AFLATOKSIN dan BAHAN PENGAWET
AFLATOKSIN
Senyawa metabolik sekunder yang bersifat toksik dan karsinogenik Dihasilkan: Aspergilus flavus & Aspergilus parasiticus Keduanya tumbuh pada biji-bijian, kacang-kacangan, padi-padian. Ada beberapa jenis Aflatoksin : B1, B2, G1 dan G2. Dapat diproduksi oleh kedua jamur tersebut baik selama tanaman sedang tumbuh, dipanen maupun dalam penyimpanan. Aflatoksin B1 toksis dan karsinogenik terhadap binatang dan manusia Tikus yang diberi makanan yang mengandung 2ppb aflatoksin dalam waktu lama tumor pada hati.
PENENTUAN AFLATOKSIN HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) (High Performance Liquid Chromatography) Kolom waktu refensi Fase stasioner Fase mobil elusi Injeksi Detektor Kromatogram Standar
Penentuan aflatoksin dengan HPLC Alat : Kromatografi dilengkapi 2 pompa dan kolom berukuran 250 x 4,6 mm, 5 µm Supelco, fase reversi C18, Guard column dengan isian 2 µm (Rheodyne Model 7125 dengan 50 µl loop) yang diletakkan antara injektor dan kolom Detektorfluoresen Fase mobil = air : metanol = asetonitril 50 : 40 : 10 laju alir 0,8 ml/menit Koil reaktor berukuran 5000 x 0,3 mm untuk derivatisasi
Penentuan aflatoksin dengan HPLC Cara ekstraksi : 50 g sampel + 59 NaCl + 140 ml metanol : air (70 : 30) blender dengan kecepatan tinggi. Saring ekstraknya dengan kertas saring whatman 12 ml ekstrak + 30 ml air deionisasi (agar konsentrasi metanol akhir = 20%) Ekstrak encer yang mengandung 1 g sampel dialirkan melalui affinity column untuk pemurnian afltoksin Cuci affinity column 1 x dengan 10 ml air deionisasi Aflatoksin dikeluarkan dari kolom dengan pencucian menggunakan 1 ml metanol
Kondisi kromatograf : Alat HPLC Kolom Shodex R Spak DS – 613 10 µl atiquod sampel injeksikan dalam kolom Zat pengawet dielusi se c isokratis dengan kecepatan 1,0 ml/menit Deteksi dengan UV spektrometri pada λ = 230 nm (kompromi untuk µ macam pengawet) Kuantitatif : puncak zat pengawet dibandingkan dengan standar
Zat pengawet : asam benzoat asam sorbat paraben sering dicampur Na-benzoat Penentuan zat pengawet dalam minuman dengan HPLC Reagensia : Larutan standar 0,1% dibuat dengan melarutkan 1 g dalam 200 ml metanol encerkan sp 1 l dengan air deionisasi. Fase mobil : 0,05 MKH2PO4 (pH 2,65) dan asetonitril 60 : 40 (v/v), saring melalui Duropore filter ukuran 0,45 µm, hilangkan gas dengan sonikasi.
Preparasi Sampel : - Sentrifus sampel dalam tabung sentrifus 50 ml pada 1500 rpm selama 6,5 menit - Kolom C18 kartrij dielusi dengan 2 ml metanol kemudian dengan 4 ml air. - 2 ml supernatan injeksikan melalui kartrij yang telah disiapkan. - Cuci kartrij dengan 0,4 ml heksana, elusi zat pengawet dengan 3 ml metanol, saring melalui Duropore - Ekstrak metanol diuapkan 0,5 ml dengan aliran gas N2 encerkan menjadi 1 ml dengan air deionisasi siap diinjeksikan
Dengan kromatografi kolom Kolom : kaca p = 150 mm d = 8 mm diisi dengan florisil (100 – 200 mesh) 15 mm dibagian bawah dan 15 mm bagian atas dengan alumina netral yang tidak mempunyai daya fluoresensi bagian atas dan bawah dibatasi wol kaca/pulp kertas. Untuk okhratoksin A kolom ukuran sama tetapi diisi dengan 60 mm florisil. Reagensia : Zat pelarut untuk ekstraksi : metanol : air (8 : 2 v/v). Larutan penjernih, 150 g Zn SO4 dan 50 g asam fosfotungtat dilarutkan dalam 1000 ml aquadest. Larutan heksan : aseton (8 : 2 v/v). Benzen. Metil alkohol H2SO4 0,25 N
Prosedur : Sampel (kacang tanah) haluskan 1’ dengan blender. + metanol – air, blender 1’, biji-bijian berminyak blender 2’ sampel : pelarut = 1 : 2. Saring dengan kertas saring (15 ml ekstrak). + 15 ml larutan pembersih, gojog. Saring 15 ml campur melalui fiber glass. + 3 ml benzen, gojog, diamkan pemisah ambil 1 ml bagian atas masukkan ke dalam mini kolom, isap dengan vakum pada bagian bawah kolom. + 5 ml heksan – asetan, keluarkan, 2’ Aflatoksin band (garis) biru berfluoresensi di bawah sinar UV gelombang panjang (minimal 4 ppt) Untuk okhratoksin A, 1 ml larutan benzen pada lapisan atas masukkan mini kolom untuk aflatoksin isap dengan vakum. + 3 ml metil alkohol (metanol) isap dengan vakum 15 – 20’ Lepas vakumnya + 0,3 ml H2SO4 0,25 N Segera lihat kolom dengan sinar UV Okhratoksin warna biru berfluoresensi kira-kira 1 cm dari bagian atas kolom beras, jagung, kacang : ± 8 ppb gandum/sorghun : ± 16 ppm
Penentuan bahan pengawet Asam benzoat (kualitatif) Ambil sampel + 4 bagian air, aduk, saring Ambil ± 50 – 100 ml larutan + H2SO4 encer (4 N), gojog 2 x dengan 20 dan 10 ml ether uapkan larutan etheris dengan pemanasan lambat. Residu + 10 ml H2SO4 (p) atau 1 tetes HNO3 berasap (HNO3 65%) atau 50 mg KNO3, panaskan 180oC, 3’ Setelah dingin + (NH4) sS atau 40 mg hidroksilamin warna merah coklat : asam benzoat.
