunggal dan ganda. Bagian dari kation molekul ini pada waktu bertemu dengan elektron akan menerima energi yang tinggi yang akan menyebabkan penguraian lebih lanjut kation molekul menjadi fragmen yang lebih kecil (fragmentasi). Kation molekul dan fragmen yang bermuatan positif akan dipercepat oleh tegangan tarikan dan dibelokkan dalam ruang pengurai. Bagian ini terdiri dari tabung logam yang terdapat diantara dua kutub magnet. Medan magnet akan membelokkan bagian yang bermuatan dari arah garis lurus aliran menjadi pita yang melengkung yang dengan perubahan kontinyu medan magnet atau tegangan tarikan kation sesuai dengan massanya akan diregristrasi berurutan sebagai spektrum massa (Roth, 1988). Instrumen GC-MS terdiri dari gas pengangkut (Carrier Gas), pengatur aliran dan pengatur tekanan, tempat injeksi, kolom serta detektor. a. Gas pengangkut Gas pengangkut yang sering dipakai dalam GC-MS adalah H2, N2, Ar dan He. Gas ini berfungsi sebagai fase gerak, gas membawa cuplikan yang telah teruapkan untuk masuk ke dalam kolom, dalam GC-MS gas pengangkut yang digunakan harus memenuhi persyaratan dan dasar pemilihannya antara lain: inert atau tidak bereaksi dengan sampel, pelarut dan material dalam kolom, murni dan commit to user



mudah diperoleh serta murah, sesuai dengan detektor dan harus dapat mengurangi difusi gas (Sastrohamidjojo, 2004). b. Pengatur aliran dan tekanan Pengatur aliran dan tekanan berfungsi untuk mengalirkan uap sampel masuk ke dalam kolom. c. Tempat injeksi Pemisahan dengan GC sampel harus berada dalam fase uap. Teknik menginjeksi tergantung pada jenis sampel, adapun jenis teknik injeksi sampel dalam GC antara lain: split, dalam teknik injeksi ini sampel tidak langsung dimasukkan dalam kolom tetapi sebagian besar dibuang, sampel yang dimasukkan hanya sekitar 0,1-1 %. Secara umum teknik ini banyak digunakan. Split less, dalam teknik injeksi ini sampel semuanya dimasukkan ke dalam kolom, biasanya digunakan untuk sampel yang tidak diisolasi dalam jumlah yang besar serta memiliki konsentrasi rendah. On colum, pada teknik ini merupakan tempat injeksi untuk sampel yang mudah rusak atau sampel yang tidak tahan pada suhu tinggi dimana sampel tidak melewati suhu injektor yang tinggi tetapi hanya melewati suhu kolom. Wet needle merupakan salah satu teknik injeksi dimana sampel diuapkan di dalam injektor sehingga sampel yang masuk ke dalam kolom sudah berada dalam bentuk gas. d. Kolom Kolom merupakan jantung kromatografi, keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung dari pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom GC dibedakan menjadi 2 yaitu: Packed dan capillary. Pada kolom jenis packed sangat bagus untuk sampel dalam skala besar namun kelemahannya lambat dan tidak efisien, diameter partikel berukuran < 100-300 µm sedangkan pada capillary keuntungannya adalah cepat dan efisien karena menggunakan sampel dalam jumlah yang sedikit. e. Detektor Detektor berfungsi sebagai pendeteksi komponen-komponen cuplikan yang telah terpisah. Detektor yang baik memiliki sensitivitas yang tinggi, respon commitserta to user linier yang lebar bersifat non destruktif memiliki respon yang sama terhadap



semua jenis senyawa. Jenis-jenis detektor antara lain: 1) Flame Ionization Detector (FID), detektor jenis ini efluen gas yang keluar dan kolom dicampur dengan gas H2 serta dibakar dengan O2, sehingga menjadi ion. Ion-ion tersebut akan menyebabkan peningkatan arus, perubahan arus selanjutnya diukur dan dikonversikan dalam GC-MS. Dalam FID ini memiliki sifat tidak sensitif terhadap H2O, CO2 dan SO2. Selain itu, destruktif dan respon dipengaruhi oleh jumlah atom C, FID ini memiliki sensitivitas 10-13 g/s, 2) Thermal Conductivity Detector (TCD) detektor jenis ini memiliki sifat nondestruktif dan tidak sensitif dengan sensivitas 10-8 g/s, 3) Mass Spektrometri (MS) detektor jenis ini diset untuk mendeteksi ion fragmen tunggal yang spesifik untuk senyawa yang dianalisa. Berdasarkan kecepatan pompa dari MS, lebih kurang 1-5% efluen GC displit ke dalam MS, selanjutnya komponen yang telah terpisah ditembaki dengan elektron terfragmentasi menjadi ion-ion radikal. Pada MS bagian molekul paling mudah terfragmentasi adalah yang memiliki kerapatan elektron yang paling tinggi (Sastrohamidjojo, 2004). Skema alat GC-MS digambarkan dalam Gambar 12 berikut:

Gambar 12. Skema alat GC-MS

10. Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri Prinsip umum untuk menentukan aktivitas antibakteri adalah dengan melihat adanya hambatan pertumbuhan bakteri. Zat antibakteri dapat diperoleh dari hasil fermentasi, sintetik dan dapat diperoleh dari hasil isolasi dari tanaman. commit to user



Penapisan zat antibakteri dilakukan secara in vitro. Metode ini dibagi menjadi 2 bagian yaitu metode difusi agar dan metode dilusi. a. Metode difusi Metode ini dibagi menjadi tiga yaitu metode perforasi, metode gores silang dan metode cakram kertas. 1) Metode perforasi Bakteri uji yang umurnya 18-24 jam disuspensikan kedalam media agar pada suhu sekitar 45 oC. Suspensi bakteri dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian dicampur dengan 15 mL media agar steril. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara gerakan memutar. Setelah agar membeku, dibuat lubang dengan menggunakan perforator berdiameter 6 mm, tiap lubang diisi dengan 20 µL sampel ekstrak yang sebelumnya telah dilarutkan dalam larutan DMSO dengan konsentrasi 10%, kemudian cawan diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Aktivitas antibakteri dapat dilihat daerah bening yang mengelilingi lubang perforasi. 2) Metode Gores Silang Zat yang akan diuji diserapkan ke dalam kertas saring (empat persegi panjang) dengan cara meneteskan pada kertas saring kosong larutan antibakteri sejumlah volume tertentu dengan kadar tertentu pula. Kertas saring tersebut diletakkan dipermukaan agar padat, kemudian digores dengan suspensi bakteri melalui kertas saring dan diinkubasikan selama 18-24 jam pada suhu 37oC. Aktivitas antibakteri dapat dilihat dari daerah bening yang tidak ditumbuhi bakteri dekat kertas saring. 3) Metode Cakram Kertas Zat yang akan diuji diserapkan ke dalam cakram kertas dengan cara meneteskan pada cakram kertas kosong larutan antibakteri sejumlah volume tertentu dengan kadar tertentu pula. Cakram kertas diletakkan di atas permukaan agar padat yang telah dituangkan bakteri sebelumnya. Cawan petri diinkubasi pada suhu 30°C selama 2 hari sampai 4 hari. Aktivitas antibakteri dapat dilihat dari daerah hambat di sekeliling cakram kertas. commit to user



b. Metode dilusi Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat (solid dilution). 1) Metode dilusi cair Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antibakteri pada medium cair yang ditambahkan dengan bakteri uji. Larutan uji agen antibakteri pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan bakteri uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan bakteri uji ataupun agen antibakteri dan diinkubasi selama 18-24 jam. 2) Metode dilusi padat Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah suatu konsentrasi agen antibakteri yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa bakteri uji (Pratiwi, 2008).

11. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Uji Banding Konsentrasi hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi terkecil (pengenceran terbesar) suatu obat yang masih menghambat pertumbuhan bakteri. KHM sangat penting untuk menentukan dosis efektif terkecil dari obat dan memberikan indek perbandingan dengan obat yang lain. Uji potensi suatu sampel (zat antibakteri) bertujuan untuk mengetahui sejauh mana kekuatan atau daya aktivitas antibakteri sampel tersebut bila dibandingkan terhadap suatu zat pembanding. Metode yang digunakan adalah dengan cara membandingkan respon yang dihasilkan oleh zat antibakteri yang diperiksa terhadap respon suatu zat antibakteri pembanding. Respon tersebut berupa hambatan terhadap pertumbuhan bakteri uji. Uji potensi suatu sampel dapat dilakukan dengan cara membuat suatu grafik atau kurva standart dari zat pembanding, dimana logaritma konsentrasi zat pembanding diplotkan terhadap sumbu x dan diameter daerah hambat diplotkan commit to persamaan user terhadap sumbu y, sehingga diperoleh garis linier. Berdasarkan



persamaan garis linier tersebut, nilai diameter daerah hambat pada konsentrasi yang telah ditetapkan disubtitusikan ke y maka akan diperoleh nilai x. Antilog dari nilai x merupakan nilai konsentrasi sampel yang setara dengan zat pembanding, sehingga dapat ditetapkan nilai uji banding sampel terhadap zat pembanding, yaitu dengan menggunakan rumus sebagai berikut.

