AKTIV VITAS ANTIOKSID DASI EKSTRAK JA AMUR KU UPING HIITAM (Au uricularia ppolytrichaa)
SYAH HRUL FALA AKH
PROGRAM M STUDI BIIOKIMIA FAKUL LTAS MAT TEMATIKA A DAN ILM MU PENGET TAHUAN ALAM A IN NSTITUT P PERTANIA AN BOGOR R BOGOR 2008
ABSTRAK SYAHRUL FALAKH. Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Jamur Kuping Hitam (Auricularia polytricha). Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan SULISTIYANI. Salah satu jamur yang sering dikonsumsi dan berfungsi sebagai obat adalah jamur kuping hitam. Jamur ini telah diketahui sebagai obat antihiperlipidemia dan diduga memiliki senyawa antioksidan yang mampu menyembuhkan penyakit penyempitan pembuluh darah serta tekanan darah tinggi yang diakibatkan pengaruh radikal bebas dari lingkungan. Ekstrak etanol 30 % jamur kuping hitam diteliti untuk mempelajari potensi antioksidasinya pada berbagai konsentrasi dengan menggunakan vitamin E 200 ppm (α-tokoferol) sebagai pembanding. Analisis dilakukan secara in vitro dengan metode thiobarbituric acid (TBA). Aktivitas antioksidasi ditentukan dengan cara mengoksidasi substrat asam linoleat pada suhu 40 °C selama delapan hari dengan atau tanpa ekstrak. Hasil oksidasi berupa malondialdehida (MDA) akan bereaksi dengan asam tiobarbiturat membentuk produk berupa kompleks berwarna merah (MDA-TBA) yang serapannya diukur dengan spektrofotometer pada λ 532 nm. Ekstrak jamur kuping hitam dengan konsentrasi 50, 100, 200, 500, dan 1000 ppm berturut-turut memiliki daya hambat sebesar 77.2%, 72.7%, 79.1%, 74.3%, dan 51.9%. Kontrol positif yang digunakan (α-tokoferol 200 ppm) memiliki daya hambat sebesar 67.6%. Dari hasil uji Duncan (α=0.05) diperoleh bahwa ekstrak dengan konsentrasi 50, 100, 200, dan 500 ppm memiliki aktivitas antioksidasi yang sebanding dengan α-tokoferol.
iii
ABSTRACT SYAHRUL FALAKH. Antioxidant Activity of Cloud Ear Fungus Extract (Auricularia polytricha). Under the direction of MEGA SAFITHRI and SULISTIYANI. One of fungus which is consumed and used as medicine is cloud ear fungus. This fungus has been known as antihiperlipidemic and is expected have antioxidant substances that be able to cure atherosclerosis and high blood pressure which is caused by free radical influences from environment. Ethanol extract (30%) from cloud ear fungus is observed for studying its antioxidant potential in various concentrations with 200 ppm vitamin E (α-tokoferol) as antioxidant standard. Antioxidant activity was determined using Thiobarbituric Acid (TBA) method. In this method, linoleic acid was oxidized by air at 40 °C for eight days with or without extract and the final product malondialdehida (MDA) was measured with spectrophotometer at λ 532 nm. Cloud ear fungus extract with concentration 50, 100, 200, 500, and 1000 ppm each has inhibition ability 77.2%, 72.7%, 79.1%, 74.3%, and 51.9%. Positive control that has been used has inhibition ability 67.6%. Based on Duncan test (α=0.05), extract with concentration 50, 100, 200, and 500 ppm have same antioxidant acitivity with αtokoferol.
iv
AKTIVITAS ANTIOKSIDASI EKSTRAK JAMUR KUPING HITAM (Auricularia polytricha)
SYAHRUL FALAKH
Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
v
Judul
:
Nama NIM
: :
Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Jamur Kuping Hitam (Auricularia polytricha) Syahrul Falakh G44104014
Disetujui Komisi Pembimbing
Mega Safithri, M.Si Ketua
drh. Sulistiyani, M.Sc, Ph.D Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus:
vi
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat, nikmat, dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini dengan lancar. Shalawat dan salam semoga selalu terlimpah kepada Nabi Muhammad s.a.w. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang telah dilaksanakan sejak bulan Agustus sampai Januari 2008 di Laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia FMIPA, IPB, Bogor. Ungkapan terimakasih penulis ucapkan kepada semua pihak yang telah membantu selama kegiatan penelitian dan penyusunan karya ilmiah. Penulis mendapatkan banyak bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung yang terlibat dalam pelaksanaannya. Terima kasih kepada Mega Safithri, M.Si dan drh. Sulistiyani, M.Sc, Ph.D, selaku komisi pembimbing atas segala dukungan dan ilmu baru yang diberikan kepada penulis serta seluruh staf Laboratorium Biokimia atas segala bantuan dan kemudahan dalam pengadaan alat dan bahan penelitian. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada kedua orangtua, kakak-kakakku, dan adikku atas dukungan, ridhonya, dan doanya, Mba Lusi, Syaefudin (rekan satu tim), Alfarabi, Laela, Paramitha, Iqbal, Aswan, Auline (teman satu pembimbing), Kak Aris, Kak Adi, Presiden Biokimia 38, penghuni Hikmah Camp, Nandha, Indra, Dedy, serta semua teman Biokimia 41 atas doa, perhatian, dan dukungannya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat dalam bidang ilmu pengetahuan.
Bogor, Juni 2008
Syahrul Falakh
vii
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tegal pada tanggal 28 Mei 1986 sebagai anak ketujuh dari delapan bersaudara dari pasangan Imam Turmudzi dan Nur’aeni. Tahun 2004 penulis lulus dari SMU 1 Negeri Slawi dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada Program Studi Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia Umum S1 Kedokteran Hewan dan S1 Teknologi Hasil Perairan, Struktur dan Fungsi Subseluler, serta Pengantar Penelitian Biokimia S1 Biokimia pada tahun akademik 2007/2008. Penulis juga pernah melaksanakan Praktik Lapangan (PL) di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Plasma Nutfah, Pemuliaan, dan Perbenihan, Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO), Bogor, selama periode Juli sampai Agustus dan menulis laporan ilmiah yang berjudul Pengaruh Penambahan Ancymidol Terhadap Penampilan Cincau Hitam (Mesona palustris) Secara In Vitro. Selain itu penulis juga pernah aktif di beberapa organisasi kemahasiswaan, yaitu sebagai staff Departemen Kewirausahaan Badan Eksekutif Mahasiswa TPB pada periode 2004/2005, staff Departemen Kewirausahaan Community of Research and Education in Biochemistry (CREB’s) pada periode 2005/2006, dan Ketua Departemen Kewirausahaan Community of Research and Education in Biochemistry (CREB’s) pada periode 2006/2007.
