Tudományos Diákköri Dolgozat
ROVÓ PETRA
A TC5b minifehérje szerkezetstabilizáló sóhídjának vizsgálata NMR spektroszkópia segítségével Témavezető: Dr. Perczel András, Szerves Kémiai Tanszék
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2008
-1-
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék.....................................................................................................................2 Bevezetés ...............................................................................................................................3 Irodalmi háttér........................................................................................................................5 Minifehérjék a fehérjetervezés szolgálatában ......................................................................5 TC5b, a legkisebb mesterséges fehérje ............................................................................8 A fehérjefelgombolyodás....................................................................................................9 Elméleti háttér ......................................................................................................................15 Fehérje NMR....................................................................................................................15 Processzálás..................................................................................................................17 Asszignáció ..................................................................................................................18 Térszerkezet számítás .......................................................................................................21 Célkitűzés.............................................................................................................................23 Alkalmazott módszerek ........................................................................................................25 Fehérje szintézis ...............................................................................................................25 NMR spektroszkópia ........................................................................................................26 Szerkezetmeghatározás az NOE kényszerfeltételek alapján...............................................26 Eredmények .........................................................................................................................28 Az NMR spektrumok elemzése.........................................................................................28 A TC5b_D9E semleges körülmények között készült spektrumának az elemzése ...........28 A TC5b_D9E savas körülmények között készült spektrumának az elemzése.................30 A TC5b_R16hR semleges és savas spektrumának elemzése..........................................31 A TC5b_D9Aad_R16K semleges és savas spektrumának elemzése ..............................32 A TC5b_D9S semleges és savas spektrumának elemzése..............................................33 A szerkezetszámításból származó eredmények..................................................................37 A TC5b_D9E szerkezetének elemzése ..........................................................................37 A TC5b_R16hR szerkezetének elemzése ......................................................................40 A TC5b_D9Aad_R16K szerkezetének elemzése ...........................................................41 A TC5b_D9S szerkezetének elemzése ..........................................................................42 Összefoglalás, kitekintés.......................................................................................................44 Köszönetnyilvánítás ............................................................ Hiba! A könyvjelző nem létezik. Rövidítésjegyzék ..................................................................................................................47 Függelék...............................................................................................................................49 Felhasznált irodalom ............................................................................................................60
-2-
Bevezetés A minifehérjék olyan makromolekulák, amelyek gyakran 40, vagy még ennél is kevesebb aminosavból épülnek fel. Segítségükkel jobban megérthetőek a fehérje fel- és letekeredésének fontosabb lépései, valamint tanulmányozhatók különböző szerkezetstabilizáló hatások. Ide tartoznak a hidrogén és sóhidak, a hidrofób vagy hidrofil kölcsönhatások, valamint
minden
olyan
interakció,
amely
a
téralkat
felvételében
fontos
lehet.
Végeredményben, ezen kölcsönhatások feltérképezése segítheti elő a fehérjék racionális megtervezését.
Míg
a
másodlagos
szerkezetielemek
(α-hélix)
feltekeredésének
primerszekvencia függése elég jól értett folyamat, addig sokkal nagyobb kihívást a harmadlagos vagy másnéven a térszerkezet felvételének megtervezése. Az említett probléma részint
abból
adódik,
hogy
a
molekuláris
téralkat
kialakulása
számos
olyan
szerkezetstabilizáló gyenge kölcsönhatás következménye, melynek jóslása nehézkes és bizonytalan kimenetelű. A jövőbeli fehérjetervezés szempontjából ezért különösen fontos, hogy megértsük ezeknek a gyenge kölcsönhatásoknak a működését. Munkám során a TC5b, vagy más néven Triptofán-kalitka minifehérje (1. ábra) szerkezetstabilizáló sóhídját tanulmányoztam NMR spektroszkópia segítségével. Ez a valaha tervezett legkisebb fehérje – mindössze 20 aminosavból áll (NLYIQ WLKDG GPSSG RPPPS) –, amely kvázi fiziológiás körülmények között is harmadlagos térszerkezettel rendelkezik1. Felépítésében egy α-hélix, egy 310-hélix és egy poliprolin II típusú hélix szerveződik a központi triptofán köré, vagyis a fehérje feltekeredésének hajtóereje a hidrofób kölcsönhatás. A kialakult szerkezet stabilizálásában emellett jelentős szerep jut a D9 és R16 aminosavak közt létesülő sóhídnak. A TC5b stabil, jól meghatározott szerkezete egy racionális fehérjetervezés következménye. Kiindulási vegyületként Neidigh és mts. a Gila monster viperagyík egyik 39 aminosav hosszú fehérjéjét használták (exendin-4, EX4). A fehérje számos csonkítása és mutációja után is csak a D9-R16 sóhíd beépítésével tudták elérni azt, hogy a minifehérje vízben is több mint 95%-ban legyen feltekeredett. A sóhíd tanulmányozása során modell vegyületként a korábban Hudáky és mts. által optimált rendszert használtam (TC5b_D9E)2. Ebben a mutánsban a sóhíd egyik karja egy metilén-csoporttal meg
lett
hosszabbítva,
minek
következtében
kedvező
hidrofób
kölcsönhatás alakult ki a glutaminsav oldallánca és a hidrofób mag között. Jelen munkában azt vizsgálom, hogy milyen hatással van a szerkezet stabilitására a beépített metilén-csoport helyének szisztematikus változtatása. A sóhíd szerepére lehet abból is következtetni, hogyha
-3-
az nincs jelen a szerkezetben. Ezt kétféleképpen tudtuk elérni: egyrészt a sóhíd mutációjával (D9S variáns), másrészt a savas körülmények közötti vizsgálatokkal. Savas pH-n ugyanis a glutaminsav protonálódik, így töltés hiányában nem lép elektrosztatikus kölcsönhatásba a guanidin-csoporttal. A szerkezetben megmutatkozó változások nyomon követésére NMR spektroszkópiát alkalmaztunk.