Nilai uji banding =

Konsentrasi sampel dari kurva x 100 % Konsentrasi sampel sebenarnya (Permana, 2009)

B. Kerangka Pemikiran Daun sirih merah ( Piper crocatum Ruiz & Pav ) dari suku Piperaceae berdasarkan literatur cukup berkhasiat untuk obat tradisional, antara lain dapat mengobati keputihan, infeksi pada kulit, kuku dan telinga. Namun sampai saat ini masih sedikit informasi tentang kandungan kimia serta aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen dari ekstrak daun sirih merah. Pada umumnya tanaman yang termasuk suku Piperaceae mengandung golongan senyawa golongan alkaloid, terpenoid, flavonoid dan minyak atsiri. Sirih merah termasuk dalam suku Piperaceae, sehingga dalam sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, polifenolat, tanin dan minyak atsiri. Senyawa-senyawa tersebut merupakan senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri. Hal ini diperkuat dengan hasil penelitian Juliantina (2008) yaitu ekstrak etanol sirih merah mempunyai kemampuan antibakteri bakteri gram positif dan bakteri gram negatif khususnya terhadap Staphylococcus aureus dengan KHM 25 % dan Eschericia coli dengan KHM 6,25 %, sehingga dalam penelitian ini bertujuan mengidentifikasi komponen kimia yang terdapat dalam ekstrak daun sirih merah, kemudian menguji aktivitasnya sebagai antibakteri terhadap bakteri gram positif yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus cereus dan bakteri gram negatif yaitu Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa sehingga nanti akan diketahui senyawa aktif antibakteri apa saja yang ada di dalam ekstrak commit to user daun sirih merah.



Isolasi ekstrak daun sirih merah dilakukan dengan menggunakan maserasi dengan pelarut etanol karena etanol dapat melarutkan sebagian besar senyawa organik. Ekstrak etanol yang diperoleh kemudian diekstraksi partisi menggunakan pelarut heksana dengan corong pisah untuk mendapatkan ekstrak polar dari daun sirih merah yang telah terpisah dari ekstrak non polar. Ekstrak polar tersebut dilakukan pemisahan dengan KVC untuk mendapatkan fraksi heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol. Metode pengujian aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode lubang terhadap ekstrak etanol dan fraksi-fraksi hasil KVC untuk mengetahui aktivitas antibakterinya. Komponen kimia ekstrak etanol daun sirih merah digunakan analisa skrining fitokimia, sedangkan fraksi hasil KVC yang memiliki akivitas antibakteri tertinggi diidentifikasi dengan skrining fitokimia dan analisis GC-MS, dimana dari data GC-MS ini akan didapatkan informasi struktur senyawa kimia yang terdeteksi dalamnya. Pengobatan secara medis banyak menggunakan antibiotik sintetik seperti amoksisilin untuk pengobatan penyakit akibat infeksi bakteri. Oleh karena itu, dilakukan penentuan Konsentrasi Hambat Minimum untuk mengetahui potensi fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi terhadap keempat bakteri uji serta dilakukan uji potensi antibakteri fraksi tersebut dibandingkan dengan potensi antibakteri amoksisilin.

C. Hipotesis 1.

Ekstrak etanol daun sirih merah dan fraksi-fraksi hasil pemisahan yaitu fraksi heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol mempunyai aktivitas antibakteri.

2.

Ekstrak etanol mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, saponin dan senyawa fenol, sedangkan fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi mengandung senyawa terpenoid.

3.

Potensi fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dapat dibandingkan dengan amoksisilin.

commit to user



BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian Penelitian dilakukan dengan menggunakan metode eksperimental di laboratorium. Tahap pertama adalah pembuatan serbuk simplisia sampel. Serbuk simplisia sampel diekstraksi maserasi menggunakan pelarut etanol dan diekstraksi partisi menggunakan pelarut heksana. Terhadap ekstrak etanol yang diperoleh dilakukan pengujian aktivitas antibakteri dan dilakukan uji skrinning fitokimia. Ekstrak etanol kemudian dipisahkan dengan menggunakan kolom Kromatografi Vakum Cair (KVC) berdasarkan tingkat kepolaran, yaitu secara berurutan heksana, etil asetat dan etanol. Fraksi-fraksi hasil Kromatogravi Vakum Cair kemudian dilakukan pengujian antibakteri. Terhadap fraksi aktif kemudian dilakukan skrining fitokimia. Fraksi aktif yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi kemudian dilakukan uji golongan senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan data analisis Gas Cromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS). Penentuan potensi antibakteri dilakukan dengan mencari nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ekstrak dan nilai banding fraksi terhadap standar amoksisilin.

B. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan mulai bulan April 2010-November 2010 di Laboratorium Kimia Dasar FMIPA Universitas Sebelas Maret dan Sub Lab Biologi Laboratorium Pusat Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.

C. Alat dan Bahan 1. Alat-alat yang digunakan Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca timbang (Denver INST.TL603D dan Mettler Toledo AT400), heating mantel (J.P. commit userpump, statif dan klem, penyaring SELETA., s.a), vortex mixer (VM 300), to water

33



Buchner, oven (Memmert Model 500), Kromatografi Vakum Cair (KVC), corong pisah, evaporator (Bibby RE 200B), bejana KLT, semprot KLT, perforator diameter 6 mm, pembakar spirtus, pendeteksi UV (PUV/BDH), autoklaf (Presoclave 75 P-Selecta), hotplate-stirer (RCT Basic Labortechnik), pipa kapiler, mikropipet 10-100 µL, cawan petri, jarum ose, laminar air flow (Minihelik II), inkubator (Hotcold M P-Selecta), GC-MS (QP2010S SHIMADZHU), spatula logam, selang air, lemari asam, lemari pendingin dan peralatan gelas.

2. Bahan-bahan yang digunakan a. Bahan yang diteliti Daun Sirih Merah dari daerah Magelang yang dibuat simplisia b. Bahan Kimia Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut organik yaitu etanol (96%), heksana (redestilasi), etil asetat (redestilasi), aseton teknis, asam formiat (Pro analisis), anhidrida asam asetat (Pro analisis), H2SO4 pekat, asam asetat (Pro analisis), metanol (Pro analisis), toluena (Pro analisis), dietil amin (Pro analisis), akuades, metanol, DMSO (Pro analisis), akuades, silika gel F254 (E. merck) dan plat KLT silika gel F254. Larutan pereaksi yang digunakan adalah KOH, FeCl3 1% dalam air, SbCl3 20% dalam kloroform, Dragendorff dan Lieberman Buchard. c. Bakteri Uji Bakteri uji yang digunakan adalah E. coli, B.cereus, S. aureus, dan P. aeruginosa yang diperoleh dari Universitas Setiabudi, Surakarta. d. Media Pembenihan Media pembenihan untuk bakteri adalah Nutrien Agar (E. Merck) dengan kandungan bahan per liter adalah 5 g pepton, 3 g ekstrak daging dan 12 g agar. e. Zat Pembanding Antibakteri Zat pembanding yang digunakan sebagai standar antibakteri dalam penelitian ini adalah amoksisilin (standar farmasi). commit to user



D. Prosedur Penelitian 1. Persiapan sampel sirih merah Sampel daun sirih merah diperoleh dari daerah Magelang. Daun sirih merah sebelumnya diidentifikasi oleh Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Daun sirih merah dibersihkan, dicuci, kemudian dikeringkan pada suhu kamar atau diangin-anginkan kurang lebih 1 hari dan dioven pada 40°C. Selanjutnya daun sirih merah diblender sampai berbentuk serbuk. Bahan kering simplisia disimpan dalam wadah tertutup.

2. Ekstraksi Maserasi Sampel Daun Sirih Merah Daun sirih merah dimaserasi dengan pelarut etanol selama 2x24 jam. Selanjutnya ekstrak etanol diekstraksi partisi menggunakan pelarut heksana dengan corong pisah untuk mendapatkan ekstrak polarnya. Ekstrak etanol hasil partisi kemudian diuapkan pelarutnya dengan penguap vakum putar dengan suhu 50°C hingga diperoleh ekstrak etanol kental.

3. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol Skrining fitokimia dilakukan terhadap ekstrak etanol awal. Hal ini bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa yang telah terisolasi. Penapisan fitokimia dilakukan dengan metode uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT). a. Uji Flavonoid Ekstrak sampel ditotolkan pada lempeng plat Silika Gel F254. Elusi dilakukan dengan fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat : air (100 : 11 : 11 : 27) dalam 2 ml. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Flavonoid akan memberikan warna fluorosens biru tua pada UV 254 nm dan pada UV 365 nm akan memberikan warna kuning, biru dan hijau. b. Uji Antrakuinon Uji Antrakuinon menggunakan fase diam Silika Gel F254. Elusi dilakukan dengan fase gerak eril asetat : metanol : air (100 : 13,5 : 10) dalam 2 ml. Plat dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi KOH etanolik 5%. Kemudian user plat diamati pada cahaya tampak, commit UV 254tonm, dan UV 365 nm. Antrakuinon akan



memberikan warna kuning pada cahaya tampak dan fluorosens kuning jika diamati pada UV 365 nm. c. Uji Kumarin Uji Kumarin menggunakan penyemprot KOH 5% etanolik sebagai deteksi dengan laruta pengembang dietil eter : toluen (1 : 1) dalam 2 ml yang dijenuhkan dengan asam asetat 10%. Kumarin akan menunjukkan warna biru muda jika diamati pada cahaya tampak. d. Uji Senyawa Fenolik Uji senyawa fenolik menggunakan penyemprot FeCl3 1% dan elusi dilakukan dengan fase gerak etil asetat : metanol : air (100 : 13,5 : 10) dalam 2 ml. Kemudian plat diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Fenol akan memberikan warna hijau atau biru kehitaman jika diamati pada cahaya tampak. e. Uji Saponin Uji KLT untuk saponin dilakukan dengan fase gerak kloroform : metanol : air (64 : 50 : 10) dalam 2 ml. Plat dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi SbCl3 20%. Plat kemudian diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan UV 365 nm. Saponin akan memberikan warna merah atau ungu jika diamati pada cahaya tampak. f. Uji Alkaloid Fase gerak yang digunakan adalah toluena : etil asetat : dietil amin (7 : 2 : 1) dalam 2 ml. Plat KLT dideteksi semprot dengan menggunakan pereaksi Dragendorff. Plat kemudian diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm dan UV 365 nm. Alkaloid akan memberikan warna coklat dibawah sinar tampak dan pada UV 365 nm akan memberikan warna fluorosens kuning atau biru. g. Uji Asam Lemak Uji KLT asam lemak menggunakan penyemrot rhodamin B dalam etanol dan fase gerak benzena : dietil eter (95% : 5%) dalam 2 ml larutan. Semua jenis asam lemak dapat dideteksi dengan rhodamin B. Plat kemudian diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm. Plat akan menunjukkan warna ungu commit user254 dan 365 nm. jika sampel mengandung asam lemak padatoUV



h. Uji Terpenoid dan Steroid Fase pengembang yang digunakan untuk analisa steroid dan terpenoid adalah heksana : etil asetat (95% : 5%) dalam 2 ml. Reagen penyemprot untuk steroid adalah SbCl3 dalam kloroform, sedangkan untuk terpenoid adalah larutan Lieberman Buchard. Steroid dan terpenoid akan memberikan warna ungu jika diamati pada cahaya tampak dan dibawah sinar UV 254 nm.

4. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Ekstrak etanol dibuat konsentrasi tertentu dengan pelarut dimetil sulfoksida (DMSO). Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi lubang dengan tahap kerja sebagai berikut: a. Sterilisasi alat Alat yang digunakan untuk aktivitas antibakteri disterilkan dalam autoklaf dengan temperatur 121ºC selama kurang lebih 20 menit. b. Pembuatan media agar miring Sebanyak 20 gram NA (Nutrien Agar) dilarutkan dalam 1 L akuades, kemudian dipanaskan dengan stirer sampai warna kuning bening. Larutan NA kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Tabung reaksi ditutup dengan kapas dan alumunium foil lalu disterilisasi pada suhu 121ºC selama 20 menit. Tabung reaksi ditempatkan ditempat yang miring dan didiamkan sampai padat pada suhu kamar. c. Pembuatan biakan bakteri Bakteri uji ditempelkan pada media miring agar NA dengan pola zig zag, masing-masing bakteri dibuat 3 biakan bakteri dan dilakukan dalam keadaan steril pada ruang isolasi dengan sinar UV. Biakan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 1 hari untuk semua bakteri uji. d. Penyediaan suspensi bakteri uji Untuk membuat suspensi bakteri, ambil 1 ose bakteri kemudian dimasukkan ke dalam 3 ml dalam aquades steril, dengan catatan 1 tabung untuk 1 bakteri. Larutan diaduk sampai keruh, lalu ditutup dengan kapas. commit to user



e. Uji antibakteri Sebanyak 1 gram NA dilarutkan dalam aquades 50 ml dan dipanaskan sampai kuning bening. Larutan NA kemudian dimasukkan ke dalam botol duran masing-masing sebanyak 15 ml. 100 µl suspensi bakteri diambil lalu taruh dalam cawan petri yang steril. Ke dalam cawan petri yang berisi suspensi bakteri, kemudian dituangkan media NA steril sebanyak 15 ml dalam suhu tubuh sekitar 30-37ºC (tidak terlalu panas dan tidak terlalu dingin), cawan petri digoyangkan sehingga kedua larutan tercampur rata. Campuran tersebut didiamkan sampai beku ( ±15 menit). Setelah itu, dibuat lubang dengan ukuran 6 mm dengan alat pervorator dan spatula. Lubang tersebut diisi dengan 20 µl sampel yang telah dicampur dengan DMSO. Cawan petri dibungkus kembali dengan kertas dan diinkubasi selama 1 hari pada suhu 37ºC.

5. Pemisahan Ekstrak Etanol Ekstrak etanol kental dilakukan pemisahan dengan menggunakan Kromatografi Vakum Cair (KVC). Kolom KVC yang digunakan memiliki diameter 6 cm. Sebelum melakukan pemisahan dilakukan persiapan kolom KVC dan persiapan sampel. Silika gel F254 sebanyak 60 gram dimasukkan kedalam kolom kromatografi sampai padat dengan cara ditekan-tekan. Sampel sebanyak 10 gram dicampur dengan silika adsorb sebanyak 10 gram sampai tercampur rata. Apabila sampel dan silika gel F254 sulit homogen, maka ditambahkan aseton perlahan-lahan sampai kedua bahan tersebut tercampur rata. Setelah homogen, sampel dibiarkan beberapa saat sampai kering. Sampel ekstrak etanol kering kemudian dimasukkan kedalam kolom kromatografi yang telah diisi dengan silika gel F254. Eluen utuk proses elusi pertama adalah heksana, yang dilanjutkan dengan etil asetat dan terakhir etanol untuk mendapatkan fraksi heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol. Eluen yang digunakan sebanyak 400 ml heksana, 300 ml etil asetat dan 300 ml etanol. Pemisahan ekstrak etanol dilakukan 3 kali untuk mendapatkan fraksi-fraksi yang lebih banyak. commit to user



Fraksi heksana, etil asetat dan etanol yang diperoleh kemudian diuapkan pelarutnya dengan penguap vakum putar dengan suhu 40°C hingga diperoleh fraksi heksana kental, fraksi etil asetat kental dan fraksi etanol kental.

6. Pengujian Aktivitas Antibakteri terhadap Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan a. Uji aktivitas fraksi-fraksi hasil KVC Fraksi-fraksi yang didapat dilakukan pengujian antibakteri menggunakan tahapan kerja seperti pada pengujian pada ekstrak etanol untuk mendapatkan fraksi teraktif antibakteri. b. Penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri Penetapan KHM dilakukan untuk mengetahui konsentrasi terendah sampel uji yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Penetapan KHM dilakukan dengan metode perforasi sama seperti pengujian antibakteri dengan melakukan variasi konsentrasi sampel. KHM dilakukan terhadap fraksi hasil KVC yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi. c. Penetapan KHM amoksisilin Konsentrasi Hambat Minimum amoksisilin murni ditetetapkan dengan cara yang sama dengan penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri.

7. Pengujian Golongan Fraksi Teraktif Antibakteri Pengujian golongan senyawa fraksi teraktif antibakteri sama seperti pengujian yang dilakukan pada ekstrak etanol.