viii
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix PENDAHULUAN .................................................................................................. 1 TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 1 Jamur Kuping Hitam (Auricularia polytricha) ................................................... 1 Radikal Bebas, Lipid Peroksida, dan Antioksidan .............................................. 2 Metode Analisis Aktivitas Antioksidasi ............................................................. 4 α-tokoferol........................................................................................................... 5 BAHAN DAN METODE ....................................................................................... 5 Bahan dan Alat .................................................................................................... 5 Metode Penelitian ............................................................................................... 6 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 7 Kandungan Fitokimia .......................................................................................... 7 Penentuan Waktu Inkubasi Asam Linoleat Metode Diena Terkonjugasi ........... 8 Analisis MDA Aktivitas Antioksidasi Jamur Kuping Hitam.............................. 8 SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 11 Simpulan ........................................................................................................... 11 Saran.................................................................................................................. 11 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 11 LAMPIRAN .......................................................................................................... 14
ix
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Jamur kuping hitam (Auricularia polytricha). .................................................. 2 2 Mekanisme pembentukan radikal bebas ........................................................... 3 3 Mekanisme pembentukan radikal bebas dalam peroksidasi lipid ..................... 3 4 Reaksi antara MDA dengan TBA ..................................................................... 5 5 Nilai serapan ikatan diena terkonjugasi asam linoleat selama waktu inkubasi. 8 6 Konsentrasi MDA (μM) dari ekstrak jamur kuping hitam pada beberapa tingkatan konsentrasi......................................................................................... 9 7 Persentase daya hambat ekstrak jamur kuping hitam pada beberapa tingkatan konsentrasi. ....................................................................................................... 9
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahapan penelitian ........................................................................................... 15 2 Rendemen jamur kuping hitam ....................................................................... 15 3 Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan metode diena terkonjugasi . 16 4 Hasil analisis diena terkonjugasi ..................................................................... 16 5 Pembuatan kurva standar TMP ....................................................................... 17 6 Hasil pengukuran kurva standar TMP............................................................. 17 7 Pengukuran kadar MDA ................................................................................. 18 9 Uji statistik potensi antioksidasi sampel ......................................................... 20 10 Hasil uji fitokimia ekstrak jamur kuping hitam .............................................. 20
1
PENDAHULUAN Pola hidup modern yang telah menjadi kebiasaan dalam kehidupan masyarakat belakangan ini, telah mengubah pola konsumsi masyarakat. Pola konsumsi masyarakat yang serba instan, seperti makanan junkfood yang tidak sehat, dapat menimbulkan berbagai penyakit seperti penyakit jantung koroner (PJK) dan kanker. PJK merupakan salah satu penyebab kematian sepertiga dari seluruh kematian pada masyarakat makmur di dunia barat. PJK disebabkan oleh penyempitan nadi koroner, yaitu pembuluh nadi di dalam dinding jantung. Penyempitan pembuluh darah ini dapat disebabkan oleh adanya plak aterosklerotik yang dapat menyebabkan pembekuan darah lokal, yaitu adanya pengendapan atau penempelan lipid seperti low-density lipoprotein (LDL) yang bersifat arteogenik yang mudah teroksidasi menjadi radikal bebas, yang selanjutnya berubah menjadi LDL-teroksidasi. LDL teroksidasi yang berukuran kecil ini sangat mudah larut dalam darah dan masuk ke lapisan dalam dinding pembuluh darah. Apabila hal ini terus terjadi maka LDL ini akan membentuk suatu plak aterosklerotik yang selain dapat menyebabkan penurunan kelenturan pembuluh nadi jantung, juga dapat menghambat suplai oksigen dan glukosa yang akan menyebabkan terjadinya serangan jantung (Youngson 2005). Penyempitan pembuluh darah yang disebabkan LDL yang teroksidasi radikal bebas dapat dicegah dengan adanya antioksidan dalam tubuh. Antioksidan merupakan substansi kimia yang berfungsi untuk menetralisasi radikal bebas dengan cara memberikan elektron kepada radikal bebas (Atmosukarto & Mitri 2003). Selanjutnya antioksidan dapat mencegah terjadinya kerusakan pada sel normal terutama pada bagian-bagian sel seperti protein, karbohidrat, lipid, dan DNA (Tuminah 1999). Antioksidan dapat berupa enzim yang terdapat dalam tubuh seperti superoksida dismutase, glutation peroksidase, dan katalase. Selain itu, terdapat antioksidan yang merupakan senyawa nonenzim seperti vitamin E, vitamin A, vitamin C, betakaroten, selenium, dan tirosin (Kartawiguna 1998). Biasanya senyawa antioksidan non-enzim berasal dari bahan makanan. Salah satu komoditi bahan makanan yang diduga memiliki potensi sebagai antioksidan
adalah jamur. Sekitar 15000 spesies jamur yang ada di dunia, 700 spesies diantaranya telah digunakan sebagai obat. Salah satu diantaranya adalah kuping hitam (Auricularia polytricha). Jamur kuping hitam tergolong dari kelas basidiomycota dan merupakan jenis jamur yang aman dimakan (edible mushroom) karena tidak mengandung senyawa yang bersifat toksik (Chang & Miles 1989). Jamur kuping hitam dipercaya memiliki khasiat sebagai obat sakit tenggorokan (sore throat), obat cacing, penurun gula darah, serta mampu menyembuhkan penyakit penyempitan pembuluh darah dan tekanan darah tinggi. Jamur kuping hitam telah diketahui sebagai antihiperlipidemia. Menurut Dahlianti (2001), ekstrak etanol jamur kuping hitam mampu menurunkan kadar kolesterol dan kadar trigliserida pada hewan coba tikus galur whistar. Selain itu, ekstrak metanol dari jamur kuping hitam dapat berfungsi sebagai antibakteri (Gbolagade & Fasidi 2005). Namun sampai saat ini penelitian mengenai potensi antioksidan jamur kuping hitam secara in vitro masih belum dilakukan. Oleh karena itu penelitian tentang potensi antioksidasi jamur kuping hitam secara in vitro perlu dilakukan. Penelitian ini bertujuan menentukan adanya aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 30% jamur kuping hitam dengan menggunakan metode TBA, serta membandingkan potensi antioksidasinya dengan vitamin E (α-tokoferol). Hipotesis penelitian ini adalah ekstrak etanol jamur kuping hitam memiliki potensi sebagai antioksidan yang ditentukan dengan adanya penghambatan proses oksidasi asam linoleat oleh radikal bebas secara in vitro. Hasil penelitian ini diharapkan memberikan informasi ilmiah mengenai potensi jamur kuping hitam sebagai antioksidan alami yang selanjutnya dapat dijadikan dasar untuk pengembangan jamur kuping hitam sebagai produk fitofarmaka.
TINJAUAN PUSTAKA Jamur Kuping Hitam (Auricularia polytricha) Jamur merupakan tubuh buah yang tampak di permukaan media tumbuh dari sekelompok fungi (Basidiomycota), berbentuk seperti payung dan terdiri dari bagian yang tegak atau batang serta bagian yang membulat atau
2
mendatar. Secara teknis biologis, tubuh buah ini disebut basidium. Beberapa jenis jamur ada yang aman untuk dimakan manusia (edible) dan ada yang tidak aman dimakan (nonedible) karena memiliki senyawa yang bersifat toksik (Chang & Miles 1989). Beberapa contoh jamur aman dimakan adalah jamur merang (Volvariela volvacea), jamur tiram (Pleurotus ostreatus), jamur kuping (Auricularia polytricha), jamur kancing atau champignon (Agaricus campestris), dan jamur shitake (Lentinus edulis). Jamur-jamur tersebut diduga memiliki komponen bioaktif yang dapat berfungsi sebagai obat. Salah satu diantaranya adalah jamur kuping. Jamur kuping hitam merupakan salah satu dari berbagai jenis jamur kayu yang dapat dikonsumsi. Disebut sebagai jamur kuping karena jamur yang tergolong dalam genus Auricularia ini mempunyai bentuk dan kekenyalan yang menyerupai kuping atau telinga. Biasanya jamur kuping dikenal juga sebagai jamur kuping pohon atau kuping kayu, karena tumbuh pada batang-batang kayu terutama kayu yang sudah lapuk (Cahyana 2002). Jamur kuping hitam memiliki bentuk tubuh berupa lembaran yang bergelombang, tidak menentu, dan berbentuk seperti cawan. Secara umum ciri jamur kuping hitam adalah berdaging lunak seperti agar-agar, berlendir, tubuh buahnya berwarna keunguan atau hitam dengan lebar 6-10 cm, elastis, tembus cahaya, dan tidak berbau (Gambar 1). Jamur kuping optimum tumbuh pada suhu 20-30 ºC di daerah beriklim dingin sampai panas. Kelembaban ideal yang dibutuhkan berkisar 80-90% (Cahyana 2002). Menurut Alexopoulos dan Mims (1979) Auricularia polytricha diklasifikasikan dalam divisi Eumycota, subdivisi Basidiomycota, kelas Heterobasidiomycetes, subkelas Phragmobasidiomycetidae, ordo Auriculariales, famili Auriculariaceae, genus Auricularia, dan spesies Auricularia polytricha. Sebagai bahan makanan yang banyak dikonsumsi di Asia, terutama di daerah Cina dan Jepang, nutrisi yang terkandung dalam jamur kuping cukup tinggi. Jamur ini mengandung 4.2% protein, 2.8% karbohidrat, 5.3 % lemak, dan 19.8 % serat (Chang & Miles 1989). Selain itu jamur kuping juga mengandung kalsium, kalium, fosfor, kalsium, magnesium, besi, dan natrium (Gbolagade et al 2006). Selain kandungan nutrisinya, lendir pada jamur kuping hitam berkhasiat untuk
menetralkan senyawa racun berbahaya yang terdapat dalam bahan makanan. Wasser dan Alexander (1999) menyatakan jamur kuping sudah digunakan sebagai obat maupun suplemen serta dikomersialkan sebagai antihiperlipidemia dan obat kardiovaskular. Di Inggris ekstrak jamur kuping dimanfaatkan sebagai obat sakit tenggorokan (sore throat), obat cacing, dan penurun gula darah. Menurut Dahlianti (2001), pemberian ekstrak etanol 30% jamur kuping hitam pada tikus galur wistar dengan dosis 0.4g/kg bobot badan, mampu menurunkan kadar kolesterol dan kadar trigliserida dalam darah. Pada kelompok perlakuan yang dicekok ekstrak jamur kuping hitam menunjukkan peningkatan konsentrasi kolesterol dan trigliserida tidak sebesar kelompok kontrol kolesterol. Sementara itu, pada tahap pengobatannya, pencekokan ekstak mampu menurunkan kadar kolesterol dan kadar trigliserida masing-masing sebesar 41.7% dan 25.9%. Salah satu jamur yang tergolong kelas basidiomycetes selain jamur kuping hitam dan banyak dikonsumsi adalah jamur tiram (Pleurotus ostreatus). Jamur tiram mampu memproduksi lovastatin dalam jumlah banyak. Lovastatin merupakan salah satu obat penurun kolesterol darah dan merupakan kelompok statin yang berfungsi sebagai inhibitor enzim reduktase HMG-KoA (Wasser & Weis 1999). Selain itu, ekstrak etanol 30% jamur tiram mampu menurunkan kadar kolesterol darah pada hamster jantan (Bobek et al 1993).
