v
ABSTRACT ATRA ROMEIDA. Induced Mutation by Gamma-ray Irradiation for the Development of Superior Orchid Clones Spathoglottis plicata Blume. Accession Bengkulu. Supervised by Surjono Hadi Sutjahjo, Agus Purwito, Dewi Sukma, and Rustikawati. Spathoglottis plicata Blume. is one species of orchids with lower level of genetic diversity, especially in flower color compared to other orchids. S. plicata accession Bengkulu usually produce pink to purple flower with a bright purple stems and flower stalk. The aimed of the research were (1) to find the tissue culture protocols to propagate S. plicata though protocorm like bodies, (2) to induce the genetic diversity of S. plicata accession Bengkulu using gamma irradiation to plantlets, (3) to determine a lethal dose 50% (LD50) for plantlets through gamma irradiation, and (4) to identify genetic variations of orchids S. plicata and its mutants using morphological characters and ISSR markers. The growth and multiplication of protocorm like bodies can be induced by using MS medium supplemented with 50 to 100 ml L-1 coconut water. The best treatment to develope plb into plantlet was MS medium containing of vitamin B5 with addition of 75 ml L-1 coconut water and 2% activated charcoal or MS medium supplemented with 20 μM BA and 2% activated charcoal. Furthermore, MS medium containing of B5 vitamin enriched with 20 μM BA or MS medium containing of vitamin B5 with addition of 75 ml L-1 coconut water was the best treatment for plantlet multiplication. Induced mutation using gamma-ray irradiation to the plbs and plantlets could increase the genetic diversity of S. plicata. Lethal Dose 50% (LD50) of plb survival rate was 47.71 Gy, while LD50 of plantlet survival rate was 50.74 Gy. Gamma-ray irradiation to the plantlet resulted nine potential mutants (0.36%) that be selected by morphological characters of the shape and color of flowers. Morphological characters and ISSR markers can be used to identify the mutants. Clustering analysis by using Unweighted Pair Group Method and Arithmatic Average and Principal Component Analysis of 12 samples and its mutants based on ISSR markers could clearly distinguish the wild type and its mutants. It formed five groups of coefficient similarity at 0.68 with goodness of fit correlation matrix value of 0.91 (very suitable). The grouping of those samples was more accurate and more efficient by using ISSR markers compared to the morphologycal markers. This clustering successfuly separated the wild type and its mutants. Keywords : Spathoglottis plicata, in vitro, morphological characters, ISSR markers, mutant, gamma irradiation
vi
vii
RINGKASAN
ATRA ROMEIDA. Induksi Mutasi dengan Iradiasi Sinar Gamma untuk Pengembangan Klon Unggul Anggrek Spathoglottis plicata Blume Aksesi Bengkulu. Di bawah Bimbingan Surjono Hadi Sutjahjo, Agus Purwito, Dewi Sukma, dan Rustikawati. Spathoglottis plicata Blume. merupakan salah satu jenis anggrek tanah yang memiliki keragaman genetik dan warna bunga yang rendah dibandingkan dengan jenis anggrek lainnya. Warna bunga standar yang banyak tumbuh di berbagai tempat di Indonesia, khususnya di Bengkulu adalah jenis yang memiliki warna bunga pink hingga ungu cerah. Akibat keragaman genetik yang rendah maka upaya pemuliaan tanaman secara konvensional untuk mendapatkan varietas baru menjadi