1. ábra A TC5b szerkezetstabilizáló Asp9-Arg16 sóhídja
-4-
Irodalmi háttér Minifehérjék a fehérjetervezés szolgálatában Habár a minifehérjének nincsen általánosan elfogadott definíciója, néhány közös jellemző mindegyikükre igaz. A legfontosabb ezek közül a harmadlagos struktúra. Ennek kialakításában a minifehérjét alkotó összes másodlagos szerkezeti elem (α-hélix, β-redő és különböző kanyar régió) kooperatívan részt vesz. A másodlagos elemek kölcsönhatásának következtében az NMR spektrumában megnő a jeldiszperzitás, ami valóban a nagyobb fehérjékhez teszi hasonlatossá. Felépítését tekintve az ideális minifehérjét csak α,L-aminosav építi fel, szerkezetét sem fémion, sem diszulfidhíd nem stabilizálja, és nem képez dimert vagy oligomert. Ezen felül elvárás még, hogy fiziológiás körülmények között oldható legyen, vizes közegben is spontán – segédfehérjék nélkül – vegye fel a natív szerkezetét, és a vizsgálni kívánt koncentráció tartományban ne mutasson aggregációt. Kis méretének köszönhetően a minifehérje egyszerűen szintetizálható hagyományos szilárd fázisú szintézissel. Ez a módszer lehetővé teszi azt is a nem-természetes, vagy jelölt aminosavakat beépítését a peptidláncba. Ezeknek a módosított aminosavaknak egyrészt a szerkezet spektroszkópiás tanulmányozása során jut szerep (13C,
15
N NMR, Fluoreszcens
spektroszkópia), másfelől segítségükkel gyengített vagy erősített kölcsönhatások hozhatók létre például oldalláncok csonkításával vagy hosszabbításával; ami a kölcsönhatás tanulmányozása szempontjából lehet fontos. Az önálló felgombolyodásra képes, stabil fehérjék tervezése számos kihívással jár. Tudva azt, hogy a természetes fehérje a szekvenciájában kódol minden információt a natív térszerkezetéről, az ahhoz vezető útról (folding) és a funkciójáról3, olyan szekvenciát kell nekünk is tervezni, ami magában hordozza ezeket a tulajdonságokat. Ezért nem elég az, ha a tervezés során csak a 3D szerkezetet megvalósítását tűzzük ki célul, hanem a felgombolyodás folyamatát, az azt mozgató erőket is modelleznünk kell a siker érdekében. Ez persze bonyolítja a tervezés menetét. De minden létrehozott fehérje – legyen az teljesen letekeredett, vagy részben rendezett szerkezetű – egy-egy lépéssel közelebb visz bennünket a fehérjét létrehozó és az azt stabilizáló erők megértéséhez. A természetben előforduló kisméretű, önálló felgombolyodásra képes fehérjék aminosavaik jelentős hányadát használják a harmadlagos szerkezet fenntartására. Például számos toxin és proteáz inhibitor (többek között az erabutoxin és a bovin pankreáz tripszin
-5-
inhibitor) összetett diszulfid híd rendszert képez a fehérje magjában, más fehérjék pedig fémionokat használnak stabilizáló elemként (pl. Zn-ujj DNS kötő domén). A fehérjetervezés egyik ága, az ún. „redesign” ezeket a kis természetes fehérjéket veszi alapul, és szekvenciális módosításokkal optimalizálja, általánosítja a szerkezetet. Olyan módon teszi ezt, hogy a fold (gomboly) megmaradjon a diszulfidhíd vagy a fémion jelenléte nélkül is. Ez minden esetben iteratív egy folyamat, ahol a mutánsokat lépésenként spektroszkópiai módszerekkel (pl. CD, NMR) analizálják, a sikeres módosítást megtartják, míg a kialakult nemkívánatos jelleget a következő generációban eliminálják vagy korrigálják. Redesign elvet használt Imperiali és mts. a Zn-ujj domén (2.A ábra) szerkezetének módosítása során4. Céljuk egy β-hajtű és egy α-hélixből felépülő fehérje (ββα) előállítása volt, ami felépítésében megfelel a Zn-ujj doménnek, de fém ion jelenléte nélkül is stabil. Első lépésként a β-hajtűt és az α-hélixet optimalizálták külön-külön, beiktattak hélix kezdő és záró aminosavakat, valamint egy II’ típusú β kanyart. Majd a fém-kötő aminosavat hidrofóbra cserélték, így biztosítva a két másodlagos szerkezeti elem közötti kölcsönhatást, s ezzel elérték a kívánt szerkezetet (2.B ábra).
2. ábra A Egy természetes Zn-ujj domén. A szerkezet stabilitása a Zn2+ ionnak köszönhető, amely köré három cisztein és egy hisztidin koordinálódik. B „Redesign” elven módosított Zn-ujj szerkezet. A Zn2+ ion helyett hidrofób oldalláncokkal (Leu, Val) stabilizálták a foldot. C De novo elven tervezett Zn-ujj domén. A hidrofób magban itt fenilalanin csoportokat építettek be. A szerkezetek alatt a fehérjék PDB kódjai olvashatóak.
A fehérjetervezésének egy másik módszere a „de novo design”, amely az aminosavak, fehérjék szerkezet- és stabilitás-meghatározó fizikai és kémiai tulajdonságait veszi alapul, és fehérjeadatbázisokra valamint
ab initio számításokra támaszkodva jósol optimális
szekvenciákat. A de novo elv tulajdonképpen egy inverz szerkezetjóslás: egy ismert
-6-
szekvencia háromdimenziós szerkezetének keresése helyett egy bizonyos szerkezethez keresünk optimális szekvenciát. Ez a megközelítés alapjában új perspektívát nyit a szerkezetkutatásban mélyebb betekintést nyújtva a fehérje felgombolyodásának mikéntjébe. Az elmúlt évtizedben számos algoritmus látott napvilágot, amelyek objektív és kvantitatív módszert használnak a de novo fehérjetervezés során, ilyen például a WHATIF5 vagy a PERLA6. Ezek a programok automata oldalláncválasztó algoritmusuk segítségével figyelembe veszik a lehetséges oldallánc-oldallánc, vagy oldallánc-gerinc kölcsönhatásokat, és a lehetőségeket végig próbálva a legoptimálisabb aminosavat választják az adott pozícióra. Más-más pontozást használnak a mag illetve a felszíni aminosavak választása esetén, de egy hélixen belül is változtatják a pontozási függvényt. A természetben megfigyelt eloszlást alapul véve hélix kezdő N-terminális aminosavnak nagyobb eséllyel választanak Asn-t, mint más aminosavat, záró elemként pedig Gly kerül leggyakrabban. A fehérje oldhatóságát töltött aminosavak beépítésével növelik, és az aggregáció elkerülése végett a lánc végére legtöbbször Gly-nel kapcsolt Arg-t építenek be. Az egyik legelső de novo tervezett fehérjét Hecht és mts. szintetizálták7. Az előállított 79 aminosavból felépülő fehérje (PDB: 1FLX) – melyet Felix fantázianévvel illettek – a jósolt szerkezetnek megfelelően négy antiparallel α-hélixből álló balmenetű kötegbe rendeződött, amelyben az első és a negyedik hélixet egy diszulfid híd kötötte össze. Felépítését tekintve természetes fehérje jellegű (a 20 természetes aminosav közül 19-et tartalmaz), de NMR spektrumát nézve inkább félúton van a rendezett és a rendezetlen fehérje között. Hasonló módon készült a Betabellin antiparallel β-hordó szerkezetű mesterséges fehérje is8. A tervezettnek megfelelően kialakult a β-hordó motívum, de a β-redőben előforduló sok hidrofób aminosav miatt a fehérje vízben oldhatatlan maradt. Csak további redesign lépések tették lehetővé, hogy vízoldható legyen a fehérje. NMR spektrumában nagy volt a jeldiszperzitás, ami rendezett fehérjére utal, COSY spektruma azonban több konformációs állapotról tanúskodott, NOESY spektrumában pedig nem volt egy szekvenciálisan távoli NOE sem, azaz a harmadlagos szerkezet igen gyengének bizonyult. Ennél nagyobb sikert ért el Dahiyat és Mayo a Zn-ujj domén szerkezetének de novo újra tervezése során9. Egy teljesen automata számítógépes módszert fejlesztettek ki az optimális szekvencia megválasztására. Ennek segítségével egy olyan 28 aminosavból álló fehérjét terveztek, ami az NMR és CD mérések szerint stabil, egy konformerrel jellemzehető, és a szerkezeti elemei a folding során kismértékű kooperativitást is mutatnak (2.C ábra).
-7-
TC5b, a legkisebb mesterséges fehérje A ma ismert legkisebb és legstabilabb a priori tervezett minifehérje a TC5b, vagy más néven Trp-kalitka. Neidigh és mts. A Gila monster viperagyík nyálában megtalálható 39 aminosav hosszú helikális polipeptidből indultak ki (exendin-4, EX4), és számos csonkítás és mutáció után 20 aminosavra tudták csökkenteni a fehérje méretét úgy, hogy közben a szerkezetét is stabilizálták, vízoldhatóságát növelték1. Az így előállított kompakt, globuláris minifehérje több, mint 95 %-ban van jelen feltekeredett állapotban vízben, fiziológiás pH-n, 280 K hőmérsékleten. Az EX4 vízben részlegesen rendezett, triflouralkoholos közegben viszont stabil, rendezett struktúrával bír. Szerkezete egy hosszú helikális lánc és az arra visszahajló rövidebb poli prolin II hélixből áll. A szerkezet stabilitását a Trp25 köré szerveződött hidrofób mag adja. Ezt a motívumot nevezték el később Trp-kalitkának (TC, Trp-cage). A tervezés során első lépésként a hidrofób maggal semmiféle kölcsönhatást nem mutató N-terminális régió csonkították le. Majd beiktattak a szerkezetbe egy stabilizáló AspArg sóhidat, miközben a kedvezőtlen (ExxxD) Coulomb kölcsönhatás elkerülésére a glutaminsavat (E) glutaminra (Q) cserélték, létrehozva ezáltal a hélix-kedvelő QxxxD kölcsönhatást10. Legvégül a hidrofób mag pakoltságát tökéletesítették a fenilalanin → tirozin mutációval. A végső szekvencia ennek következtében: NLYIQWLKDGGPSSGRPPPS (3. ábra).