8. Kromatografi Gas-Spektrometer Massa (GC-MS) Uji GC-MS dilakukan untuk megidentifikasi komponen fraksi teraktif antibakteri daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav. ). Kondisi alat GC-MS dapat dilihat pada Lampiran 14a.

commit to user



E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data Penelitian ini menghasilkan berbagai data. Uji aktivitas antibakteri pada ekstrak, fraksi-fraksi dan amoksisilin didapatkan diameter hambat pada konsentrasi tertentu. Pada tahap pengujian aktivitas antibakteri ini diketahui fraksi mana yang menunjukkan aktivitas antibakteri tertinggi berdasarkan diameter hambat yang dihasilkan. Fraksi antibakteri tertinggi tersebut kemudian dianalisis dengan kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi gas-spektroskopi masa (GCMS), uji penentuan konsentrasi hambat minimum (KHM) dan uji banding. Skrining fitokimia dengan KLT didapatkan golongan senyawa yang terdapat pada ekstrak dan fraksi. Kromatogram GC diperoleh informasi jumlah senyawa yang terdeteksi dan dari spektra GC-MS didapatkan struktur senyawa kimia yang terdeteksi dalam fraksi yang menunjukkan aktivitas antibakteri tertinggi. Pada penentuan konsentrasi hambat minimum didapatkan data nilai KHM. Pada uji banding aktivitas terhadap standar amoksisilin diperoleh data nilai uji antibanding. Data-data diameter hambat dan variasi konsentrasi hasil pengujian aktivitas antibakteri dilakukan analisa data dengan One-Way Anova.

commit to user



BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Identifikasi Sampel Identifikasi tanaman daun sirih merah yang berasal dari daerah Magelang, dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa jenis yang diteliti adalah Piper crocatum Ruiz & Pav. dengan nama umum sirih merah.

B. Persiapan dan Ekstraksi Sampel Daun sirih merah sebanyak 5 kg dicuci, kemudian diangin-anginkan sampai layu kurang lebih satu hari dan dioven pada 40o C. Proses pengeringan ini bertujuan untuk mengurangi kadar air hingga kadar air dalam simplisia menjadi ≤ 10%, sehingga dapat meminimalkan pertumbuhan jamur selama proses penyimpanan simplisia. Daun sirih merah kering diserbuk kasar sebelum dilakukan ekstraksi. Hal ini bertujuan untuk memperluas permukaan yang berinteraksi dengan pelarut sehingga lebih banyak senyawa yang dapat terekstrak. Serbuk yang diperoleh dari 5 kg daun sirih merah segar diperoleh sebanyak 889,926 gram. Sampel yang telah berbentuk serbuk kering kemudian ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan 4 L pelarut etanol selama 2 x 24 jam menghasilkan ekstrak encer berwarna hijau kehitaman sebanyak 2 L. Etanol merupakan pelarut universal yang baik untuk ekstraksi semua golongan senyawa metabolit sekunder (Kristanti, 2008). Ekstrak hasil maserasi kemudian diekstraksi cair-cair dengan pelarut heksana dan dihasilkan ekstrak etanol berwarna hijau pekat. Pelarut untuk ekstraksi mempunyai kepolaran yang berbeda. Hal ini disebabkan kandungan kimia dari suatu tumbuhan hanya dapat terlarut pada pelarut yang sama kepolarannya, sehingga suatu golongan senyawa dapat dipisahkan dari senyawa lainnya (Kochhar, 1990). Ekstraksi

cair-cair

menggunakan corong pisah bertujuan untuk commit to user meminimalisir senyawa non polar yang terkandung dalam ekstrak etanol.

41



Selanjutnya ekstrak polar hasil ekstraksi cair-cair diuapkan dengan rotary evaporator menghasilkan ekstrak etanol kental sebanyak 45,159 gram dengan rendemen 5,07%. Ekstrak etanol kental ini digunakan sebagai sampel pada prosedur kerja selanjutnya.

C. Pengujian Golongan Senyawa Ekstrak Etanol Ekstrak etanol kental yang diperoleh dilakukan uji pendahuluan atau skrinning fitokimia untuk mengetahui golongan senyawa apa saja yang terkandung didalam ekstrak etanol. Skrinning fitokimia dilakukan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Golongan senyawa yang diuji adalah saponin, senyawa fenolik, alkaloid, flavonoid, kumarin, steroid, antrakuinon, asam lemak dan terpenoid. Skrinning fitokimia yang dilakukan terhadap ekstrak etanol dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Hasil Skrinning Fitokimia Senyawa Kimia Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav ) Kandungan Hasil Uji KLT Deteksi Kesi Senyawa semprot mpul Rf Sinar Tampak UV254nm UV365nm an Hasil Teori Hasi Teori Hasil Teori Uji l Uji Uji Senyawa 0,7 Hijau Hijau, FeCl3 1% + fenolik* 2 biru/hita m Saponin* 0,1 Ungu Merah, SbCl3 20% + 1 ungu Flavonoid* 0,9 HijauFluorosen Hijau Kuning, + kuning s biru tua biru, hijau Antrakuinon 0,2 Kunin Kuning Fluorosen KOH 5% + * g s kuning Kumarin* Hijau Biru KOH 5% muda muda Alkaloid* 0,0 Coklat Coklat Fluorose Fluorosen Dragendorf + 6 ns s f kuning kuning/bir u Asam 0,4 Ung Ungu Rhodamin + lemak** 0,5 u B 8 commit to user Terpenoid 0,2 Ungu Ungu Ung Ungu Lieberman +



dan steroid**

2 u Buchard 0,3 dan SbCl3 3 Keterangan: (+) = Ada golongan senyawa kimia * = Wagner, 1983 (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia ** = Harborne, 1996 Hasil uji KLT ekstrak etanol daun sirih merah seperti yang tercantum dalam Tabel 2 menunjukkan bahwa ekstrak etanol mengandung senyawa golongan senyawa fenolik, alkaloid, saponin, flavonoid, steroid, alkaloid, antrakuinon, terpenoid, dan asam lemak. Komponen kimia dari suatu tanaman tergantung dari daerah geografi, umur tanaman, iklim lokal, musim dan perbedaan genetik (Yuksel, et al, 2006).

D. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Ekstrak etanol kental yang diperoleh kemudian dilakukan pengujian aktvitas antibakteri menggunakan 4 bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa. Metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri adalah metode perforasi dengan diameter lubang 6 mm. Dasar pengamatan dari metode ini adalah terbentuk atau tidaknya zona bening disekitar sumuran setelah media agar yang ditanami bakteri diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam, sehingga besarnya penghambatan terhadap bakteri uji dapat teramati dengan jelas. Ekstrak etanol kental dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) dengan konsentrasi 100%, 75%, 50% dan 25%. Sampel dilarutkan dalam DMSO karena DMSO dapat melarutkan secara sempurna ekstrak etanol dan merupakan kontrol negatif. Hasil pengujian aktivitas antibakteri dapat dilihat pada Tabel 3, sedangkan pengujian selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 4.

Tabel 3. Hasil pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav ) terhadap 4 bakteri uji Bakteri

E. coli S. aureus

Konsentrasi 100% 11,29±0,08 11,62±0,09

Diameter Hambat Rata-Rata Konsentrasi Konsentrasi 75% 50% 10,90±0,05 9,75±0,05 commit to user 10,52±0,09 9,59±0,06

Konsentrasi 25% 8,80±0,24 8,15±0,10


11,74±0,03 9,55±0,14 8,64±0,09 B. cereus 11,64±0,13 8,27±0,06 8,00±0,05 P. aeruginosa Keterangan: Diameter lubang = 6 mm dengan 3 kali pengulangan


7,90±0,04 7,62±0,11

Hasil uji menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah menunjukkan penghambatan terhadap keempat bakteri uji. Ekstrak etanol pada konsentrasi 100% termasuk mempunyai aktivitas yang kuat karena diameter penghambatannya lebih dari 10 mm. Hasil tersebut juga menunjukkan bahwa meningkatnya konsentrasi ekstrak juga meningkatkan diameter daerah hambat pertumbuhan. Hal ini disebabkan oleh meningkatnya senyawa-senyawa kimia yang bersifat antibakteri (Sumarnie, 1999). Ekstrak etanol mengandung senyawa fenolat, alkaloid, saponin, flavonoid dan terpenoid yang secara teori telah terbukti aktif sebagai senyawa antibakteri. Flavonoid dapat membentuk kompleks dengan dinding sel bakteri dengan merusak membran mikroba. Senyawa fenolat dapat menyebabkan denaturasi protein melalui proses adsorpsi dengan melibatkan ikatan hidrogen. Pada kadar rendah, terbentuk kompleks protein-fenol dengan ikatan lemah dan segera mengalami peruraian, diikuti penetrasi fenol ke dalam sel dan menyebabkan presipitasi serta denaturasi protein. Pada kadar tinggi, fenol menyebabkan koagulasi protein dan membran sel mengalami lisis, mengubah permeabilitas membran bakteri (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Hasil pengujian aktivitas antibakteri terhadap ekstrak etanol selanjutnya dilakukan analisis data secara statistik untuk mengetahui secara pasti apakah terdapat perbedaan aktivitas antibakteri yang nyata diantara keempat konsentrasi ekstrak etanol diatas. Metode analisa yang digunakan adalah metode One Way Anova. Data hasil analisa dapat dilihat pada Lampiran 5. Berdasarkan hasil analisis statistik dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata antara konsentrasi 100%, 75%, 50%, dan 25% (sig < 0,05). Selanjutnya untuk mengetahui perbedaan aktivitas antibakteri antar bakteri dilakukan pengujian lebih lanjut dengan menggunakan metode LSD. Dari data diperoleh bahwa untuk konsentrasi 100% bakteri E. coli menunjukkan perbedaan aktivitas yang nyata terhadap semua bakteri uji yang lain.to Konsentrasi 75% dan 50% bakteri commit user



Staphylococcus

aureus,

Bacillus

cereus

dan

Pseudomonas

aeruginosa

menunjukkan perbedaan yang nyata terhadap semua bakteri uji yang lain. Ekstrak

etanol

kemudian

dilakukan

pemisahan

menggunakan

Kromatografi Vakum Cair dengan pelarut organik yang semakin meningkat kepolarannya. Pemisahan dilakukan untuk mendapatkan fraksi yang mempunyai kepolaran berbeda sehingga dapat diketahui fraksi apa yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi.