sangat terbatas. Anggrek S. plicata pada habitat aslinya dapat tumbuh pada lahan marjinal sehingga dapat digunakan sebagai ornamen taman dan pembatas jalan di perkotaan karena tidak memerlukan perawatan yang intensif. Tujuan utama penelitian ini adalah untuk mendapatkan klon mutan unggul anggrek S. plicata asal Bengkulu melalui induksi mutasi dengan iradiasi sinar gamma. Percobaan ini terdiri dari 3 kelompok percobaan. Percobaan pertama bertujuan untuk mendapatkan teknik perbanyakan massal secara klonal yang standar untuk produksi bahan tanam yang seragam anggrek S. plicata secara in vitro. Percobaan kedua bertujuan untuk menginduksi keragaman genetik anggrek S. plicata aksesi Bengkulu menggunakan iradiasi sinar gamma dan menentukan radiosensitivitas plb dan planlet hasil iradiasi sinar gamma dalam pembentukan mutan potensial untuk pengembangan klon mutan unggul anggrek S. plicata aksesi Bengkulu. Percobaan terakhir bertujuan untuk menganalisis efektifitas dan akurasi penggunaan marka morfologi dan marka molekuler menggunakan primer ISSR untuk mengidentifikasi keragaman genetik mutan anggrek S. plicata hasil iradiasi sinar gamma dan pembandingnya. Percobaan in vitro untuk mendapatkan teknik perbanyakan massal anggrek S. plicata terdiri dari dua percobaan terpisah. Percobaan pertama menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) 3 faktor. Faktor pertama adalah jenis medium ( MS dan VW). Faktor kedua adalah jenis bahan organik komplek yang terdiri dari 4 jenis yaitu (buah air kelapa, pisang ambon, kuning telur dan kentang). Faktor ketiga adalah konsentrasi bahan organik komplek (0, 50, 100, 150 ml L-1 untuk air kelapa dan kuning telur, 0, 50, 100 dan 150 g L-1 untuk kentang dan buah pisang Ambon). Percobaan kedua menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor perlakuan. Faktor pertama adalah formulasi jenis vitamin dan konsentrasi gula yang terdiri dari empat macam formulasi yaitu J1 = vitamin MS + gula 30 g L-1 , J2 = vitamin B5 + gula 30 g L-1 , J3= vitamin MS + gula 40 g L-1 , J4 = vitamin B5 + gula 40 g L-1. Faktor kedua adalah penambahan sitokinin yang terdiri dari 7 kombinasi
viii
perlakuan yaitu S0 = tanpa sitokinin (kontrol), S1 = 20 μM BA, S2 = 40 μM BA, S3 = 20 μM kinetin, S4 = 40 μM kinetin, S5 = 75 ml-1 air kelapa dan S6 = 150 ml L-1 air kelapa. Percobaan induksi mutasi menggunakan bahan iradiasi plb dan plantlet menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan perlakuan sebelas taraf dosis iradiasi sinar gamma, yaitu D0 (kontrol) tanpa diiradiasi, D1 = 10 Gy (0' 41''), D2 = 20 Gy (1' 22''), D3 = 30 Gy (2' 03''), D4 = 40 Gy (2' 45''), D5 = 50 Gy (3' 59''), D6 = 60 Gy (4' 07''), D7 = 70 Gy (4' 48''), D8 = 80 Gy (5' 29''), D9 = 90 Gy (6' 10''), D10 = 100 Gy (6' 52''). Setiap dosis perlakuan diulang sebanyak 10 kali atau sebanyak 10 botol yang setara dengan 250 plb atau planlet. Plb yang sudah diradiasi di sub kultur ke medium baru dan dilakukan pengamatan morfologi terhadap karakter vegetatif di laboratorium kultur jaringan tanaman. Planlet diiradiasi didalam botol kultur, setelah diradiasi langsung diaklimatisasi pada medium non steril berupa campuran tanah : kompos : akar pakis dengan perbandingan 1 : 1 : 1 dan dipelihara di rumah kawat dengan naungan 45%. Pengamatan karakter morfologi dilakukan pada fase pertumbuhan vegetatif