Gambar 1 Jamur kuping hitam (Auricularia polytricha). Radikal Bebas, Lipid Peroksida, dan Antioksidan Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbital terluarnya (Mimić-Oka et al 1999). Adanya elektron bebas yang tidak berpasangan
3
mengakibatkann radikal bebaas bersifat sanngat m r reaktif dan tiddak stabil. Unntuk menstabillkan d radikal beebas cenderungg bereaksi denngan diri, s senyawa lain untuk mendaapatkan pasanngan e elektron. Beb berapa radik kal bebas yyang t terdapat di daalam tubuh anntara lain radiikal h hidroksil (OH*), radikal perooksil lipid (LOO O*), * r radikal oksid da nitrit (NO O ), dan radiikal s supeoksida (O2*) (Langseth 1995). 1 Radikal beebas dapat dih hasilkan dari hhasil m metabolisme t tubuh (endogenous) misalnnya, s sekitar 5 perseen dari oksigenn pernafasan aakan d diubah menjaadi radikal bebas. Selain itu f faktor ekstern nal (eksogenoous) juga daapat m menghasilkan radikal bebaas, seperti aasap r rokok, hasil penyinaran ultra u violet, zat k kimiawi dalaam makanann maupun ddari s senyawa-senya awa polutan laain. Adanya attom a atau molekul radikal bebas terjadi melaalui s sederetan mekanisme reakksi (Gambar 2). R Reaksi tahap pertama adallah pembentuukan r radikal bebas awal (inisiassi). Tahap keedua a adalah penambbatan atau terb bentuknya radiikal b baru (propagaasi). Reaksi ini terjadi seccara t terus meneruss karena menghasilkan radiikal b bebas lain yang y menyebaabkan terjadinya p proses oksidassi lebih lanjutt. Tahap terakkhir a adalah terminnasi, yaitu peenghilangan aatau p pengubahan raadikal bebas menjadi moleekul s stabil dan tak reaktif. Term minasi terjadi bila b a ada reaksi an ntara radikal bebas b itu senndiri ( (Hart 1983). mbul Beberapa kerusakan yaang dapat tim a akibat serangan radikal bebas antara lain l k kerusakan prootein, DNA, peroksidasi p lippid, k kerusakan membran sel, terutama penyuusun m membran sel berupa b asam lemak tidak jennuh y yang merupakkan bagian darri fosfolipid serta p protein, meenimbulkan dan autoimun, m menyebabkan penyakit degeeneratif. Penyakit y yang disebabkan oleh radikaal bebas umum mnya b bersifat kron nis, yaitu dibutuhkan waaktu b bertahun-tahun n untuk peenyakit terseebut m menjadi nyatta (terjadi akumulasi a dallam t tubuh). Conttoh penyakitt yang serring d dihubungkan dengan radikkal bebas adaalah p penyakit jantu ung koroner dan d kanker. A Akan t tetapi, keberradaan radikaal bebas tidak s selamanya berrbahaya bagi tubuh. Misalnnya, r radikal bebas berperan daalam pencegaahan p penyakit yangg disebabkan mikroba melalui s sel-sel darah khhusus (Tuminaah 2000). Salah satu molekul yangg sensitif terhaadap s serangan radik kal bebas adaalah lipid. Reaaksi a antara lipid dan radikaal bebas aakan m menghasilkan lipid perokssida. Peroksiddasi l lipid terjadi akibat a serangaan radikal beebas t terhadap asam m lemak tak jenuh majem muk
(PUF FA) yang seddikitnya meng gandung tiga ikatan n rangkap (Hallliwel dan Guttteridge 1985, diacuu dalam Wiseeman et al 20005). Reaksi radik kal bebas terhadap PU UFA akan meng ghasilkan perooksil lipid (R ROO*) yang dapatt menghasilkann lipid perokssida (Gambar 3). Jiika radikal perroksil lipid berreaksi dengan PUFA A yang lain dapat membbentuk lipid perokksida (ROOH) dan lipid bebbas (R*) yang baru. Lipid peroksida terben ntuk akibat hilanngnya sebuahh atom hidrrogen yang diakibatkan seranggan radikal peeroksil lipid. ksi ini berlanggsung secara berantai dan Reak terus menerus, sebaab reaksi ini menghasilkan m radik kal lipid bebass (R*) yang lain l (Murray 2003). m tubuh tidak Juumlah lipid peeroksida dalam boleh h melebihi kkadar normalnnya yaitu 4 nmoll/mL (Yagi 19994). Seiring bertambahnya b usia, kadar peroksiida lipid dalam m tubuh akan semaakin meningkaat. Tingginya kadar lipid perokksida dalam ttubuh dapat menyebabkan m terjaddinya penyakkit kardiovasskular yaitu strokke (sakit janttung) dan atterosklerosis. Ateroosklerosis m merupakan penyempitan pemb buluh darah yyang terjadi akkibat adanya penem mpelan kolesterol/lipid padaa sel endotel pemb buluh darah arrteri. Hal ini berawal dari tinggginya LDL yyang bersifatt aterogenik (muddah teroksidasi menjadi raddikal bebas), yang kemudian larrut dalam darrah dan akan menjadi plak aterossklerotik.
Gamb bar 2 Mekaniisme pembenttukan radikal bebas (H Hart 2003).
Gamb bar 3 Mekaniisme pembenttukan radikal bebas daalam peroksidaasi lipid.
4
Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menetralisir atau menstabilkan radikal bebas dengan cara melengkapi kekurangan elektron pada radikal bebas tersebut. Substansi ini mampu mencegah terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas yang dapat menimbulkan stres oksidatif (ketidakseimbangan antara prooksidan dan antioksidan). Mekanisme kerja antioksidan pada radikal bebas terdapat tiga macam, yaitu (1) antioksidan primer yang mampu mengurangi pembentukan radikal bebas baru dengan cara memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil. Contohnya adalah SOD (superoskida dismutase), glutation peroksidase, dan katalase yang dapat mengubah radikal superoksida menjadi molekul air. (2) Antioksidan sekunder berperan mengikat radikal bebas dan mencegah amplifikasi senyawa radikal. Beberapa contohnya adalah vitamin C, vitamin B, vitamin E, betakaroten dan senyawa fitokimia. (3) Antioksidan tersier yang berperan dalam mekanisme biomolekuler. Antioksidan tersier terdiri atas enzim perbaikan DNA dan metionin sulfoksida reduktase (Kartikawati 1999). Menurut Winarno (1997), antioksidan diklasifikasikan menjadi dua jenis yaitu sintetik dan alami. Antioksidan sintetik merupakan antioksidan hasil sintesis reaksi kimia. Beberapa antioksidan sintetik yang sering digunakan butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), propilgalat (PG), nordihidroguaricetic Acid (NDGA). Antioksidan sintetik tersebut adalah senyawa-senyawa fenol yang biasanya beracun, sedangkan antioksidan alami diperoleh dari hasil ekstraksi bahan alami. Contohnya antara lain tokoferol, lesitin, fosfatida, sesamol, gosipol, dan asam askorbat. Berdasarkan sumbernya, antioksidan terbagi menjadi antioksidan endogen dan antioksidan eksogen. Antioksidan endogen merupakan antioksidan yang dapat diproduksi oleh tubuh sendiri atau secara alami terdapat di dalam tubuh. Beberapa enzim dalam tubuh yang merupakan antioksidan endogen adalah superoksida dismutase, glutation peroksidase, glutation peroksidase, biliverdin reduktase, katalase, tioredoksin reduktase, dan heme oksigenase. Contoh antioksidan endogen lain yang bukan enzim adalah glutation dan koenzim-Q. Antioksidan eksogen adalah antioksidan yang diperoleh dari luar tubuh atau dari asupan makanan. Contohnya antara
lain vitamin C, vitamin E, dan beberapa senyawa fitokimia pada beberapa jenis tanaman, yaitu flavonoid, senyawa fenol, terpenoid, alkaloid, saponin, dan tanin (Atmosukarto 2003). Metode Analisis Aktivitas Antioksidasi Aktivitas antioksidasi dapat diuji secara langsung maupun tidak langsung. Pengujian secara langsung didasarkan pada pengukuran produk-produk utama dari oksidasi lipid, yang umumnya adalah hidroperoksida dan produk sekunder seperti aldehid. Pengujian aktivitas antioksidan secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa metode diantaranya adalah metode oksigen aktif (active oxygen methods, AOM), metode feritiosianat (FTC), metode tiobarbituric acid (TBA), uji Schall, uji masa simpan, dan metode Rancimat (Adawiyah et al 2001). Pengujian secara tidak langsung didasarkan pada pengukuran selain produk utama atau sekunder dari oksidasi lipid, misalnya jumlah oksigen yang diperlukan untuk oksidasi. Beberapa pengujian aktivitas antioksidasi secara tidak langsung, yaitu uji wadah oksigen (Oxygen Bomb Test), sistem emulsi β-karoten-linoleat, penyemprotan larutan β-karoten, dan metode penimbangan (Adawiyah et al 2001). Selain metode tersebut, ada pula beberapa metode lainnya seperti bilangan ansindin, uji bilangan peroksida, metode Kreis, dan diena terkonjugasi. Metode yang digunakan untuk menentukan aktivitas oksidasi pada penelitian ini adalah metode TBA. Menurut Kikuzaki dan Nakatani (1993), prinsip dari metode ini adalah proses autooksidasi dari asam linoleat akan menghasilkan malondialdehida (MDA) yang dengan adanya asam 2-tiobarbiturat akan membentuk kompleks MDA-TBA yang berwarna merah muda yang dapat diukur serapannya pada λ 532 nm (Gambar 4). Secara spektrofotometri, uji TBA digunakan unutk mengukur jumlah MDA dalam bentuk tiobarbituric acid reactive substsances (TBARS). Reaksi TBA diketahui sangat sensitif terhadap peroksida lipid. Meski demikian produk oksidasi lipid lainnya seperti 2-alkenals, 2,4-alkenadials, dan 2,4hidroxyalkenals serta senyawa-senyawa non lipid lainnya seperti gula, asam amino, urea, biliverdin, glioksal, dan furfural aldehid dapat bereaksi dengan TBA membentuk kompleks berwarna yang dapat terukur pada panjang