3. ábra A TC5b minifehérje szerkezetének szalagmodellje. A központi Trp6 (sárga) köré szerveződött hidrofób mag aminosavai vannak feltüntetve: Tyr3 (lila), Leu7 (narancssárga), Pro12, Pro18, Pro19 (kék).
-8-
A TC5b a szerkezetének publikálása óta nagy érdeklődésre tart számot mind a kísérleti mind az elméleti kémikusok körében. Több csoport látott hozzá a további variánsok tervezéséhez, így mára már több mint 60 TC5b mutáns létezik11. Ezek majd’ mindegyike felvette a Trp-kalitka foldot kvázi fiziológiás körülmények között (pH 6-7, 280 K). A tanulmányokból az is kiderült, hogy mind a kémiai eltolódást, mind a távoli NOE mintázatot tekintve nagy hasonlóság volt a különböző variánsok NMR spektrumai között. A mutánsok szerkezeteinek elemzése során több kérdésre is választ kerestek, többek között arra, hogy pl. mi az összefüggés a hélix önmagában meglevő stabilitása és a globális stabilitás között; hogyan befolyásolja a prolinok entrópia effektusa a folding termodinamikáját; milyen szerepe van a D9-R16 sóhídnak a szerkezet stabilizálásában; milyen hatása van a helyi másodlagos struktúráknak stb. Más csoportok molekula mechanikai szimulációkkal próbálták a Trpkalitka felgombolyodását modellezni. A számítások során elsősorban azokat a specifikus kölcsönhatásokat keresték, amelyek elősegítik ezt a folyamatot.
A fehérjefelgombolyodás A fehérjék egyedülállóak a makromolekulák között abból a szempontból, hogy a szekvenciájuktól függően képesek viszonylagosan stabil, jól meghatározott, három-dimenziós térszerkezet kialakítására. Ezt a folyamatot nevezzük a fehérje felgombolyodásának, vagy más néven feltekeredésének*. Elméletileg egy fehérje számtalan konformációban létezhetne, mégis csak egy – vagy legfeljebb néhány – valósul meg a természetben. S hogy melyik az a néhány, az benne rejlik a fehérje elsődleges szerkezetében, a szekvenciában. Azonban a mai ismeretek szerint a természeten kívül más még nem tudja ezt az információt teljes egészében értelmezni. Még nagyon sokat kell a felgombolyodás mechanizmusáról tanulnunk ahhoz, hogy csupán a szekvenciát ismerve meg tudjuk mondani a natív állapot térszerkezetét. Ennél valamivel kézenfekvőbb problémának tűnik annak a folyamatnak a feltárása, ahogyan a fehérje kialakítja a natív konformációját. Nyilvánvalóan ez nem egy random fluktuáción alapuló folyamat, ami egy egyszerű számítással belátható. Tegyük fel például, hogy egy aminosav nyolc különböző konformációban fordulhat elő: ekkor egy 20 aminosavból álló minifehérje 820 ≈ 1018 konformációs állapotban létezhet. Ha minden konformációs állapot kipróbálása csak 1 ns-ig tartana, akkor a konformációs tér teljes bejárása több mint egy évet venne igénybe. A természet ennél viszont lényeges gyorsabban dolgozik, ugyanis egy átlagos fehérje felgombolyodása a másodperc-perc időskálán mozog, a *
Használatos még a folding kifejezés is.
-9-
leggyorsabban tekeredő 20 aminosavból álló TC5b felgombolyodásához pedig elegendő 4
µs12. Így valószínűsíthető, hogy csak néhány intermedier konformeren keresztül vezet az út a rendezett szerkezethez. Ugyanakkor ma már azt is tudjuk, hogy in vivo a fehérje feltekeredésében sok esetben enzimek és chaperon fehérjék segédkeznek, és könnyítik meg a végső szerkezet elérését, lecsökkentve a bejárható konformációs teret. Azonban a jelenlétük nem szükségszerű, számos példa van olyan in vitro előállított fehérjére, amely kofaktorok és segédfehérjék nélkül is felgombolyodik a natív állapotába. A fehérjefeltekeredés során a legegyszerűbb esetben egy kétállapotú rendszert tételezünk fel. Ezt tekinthetjük tulajdonképpen a felgombolyodás elemi lépésének13. f eltekeredés
U letekeredett unf olded
letekeredés
N natív f olded
Kémiai szempontból nézve ez egy izomerizációs egyensúly a letekeredett (unfolded vagy random coil) U és a natív (folded) N állapot között. Egyszerűsége ellenére azonban ez a modell meglepően sok fehérje konformációs egyensúlyát le tudja írni. Abban az esetben is alkalmazható a modell, ha nem egy legombolyodott és egy felgombolyodott állapotot tételezünk fel, hanem egy Ui és egy Ni (i = 1 .. n) sokaságot, ahol egymás között a specieszek egyensúlyban vannak. Ha az U és az N sokaságon belül az átalakulás sokkal gyorsabb, mint a két sokaság között, akkor a legtöbb kísérleti módszer csak egy kétállapotú rendszert fog detektálni, ahol a reakció elsőrendű kinetikát követ. De még ha összemérhető is a két folyamat sebessége, akkor is kétállapotú marad a rendszer, csak már nem elsőrendű a reakció. Általános esetben azonban
számolni kell
az U és
N állapottól tisztán
megkülönböztethető intermedier (I, J, K) állapotok, állapot-sokaságok létével is. U1
I1
J1
K1
N1
U2
I2
J2
K2
N2
Un
In
Jn
Kn
Nn
Egy ilyen összetett modell nehezen használható a gyakorlatban, de kísérleteken alapuló különböző egyszerűsítésekkel élve a valóságot jól leíró közelítéshez juthatunk. A két leggyakrabban alkalmazott modell a diffúzió-ütközés (diffusion-collision)14 illetve a - 10 -
magképzés-kondenzáció (nucleation-condensation)15 mechanizmus. Az előbbi szerint a fehérjének először a másodlagos szerkezeti elemei alakulnak ki, amit a szerkezeti elemek között a harmadlagos kontaktusok diffúzív keresése követ. Míg az utóbbi értelmében először a fehérjében a hidrofób mag alakul ki, ami köré ezután szerveződik a natív struktúra. A fehérjefelgombolyodás termodinamikája szempontjából a rendezetlenből rendezett szerkezetté alakulás a rendszer jelentős entrópiacsökkenésével jár. Termodinamikailag ez egy kedvezőtlen folyamat, és ahhoz, hogy a reakció mégis lejátszódhasson (∆rG < 0), a GibbsHelmholz egyenlet értelmében kell lennie olyan folyamtoknak, amelyek entalpianyeresége kompenzálja az entrópiacsökkenéssel járó energiaveszteséget.