dan fase generatif tanaman hasil iradiasi, selanjutnya dilakukan analisis molekuler menggunakan marka ISSR terhadap tanaman hasil seleksi morfologi. Data biner dianalisis pengelompokan (clustering) menggunakan metode SAHN (Sequential Agglomerative Hierarchical and Nested)-UPGMA (Unweighted pair-group method arithmatic average). Perbanyakan massal secara klonal yang standar dan terbaik untuk pertumbuhan dan multiplikasi plb anggrek S. plicata secara in vitro telah berhasil didapatkan. Medium untuk pertumbuhan dan perkembangan biji anggrek dan plb adalah medium MS + 50- 100 ml L-1 air kelapa dan medium VW + 50-100 ml L-1 air kelapa. Perkembangan plb menjadi plantlet dan multiplikasi plantlet anggrek S. plicata yang terbaik dapat menggunakan medium MS vitamin B5 + 75 ml L-1 air kelapa atau menggunakan medium MS + BA 20 μM + 2 % arang aktif. Induksi mutasi menggunakan iradiasi sinar gamma pada plb maupun plantlet sudah mampu meningkatkan keragaman genetik anggrek S. plicata. Radiosensitivitas plb terhadap dosis iradiasi sinar gamma lebih rendah dibandingkan dengan planlet. Lethal dose 50% (LD50) untuk iradiasi plb berkisar antara 34.40 Gy – 47.71 Gy. Lethal dose 50% (LD50) untuk iradiasi planlet berkisar antara 36.58 Gy – 50.74 Gy. Iradiasi sinar gamma pada planlet S. plicata telah berhasil mendapatkan 9 mutan potensial atau sebesar 0.36% dari total 2 500 plantlet yang diiradiasi. Mutan perubahan warna bunga yang sudah stabil sampai generasi ketiga adalah mutan 3 (3SpBa50), mutan 7 (7SpBa40), dan stabil sampai generasi keenam yaitu mutan 1 (1SpBa50), mutan 2 (2SpBa70) dan mutan 4 (4SpBa60). Mutan perubahan bentuk bunga yang sudah stabil sampai generasi ketiga adalah mutan 8 (8SpBa30) dan mutan 9 (9SpBa60). Mutan perubahan bentuk pertumbuhan vegetatif sampai generasi keenam tapi belum menghasilkan bunga adalah mutan 5 (5SpBa100) dan mutan 6 (6SpBa50). Hasil analisis keragaman genetik berdasarkan marka morfologi dan marka molekuler menggunakan 10 primer ISSR terhadap 9 tanaman mutan anggrek S. plicata hasil iradiasi sebelas taraf dosis iradiasi sinar gamma dan 3 kultivar S. plicata sebagai pembandingnya, menghasilkan 70 karakter morfologi yang dapat dirinci
ix
menjadi 177 sub karakter. Polimorfisme hasil karakterisasi morfologi mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya dikatagorikan tinggi yaitu mencapai 89.27%. Hasil analisis klustering karakter morfologi menggunakan metode UPGMA pada koefisien kemiripan 0.68 dan analisis komponen utama telah mampu mengelompokkan 9 mutan anggrek S. plicata dan 3 pembandingnya menjadi 5 kelompok utama, dengan nilai goodness of fit matriks korelasi (r) sebesar 0.89 (sesuai). Total pita yang dihasilkan dari 10 primer ISSR sebanyak 360 pita, yang tersebar ke dalam 71 lokus ISSR. Polimorfisme pola pita DNA yang dihasilkan dari 10 primer ISSR menunjukkan keberagaman yang sangat tinggi hingga mencapai 91.14%. Hasil analisis klustering pola pita ISSR menggunakan metode UPGMA dan analisis komponen utama terhadap 9 mutan anggrek S. plicata dan 3 pembandingnya mampu dibedakan dengan tegas menjadi 5 kelompok utama pada koefisien kemiripan 0.68 dan nilai goodness of fit matrik korelasi (r) penanda molekuler mencapai 0.91 (sangat sesuai). Keywords : Spathoglottis plicata, in vitro, ISSR, karakter morfologi, mutan, iradiasi sinar gamma