5
HS 2
N
OH
+
N
CHO CH2 CHO
OH TBA
S
N N
OH
HO
N
C C C H H H OH
MDA
OH Produk
SH
N
+
2H2O
Air
Gambar 4 Reaksi antara MDA dengan TBA gelombang yang sama (Schultz 1963; Wong 1995) Sebelum uji potensi antioksidasi dengan metode TBA, terlebih dahulu dilakukan pengukuran diena terkonjugasi yang merupakan produk primer dari oksidasi asam linoleat dengan metode diena terkonjugasi. Pengukuran dilakukan untuk menentukan waktu inkubasi asam linoleat pada uji potensi antioksidasinya. Tahapan awalnya (inisiasi) asam linoleat akan dioksidasi menjadi diena terkonjugasi. Kemudian pada tahap berikutnya (propagasi), kadar diena terkonjugasinya terus meningkat dan akan mencapai kadar yang maksimum. Diena terkonjugasi tersebut dapat ditentukan intensitas penyerapannya pada λ 234 nm (Rossel 1983, diacu dalam Tensiska 2001). Selanjutnya diena terkonjugasi akan membentuk hidroperoksida dan akan mengalami dekomposisi menjadi MDA. Metoda diena terkonjugasi digunakan sebagai metode untuk menentukan waktu inkubasi linoleat karena metode ini lebih cepat. lebih sederhana, dan membutuhkan sampel dalam jumlah yang cukup kecil dibandngkan dengan beberapa metode yang lain. α-tokoferol Vitamin E merupakan antioksidan yang tergolong senyawa fenolik yang larut lemak serta terletak di membran eritosit dan plasma lipoprotein. Sebagai antioksidan dalam tubuh, vitamin E bertindak sebagai scavenger (penangkap) radikal-radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh atau terbentuk di dalam tubuh dari proses metabolisme normal. Vitamin E bertindak sebagai donor ion hidrogen dan dapat mengubah radikal peroksil (hasil peroksidasi lipid) menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif dan relatif stabil sehingga tidak mampu merusak rantai asam lemak. Vitamin E terdiri atas beberapa macam diantaranya adalah α-tokoferol, β-tokoferol, δtokoferol, dan γ-tokoferol. Komponen vitamin E yang paling banyak ditemukan adalah α-
tokoferol yang memiliki cincin aromatik tersubtitusi dan rantai panjang isoprenoid sebagai rantai samping (Lehinger 1997). Peranan vitamin E dalam sel adalah dengan cara mengikat radikal bebas. Dalam jaringan, vitamin E menekan terjadinya asam lemak tidak jenuh yang terdapat pada membran, dengan demikian mampu menjaga atau mempertahankan fungsi membran. Menurut (Turkoglu et al 2006), vitamin E dengan konsentrasi 80 dan 160 ppm mampu menghambat terjadinya oksidasi masing masing sebesar 98.6% dan 99.2%. Oleh karena itu senyawa ini dijadikan sebagai antioksidan pembanding untuk ekstrak jamur kuping hitam.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penapisan fitokimia adalah etanol 30%, kloroform, amoniak, H2SO4, pereaksi Dragendrof, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, FeCl3, eter NaOH 10%, dan aquades. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis waktu inkubasi dan analisis MDA adalah etanol 70%, etanol absolut, air bebas ion, asam linoleat 50 mM, bufer fosfat 0.1 M pH 7, NaOH 0.1 M, α-tokoferol (Vitamin E), TMP (1,1,3,3-tetrametoksipropana), TCA (asam trikloroasetat), TBA (Tiobarbituric Acid) 1%, asam asetat glasial, dan jamur kuping hitam. Alat-alat yang digunakan dalam penapisan fitokimia adalah gelas piala, mortar, tabung reaksi, papan uji, penangas, kain kasa, sudip, corong, dan gegep. Alat-alat yang digunakan untuk analisis waktu inkubasi dan analisis MDA ialah gelas piala, pipet Mohr, pipet tetes, mikropipet, oven, botol gelap berulir, vortex, gelas ukur, penangas air, batang pengaduk, labu Erlenmeyer, labu takar, termometer, kuvet, spektrofotometer, sentrifus, dan tabung sentrifus.
6
Metode Penelitian Analisis Fitokimia Ekstrak Jamur Kuping Hitam (Harbone 1987) Uji Alkaloid. Ke dalam 10 mL kloroform ditambahkan ekstrak sampel sebanyak 0.0512 g dan beberapa tetes ammonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam diambil kemudian ditambahkan dengan pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan merah oleh pereaksi Dragendorf, endapan putih oleh pereaksi Meyer, dan endapan coklat oleh pereaksi Wagner. Sebagai kontrol positif digunakan daun tapak dara. Uji Saponin. Ekstrak sampel sebanyak 0.0535 g ditambah air secukupnya dan dipanaskan selama lima menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok. Timbulnya busa selama ± 10 menit menunjukkan adanya saponin. Sebagai kontrol positif digunakan buah klerak. Uji Flavonoid dan Fenolik Hidrokuinon. Ekstrak sampel sebanyak 0.0521 g ditambah metanol 30% sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditambah NaOH 10% (b/v) atau H2SO4. Terbentuknya warna merah karena penambahan NaOH menunjukkan adanya senyawa fenolik hidrokuinon, sedangkan warna merah yang terbentuk akibat penambahan H2SO4 pekat menunjukkan adanya flavonoid. Sebagai kontrol positif digunakan biji buah pinang. Uji Triterpenoid dan Steroid. Ekstrak sampel sebanyak 0.0510 g ditambah 25 mL etanol 30% kemudian dipanaskan dan disaring. Selanjutnya filtrat diuapkan dan ditambah eter. Lapisan eter ditambah dengan pereaksi Lieberman Buchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid. Sebagai kontrol positif digunakan somjawa. Uji Tanin. Ekstrak sampel sebanyak 0.0518 g ditambah 5 mL air dan dididihkan selama beberapa menit. Selanjutnya campuran disaring dan filtratnya ditambah FeCl3 1% (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin. Sebagai kontrol positif digunakan daun teh hijau. Penentuan Waktu Inkubasi dengan Metode Diena Terkonjugasi (Esterbaur et al 1989, diacu di dalam Ekawati 2007) Sebanyak 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7, 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol
99.8%, dan 1 mL air bebas ion dicampurkan dan ditempatkan pada botol gelap berulir, kemudian campuran dan diinkubasi pada suhu 40 °C. Pengukuran intensias serapannya dilakukan dengan cara sebanyak 50 µL campuran asam linoleat yang telah diinkubasi ditambahkan ke dalam 6 mL etanol 75%. Selanjutnya campuran tadi dibaca serapannya pada panjang gelombang 234 nm. Larutan etanol 75% digunakan sebagai blanko. Pengukuran dilakukan tiap hari sampai tercapai serapan maksimum dan memberikan hasil pengukuran yang cenderung turun. Analisis Potensi Antioksidasi dengan Metode TBA (Kikuzaki 1993) Ekstrak jamur kuping dibuat dalam konsentrasi 50, 100, 200, 500, dan 1000 ppm. Masing-masing sampel diambil sebanyak 1 mL, selanjutnya ditambahkan dengan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%. Larutan kontrol positif digunakan 1 mL α-tokoferol, 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%, sedangkan untuk larutan kontrol negatif ditambahkan 1 mL air bebas ion, 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%. Semua larutan ini kemudian dimasukkan dalam botol gelap berulir dan diinkubasi di penangas 40 °C selama waktu inkubasi optimum dari metode diena terkonjugasi. Dua hari setelah waktu inkubasi maksimum, dilakukan pengukuran TBARS melalui metode TBA (Kikuzaki & Nakatani 1993) dengan mengambil 1 mL dari setiap larutan, kemudian ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Blanko yang digunakan adalah akuades dengan perlakuan yang sama. Selanjutnya campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100 °C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Kemudian panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan TMP dengan konsentrasi 1.5, 3, 6, 9, 12, 15, dan 18 µM. Tiap larutan dipipet 1 mL dan ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100 °C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Kemudian serapannya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Blanko yang digunakan