E. Pemisahan Ekstrak Etanol Ekstrak etanol kental dipisahkan dengan cara pemisahan menggunakan Kromatografi Vakum Cair (KVC) untuk mendapatkan fraksi dengan tingkat kepolaran yang semakin meningkat. Kromatografi Vakum Cair merupakan salah satu kromatografi kolom khusus yang biasanya juga menggunakan silika gel sebagai adsorben (Kristanti, 2008). Sebanyak 10 gram ekstrak etanol kental dipisahkan dengan menggunakan eluen atau pelarut organik secara berurutan yaitu heksana, etil asetat dan etanol, dimana nantinya berdasarkan prinsip like dissolve like maka senyawa yang kurang polar akan larut dalam eluen yang kurang polar dan senyawa yang kepolarannya lebih tinggi akan larut dalam eluen yang lebih polar. Pemisahan ekstrak etanol dapat dijelaskan sebagai berikut: 1. Elusi dengan menggunakan eluen heksana Pemisahan ini dilakukan dengan mengelusi ekstrak etanol secara bertahap @100 ml dengan eluen heksana sebanyak 4 kali. Hasil elusi menghasilkan eluat berwarna kuning oranye. Heksana merupakan pelarut organik yang memilki kepolaran rendah, sehingga senyawa yang kurang polar juga akan terelusi dalam pelarut heksana. Hasil pemisahan menunjukkan bahwa fraksi heksana yang diperoleh lebih sedikit. Hal ini dimungkinkan karena senyawa yang kepolarannya rendah telah terikat pada saat ekstraksi cair-cair dengan corong pisah. 2. Elusi dengan menggunakan eluen etil asetat Elusi selanjutnya menggunakan eluen etil asetat sebanyak @100 ml commit to user sebanyak 3 kali. Hasil elusi menghasilkan eluat yang berwarna hijau. Hasil



pemisahan didapatkan fraksi etil asetat yang jauh lebih besar dari fraksi heksana. Hal ini disebabkan etil asetat merupakan eluen yang kepolarannya lebih tinggi dibandingkan dengan heksana dan lebih rendah dibandingkan dengan etanol, sehingga senyawa yang kepolarannya sedang akan larut dalam etil asetat.

3. Elusi dengan menggunakan eluen etanol Elusi terakhir menggunakan eluen etanol sebanyak @100 ml sebanyak 3 kali. Hasil elusi menghasilkan fraksi etanol berwarna hijau. Etanol merupakan senyawa paling polar diantara heksana dan etil asetat sehingga mudah melarutkan senyawa yang kepolarannya tinggi dalam kolom. Eluat hasil KVC dievaporasi dengan rotary evaporator menghasilkan fraksi-fraksi kental. Fraksi-fraksi tersebut kemudian diuji aktivitas antibakterinya masing-masing terhadap bakteri uji yang dapat dihambat oleh ekstrak etanol. Pengujian dilakukan untuk mengetahui fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi. Hasil pemisahan dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Hasil Kromatografi Vakum Cair Ekstrak Etanol Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Pelarut Heksana Etil asetat Etanol

Berat fraksi (g) 0,102 3,536 4,236

Warna Kuning oranye Hijau Hijau

Persentase (%)* 1,02% 35,36% 42,36%

Keterangan: *: Dari berat ekstrak etanol yang dipisahkan

F. Pengujian Aktivitas Antibakteri Fraksi-Fraksi Hasil Pemisahan Fraksi-fraksi kental yang diperoleh kemudian diuji aktivitas antibakterinya menggunakan 4 macam bakteri uji yang menunjukkan hambatan pada ekstrak etanol yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa. Metode yang digunakan sama seperti yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri pada ekstrak etanol yaitu metode perforasi dengan diameter lubang 6 mm. Konsentrasi masing-masing fraksi pada uji aktivitas antibakteri ini adalah 25 % yang dilarutkan dalam DMSO. Penentuan konsentrasi commit to user yang sama bertujuan untuk mendapatkan fraksi teraktif yang dapat menghambat



pertumbuhan keempat bakteri uji. Hasil pengujian antibakteri dapat dilihat pada Tabel 5 dimana juga ditunjukkan hasil pengujian ekstrak etanol dengan konsentrasi yang sama sebagai perbandingan, sedangkan pengujian selengkapnya dapat terdapat pada lampiran 6.

Tabel 5. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol dan Fraksi-Fraksi Hasil Kromatografi Vakum Cair terhadap 4 Bakteri Uji Fraksi (konsentrasi 25 %)

Diameter Hambat Rata-Rata (mm)

Ekstrak etanol

B. cereus 7,90±0,04

S. aureus 8,15±0,10

E.coli 8,80±0,24

P. aeruginosa 7,62±0,11

Heksana

7,75±0,17

7,55±0,17

7,38±0,04

7,77±0,10

Etil asetat

7,22±0,26

7,06±0,06

7,20±0,08

7,11±0,23

Etanol

7,30±0,07

7,31±0,09

7,24±0,04

6,47±0,15

Keterangan: diameter lubang = 6 mm dengan 3 kali pengulangan Hasil pengujian aktivitas antibakteri pada Tabel 5 menunjukkan bahwa fraksi heksana mempunyai aktivitas tertinggi terhadap keempat bakteri uji dibandingkan dengan fraksi-fraksi lain hasil pemisahan dengan kromatografi vakum cair. Berdasarkan hasil pengujian aktivitas antibakteri terhadap fraksi-fraksi daun sirih merah selanjutnya dilakukan dilakukan análisis data secara statistik untuk mengetahui secara pasti apakah terdapat perbedaan aktivitas antibakteri yang nyata diantara masing-masing fraksi hasil kromatografi vakum cair. Uji statistik dilakukan dengan menggunakan metode One Way Anova. Hasilnya ditunjukkan pada Lampiran 7. Berdasarkan hasil análisa secara statistik, dapat disimpulkan bahwa untuk semua fraksi yaitu fraksi heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol terdapat perbedaan aktivitas antibakteri yang nyata terhadap keempat bakteri uji. Kemudian pengujian lebih lanjut dilakukan untuk mengetahui secara pasti perbedaan aktivitas antibakteri antar fraksi. Pengujian dilakukan menggunakan LSD. Hasil análisis menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang nyata antara to userlain dalam menghambat semua fraksi heksana dengan kedua commit fraksi yang



pertumbuhan keempat bakteri uji. Berdasarkan análisis tersebut dapat disimpulkan bahwa fraksi heksana mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dan nyata terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Eschericia coli dan Pseudomonas aeruginosa. Selanjutnya, dilakukan penetapan konsentrasi hambat mínimum terhadap fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi terhadap keempat bakteri uji yaitu fraksi heksana.

G. Penetapan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Nilai Banding 1. Penetapan KHM Fraksi Heksana Fraksi heksana dilakukan penetapan KHM terhadap keempat bakteri uji. Penetapan dimulai dengan variasi konsentrasi dimulai dari konsentrasi 15% sampai dengan 1%. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 6, sedangkan hasil pengujian selengkapnya terdapat pada Lampiran 8.