∆ r G = ∆ r H − T∆ r S ∆rG a rendszer moláris szabad entalpia változása ∆rH a rendszer moláris entalpia változása ∆rS a rendszer moláris entrópia változása T az abszolút hőmérséklet Tudva azt, hogy a fehérje kovalens struktúrája nem változik a feltekeredés során (itt most eltekintünk a diszulfidhíd-képződéstől), egyedül a nem-kovalens jellegű (H-híd, van der Waals, elektrosztatikus, hidrofób) kölcsönhatások lehetnek a mozgatóerői a natív állapot felvételének. A tapasztalat is azt mutatja, hogy általában az a legstabilabb konformáció (legkisebb G), ahol a legtöbb másodlagos kölcsönhatás alakul ki. A natív állapot alacsony szabadentalpiája azonban nem egyszerűen ezeknek a gyenge kölcsönhatásoknak a kialakulásával járó energianyereségek összege. Minden a fehérjén belüli H-híd és van der Waals kötés kialakításához egy vagy több ugyanilyen erősségű kötést kell felhasítani az aminosav és a környező víz között. Így az ezekből származó nettó energianyereség közel nulla. Töltött aminosavból viszonylag kevés van egy fehérjében, így az elektrosztatikus kölcsönhatáson alapuló sóhíd képzés sem lehet a fő mozgató rugója az eseményeknek16, habár a sóhidak fontos szerephez juthatnak a gombolyodás folyamatának irányításában17. Tehát ezeket figyelembe véve arra a megállapításra juthatunk, hogy a feltekeredés entalpianyeresége a hidrofób aminosavak közötti kedvező kölcsönhatásnak az eredménye. Későbbi vizsgálatok azt is kimutatták, hogy az apoláris aminosavak aggregációja, vagyis a hidrofób mag kialakulása a dehidratáció következtében entrópia növekedéssel jár18. A két ellentétes előjelű
- 11 -
entrópia effektus (negatív konformációs rendeződés és pozitív dehidratáció) eredője közel nulla, így a reakció végbemeneteléért a kismértékű entalpianyereség a felelős*. De hogy milyen mértékben, és hogy milyen egyéb hatások irányítják a fehérje felgombolyodását, az még máig nem tisztázott teljes mértékben. A fehérjefeltekeredés kísérletes vizsgálatához előszeretettel alkalmaznak kis modelleket, például minifehérjéket. Szemben az izolált, másodlagos szerkezettel bíró polipeptidekkel (pl β-hajtű vagy alanin-alapú α-hélix), a minifehérjékben azok a harmadlagos,
gyenge
kontaktusok
is
vizsgálhatóak,
amelyek
a
valódi
fehérjék
felgombolyodásában esszenciális szerepet játszanak. Kézenfekvő volt tehát a legkisebb, harmadlagos struktúrával rendelkező fehérje, a TC5b ezirányú vizsgálata. A feltekeredésére vonatkozólag már több, olykor ellentmondásos kísérlet született. Az első eredmények kapcsán azt feltételezték, hogy a TC5b natív állapotának felvétele egy kooperatív, kétállapotú folyamat eredménye, tehát csak a random coil és a natív szerkezet létezik vizes oldatban. Szigmoidális termikus denaturáció profilt mutatott mind a CD, a Trp-fluoreszcens12 és az NMR másodlagos kémiai eltolódáson alapuló mérés, 42 °C körüli inflekciós ponttal. Ez az ún. olvadási hőmérséklet (Tm), ahol egymással egyensúlyban egyenlő számban van jelen a le és a felgombolyodott szerkezet. Később DSC (Differential Scanning Calorimetry) mérésekkel is hasonló megállapításra jutottak, a kísérleti pontokra tökéletesen illeszkedett a kétállapotú rendszer modellje19. Ugyanakkor Ahmed és mts. UV-rezonancia Raman spektroszkópiai mérések alapján egy sokkal bonyolultabb feltekeredési szcenáriót feltételeztek20. Méréseik szerint a denaturált állapotban is jelen van reziduális α-hélix (ui. az α-hélix fokozatos olvadáson ment keresztül 4 és 70 °C között), tehát a gombolyodás során ez a szerkezeti elem már igen korán kialakul. Emellett megfigyeltek 20 °C körül egy kompakt intermediert, ahol mind a PPII lánc, mind a 310-hélix még inkább eltemette a központi triptofánt. Neuweiler és mts. Fluoreszcencia Korrelációs Spektroszkópia (FCS) méréseket végezve szintén intermedier állapotot figyelt meg21. Ez a mérés azonban az „olvadt-gombóc” állapotú intermedierben nem egy jobban eltemetett, hanem inkább egy oldószernek jobban kitett triptofánról adott számot. Elméletük szerint a kezdeti hidrofób kollapszus – ami az olvadt-gombócot eredményezi –, nagyban meggyorsítja a natív szerkezet kialakulását, lecsökkentve az elérhető konformációs állapotok számát. Ez megmagyarázhatja a TC5b megdöbbentően rövid feltekeredési idejét (4 µs). Hidrofób kollapszusra utaló jeleket találtak Mok és mts. is egy speciális fotokémiai *
A gombolyodás nem járhat összentrópia növekedéssel, hiszen akkor a hőmérséklet emelésére a ∆rG tovább csökkenne, vagyis a fehérje rendezettebbé válna. A tapasztalat pedig nem ezt mutatja.
- 12 -
polarizációs (Photo-CIDNP, PhotoChemically Induced Dynamic Nuclear Polarization) NMR technika segítségével22. A denaturált oldatban olyan oldalláncok között találtak NOE jeleket, amelyek a natív térszerkezetben távol vannak egymástól. Tehát ezek szerint a részlegesen legombolyodott fehérje egy, a natívtól különböző szerkezettel rendelkezik. A végső állapot eléréséhez először fel kell hasadnia, majd újraformálódnia a D9-R16 sóhídnak. A fehérjegombolyodás folyamatát nemcsak kísérleti úton lehet megközelíteni, hanem elméleti molekula mechanikai szimulációk segítségével is. Az elmúlt időben tapasztalt nagymértékű fejlődés a számítástechnika és a modellező programok terén lehetővé tette mára az atomi szintű, explicit oldószert használó fehérjefolding szimulációkat. A TC5b kis mérete és gyors feltekeredési kinetikájának köszönhetően ideális rendszerként szolgál ezekhez a számítógépes szimulációkhoz. Az első TC5b folding szimulációt Simmerling és mts. végezték még a kísérleti szerkezet publikálása előtt23. A molekuladinamikai számításaikban egy módosított AMBER99 erőteret24 és általánosított Born oldószermodellt 25 alkalmaztak, hogy atomi képet tudjanak adni a TC5b feltekeredéséről. A különböző kezdeti nyújtott szerkezetből elindított szimulációk egyazon konformerbe konvergáltak, ami majdnem teljesen megegyezett (1,4 Å RMSD) az NMR spektrumból megállapított szerkezettel. Szintén általánosított Born oldószermodellt használt Snow és mts. a gombolyodási ráta sztochasztikus becslése során26 több ezer rövid (nanoszekundumos) kinetikai szimulációt futtatva OPLS erőtérben27. Elméletük szerint, a hidrofób kollapszust követően egy fehérjének lehet natívszerű topológiája28, amit be is bizonyítottak a Trp-kalitka folding szimulációja során. Más elméleti csoportok arra használták ezt a minifehérjét, hogy molekuladinamikai erőtereket tervezzenek, teszteljenek29 és az azokban használt paramétereket optimalizálják a segítségével30. Ennek eredményeképpen sokat fejlődött a szimulációs technika, és az első próbálkozások óta számos új, pontosabb, a valóságot jobban leíró szimuláció született a TC5b termodinamikai stabilitásának és a feltekeredés trajektóriájának elemzése céljából. Legújabban Juraszek és mts. replica exchange molekuladinamikai (REMD)31 számításokat
használva
explicit
oldószerben
modellezte
a
Trp-kalitka
fel-
és
32
legombolyodását, és egy egészen összetett folyamathoz jutottak . Eredményeik szerint a feltekeredésben a hidrofób kollapszust követően két út lehetséges a natív szerkezet elérésére. A nagyobb valószínűséggel bekövetkező események szerint az α-hélix kialakulása előtt jön létre a Trp6 és a prolinok közötti hidrofób kölcsönhatás. Ekkor egy olyan β-hajtűre emlékeztető hurok (loop) szerkezet formálódik, amit harmadlagos kontaktusok és H-hidak tartanak össze (magképzés-kondenzáció modell). Ahogy az oldószernek kitett Trp6 befordul a - 13 -
magba, kialakul a natív térszerkezet. Másfelől, az esetek 20 %-ban azt találták, hogy miközben kialakul az α-hélix, aközben két, egymástól elkülönült hidrofób klaszter is létrejön, ami később összekapcsolódik a hidrofób maggá (diffúzió-ütközés modell).