7
adalah akuades dengan perlakuan yang sama (Yagi 1994). Analisis Data Data kadar MDA yang bereaksi dengan TBA membentuk kompleks MDA-TBARS dianalisis secara statistik dengan menggunakan metode rancangan acak lengkap (RAL) (Gaspersz 1994). Model rancangan tersebut adalah: Yij = μ + λ + εij keterangan: μ = Pengaruh rataan umum λi = Pengaruh perlakuan ke-i, i = 1,2,3,..,6 εij = Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j = 1,2,3 i = 1 adalah kontrol negatif (akuades) i = 2 adalah pembanding atau kontrol positif α-tokoferol 200 ppm i = 3 adalah ekstrak jamur kuping 50 ppm i = 4 adalah ekstrak jamur kuping 100 ppm i = 5 adalah ekstrak jamur kuping 200 ppm i = 6 adalah ekstrak jamur kuping 500 ppm i = 7 adalah ekstrak jamur kuping 1000 ppm
HASIL DAN PEMBAHASAN Kandungan Fitokimia Ekstraksi jamur kuping hitam dilakukan oleh Sulistiyani et al (2007) dan mengacu pada penelitian Dahlianti (2001) yaitu dengan menggunakan metode maserasi dengan etanol 30% sebagai pelarut. Rendemen yang diperoleh adalah sebesar 14.77%. Persentase tersebut menunjukkan banyaknya senyawa bioaktif yang diduga sebagai senyawa bioaktif yang terekstrak. Ekstrak ini selanjutnya dianalisis secara kualitatif untuk menentukan kandungan senyawa fitokimianya. Analisis fitokimia merupakan uji pendahuluan yang digunakan untuk mengetahui adanya senyawa-senyawa
metabolit sekunder pada ekstrak jamur kuping. Bahan-bahan metabolit sekunder seperti alkaloid, saponin, polifenol, terpenoid, flavonoid, dan sebagainya dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain: lingkungan tumbuh, umur tanaman saat dipanen, waktu panen dan penanganan pasca panen. Bahan yang digunakan sebagai kontrol positif dalam analisis penapisan fitokimia terhadap ekstrak jamur kuping hitam adalah daun tapak dara (uji alkaloid), buah klerak (uji saponin), teh hijau (uji tanin), som jawa (uji triterpenoid), dan biji buah pinang (uji flavonoid dan fenolik). Bahan-bahan ini diketahui memiliki senyawa fitokimia tertentu dalam jumlah yang cukup banyak. Hasil uji dikatakan positif jika ekstrak jamur kuping memberikan hasil reaksi berupa terbentuknya warna, buih, dan endapan seperti yang terjadi pada sistem campuran kontrol positif. Penapisan fitokimia ekstrak jamur kuping menunjukkan hasil positif pada uji senyawa golongan alkaloid, fenolik/hidrokuinon, dan flavonoid (Tabel 1). Hasil negatif ditunjukkan pada saponin, tanin, dan steroid. Hal ini disebabkan senyawa saponin pada umumnya larut dalam air, namun sedikit atau sama sekali tidak dalam etanol dan metanol pekat (Muchtadi 1989). Selain itu, tidak terdapatnya steroid disebabkan sifat dari steroid yang relatif nonpolar, sehingga kemungkinannya kecil untuk larut dalam etanol 30% (Koolman & Rohm 2000). Hasil ini berbeda dengan penelitian Dahlianti (2001), yang menunjukkan ekstrak jamur hitam hanya memiliki senyawa triterpenoid/steroid. Sementara itu hasil analisis serbuknya memiliki senyawa flavonoid, dan triterpenoid/steroid. Perbedaan kandungan metabolit sekunder pada jenis tanaman yang sama sering kali terjadi karena pengaruh lingkungan. Kandungan metabolit sekunder yang disekresikan oleh tanaman
Tabel 1 Hasil uji fitokimia ekstrak etanol 30%jamur kuping hitam Uji Sampel Ekstrak etanol 30% Kontrol positif Alkaloid Dagendorf + Daun tapak dara Wagner ++++ Daun tapak dara Mayer + Daun tapak dara Saponin Buah klerak Tanin Daun teh hijau Triterpenoid/steroid Som jawa Flavonoid + Biji buah pinang Fenolik/Hidrokuinon ++ Biji buah pinang Keterangan: (++++): tinggi, (+++): sedang, (++): cukup, (+): rendah, (-): tidak ada
++++ ++++ ++ ++++ ++++ ++++ +++ +++
8
Penentuan Waktu Inkubasi Asam Linoleat Metode Diena Terkonjugasi Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan metode diena terkonjugasi terlebih dahulu dilakukan sebelum pengukuran aktivitas antioksidasi sampel. Sistem asam linoleat yang digunakan akan teroksidasi oleh oksigen. Sebelum membentuk produk akhir peroksida lipid, asam linoleat yang terkena radikal bebas akan menstabilkan diri dengan cara menata ulang ikatan rangkapnya sehingga terbentuk diena terkonjugasi (Murray 1999). Ikatan diena terkonjugasi akan memberikan serapan spesifik pada panjang gelombang 234 nm (Rossel 1983, diacu dalam Tensiska 2001). Analisis diena terkonjugasi memberikan hasil pengukuran yang meningkat dari hari ke0 dan menghasilkan absorbansi maksimum pada hari ke-6 (Gambar 5). Pada hari tersebut pembentukan diena terkonjugasi telah mencapai hasil yang maksimum yang selanjutnya akan menurun pada hari berikutnya. Setelah hari ke-8 nilai absorbansi terus menurun sampai hari ke-10. Penurunan diena terkonjugasi terjadi karena diena terkonjugasi mengalami dekomposisi secara bertahap membentuk hidroperoksida dan berlanjut membentuk hasil akhir dari oksidasi lipid yang kebanyakan menjadi MDA. Proses penataan ulang pada linoleat yang terkena radikal bebas yang selanjutnya membentuk diena terkonjugasi dipengaruhi oleh suhu inkubasi yang tidak stabil dan adanya oksigen
dalam campuran linoleat. Hal inilah yang diduga menyebabkan kenaikan pada hari ke-8. Menurut Tensiska (2001), pembentukan diena terkonjugasi proporsional dengan konsumsi oksigen dan pembentukan peroksida lipid selama tahap awal oksidasi. Hasil penentuan waktu inkubasi linoleat dengan metode diena terkonjugasi dipengaruhi oleh beberapa faktor yang dapat memberikan nilai absorbans maksimum pada hari yang berbeda-beda. Menurut Adikusuma (2007) hasil absorbansi maksimum pada campuran linoleat diperoleh pada hari ke-6. Hasil yang berbeda ditunjukan oleh Martolisch dan Ekawati (2007) yang menyatakan absorbans maksimum dicapai pada hari ke-3. Faktor yang menyebabkan perbedaan hasil tersebut adalah kualitas asam linoleat, suhu inkubasi yang tidak konstan, serta keberadaan oksigen. Jumlah hari yang diperlukan pada inkubasi linoleat agar mencapai absorbans maksimum akan menentukan lamanya waktu inkubasi pada penentuan aktivitas antioksidasi ekstrak. 1.4 1.2 1 Absorban
tergantung pada variasi genetik individual dan kondisi geografis tempat tumbuh. Selain itu, penggunaan bahan yang dipakai, serta kesensitifan alat dalam menganalisis senyawa fitokimia tersebut dapat mempengaruhi hasil yang diperoleh sehingga memungkinkan terjadinya hasil uji yang berbeda. Senyawa fenolik dan flavonoid merupakan komponen bioaktif yang sering ditemukan pada beberapa jenis jamur yang aman dimakan. Beberapa jenis jamur tersebut adalah jamur Ramaria flava (Gezer et al 2006) dan Russula delica (Turkoglu et al 2007). Ekstrak etanol dari kedua jenis jamur tersebut memiliki komponen bioaktif berupa senyawa flavonoid, dan fenolik/hidrokuinon. Selain itu, senyawa fenolik/hidrokuinon juga ditemukan pada ekstrak etanol Morchella conica (Turkoglu et al 2006). Senyawa tersebut diduga sebagai komponen bioaktif yang berfungsi sebagai antioksidan alami yang mampu menghambat terbentuknya lipid peroksida pada sistem linoleat.
0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
2
4
6
8
10
12
Hari ke-
Gambar
5
Nilai serapan ikatan diena terkonjugasi asam linoleat selama waktu inkubasi.