Tabel 6. Hasil Pengujian Penetapan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Fraksi Heksana terhadap 4 Bakteri Uji Konsentrasi

Diameter Hambat Rata-Rata (mm) B. cereus

S. aureus

E.coli

P. aeruginosa

15%

7,51±0,02

7,57±0,06

7,27±0,03

7,72±0,03

10%

7,18±0,10

7,32±0,10

6,83±0,08

7,48±0,10

5%

6,99±0,04

6,99±0,19

6,00±0,00

6,93±0,03

1%

6,00±0,00

6,00±0,00

6,00±0,00

6,00±0,00

Keterangan: Diameter lubang = 6 mm dengan 3 kali pengulangan Berdasarkan data diatas diperoleh bahwa pada konsentrasi 10% menunjukkan nilai KHM terhadap bakteri E.coli. Sedangkan untuk bakteri B. cereus, S. aureus dan P. aeruginosa menunjukkan nilai KHM pada konsentrasi 5%. Dari data diatas dapat disimpulkan bahwa ekstrak heksana mempunyai KHM paling rendah untuk bakteri B. cereus, S. aureus dan P. aeruginosa. Diameter daerah hambat fraksi heksana daun sirih merah pada S. aureus > Bacillus cereus > Pseudomonas aeruginosa > E. coli. Perbedaan daerah hambatan pada pertumbuhan S. aureus, Bacillus commitcereus, to userPseudomonas aeruginosa dan E.



coli dapat disebabkan oleh perbedaan komponen penyusun dinding sel antara bakteri gram positif dan gram negatif. Bacillus cereus dan S. aureus merupakan bakteri gram positif sedangkan dan E. coli dan Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri gram negatif, dimana secara umum dinding bakteri gram negatif berbeda dengan bakteri gram positif dan hal ini dapat menjelaskan bahwa banyak zat antibakteri yang tidak sensitif terhadap bakteri gram negatif. Bakteri gram positif terdapat lapisan peptidoglikan 50-100 lapis dan selebihnya adalah membran dan sitoplasma. Sedangkan bakteri gram negatif hanya tediri dari 1-2 lapisan peptidoglikan tetapi memiliki membran luar (Norajit, 2007; Siswandono dan Soekardjo, 2000). Membran luar ini berfungsi sebagai lapisan pelindung pada bakteri gram negatif dari zat-zat yang bersifat racun termasuk zat antibakteri yang mempunyai target menghambat sintesis peptidoglikan, dengan adanya membran luar tersebut maka penetrasi antibakteri ke daerah sasaran (membran terdalam) untuk melakukan aktivitasnya dapat dicegah (Jawetz et al, 2005). Hal ini yang menyebabkan zat antibakteri kurang efektif terhadap beberapa bakteri gram negatif (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Data Tabel 6 kemudian dilakukan analisa statistik untuk mengetahui perbedaan secara pasti antara ekstrak dengan bakteri uji. Analisa statistik menggunakan One Way Anova dengan hasilnya ditunjukkan pada Lampiran 9. Berdasarkan analisa statistik dapat diketahui bahwa pada konsentrasi 15%, 10%, dan 5% terdapat perbedaan yang nyata. Análisis lebih lanjut dilakukan untuk mengetahui perbedaan secara pasti antar konsentrasi dengan menggunakan metode LSD. Hasil análisis menunjukkan bahwa secara umum terdapat perbedaan yang nyata antara konsentrasi satu dengan konsentrasi yang lain.

2. Penetapan KHM Amoksisilin Antibiotik pembanding yang digunakan dalam penelitian ini adalah amoksisilin. Pemilihan amoksisilin sebagai pembanding dikarenakan amoksisilin merupakan antibiotik yang memiliki spektrum penghambatan yang luas (Mutschler, 1991). commit to user



Amoksisilin mempunyai beberapa kelebihan bila dibandingkan dengan antibiotik lain seperti ampisilin dan eritromisin. Amoksisilin dan ampisilin merupakan antibiotik turunan penisilin yang mempunyai aktivitas dan spektrum penghambatan yang sama tetapi amoksisilin diabsorbsi lebih baik dalam usus, sehingga kerja amoksisilin lebih efektif dibandingkan ampisilin (Katzung, 2001). Amoksisilin menghambat pertumbuhan bakteri dengan menghambat tahap spesifik dalam sintesis dinding sel bakteri. Dinding sel bakteri tersusun dari kompleks polimer silang kait peptidoglikon yang terdiri dari polisakarida dan polipeptida. Polisakarida tersusun dari asam N-asetilglukosamin dan asam Nasetilmuramat yang berikatan secara β-1-4 glukosida. Polipeptida terikat pada Nasetilmuramat dan tersusun dari tetrapeptida asam amino yang berakhir pada Lalanin-D-alanin. Protein-protein pengikat penisilin (PBPs) mengkatalisis reaksi transpeptidase yang melepaskan alanin akhir untuk membentuk ikatan silang dengan ikatan peptida terdekat. Amoksisilin merupakan antibiotik semisintetik yang mengandung cincin β-Laktam. Cincin β-Laktam merupakan analog struktural dari L-alanin-D-alanin alami yang secara kovalen diikat oleh PBP pada situs aktif. Setelah amoksisilin terhubung pada PBP, reaksi transpeptidase dapat dihambat (Katzung, 2001). Akibatnya dinding sel menjadi lemah dan karena adanya tekanan turgor dari dalam, dinding sel akan pecah atau lisis sehingga bakteri mati (Siswandono dan Soekardjo, 2000). Penetapan KHM dilakukan dengan variasi konsentrasi mulai dari konsentrasi 5.10-3% sampai konsentrasi 2,5.10-4%. Hasil pengujian KHM amoksisilin ditunjukkan pada Tabel 7, sedangkan hasil selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 10. Tabel 7. Hasil Pengujian Penetapan Konsentrasi Hambat Minimun (KHM) Amoksisilin terhadap 4 Bakteri Uji Konsentrasi Diameter Hambat Rata-Rata (mm) (%) B. cereus P. aeruginosa S. aureus E. coli -3 5.10 11,74±0,07 9,86±0,09 10,25±0,13 11,27±0,10 2,5. 10-3 10,26±0,08 8,74±0,09 9,40±0,06 9,78±0,06 -3 1. 10 8,51±0,06 8,55±0,09 8,62±0,06 8,56±0,08 7,5.10-4 7,78±0,10 7,75±0,05 7,32±0,04 7,45±0,11 -4 5.10 6,00±0,00 6,00±0,00 7,44±0,51 7,21±0,07 -4 2,5.10 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 6,00±0,00 to user Keterangan: Diameter lubang = 6 commit mm dengan 3 kali pengulangan



Berdasarkan data dapat diketahui nilai KHM amoksisilin terhadap keempat bakteri uji. Nilai KHM amoksisilin adalah 7,5.10-4% terhadap bakteri B. cereus dan P. aeruginosa, sedangkan untuk E. coli dan S. aureus sebesar 5.10-4%. Data Tabel 7 yang diperoleh, selanjutnya dilakukan analisis statistik untuk mengetahui perbedaan secara pasti antara konsentrasi amoksisilin dengan bakteri uji. Metode analisis yang digunakan adalah One Way Anova dan hasilnya ditunjukkan pada Lampiran 11. Berdasarkan analisis dapat disimpulkan bahwa secara umum terdapat perbedaan yang nyata untuk semua konsentrasi terhadap keempat bakteri uji.

3. Penetapan Nilai Banding Fraksi Heksana Penetapan nilai banding fraksi heksana dilakukan dengan pembanding amoksisilin. Pengujian terhadap amoksisilin dilakukan pada variasi konsentrasi sama seperti pada penentuan KHM amoksisilin yaitu 5.10-3 % hingga 2,5.10-4 %. Konsentrasi fraksi heksana yang digunakan adalah 15% yaitu merupakan konsentrasi tertinggi yang digunakan untuk penetapan KHM fraksi heksana. Hasil pengujian aktivitas antibakteri fraksi heksana konsentrasi 15% yang selanjutnya digunakan untuk penetapan nilai banding ditunjukkan pada Tabel 6, sedangkan hasil selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 10. Perhitungan nilai banding dilakukan dengan cara membuat grafik log konsentrasi amoksisilin vs rata-rata diameter daerah hambat amoksisilin. Persamaan garis linear yang didapatkan dari grafik diplotkan terhadap diameter hambat rata-rata fraksi heksana pada konsentrasi 15% sehingga diperoleh konsentrasi fraksi yang setara dengan amoksisilin. Data Tabel 6 diketahui bahwa pada konsentrasi 15% fraksi heksana memberikan diameter hambat rata-rata untuk bakteri B. cereus sebesar 7,51 mm. Kemudian dengan menggunakan persamaan garis linear dari grafik amoksisilin, maka didapat x = -3,15 dan anti log x = 7,05.10-4%. Jadi dapat disimpulkan bahwa pada konsentrasi 15%, fraksi heksana mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri B. cereus yang setara dengan commit to diameter user konsentrasi amoksisilin 7,05.10-4% dengan hambat rata-rata sebesar 7,51



mm atau dapat dikatakan bahwa potensi fraksi heksana dibandingkan dengan amoksisilin sebesar 4,7.10-3%. Selanjutnya perhitungan yang sama dilakukan terhadap ketiga bakteri uji yang lain. Penghitungan nilai banding selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 12. Hasil penetapan nilai banding fraksi heksana untuk keempat bakteri uji terhadap amoksisilin dapat dilihat pada Tabel 8.