- 14 -
Elméleti háttér Fehérje NMR Az NMR spektroszkópia a technikai fejlődés eredményeként mára a fehérje biokémia fontos és mással nem pótolható eszközévé vált. Segítségével lehetőség nyílik arra, hogy peptidek és kisméretű fehérjék szerkezetét, konformációs dinamikáját, kötőhelyeik sztereokémiáját közel fiziológiás körülmények között, oldat fázisban határozzuk meg33. Különös jelentősége van a fehérjék konformációs flexibilitásával összefüggő jelenségek vizsgálatában, hiszen az NMR tükrözi az atomi szintű mozgásokat és kicserélődési folyamatokat. Szemben a Röntgen krisztallográfiás szerkezetmeghatározással, ez a módszer nem igényli a fehérje kristályosítását, ami az előbbi módszer alkalmazhatóságának korlátja. Hátránya azonban, hogy 50 kDa tömegű fehérjénél nagyobbat csak speciális körülmények között lehet NMR segítségével vizsgálni. Ezért az NMR spektroszkópiát sokan a Röntgen krisztallográfia komplementer módszereként tartják számon. Biológiai rendszerek kvantitatív vizsgálatára a hagyományos 1D NMR mérések nem alkalmasak, mert a spektrumban jelentkező sok száz átfedő jelet nem lehetett egyértelműen azonosítani. Kvalitatív képet azonban már egy 1D felvételből is kaphatunk. A jeldiszperzitás mértéke utal a fehérje rendezettségi fokára: a kisebb jeldiszperzitás egy kevésbé rendezett szerkezetsokaságnak felel meg, míg a jól elkülönülő jelek rendezett konformerre utalnak. A jelek vártnál nagyobb félértékszélessége aggregációt, vagy megnövekedett flexibilitást jelent. Egyre nagyobb mágneses térerő használatával ugyan jelentősen lehet javítani az 1D NMR spektrum felbontásán, de a nagy áttörést a fehérjeszerkezet kutatásban mégsem a növekvő tér, hanem a 2D NMR technika kidolgozása jelentette34. Ebben az esetben a 90°-os rádiófrekvenciás gerjesztő pulzus és az adatgyűjtés ideje közé egy ún. kifejlődési időt (t1) iktatunk be, melynek időtartamát a méréssorozatban rendre növeljük. Ezalatt az idő alatt, különböző pulzusszekvenciák alkalmazásával lehetőség nyílik arra, hogy az egymás környezetében levő spinek között kapcsolatot hozzunk létre pl. polarizáció vagy koherencia transzferrel. Ekkor egyes spinek a környező spinek állapotaival modulálódnak. Az interferrogramm (FID, Free Induction Decay) detektálása alatt (t2) így nemcsak az adott spinről, hanem annak környezetéről is információt nyerhetünk. A Fourier-transzformáció mindkét dimenzióban elvégezhető (F1(t1) indirekt, és F2(t2) direkt dimenzió), és így kapjuk a kétdimenziós F1( ω1), F2( ω2) spektrumot. - 15 -
4. ábra a,TOCSY és b, NOESY pulzusszekvenciák
Az NMR spektrumból közvetlen szerkezeti információ nem olvasható ki, adott pulzusszekvenciák használatával csupán speciális atompár-kapcsolatokra következtethetünk. A korrelációs módszereknél a szomszédos atomok közötti kötéseken keresztül valósul meg a mágnesezettség-transzfer.
Hagyományos
homonukleáris
korrelációs
spektroszkópiát
alkalmazva (COSY, COrrelation SpectroscopY) csak az egymással skalárisan csatolt spinek között létesül mágneses kapcsolatot, ún. koherencia transzfer. A 1H-1H-TOCSY (Total
COrrelation SpectroscopY) pulzusszekvencia (4.a ábra) egy ún. teljesen korrelált spektrumot eredményez. Ekkor a keverés (spinlock) időtartamától függően az egymás közötti skaláris csatolás következtében a mágnesezettség több lépésben átadódik a spinrendszer távolabbi protonjainak. Így, míg a COSY spektrumban csak az egymással csatolt protonok adnak keresztcsúcsot, addig a TOCSY mérés alkalmával akár az összes egy spinrendszerhez tartozó Hα, Hβ … Hω proton modulálódik egymás spinállapotaival, keresztcsúcsot hozva létre a 2D spektrumban. Ez nagy segítséget nyújt az aminosavak spinrendszereinek azonosításában. Teljes fehérjeszerkezet meghatározás a TOCSY spektrum alapján azonban nem végezhető el, mivel információ ezzel csak a különálló spinrendszerekről nyerhető. Ahhoz, hogy szekvenciálisan sorba rendezzük az aminosav-jelsorozatokat, szükség van olyan pulzusszekvenciára, amely más elven valósítja meg a mágnesezettség transzfert, például a téren át is képes mágneses relaxációt kiváltani. Erre a legelterjedtebben a NOESY (Nuclear
Overhauser
Effect
SpectroscopY)
mérést
használják
(4.b
ábra),
amely
nemcsak
szekvenciálisan közeli, hanem szekvenciálisan távoli, térben mégis közel eső atomok detektálására is alkalmas. A nukleáris Overhauser effektus (NOE) egy téren át ható dipoldipol relaxáció, melynek során az egymástól maximum 5 Å távolságban levő atommagok a keresztrelaxáció
következményeként
kölcsönösen - 16 -
befolyásolják
egymás
mágneses
környezetét, így megfelelő pulzusszekvenciát használva spektrumban detektálható jelet adnak (5. ábra). Az NOE jel nagysága (a jel alatti terület) r-6-os távolságfüggést mutat a két kölcsönható mag között. Így az integrál ismeretében következtethetünk az atomok fizikai távolságára.
NOE ∝ r −6 ⋅ f (τ c ) 5. ábra Téren át ható dipólus csatolás (NOE)
Összességében tehát elmondható, hogy a 2D NMR technika segítségével a fehérje primer szekvenciájának ismeretében a teljes jelhozzárendelés elvégezhető, és elegendő NOE kényszerfeltétellel a fehérje oldatbeli konformációja közelíthető.
Processzálás A felbontás és a jel-zaj arány javításának érdekében a t2 idő alatt begyűjtött interferrogrammot a Fourier transzformáció előtt tovább módosíthatjuk különböző ablakfüggvények használatával. Alapjában kétféle elv szerint dolgozhatunk, attól függően, hogy a felbontást szeretnénk növelni a rejtett finomszerkezet feltárására, vagy a jel-zaj arányt fokozni egy zajos spektrumban. Ezek elérésére számos matematikai súlyozó függvényt, ún. ablakfüggvényt dolgoztak ki az elmúlt évtizedekben, de széles körben ezek közül csak néhány terjedt el. Tudva azt, hogy bármely NMR FID-ben az adatgyűjtés ideje alatt a jelintenzitás exponenciálisan lecseng, a zaj viszont állandó marad, kiválaszthatjuk, és felnagyíthatjuk a FID számunkra értékes részét a megfelelő ablakfüggvény alkalmazásával. Ha
exponenciálisan
lecsengő
függvénnyel
szorozzuk
az
interferrogrammot
(exponential multiplication), akkor a FID legelső felét felerősítjük, míg a lecsengő részét szinte teljesen elnyomjuk, javítva ezzel a jel-zaj arányon a jelfelbontás rovására. Eltolt Gauss vagy eltolt Lorentz-Gauss ablakfüggvényt alkalmazva a FID középső részét növeljük meg, szélesítve ezzel az információban gazdag tartományt, ami által a spektrum felbontását tudjuk jelentős mértékben javítani, a jel-zaj arány rovására. További előny még az is, hogy a Lorentz-Gauss transzformáció eredményeképpen nem Lorentz, hanem Gauss görbe alakú jelet kapunk, aminek valamivel keskenyebb az alapvonalon mért szélessége. Mivel a mágnesezettség vektor és a vevő csatorna fázisa a legtöbb esetben nem egyezik meg egymással (nulladrendű fázis hiba), és mert a spektrométer elektronikája nem
- 17 -
teszi lehetővé a gerjesztést követő azonnali detektálást kémiai eltolódás szerinti fázisszeparációt eredményezve (első rendű fázis hiba), ezért a Fourier transzformációt követően nullad- és elsőrendű fáziskorrekciót kell végezni. A fázis beállításakor az adszorpciós jelalakot részesítjük előnyben a diszperziós jelalakkal szemben.