Analisis MDA Aktivitas Antioksidasi Jamur Kuping Hitam Berdasarkan hasil penentuan waktu inkubasi linoleat yang memberikan absorban maksimum pada hari ke-6, pengukuran MDA dilakukan pada hari ke-8 dengan harapan hidroperoksida telah mengalami dekomposisi sempurna membentuk MDA. Senyawa MDA yang terbentuk dari hasil dekomposisi dari hidroperoksida dianalisis dengan metode TBA untuk menentukan aktivitas antioksidasinya. MDA hasil terminasi diukur sebagai TBARS dan bereaksi dengan TBA membentuk kompleks MDA-TBA menghasilkan kompleks warna merah muda dengan serapan maksimum pada panjang gelombang 532 nm
9
(Kikuzaki & Nakatani 1993). Sebagai kurva standarnya digunakan senyawa TMP pada berbagai konsentrasi. TMP digunakan sebagai standar karena akan membentuk MDA jika dihidrolisis dengan asam. Persamaan yang diperoleh dari kurva standar TMP digunakan untuk menentukan konsentrasi MDA. Hasil uji TBA pada campuran asam linoleat dan bufer fosfat, terlihat bahwa secara keseluruhan ekstrak jamur kuping hitam mampu menghambat terjadinya oksidasi asam linoleat yang ditandai dengan konsentrasi MDA yang terukur lebih kecil dibandingkan dengan kontrol negatif (akuades). Konsentrasi MDA dari tiap-tiap perlakuan dapat dilihat pada Gambar 6. Kontrol negatif menghasilkan konsentrasi MDA yang tinggi dibandingkan perlakuan yang lain yaitu 10.961 μM. Tidak adanya senyawa yang berperan sebagai antioksidan mengakibatkan asam linoleat akan terus mengalami oksidasi membentuk MDA dalam jumlah yang cukup banyak. Kontrol positif (vitamin E 200 ppm) memiliki konsentrasi MDA sebesar 3.566 μM. Hal ini menunjukkan vitamin E sebagai antioksidan mampu menghambat pembentukan MDA. Vitamin E bertindak sebagai donor ion hidrogen dan dapat mengubah radikal peroksil (hasil peroksidasi lipid) menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif sehingga tidak mampu merusak rantai asam linoleat. Hampir secara keseluruhan, perlakuan penambahan ekstrak jamur kuping memberikan hasil konsentrasi MDA yang lebih rendah dibandingkan dengan kontrol positif. Secara berturut-turut konsentrasi 50, 100, 200, 500, dan 1000 ppm memberikan hasil konsentrasi MDA sebesar 2.495, 2.988, 2.287, 2.817, dan 5.270 μM. Konsentrasi MDA cenderung meningkat pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi yang tinggi (1000 10.961± 0.307
90 77.2
80
10.000
67.6
70 5.270± 1.945
8.000 6.000
3.556± 1.165
4.000
2.988± 2.817± 2.495± 0.276 2.287± 0.140 0.593 0.290
% daya hambat
Konsentrasi MDA (μM)
12.000
ppm). Ekstrak jamur kuping hitam dapat berubah sifat menjadi prooksidan jika pemberian ekstrak dilakukan pada konsentrasi yang lebih tinggi lagi. Menurut Gordon (1990), ekstrak suatu bahan yang memiliki peran sebagai antioksidan dapat berubah sifatnya menjadi prooksidan jika pemberian dilakukan dalam konsentrasi dalam jumlah yang tinggi. Aktivitas penghambatan (% daya hambat) terhadap pembentukan MDA dari tiap perlakuan juga dapat dihitung dari kadar MDA yang diperoleh (Gambar 7). Persentase daya hambat menggambarkan besarnya potensi dari masing-masing ekstrak dengan berbagai konsentrasi dalam berperan sebagai antioksidan. Kontrol negatif digunakan sebagai acuan untuk menentukan persentase daya hambat karena dalam inkubasinya tidak diberi perlakuan sehingga proses oksidasi berjalan normal tanpa adanya hambatan dari ekstrak yang ditambahkan. Sebagai kontrol positif vitamin E 200 ppm memiliki aktivitas penghambatan sebesar 67.6%. Aktivitas penghambatan ekstrak jamur kuping hitam pada konsentrasi 50, 100, 200, 500, dan 1000 ppm masing-masing adalah 77.2%, 72.7%, 79.1%, 74.3%, dan 51.9%. Dari hasil yang diperoleh tersebut secara umum ekstrak jamur kuping hitam memiliki aktivitas penghambatan yang lebih baik dibandingkan vitamin E, terkecuali perlakuan dengan konsentrasi 1000 ppm yang memiliki persentase daya hambat yang terkecil dibandingkan dengan perlakuan yang lainnya. pada beberapa tingkatan konsentrasi. Hasil analisis stastistik dengan uji Duncan (α=0.05) diperoleh bahwa aktivitas antioksidasi dari ekstrak jamur kuping hitam dengan konsentrasi 50, 100, 200, dan 500 ppm (variabel a) tidak berbeda nyata dengan
79.1 72.7
74.3
60
51.9
50 40 30 20
2.000
10
0.000
0.0
0 k-
k+
50
100
200
500
1000
k-
Gambar 6 Konsentrasi MDA (μM) dari ekstrak jamur kuping hitam
k+
50
100
200
500
1000
Perlakuan (ppm)
Pelakuan (ppm)
Gambar 7
Persentase daya hambat ekstrak jamur kuping hitam pada beberapa tingkatan konsentrasi.
10
kontrol positif serta berbeda nyata dengan ekstrak 1000 ppm dan kontrol negatif. Selain itu, ekstrak 1000 ppm (variabel b) dan kontrol negatif (variabel c) memberikan hasil yang berbeda nyata dengan semua perlakuan (Tabel 2). Berdasarkan hasil tersebut berarti ekstrak dengan konsentrasi 50, 100, 200, dan 500 ppm memiliki aktivitas antioksidasi yang sebanding dengan vitamin E. Proses autooksidasi asam linoleat dapat dihambat dengan adanya senyawa antioksidan. Penambahan ekstrak jamur kuping hitam pada campuran asam linoleat dan bufer fosfat dilakukan seawal mungkin (pada hari ke-0) untuk menghasilkan efek antioksidasi yang maksimum. Antioksidan akan bekerja secara optimum jika diberikan diawal periode induksi, yaitu pada saat awal oksidasi linoleat mulai terjadi, dalam hal ini proses autooksidasi masih berjalan dengan lambat. Dengan demikian proses autooksidasi asam linoleat dihambat dengan adanya senyawa antioksidan. Sementara itu dengan adanya antioksidan, senyawa MDA yang terbentuk dari hasil autooksidasi akan lebih sedikit daripada tanpa penambahan antioksidan. Nilai serapan yang diperoleh akan sebanding dengan konsentrasi MDA yang terbentuk dan berbanding terbalik dengan aktivitas antioksidasinya. Selama waktu inkubasi 8 hari, proses autooksidasi asam linoleat oleh oksigen dapat dihambat dengan penambahan ekstrak jamur kuping pada campuran linoleat dan buffer fosfat. Variasi konsentrasi ekstrak yang ditambahkan yaitu 50, 100, 200, 500, dan 1000 ppm. Sebagai pembanding digunakan vitamin E (α-tokoferol) 200 ppm. Vitamin E 200 ppm digunakan sebagai pembanding karena termasuk komponen fenolik penyusun membran sel dan merupakan antioksidan alami yang biasanya terdapat pada makanan. Konsentrasi senilai 200 ppm merupakan konsentrasi ambang batas maksimum antioksidan yang diperbolehkan dalam makanan (Hernani & Rahardjo, Bermond 1990). Konsentrasi 50 dan 100 ppm pada ekstrak dipilih untuk mengetahui khasiat jamur kuping sebagai antioksidan apabila konsentrasinya di bawah ambang batas. Pemakaian konsentrasi 500 dan 1000 ppm digunakan untuk melihat aktivitas antioksidasinya apabila pada konsentrasi 200 ppm tidak bekerja secara optimum. Pengukuran analisis MDA dilakukan berdasarkan kelompok perlakuan yaitu dari kontrol negatif, kontrol positif, sampel 50 ppm, dan seterusnya. Proses oksidasi akan
terhenti ketika sampel direaksikan dengan TBA dan membentuk kompleks MDA-TBA. Aktivitas suatu antioksidan sangat dipengaruhi oleh konsentrasi dan ketahanan terhadap berbagai faktor fisik maupun kimia. Menurut (Coopen 1983), antioksidan yang ideal memiliki aktivitas yang baik pada konsentrasi yang rendah dan sebanding dengan vitamin E, serta memiliki daya tahan yang baik pula terhadap perubahan kondisi suhu, pH, cahaya, dan oksigen. Dari perlakuan yang ada, ekstrak jamur kuping dengan konsentrasi yang rendah yaitu 50 ppm memiliki aktivitas daya hambat yang lebih besar dari pada vitamin E dan hasil uji statistiknya memberikan hasil yang sebanding dengan vitamin E. Dengan demikian penggunaan ekstrak akan menjadi lebih ekonomis karena hanya diperlukan sedikitt ekstrak untuk membuat konsentrasi 50 ppm yang memiliki aktivitas yang tidak berbeda nyata dengan vitamin E. Selain jamur kuping hitam, beberapa jenis jamur yang aman dimakan dilaporkan memiliki potensi aktivitas antioksidansi yang tinggi. Jamur jenis ekstrak etanol Ramaria flava mengandung komponen bioaktif berupa flavonoid, pada konsentrasi 160 ppm memiliki aktivitas antioksidan yang sebanding dengan vitamin E dan BHA dengan aktivitas daya hambat sebesar 94.7% (Gezer et al 2006). Pada Morchella conica yang merupakan jenis jamur yang umum dikonsumsi di Turki, dilaporkan pada konsentrasi 160 ppm mampu menghambat terjadinya oksidasi linoleat sebesar 96.9% (Turkoglu et al 2006). Kedua jenis jamur tersebut diekstrak dengan menggunakan pelarut etanol. Jamur Halimeda incrassate yang diekstrak dengan air, metanol, aseton, dan metanol: air (1:1), masing masing memiliki aktivitas daya hambat oksidasi sebesar 90.6%, 26.0%, 31.0%, dan 18% (Rivero et al 2003). Tabel 2 Hasil analisis kadar MDA dengan uji Duncan Perlakuan Kadar MDA (μM) Ekstrak 200 ppm 2.287a Ekstrak 50 ppm 2.495a Ekstrak 500 ppm 2.817a Ekstrak 100 ppm 2.988a Vit E 200 ppm 3.556a Ekstrak 1000 ppm 5.270b Akuades 10.961c Keterangan: Perlakuan yang memiliki variabel yang sama berarti tidak berbeda nyata.