Tabel 8. Hasil Penetapan Nilai Banding Fraksi Heksana untuk Keempat Bakteri Uji terhadap Amoksisilin Bakteri Nilai Banding (%) B. cereus 4,7.10-3 % P. aeruginosa 6,61.10-3 % S. aureus 4,19.10-3 % E. coli 3,51.10-3 % Berdasarkan hasil penetapan uji banding seperti pada Tabel 8 menunjukkan bakteri P. aeruginosa memiliki nilai banding lebih besar dibandingkan B. cereus, S. aureus dan E. coli. Semakin besar nilai banding fraksi heksana terhadap amoksisilin, maka potensi untuk menghambat bakteri juga semakin baik. Selanjutnya dilakukan identifikasi fraksi heksana dengan skrinning fitokimia dan análisis GC-MS.

H. Identifikasi Fraksi Teraktif Antibakteri Etanol yang dipisahkan dengan menggunakan KVC menghasilkan 3 fraksi yaitu fraksi heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi etanol. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan untuk mengetahui fraksi mana yang teraktif antibakteri. Hasil pengujian diketahui bahwa fraksi heksana adalah fraksi teraktif antibakteri, sehingga dilakukan identifikasi fraksi heksana untuk mengetahui senyawa apa saja yang dimungkinkan sebagai senyawa aktif antibakteri. Identifikasi komponen kimia dilakukan dengan skrinning fitokimia dan uji Kromatografi GasSpektroskopi Massa (GC-MS).

commitFitokimia to user Fraksi Heksana 1. Skrinning



Pengujian golongan senyawa dilakukan terhadap fraksi teraktif antibakteri yaitu fraksi heksana dilakukan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Golongan senyawa yang diuji adalah golongan–golongan steroid, asam lemak dan terpenoid. Skrining fitokimia yang dilakukan terhadap fraksi heksana dapat dilihat pada Tabel 9.

Tabel 9. Hasil Skrining Fitokimia (Pengujian Kualitatif) Senyawa Kimia Fraksi Heksana Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Kandungan Senyawa

Asam lemak Terpenoid Steroid

Rf

0,45 0,57 0,33 0,6 0,6 0,7

Hasil Uji KLT Hasil Pengamatan

Kesimpulan Hasil Pengamatan

Sinar Tampak

Teori

UV254nm

Teori

-

-

Ungu

+

Ungu

Ungu

Ungu latar merah muda Ungu

Ungu

+

Hijau muda

-

Ungu

Ungu

+

Keterangan: (+) = Ada golongan senyawa kimia (-) = Tidak ada golongan senyawa kimia Beberapa hasil penelitian menunjukkan senyawa terpenoid memiliki aktivitas sebagai antibakteri yaitu monoterpenoid linalool, diterpenoid, phytol, triterpenoid saponin dan triterpenoid glikosida (Grayson, 2000; Bigham et al., 2003; Lim et al., 2006). Terpenoid mempunyai aktivitas antibakteri berhubungan dengan dengan perusakan membran sel oleh senyawa lipofilik (Cowan, 1999). Penelitian Gunawan dkk (2007) menunjukkan bahwa senyawa terpenoid dari herba meniran (Pyllanthus niruri Linn) jenis phytadiene dan 1, 2-seco cladiellan menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli dan bakteri Staphylococcus aureus.

2. Hasil Analisis Kromatografi Gas-Spektrometer Massa Fraksi heksana yang menunjukkan penghambatan paling besar terhadap bakteri uji kemudian dianalisis dengan GC-MS untuk mengetahui komponen apa commit to user saja yang terdapat didalamnya. Hasil analisis dengan GC-MS akan diperoleh dua



data yaitu kromatrogram yang berasal dari hasil analisis GC dan spektra massa dari hasil analisis MS. Hasil kromatogram GC fraksi heksana daun sirih menunjukkan adanya 14 puncak. Kromatogram GC fraksi heksana daun sirih ditunjukkan pada Gambar 13. 5 6 11 10

Gambar 13. Kromatogram fraksi heksana daun sirih merah

Identifikasi lebih lanjut dilakukan dengan spektrometer massa. Hasil spektrometer massa akan diperoleh spektra massa dari masing-masing puncak yang terdeteksi pada kromatogram GC. Analisis spektra massa didasarkan pada nilai Similiarity Indeks (SI), base peak (puncak dasar) dan trend pecahan spektra massa yang dibandingkan dengan spektra dari library yaitu Wiley 229.LIB. Berikut ini beberapa contoh analisis 4 spektra massa senyawa tertinggi yang terdeteksi dengan GC-MS yang terkandung dalam fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) dan dibandingkan dengan spektra massa senyawa standar dari Wiley 229 LIB. 9. Senyawa puncak 5. Spektra massa senyawa puncak 5 dengan waktu retensi 30,202 menit dan kelimpahan 19,21% ditampilkan pada gambar 14a, sedangkan spektra massa dari senyawa standar dari library ditampilkan pada gambar 14b.

commit to user



(a)

(b) Gambar 14. (a). Spektra senyawa 5, (b). Spektra senyawa trans kariofilen Spektra tersebut diatas dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut: Tabel 10. Fragmentasi senyawa puncak 5 dibandingkan standar trans kariofilen No Senyawa Puncak Fragmentasi 1 Senyawa 4 5 6 7 9 105 120 133 147 161 175 puncak 5 1 5 9 9 3 2 Standar 4 5 6 7 9 107 120 133 148 161 175 trans kariofilen 1 5 9 9 3

189

204

189

204

Tampak pada gambar 14a dan tabel 10, spektra massa senyawa puncak 5 mirip dengan gambar 14b yang merupakan spektra massa dari senyawa trans kariofilen, dengan Similiarity Indeks 95%. Trans kariofilen merupakan golongan senyawa seskuiterpenoid bisiklik dengan rumus molekul C15H24 dan m/z 204. 10.

Senyawa puncak 6 Senyawa puncak 6 dengan waktu retensi 32,482 menit dan kelimpahan

15,18% memiliki fragmen yang mirip dengan senyawa β-farnesen. Spektra massa senyawa puncak 6 dapat dilihat pada gambar 15a dan spektra massa β-farnesen dapat dilihat pada gambar 15b.

commit to user



(a)

(b) Gambar 15.(a). Spektra senyawa 6, (b). Spektra senyawa β-farnesen Spektra tersebut diatas dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut: Tabel 11. Fragmentasi senyawa puncak 6 dibandingkan standar β-farnesen No Senyawa Puncak fragmentasi 1 Senyawa puncak 6 41 55 69 79 93 107 120 133 148 2 Standar β-farnesen 41 55 69 81 93 107 120 133 161 Tampak pada gambar 15a dan tabel 11, spektra massa senyawa puncak 6 mirip dengan gambar 15b yang merupakan spektra massa dari senyawa β-farnesen dengan Similiarity Indeks 94%. β-farnesen merupakan golongan senyawa seskuiterpenoid dengan rumus molekul C15H24 dan m/z 204. 11.

Senyawa puncak 10 Spektra masssa senyawa puncak 10 dengan waktu retensi 35,026 menit

dan kelimpahan 9,93% memiliki fragmen yang mirip dengan spektra massa senyawa ar-kurkumen. Spektra massa senyawa puncak 10 dapat dilihat pada gambar 16a dan spektra massa ar-kurkumen dapat dilihat pada gambar 16b.

commit to user

161 189

189 204



(a)

(b) Gambar 16.(a). Spektra senyawa 10, (b). Spektra senyawa ar-kurkumen Spektra tersebut diatas dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut: Tabel 12. Fragmentasi senyawa puncak 10 dibandingkan standar ar-kurkumen No Senyawa Puncak Fragmentasi 1 Senyawa 4 55 6 8 9 105 119 132 145 159 187 puncak 10 1 9 3 1 2 Standar 4 55 6 8 9 105 119 132 145 159 ar-kurkumen 1 9 3 1 Tampak pada gambar 16a dan tabel 12, spektra massa senyawa puncak 10 mirip dengan gambar 16b yang merupakan spektra massa dari senyawa arkurkumen, dengan Similiarity Indeks 92%. ar-kurkumen merupakan golongan senyawa seskuiterpenoid dengan rumus molekul C15H24 dan m/z 202. 12.