Asszignáció Az asszignáció első lépése az egyes aminosavakhoz tartozó spinrendszerek azonosítása a TOCSY spektrum alapján. Ezt a leghatékonyabban az F1 amid és F2 alifás régió jelei alapján lehet megtenni, ez a spektrum ún. ujjlenyomat régiója (6. ábra). Az itt megjelenő csúcsok száma és helye értékes információt ad az aminosav jellegéről, ugyanis felismerhetőek bennük az egyes aminosavakra jellemző karakterisztikus mintázatok. A spinrendszer azonosítás az aminosavak szintjén azonban még nem jelent minden esetben egyértelmű hozzárendelést, ugyanis egyes aminosavak többször is szerepelhetnek egy fehérjében, illetve egy spinrendszer-mintázat több aminosavra is jellemző lehet (pl. Cys, Ser, Asp, Asn mindegyike ún. J-típusú spinrendszert alkot, aminek létrehozásában csak a Hα, és Hβ protonok vesznek részt). Ezek egyértelmű azonosításához már szükség van a NOESY spektrumokra.
6. ábra Egy minifehérje NOESY spektruma. Folytonos vonal az ujjlenyomat régiót, szaggatott vonallal az alifás régiót határolja
A spinrendszerek azonosítását érdemes olyan aminosavval kezdeni, amiből lehetőleg csak egy van a szekvenciában, és a spinrendszere egyértelműen megkülönböztethető a - 18 -
többitől. Szekvenciálisan ezután meghatározható az előtte és az utána levő aminosav, ui. a NOESY spektrumban keresztcsúcs jelentkezik a i-1Hα-iHN protonok között – feltéve hogy az i. aminosav nem prolin – ui. a dHA,NH(i-1,i) távolság egy peptidláncban minden esetben 5 Å-n belül van. Ezen az elven azonosíthatóak a prolinok közötti szakaszok a szekvenciából. Legvégül pedig a kimaradt prolinokat asszignáljuk az alifás régió jelei segítségével (6. ábra). Kritikus kérdés azonban, hogy azonosítható-e egyértelműen az összes prolin egy szekvenciában csupán ennek a régiónak a felhasználásával. Számolni kell azzal is, hogy a peptidlánc első (olykor első kettő) és utolsó aminosavaihoz tartozó jelek nem, vagy csak részben jelennek meg a spektrumban ezen csoportok gyors mozgása következtében. Ha a TOCSY és NOESY spektrumok segítségével sikerült a peptidgerinchez tartozó spinrendszereket azonosítani és szekvenciálisan sorba rendezni, akkor kezdhetünk hozzá a szerkezetszámításhoz oly nélkülözhetetlen távolság-tartalmú NOE jelek azonosításába. Ezeket három főbb csoportba lehet sorolni: szekvenciális NOE-ről akkor beszélünk, hogyha a keresztcsúcs szomszédos aminosavak között jelenik meg ( i, i ± 1 ), közeli NOE-nak
hívjuk a szekvenciálisan távolabbi ( i, i ± 2,3,4 ) aminosavak közötti jelet, míg távoli NOE az a csúcs, ahol szekvenciálisan minimum 5 aminosav különbség van a keresztcsúcsot adó protonok között (7. ábra). A közeli NOE a fehérje másodlagos szerkezetéről hordozhat hasznos információt, mivel adott konformáció-típus (pl. α-hélix, β-redő) esetében karakterisztikus NOESY keresztcsúcs-elrendeződést alakul(hat) ki a környező aminosavak protonjai között (pl. az α-hélixre jellemzőek az iHα-i+3HN keresztcsúcsok). A távoli NOE csúcsok a harmadlagos térszerkezet azonosításához kulcsfontosságúak.
7. ábra Szekvenciális és közeli 1H-1H távolságok egy polipeptid láncban
- 19 -
A csúcsok asszignációja után a következő lépés a NOE keresztcsúcsok intenzitása alapján a 1H-1H távolságok meghatározása. A jelintenzitás arányos a Hi és Hj proton közötti keresztrelaxációs sebességgel (σij). A keresztrelaxáció sebességnek és a megfelelő távolság hatodik
hatványának
szorzata
egy
molekulán
belül
állandó,
így
egy
alkalmas
referenciatávolságot választva bármelyik csúcshoz tartozó távolság meghatározható. d i, j d ref
6
σ = ref σ i, j
Referenciaként olyan proton távolságot érdemes választani, ami független a fehérje konformációjától. Ez legtöbbször egy metilén-csoport, vagy egy aromás oldallánc két protonja közti távolság. Ez a módszer hibával terhelt, ezért csak nagyságrendileg következtethetünk két proton távolságára. Ezért a NOE kényszerfeltételeket távolság szerint három csoportba szokták sorolni: 1,8 – 2,5 Å; 1,8 – 3,5 Å és 1,8 – 5 Å csoportokba. Itt az 1,8 Å alsó határ a hidrogén atomok van der Waals rádiuszának az összege, míg a felső határ az NOE kialakulásának a fizikai felső határa. A szerkezetszámítás során nem büntetjük azt a konformációt, ahol a protonok a NOE intenzitása alapján számítottnál közelebb kerülnek egymáshoz, csak azt, ahol a vártnál távolabb esnek, ezért minden kényszerfeltétel kategória alsó határa 1,8 Å. Az NOE kényszerfeltételeken alapuló geometriaoptimálás előtt előzetes térszerkezetbecslést adhatunk csupán a kémiai eltolódások ismeretében is. Ekkor a Hα, Hβ, HN, Cα, Cβ jelek megfigyelt eltolódási értékeit (δobs) hasonlítjuk össze a térszerkezet nélküli peptidek, ún. „random coil” eltolódási értékeivel (δrc). A kettő különbsége a másodlagos kémiai eltolódás (CSD, Chemical Shift Deviation, δobs - δrc), ami tükrözik a fehérje rendezettségi vagy feltekeredettségi fokát. Ha NMR időskálán nézve gyors egy fehérje feltekeredése (< 20 µs), akkor a tapasztalt kémiai eltolódások a felgombolyodott (folded) és legombolyodott (unfolded)
konformerekhez
tartozó
kémiai eltolódások
populáció-súlyozott
átlagai.
Amennyiben rendelkezésre állnak a teljesen feltekeredett állapothoz tartozó referencia CSD értékek, akkor ehhez viszonyítva megadható a feltekeredett populáció aránya.