11
Berdasarkan hasil uji kualitatif fitokimia, ekstrak jamur kuping hitam memiliki senyawa alkaloid, fenolik/hidrokuinon, dan flavonoid. Ketiga senyawa ini diduga sebagai komponen bioaktif dalam ekstrak jamur kuping hitam yang berfungsi sebagai antioksidan alami yang mampu menghambat proses terjadinya oksidasi sehingga mengurangi pembentukan MDA pada sistem linoleat. Senyawa fenolik dan flavonoid merupakan senyawa antioksidan yang terkandung dalam tanaman tingkat tinggi. Kandungan senyawa fenol pada biji keluwak terfermentasi dapat berfungsi sebagai antioksidan serta memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan BHA dan BHT (Hernani & Rahardjo 2005). Flavonoid yang terdapat dalam sayuran, teh dan minuman anggur dapat mengurangi radikal bebas yang dapat menyebabkan terjadinya penyakit degeneratif (Tuminah 2000). Sementara itu, ekstrak etanol 70% daun jati belanda juga memiliki kandungan senyawa fenolik dan flavonoid yang diduga ikut berperan dalam penghambatan pembentukan MDA pada oksidasi linoleat (Martsolich 2007).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Hasil uji fitokimia menunjukkan ekstrak etanol jamur kuping hitam mengandung senyawa alkaloid, fenolik/hidrokuinon, dan flavonoid. Penambahan ekstrak pada sistem linoleat, mampu menghambat proses oksidasi asam linoleat secara in vitro. Ekstrak dengan konsentrasi 50, 100, 200, 500, dan 1000 ppm masing-masing memiliki aktivitas antioksidasi dengan daya hambat sebesar 77.2%, 72.7%, 79.1%, 74.3%, dan 51.9%. Berdasarkan hasil analisis statistik menggunakan uji Duncan (α=0.05), ekstrak dengan konsentrasi 50, 100, 200, dan 500 memiliki aktivitas yang sebanding dengan vitamin E 200 ppm. Saran Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui secara pasti senyawa bioaktif yang berperan sebagai antioksidan dalam jamur kuping hitam. Selain itu, perlu dilakukan analisis potensi antioksidasi dengan menggunakan jenis pelarut dan metode yang lainnya baik secara in vitro maupun in vivo.
DAFTAR PUSTAKA Adawiyah DR, Sarastani D, Fardiaz D. 2001. Kajian aktivitas antioksidan buah atung (Parinarium glaberimum Hassk.). [laporan penelitian]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Adikusuma F. 2007. Daya antioksidasi ekstrak isoflavon whey tahu terstandar pada proses produksi tahu yang berbeda. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Alexopoulus CJ, Mims CW. 1979. Introductory Mycology. Third edition. New York: John Willey and Sons. Atmosukarto K, Mitri R. 2003. Mencegah penyakit degeneratif dengan makanan. Cermin Dunia Kedokteran. 140:41-49. Bermond P.1990. Biological effect of food antioxidant. Di dalam: BJF Hudson, editor. Food Antioxidant. London: Elsevier Applied Science. hlm 193-251. Bobek P, Ozdin I, Kuniak L. 1993. Influence of water an ethanol extracts of the oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) on serum and liver lipids of the Syrian hamster. Nahrung. 37(6):571-575. Cahyana YA, Muchroji. 2002. Budidaya Jamur Kuping. Jakarta: Penebar Swadaya. Chang ST, Miles PG. 1989. Edible Mushrooms and Their Cultivation. Florida: CRC Press, Inc. Boca Raton. Coppen PP. 1983. The use of antioxidant. Di dalam: Allen JC dan Hamilton RJ, editor. Rancidity in Foods. London: Apllied Science Publishers. Dahlianti V. 2001. Ekstrak jamur kuping (Aurícula polytricha) sebagai antihperlipidemia pada tikus putih galur wistar. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Ekawati RA. 2007. Potensi antioksidasi daun salam (Eugina polyantha Wight) pada
12
lingkungan agrofisik yang berbeda. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Gaspersz V. 1994. Metode Perancangan Percobaan untuk Ilmu-Ilmu Pertanian, Ilmu-Ilmu Teknik, dan Biologi. Bandung: Armico. Gbolagade JS, Fasidi IO. 2005. Antimicrobial activities of some selected Nigerian mushroom. African Journal of Biomedical Research. 8:83-8. Gbolagade JS et al. 2006. Nutritive value of common wild edible mushroom from southern Nigeria. African Journal of Biomedical Research. 1(1):16-21.
Journal of Food Science 58(6):14071410. Koolman J, Rohm KH. 2001. Atlas Berwarna dan Teks Biokimia. Wanadi S I, penerjemah; Jakarta: Hipokrates. Terjemahan dari: Color Atlas of Biochemistry. Langseth L. 1995. Oxidant, antioxidant, and disease prevention. Di dalam ILSI Europe Concise Monograph Series 1-24. Brussel, Belgium. Lehninger AL. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Thenawidjaja M, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.
Gezer et al. 2006. Free-radical scavenging capacity and antimicrobial activity of wild edible mushroom from Turkey. African Journal of Biotechnology. 5(20): 1924-1928.
Martsolich KA. 2007. Potensi antioksidasi ekstrak air dan ekstrak etanol 70 % daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.). [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Gordon MH. 1990. The mechanism of antioxidant actiont in vitro. Di dalam: B.J.F. Hudson, editor. Food Antioxidant. London: Elsevier Applied Science.
Muchtadi D. 1989. Aspek Biokimia dan Gizi dalam Keamanan Pangan. Bogor: Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi, Institut pertanian Bogor.
Harbone JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Sudiro I, penerjemah; Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods.
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper. Edisi 25. Hartono A, penerjemah; Bani AP, Sikumbang TMN, editor. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Harper’sBiochemistry.
Hart H. 1983. Kimia Organik Suatu Kuliah Singkat. Edisi 11. Achmadi S, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry. Hernani, Rahardjo M. 2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Jakarta: Penebar Swadaya. Kartawiguna E. 1998. Vitamin yang dapat berfungsi sebagai antioksidan. Maj Ilm Fak Kedokteran USAKTI. 17(1):16-26. Kartikawati D. 1999. Studi efek protektif vitamin C dan vitamin E terhadap respon imun dan enzim antioksidan pada mencit yang dipapar paraquat. [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Kikuzaki H, Nobuji N. 1993. Antioxidant effect of some ginger constituents.
Mimić-Oka J, Simic DV, Simic TP. 1999. Free radicals in cardiovascular disease. The Scientific Journal Facta Universitatis 6(1):11-12. Rivero et al. 2003. Antioxidant activity in vivo and in vitro of Halimeda incrassate aqueous extracts. Cienc tecnol aliment. 23(2): 256-263. Schultz HW. 1963. Symposium on Food: Lipid and their Oxidation. Connecticut: The Avi Publishing. Tensiska. 2001. Aktivitas antioksidan ekstrak buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) dalam beberapa sistem pangan dan kestabilan aktivitasnya terhadap suhu dan pH. [tesis]. Bogor. Program pasca sarjana, Institut Pertanian Bogor.