Senyawa puncak 11 Spektra masssa senyawa puncak 11 dengan waktu retensi 37,650 menit

dan kelimpahan 313,86% memiliki fragmen yang mirip dengan spektra massa senyawa germakren D. Spektra massa senyawa puncak 11 dapat dilihat pada gambar 17a dan spektra massa germakren dapat dilihat pada gambar 17b.

commit to user

202 202



(a)

(b) Gambar 17.(a). Spektra senyawa 11, (b). Spektra germakren D Spektra tersebut diatas dapat dibuat tabel fragmentasi sebagai berikut: Tabel 13. Fragmentasi senyawa puncak 11 dibandingkan standar germakren D No Senyawa Puncak Fragmentasi 1 Senyawa 4 55 6 8 9 105 119 133 147 161 puncak 11 1 9 1 1 2 Standar 4 55 6 7 9 105 119 133 147 161 Germakren D 1 7 9 1

189

204

-

204

Tampak pada gambar 17a dan tabel 13, spektra massa senyawa puncak 11 mirip dengan gambar 17b yang merupakan spektra massa dari senyawa germakren D, dengan Similiarity Indeks 89%. Spektra massa germakren D diatas memiliki kemiripan dengan spektra massa dari germakren D yang diisolasi dari tanaman Heliothis virescens (Rostelien, 2000). Germakren D merupakan golongan senyawa seskuiterpenoid dengan rumus molekul C15H24 dan m/z 204. Analisis spektra massa senyawa lainnya dilakukan dengan cara yang sama seperti analisis empat senyawa yang telah dilakukan diatas. Hasil analisis spektra massa diperoleh 14 senyawa yang memiliki puncak dasar dan pola fragmentasi yang mirip dengan senyawa standar dari WILEY 229.LIB. Data 14 komponen fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) yang teridentifikasi disajikan pada Tabel 14.

commit to user



Tabel 14. Komponen fraksi heksana daun sirih Pav.) SI Berat Senyawa (Similiarity Puncak Molekul Indeks) 1. 92 1 204 2. 94 2 204 3. 93 3 204 4. 94 4 204 5. 95 5 204 6. 94 6 204 7. 93 7 204 8. 95 8 204 9. 92 9 204 10. 92 10 202 11. 89 11 204 12. 90 12 204 13. 86 13 204 14. 94 14 278 Total senyawa teridentifikasi

merah (Piper crocatum Ruiz & tR (menit) 26,602 27,391 27,667 28,454 30,202 32,482 32,733 33,025 34,766 35,026 35,362 37,650 38,880 69,675

Luas area (%) 1,03 1,64 2,26 4,64 19,21 15,18 8,10 6,83 5,6 9,93 13,86 1,92 6,04 3,78 100%

Perkiraan Senyawa α-cubeben β-bourbonen β-elemen Zingiberen Trans-kariofilen β-farnesen β-seskuifelandren β-humulen Diepi α-cedren ar-kurkumen Germakren-D Metanoazulen α-copaen Neopitadien

Aktivitas antibakteri fraksi heksana ini sulit dihubungkan dengan komponen atau senyawa yang khusus. Hal ini dikarenakan kompleksitas dan variabilitas senyawa-senyawa yang terkandung di dalamnya. Secara umum aktivitas antibakteri berhubungan dengan struktur terpen C10 dan C15 serta gugus hidroksil yang memiliki kemampuan untuk membentuk ikatan hidrogen dengan sisi aktif enzim target meskipun senyawa aktif lain seperti alkohol, aldehid, dan ester juga dapat berkontribusi sebagai antibakteri (Bulleti, 2004). Aktivitas penghambatan yang ditunjukkan oleh fraksi heksana dapat disebabkan oleh adanya aktivitas kerja gabungan dari senyawa yang terdapat di dalamnya sehingga menunjukkan aktivitas penghambatan yang efektif. Pengujian ekstrak etanol awal juga menunjukkan aktivitas kerja antibakteri yang lebih besar dibandingkan fraksi heksana, karena ekstrak etanol awal mengandung gabungan senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri yaitu senyawa fenolat, saponin, alkaloid, flavonoid, dan terpenoid. Aktivitas kerja gabungan dari beberapa senyawa-senyawa antibakteri dapat mengakibatkan aktivitas kerja yang lebih efektif bila dibandingkancommit denganto daya user kerja masing-masing senyawa



(Jawetz, 2005). Namun dimungkinkan juga senyawa trans kariofilen yang memiliki persentasi paling besar dibandingkan dengan senyawa lainnya mempengaruhi keefektifan dari fraksi heksana tersebut. Senyawa trans kariofilen mempunyai efek anti inflamasi, anti bakteri, anti endemik, dan dapat mencegah tumor (Erindyah, 2003). Senyawa trans kariofilen dan germakren D merupakan penyusun utama minyak atsiri daun dan bunga Phlomis crinita Cav. dengan komposisi trans kariofilen (40,8%) dan germakren D (39,1%). Minyak atsiri daun dan bunga Phlomis crinita Cav. dengan konsentrasi antara 2,5 µg/ml sampai 625 µg/ml dapat mengambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, dan Salmonella typhimurium. Selain memiliki aktivitas antibakteri, senyawa trans kariofilen juga dapat menghambat aktivitas sitotoksin pada sel tumor (Neffati, 2008). Senyawa germakren D dapat digunakan untuk obat dan dapat berfungsi sebagai penunjang aktivitas antibakteri (Bulleti, 2004; Neffati, 2008). Komponen lain yang yang diduga memiliki aktivitas antibakteri adalah α-humulen, zingiberen dan farnesen. Zingiberen dan farnesen merupakan komponen utama penyusun dari minyak atsiri, ekstrak etanol, dan ekstrak petroleum eter rimpang jahe (Zingiber officinale). Zingiberen dan farnesen dalam rimpang jahe (Zingiber officinale) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus cereus dan Listeria monocytogenes (Norajit, 2007). Struktur 13 senyawa yang tergolong seskuiterpenoid dan satu senyawa diterpenoid digambarkan pada Gambar 18 dan dan Gambar 19, sebagai berikut:

commit to user



H3C H3C

CH3

CH3

CH2

CH3 CH3

CH3

CH3

CH3 H3C

a-Humulen

Trans-Kariofilen

CH3

ar-Kurkumen

CH3 CH3

H

CH=CH2

CH3

CH 3

CH3

CH3

b-Elemen

Metanoazulen

b-bourbon

CH3

CH2

CH3 H3C

CH3

CH3

CH3

Germakren D

diepi a-cedren

CH3 b-farnesen

b-seskuifelandren

Zingiberen

CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

H H CH2 H3C

H2C=CCH 3

a-copaen

a-cubeben

Gambar 18. Struktur seskuiterpenoid daun Piper crocatum Ruiz & Pav.

neopitadien

Gambar 19. Struktur diterpenoid daun Piper crocatum Ruiz & Pav.

commit to user



BAB V PENUTUP

A. Kesimpulan 1. Ektrak etanol, fraksi heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) mempunyai aktivitas antibakteri terhadap bakteri S. aureus, B. cereus, E. coli, dan P. aeruginosa. Fraksi heksana mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dibandingkan dengan fraksi etil asetat dan fraksi etanol dengan KHM 10% terhadap E. coli dan 5% terhadap S. aureus, B. cereus dan P. aeruginosa. Ekstrak etanol memiliki aktivitas antibakteri tertinggi dibandingkan dengan ketiga fraksi hasil pemisahan. 2. Golongan senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak etanol adalah golongan senyawa fenolik, alkaloid, flavonoid, steroid, alkaloid, antrakuinon, asam lemak dan terpenoid. Identifikasi komponen kimia fraksi heksana dengan analisis data GC-MS menunjukkan adanya 14 puncak. Senyawa yang teranalisis merupakan senyawa golongan seskuiterpenoid yaitu α-cubeben (1,03%), β-bourbonen (1,64%), β-elemen (2,26%), zingiberen (4,64%), transkariofilen (19,21%), β-farnesen (15,18%), β-seskuifelandren (8,1)%, βhumulen (6,83%), diepi α-cedren (5,6%), ar-kurkumen (9,93%), germakren-D (13,86%), metanoazulen (1,92%), α-copaen (6,04%) dan golongan diterpenoid yaitu neoptadien (3,78%). 3. Nilai uji banding fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) terhadap B. cereus 4,7.10-3%, terhadap P. aeruginosa 6,61.10-3%, terhadap S. aureus 4,19.10-3% dan terhadap E. coli 3,51.10-3% dibandingkan dengan amoksisilin. Fraksi heksana memiliki potensi yang lebih baik untuk menghambat pertumbuhan bakteri P. aeruginosa > B. cereus > S. aureus > E. coli.

commit to user

62



B. Saran 1. Perlu dilakukan pemisahan fraksi heksana daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) beserta uji aktivitas antibakteri komponen utamanya. 2. Perlu dilakukan uji khasiat lain untuk mengetahui manfaat daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) secara ilmiah.

commit to user

IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI TERAKTIF DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

Recommend Documents