- 20 -
Térszerkezet számítás A NOESY méréseken alapuló szerkezetbecslés egy bonyolult, iteratív eljárás. Az NMR spektrumból nyerhető kényszerfeltételek alapján molekula dinamikai eszközöket használva, geometriai optimalizálással közelíthetjük a kérdéses fehérje oldatbeli szerkezetét. A számítások alapja egy félempirikus potenciálisenergia függvény. Ebbe építünk be az NOE kényszerfeltételeknek megfelelő energiatagot, a következő formában:
E NOE
k NOE (d ij − u ij )2 , ha d ij > u ij 2 = k NOE (lij − d ij ) , ha d ij < lij 0, ha lij ≤ d ij ≤ u ij
ahol dij az i és j magok távolsága, uij és lij a NOE kényszerfeltételek alapján meghatározott alsó és felső távolságkorlát, kNOE a büntető függvény súlya. A molekuladinamikai szimulációk során a potenciálisenergia-függvény alapján a rendszer összes atomjára kiszámítjuk a rájuk ható erőt, majd a newtoni mozgásegyenleteket egy kis ∆t nagyságú idő lépésre megoldjuk, és a részecskét ennek megfelelő en elmozdítjuk. A fehérjeszerkezet globális energiaminimumának keresése egy NP komplett probléma, azaz a változók számával exponenciálisan nő az elvégzendő művelet száma. Így az energiaminimum meghatározásához már egy kisméretű fehérje esetében is csak közelítő módszert lehet használni. A legjobb megoldás keresésére szimulált hőkezelést (simulated annealing) alkalmazunk. Ez egy valószínűségi, metaheurisztikus eljárás, ahol a keresési térben egy hőmérsékleti programot használva egy magas hő mérsékletű, nagy kinetikus energiával rendelkező állapotból fokozatos hűtéssel közelítjük a kényszerfeltételek adta globális minimumot. Magas hőmérsékleten a rendszer könnyen át tudja lépni a konformációs átmenetek közti kinetikus gátat, ezáltal nem ragad bele egy lokális minimumba, így végül nagy valószínűséggel a NOE kényszerfeltételeknek megfelelő szerkezetet veszi fel. A geometriaoptimálás során ugyanazon kényszerfeltétel-készletbő l kiindulóan általában több (10, 50, 100) szerkezetből álló sokaságot generálunk, és annak függvényében, hogy milyen arányban teljesülnek a kényszerfeltételek elemezzük a kapott eredményeket. Egyszerű és kézenfekvő módja a számított szerkezet ellenőrzésének a Ramachandran térképen a torziósszögek vizsgálata. Amennyiben nem teljesül minden, vagy elegendő kényszerfeltétel, illetve a Ramachandran térképen sok a nem megengedett tartományban levő aminosav, akkor vissza kell menni a spektrumhoz, és megvizsgálni, hogy jól asszignáltuk-e a jeleket, illetve helyesen határoztuk-e meg a távolság-besorolásukat. Ha teljesülnek a
- 21 -
kényszerfeltételek, akkor a következő lépésben azt nézzük meg, hogy a számított szerkezetek mennyire jól illeszkednek egymásra. Számszerűen erre a szórás vagy RMSD (root mean square deviation) értékből tudunk következtetni. Ez a szám azt mondja meg, hogy az egymásra illesztett szerkezetekben mekkora az egymásnak megfelelő atomok pozíciójának a szórása. Ha ez az érték kicsi (~0,5 Å), akkor jól definiált, merev szerkezete van a fehérjének, ha az RMSD ennél nagyobb, akkor az egy flexibilis szerkezetet jelöl. Nagy szórás jelentheti azt is, hogy kevés volt a számítás során felhasznált kényszerfeltétel, vagy túl engedékeny volt a kényszerfeltételek távolság besorolása. Ekkor ismét elő kell venni a spektrumot, és újabb csúcsokat azonosítani. Ezt a folyamatot addig folytatjuk, amíg tapasztalható érdemleges javulás az egyes iteratív lépések között.
- 22 -
Célkitűzés TDK munkám során a Szegedi Tudományegyetemen előállított TC5b variánsokat vizsgálom, és arra keresem a választ, hogy milyen mértékben járul hozzá a minifehérje szerkezetének globális stabilitásához, illetve a fehérje feltekeredéséhez a fehérjében jelenlevő Asp9-Ar16 sóhíd. A vizsgálatokhoz a korábban a csoportunk által már tanulmányozott, sóhíd-optimált TC5b_D9E mutánst veszem alapul. Ez az eredeti TC5b fehérjének a 9. pozíciójában metilénhosszabbított változata (Asp9 → Glu9). Megvizsgálom ennek a fehérjének két variánsát, amelyek csupán a betoldott metilén-csoport helyében különböznek egymástól (8. ábra): a TC5b_R16hR variánst (hR, homo-arginin, az arginin metilén-hosszabbított változata), illetve a TC5b_D9Aad_R16K variánst (Aad, adipinsav, a glutaminsav metilén-hosszabbított változata). Kérdés az, hogy milyen mértékben lehet egy metilén-csoport „mozgatásával” finoman hangolni egy meglevő kölcsönhatást. A sóhíd stabilizáló szerepére lehet következtetni abból is, ha megszüntetjük az adott kapcsolatot. Ennek tanulmányozására elkészült egy sóhíd deficites szerin mutáns (TC5b_D9S). Választ keresek arra, hogy a sóhíd hiányában milyen egyéb szerkezetstabilizáló kontaktusok maradnak egyben, és melyek destabilizálódnak a fehérjében.
8. ábra A munkám során tanulmányozott fehérjék sóhíd-képző aminosavai. A D9S mutáns kivételével a többi variánsban a sóhíd-tagok össz hossza ugyanannyi.
Minden mutánsról 2D homonukleáris TOCSY és NOESY NMR felvétel készült semleges (pH ≈ 6,7) és savas (pH ≈ 2,7) körülmények között. Savanyítással egyrészt a sóhíd komponensek közötti elektrosztatikus vonzást lehet gyengíteni, vagy teljesen meg is
- 23 -
szüntetni, másrészt befolyásolni lehet az egyéb pH-függő szerkezetstabilizáló elemeket, más jellegű destabilizációt érve így el, mint a D9S mutációval. A NOESY spektrumok alapján, hogyha elegendő kényszerfeltételt lehet gyűjteni, akkor molekuladinamikai számításokkal szerkezetsokaságokat generálok, melyeket egymással részletesen összevetek. Az itt megmutatkozó konformációs különbségek adhatnak számot arról,
hogy milyen összhatása
van a szerkezetre egy metilén-csoport
helyének
megváltoztatása. Dolgozatomban bemutatom az NMR méréseken és MD szimulációkon alapuló eredményeimet, amelyek egy lépéssel közelebb vezethetnek a fehérjék natív szerkezetének a kialakulását vezérlő mechanizmusok megértéséhez.
- 24 -
Alkalmazott módszerek Fehérje szintézis A munkám során vizsgált összes peptid szilárdfázisú szintézissel készült a Szegedi Tudományegyetemen. A TC5b_D9E és D9S mutáns előállításához Boc-kémiát, a TC5b_D9Aad_R16K és R16hR mutánshoz az Fmoc-kémiát alkalmaztak. A szilárd hordozó a Boc szintézisek során Merrifield típusú gyanta (1,1 mmol/g), az Fmoc szintézis során pedig Wang típusú gyanta (0,79 mmol/g) volt. A szintézis folyamán a poláris aminosavak védelmére a következő védőcsoportokat alkalmazták: tritil (Trt): Asn, Gln; terc-butilészter (Obut): Asp, Glu, Aad; 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-szulfonil (Pbf): Arg, hArg; terc-butoxikarbonil (Boc): Lys; terc-butil (But): Ser, Tyr. A nyers peptidek tisztítása szemipreparatív fordított fázisú HPLC-n történt 0,1% tri-fluorecetsav (A), 80% acetonitril (B) eluenssel egy C18-as 10 µm szemcseméretű (15 x 250 mm) oszlopon. A detektálás UV abszorbancia alapján, 220 nm-en történt. A fehérjék tisztaság ellenőrzését analitikai RPHPLC-n, egy C18-as Lichrosorb típusú oszlopon (4,6 x 250 mm) hajtották végre. A fehérjék elválasztása az alábbi gradienssel történt: 3 percig 10% B, majd az 50. percig 10%-ról 35%-ra lineárisan növekvő B. Az előállított fehérjék minőségellenőrzésére Finnigan TSQ 7000 tandem kvadrupól tömegspektrométert használtak elektrospray ionforrással. Az ilyen módon előállított fehérjék szekvenciáit és analitikai paramétereit az 1. Táblázat tartalmazza. A TC5b_D9E fehérje megegyezik a korábban Hudáky és mts. által előállított fehérjével2. Név
Tömeg (Dalton)
Szekvencia 1 2 3 4 5
6
7 8
9
10 11 12 13 14 15
16
17 18 19 20
Számított
Mért
HPLC retenciós idő (min)
TC5b_D9E
N L Y
I Q W L K
E
G
G
P
S
S
G
R
P
P
P
S
2183,47
2183,5
8,56
TC5b_D9Aad_R16K
N L Y
I Q W L K
Aad
G
G
P
S
S
G
K
P
P
P
S
2169,46
2170,0
7,61
TC5b_R16hR
N L Y
I Q W L K
D
G
G
P
S
S
G
hR
P
P
P
S
2183,44
2183,5
8,59
TC5b_D9S
N L Y
I Q W L K
S
G
G
P
S
S
G
R
P
P
P
S
2141,41
2141,4
8,50
1. Táblázat A munkám során vizsgált fehérjék szekvenciái és analitikai paraméterei
- 25 -
NMR spektroszkópia Az NMR mérések egy Bruker DRX500 típusú 500 MHz-es készüléken készültek 280 K hő mérsékleten, 2,7 < pH < 3,2 savas és 6,7 < pH < 6,9 semleges körülmények között. A minták fehérjekoncentrációja a 90% H2O / 10% D2O elegyben 2 mM körüli volt. Belső referenciaként a DSS jelét alkalmaztunk (0,0 ppm). Minden fehérjérő l mindkét pH-n 1H-1H TOCSY és 1H-1H NOESY spektrumokat vettünk fel. Az alkalmazott spektrális szélesség 10 ppm volt. A TOCSY mérésekben az izotróp keverési idő (spinlock) jellemzően 16-18 ms volt, a NOESY mérésekben a τmix 30 és 300 ms között változott. Az
adatok
feldolgozása
(processzálás)
az
nmrPipe
programmal35
történt.