13
Tuminah S. 2000. Pencegahan kanker dengan antioksidan. Cermin Dunia Kedokteran. 122:21-23. Turkoglu A et al. 2006. Antioxidant and antimicrobial activities of Morchella conica Pers. African Journal of Biotechnology. 5(11):1146-1150. Turkoglu A et al. 2007. Antioxidant and Antimicrobial Activity of Russula delica Fr: An Edidle Wild Mushroom. Eurasian Journal of Analytical Chemistry. 2(1): 5467. Wasser SP, AL Weis. 1999. Medicinal properties of substance occuring in higher Basidiomycetes mushroom: Current perspective (review). International Journal of Medicinal Mushroom. 1:31-62. Wiseman et al. 2005. Biomolecular Free Radical Toxicity: Cause and Prevention. New York: John Wiley & Sons. Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Wong GW, Hashimoto K, Shibamoto T. 1995. Antioxidant activities of rosemary and sage extracts and vitamin E in a model meat system. J Agric Food Chem 43(10):2707-2711. Yagi K. 1994. Lipid peroxides in hepatic, gastrointestinal, and pancreatic diseases, hlm 1-14 & 165-169. Di dalam D. Amstrong (penyunting), Free Radicals in Diagnostic Medicine. Plenum Press, New York. Youngson R. 2005. Antioksidan: Manfaat Vitamin C & E bagi Kesehatan. Purwoko S, penerjemah; Jakarta: Arcan. Terjemahan dari: Antioxidants: Vitamin C & E for Health.
14
LAMPIRAN
15
Lampiran 1 Tahapan penelitian Ekstrak jamur kuping hitam
Penentuan waktu inkubasi linoleat
Analisis fitokimia
Pembuatan kurva standar TMP
Analisis MDA sampel
Lampiran 2 Rendemen jamur kuping hitam (Sulistiyani et al 2007) Bobot sampel
= 256.0011 g
Bobot ekstrak
= 36.9252 g
Rendemen
= 14.77%
Rendemen
=
bobot ekstrak X 100% bobot sampel
=
36.9252 X 100% 256.0011
= 14.77%
16
Lampiran 3 Penentuan waktu inkubasi asam linoleat dengan metode diena terkonjugasi Botol gelap 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 2 mL asam linoleat 50 mM 1 mL air bebas ion Inkubasi 40 °C
Larutan 50 μL
Diambil tiap 24 jam sebanyak 50 μL
Campuran larutan 6 mL etanol 75%
Diukur serapannya pada λ 234 nm
Lampiran 4 Hasil analisis diena terkonjugasi Hari ke0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Serapan Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
Rerata ± SD
0.063 0.097 0.167 0.271 0.408 1.081 1.191 1.148 1.315 1.213 1.041
0.093 0.168 0.334 0.669 0.924 1.338 1.198 0.852 0.650 0.360 0.484
0.060 0.096 0.182 0.253 0.241 0.725 1.081 1.065 1.377 1.096 1.011
0.072±0.018 0.120±0.041 0.228±0.092 0.398±0.235 0.524±0.356 1.048±0.308 1.157±0.066 1.022±0.153 1.114±0.403 0.890±0.462 0.845±0.313
17
Lampiran 5 Pembuatan kurva standar TMP 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 6 Pengenceran 1.5 μM
3μM
6 μM
9 μM
12 μM
15 μM
18 μM
Masing-masing diambil 1 mL 2 mL TCA 20% 2 mL TBA 1 % dalam asam asetat Larutan Inkubasi 100 C selama 10 menit Lalu dinginkan Larutan Sentrifus 3000 rpm selama 15 menit Supernatan diukur serapannya pada λ 532 Lampiran 6 Hasil pengukuran kurva standar TMP
Absorban
Konsentrasi TMP (µM) 0 1.5 3 6 9 12 15 18
Serapan 2 0.000 0.056 0.115 0.208 0.324 0.418 0.527 0.634
1 0.000 0.055 0.107 0.214 0.327 0.428 0.533 0.640
0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000
Rerata ± SD 0.000±0.000 0.056±0.001 0.111±0.006 0.211±0.004 0.326±0.002 0.423±0.007 0.530±0.004 0.637±0.004
y = 0.0352x + 0.0025 R2 = 0.9998
0
5
10 Konsentrasi TMP
15
20
18
Lampiran 7 Pengukuran kadar MDA Sampel ekstrak jamur kuping 50, 100, 200, 500, dan 1000 pm
Vitamin E
Akuades
Masing-masing diambil 1 mL 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 2 mL asam linoleat 50 mM
Inkubasi 40 °C Lama inkubasi optimum hasil pengukuran diena terkonjugasi Masing-masing diambil 1 mL 2 ml TCA 20% 2 mL TBA 1 % dalam asam asetat 2 mL TCA 20% Larutan
Inkubasi 100 C selama 10 menit Lalu dinginkan
Larutan Sentrifus 3000 rpm selama 15 menit Supernatan diukur serapannya pada λ 532
19
Absorban hari ke-8 0.389 0.375 0.401 0.105 0.103 0.175 0.086 0.102 0.083 0.116 0.110 0.097 0.107 0.069 0.073 0.105 0.104 0.096 0.109 0.225 0.230
Kontrol negatif (akuades)-1 Kontrol negatif (akuades)-2 Kontrol negatif (akuades)-3 Kontrol positif (Vitamin E 200 ppm)-1 Kontrol positif (Vitamin E 200 ppm)-2 Kontrol positif (Vitamin E 200 ppm)-3 Ekstrak Jamur Kuping 50 ppm-1 Ekstrak Jamur Kuping 50 ppm-2 Ekstrak Jamur Kuping 50 ppm-3 Ekstrak Jamur Kuping 100 ppm-1 Ekstrak Jamur Kuping 100 ppm-2 Ekstrak Jamur Kuping 100 ppm-3 Ekstrak Jamur Kuping 200 ppm-1 Ekstrak Jamur Kuping 200 ppm-2 Ekstrak Jamur Kuping 200 ppm-3 Ekstrak Jamur Kuping 500 ppm-1 Ekstrak Jamur Kuping 500 ppm-2 Ekstrak Jamur Kuping 500 ppm-3 Ekstrak Jamur Kuping 1000 ppm-1 Ekstrak Jamur Kuping 1000 ppm-2 Ekstrak Jamur Kuping 1000 ppm-3
[MDA] hari ke-8 (µM) 10.980 10.582 11.321 2.912 2.855 4.901 2.372 2.827 2.287 3.224 3.054 2.685 2.969 1.889 2.003 2.912 2.884 2.656 3.026 6.321 6.463
Rerata [MDA] (µM)
SD
Daya hambat oksidasi (%)
10.961
0.370
0.0
3.556
1.165
67.6
2.495
0.290
77.2
2.988
0.276
72.7
2.287
0.593
79.1
2.817
0.140
74.3
5.270
1.945
51.9
Persamaan kurva standar TMP Y = 0.0352X + 0.0025 Absorban [MDA]
[MDA]
= 2.912 µM
% Daya hambat oksidasi= =
[MDA]kontrol negatif - [MDA] sampel X 100% [MDA]kontrol negatif 10.961- 3.556 X 100% 10.961
= 67.6%
Contoh perhitung an :
19
absorbans - 0.0025 0.0352 0.105 - 0.0025 = µM 0.0352
(µM) =
Lampiran 8 Data konsentrasi MDA dan daya hambat masing-masing sampel
Sampel
20
Lampiran 9 Uji statistik potensi antioksidasi sampel Uji ANOVA sampel jamur kuping hitam Sumber keragaman Jumlah kuadrat (JK) Perlakuan 171.246 Galat 11.616 Total 182.863
Uji Lanjut Duncan Kelompok Perlakuan Ekstrak 200 ppm Ekstrak 50 ppm Ekstrak 500 ppm ekstrak 100 ppm Kontrol positif Ekstrak 1000 ppm Kontrol negatif Sig.
Derajat bebas (DB) 6 14 20
Ulangan (N) 3 3 3 3 3 3 3
1 2.287 2.495 2.817 2.988 3.556
Kuadrat tengah (KT) 28.541 0.830
F hitung 34.398
F tabel 4.46
Alfa (α) = 0.05 2 3
5.270 0.143
10.961 1.00
1.00
Lampiran 10 Hasil uji fitokimia ekstrak jamur kuping hitam Hidrokuinon Hidrokuinon
a
b
Saponin
Hidrokuinon: a. Pembanding b. Ekstrak etanol
a
Flavonoid
a
a
Tanin
a
b
Terpenoid dan steroid
Flavonoid: a. Pembanding b. Ekstrak etanol
b
Saponin: a. Pembanding b. Ekstrak etanol
b
Terpenoid dan Steroid: a. Pembanding b. Ekstrak etanol
Alkaloid
b
Tanin: a. Pembanding b. Ekstrak etanol
a 1
b
2
3
Alkaloid: a. Pembanding b. Ekstrak etanol 1. Mayer 2. Dagendorf 3. Wagner