Ablakfüggvényként egy 90°-kal eltolt cos2 függvényt használtunk. A zajcsökkentés céljából polinomiális alapvonal korrekciót hajtottunk végre. A jelhozzárendelés a Sparky 3.112 programmal36 készült az elméleti bevezetőben ismertetett módon. A legtöbb esetben egyértelmű volt a jelhozzárendelés, és mind a gerinc és mind az oldallánc protonjeleit azonosítani lehetett. A semleges körülmények között felvett spektrumok elemzése során a kémiai eltolódásokat a Wütricht és mts. által meghatározott37 és Fesinmeyer és mts. által a TC5b-hez módosított38 térszerkezet nélküli, ún. „random coil” referencia értékekhez viszonyítottam. A savas spektrumoknál Schwarzinger és mts. random coil eltolódás értékeit használtam referenciaként39. A két mesterséges aminosav, az adipinsav, és a homo-arginin random coil értékei helyett a glutaminsav illetve az arginin megfelelő eltolódásai értékeit használtam, mivel nem állt rendelkezésemre a megfelelő adat. A szerkezetszámítás a NOESY spektrumok keresztcsúcsainak integrálásával nyert távolságjellegű kényszerfeltételeken alapult. A referenciatávolságot a Trp6Hε1-Hδ1 protonok között létrejövő NOE-ból származtattam (2,56 Å). Az intenzitás alapján három távolságtartományba kerültek az NOE jelek: 1,8 – 2,5 Å, 1,8 – 3,5 Å illetve 1,8 – 5 Å (adott esetekben az 5 Å helyett 6 Å volt az alkalmazott felső korlát). Más nem NOE-ból származó kényszerfeltételt (pl. H-híd, dihedrális szög stb.) nem alkalmaztam a szerkezetfinomítás során.
Szerkezetmeghatározás az NOE kényszerfeltételek alapján A szerkezetfinomításhoz a CNS-solve 1.1 programcsomagot40 használtam, amely az elméleti bevezetőben ismertetett szimulált hőkezelési protokollal keresi a fehérje globális energiaminimumát. A program bemeneti információként a fehérje szekvenciáját és az NOE kényszerfeltételeket használja. Mivel nem természetes aminosavat tartalmazó fehérjékre is
- 26 -
kellett szerkezetet számolnom (adipinsav, homo-arginin), amelyek kezelésére a CNS-solve program eredetileg nincsen felkészítve, ezért a programcsomag megfelelő topológia- és paraméterkönyvtárait kiegészítettem a mesterséges aminosavakhoz tartozó információkkal. Az adipinsav esetében a glutaminsav alapján, míg a homo-arginin esetében a természetes arginin alapján készítettem a konnektivitási és töltéseloszlási táblázatokat. A program AMBER erőteret használ az energiafüggvények felépítéséhez*, és ennek megfelelően határozza meg az egyes energiatagokat és azok paramétereit a szerkezetszámítás közben. Az aminosav-szekvenciából először egy szerkezeti fájlt generál, majd ebbő l egy következő lépésben nyújtott szerkezetet számít. Ez lesz a kiindulási szerkezet minden szimulált hőkezelés során, ahol a program a megadott kényszerfeltételeknek megfelelően keresi a globális minimumot. A geometriaoptimálás során minden iteratív lépésben 5 szerkezetet számítottam, és a szerkezetfinomítás végeztével pedig 50-et, és ebbő l az 50-bő l választottam ki a legjobb (legalacsonyabb belső energiával rendelkező) 10 szerkezetet. A kapott konformerek egymásra illesztését és a további elemzését a Chimera41 nevű programmal, a ϕ, ψ torziósszögek elemzését pedig a Fehérje Adatbank (Protein Database, PDB) ellenőrző (validation) szerverével végeztem.
*
Ezt az erőteret kifejezetten fehérjék és nukleinsavak molekuladinamikai szimulációjához fejlesztették ki. Az oldószerhatást az erőtér csupán egy távolságfüggő dielektromos állandóval veszi számításba.
- 27 -
Eredmények Az NMR spektrumok elemzése A TC5b_D9E semleges körülmények között készült spektrumának az elemzése A Trp-kalitka motívum szerkezetstabilizáló sóhídjának kísérleti vizsgálatához a korábban a csoportunk által szintetizált, sóhídoptimált D9E mutánst vettem alapul. Ez a fehérje annyiban különbözik az eredeti TC5b fehérjétől, hogy a sóhídban résztvevő egyik aminosav (Asp9) oldallánca egy metilén-csoporttal hosszabb (Asp → Glu csere), a fehérje többi alkotója és a kísérletek során használt NMR mérési körülmények megegyeztek a Neidigh és mts. által alkalmazottakkal1. Így a spektrumokban jelentkező különbség elsősorban csak a mutációnak köszönhető (minimális rezonancia-eltérést válthat ki a kismértékű pH és hő mérséklet különbség is). Első lépésként újból elvégeztem a D9E mutáns NMR spektrumainak az elemzését, majd ezek alapján a szerkezetoptimálást hajtottam végre. A spektrum-asszignáció során néhány csúcsot másként azonosítottam*, mint az korábban volt, ebből kifolyólag a számított szerkezet is eltér a korábban publikálttól. Az NMR spektrumok jelhozzárendelése egyértelműen elvégezhető volt, egyedül az Asn1 és Leu2 aminosavak amid-protonjai nem adtak jelet a spektrumokban, a többi jelet azonosítani lehetett (F-I. Táblázat). A „hiányzó” amid-protonok feltételezhetően azért nem jelennek meg a spektrumban, mert a fehérje flexibilis, oldószernek kitett, terminális részén helyezkednek el, ahol az amid-protonok könnyen lecserélődnek deutériumra. A D9E mutáns spektruma egy rendezett, stabil szerkezetet tükröz, ugyanis a NOESY spektrumában a fehérje kis méretéhez képest igen sok az interreziduális NOE (256) – egy aminosavra átlagosan több mint 12 ilyen NOE jut –, melyben igen jelentős a távoli (szekvenciálisan minimum 5 aminosavra levő) NOE-k aránya (68). A másodlagos kémiai eltolódásokat tekintve az α-hélix kialakításában résztvevő aminosavak (Asn1-Lys8) Hα protonjelei – az α-hélixekre jellemzően – jelentős (-0,3 ppm < ∆δ(Hα) < -0,7 ppm) negatív kémiai eltolódást mutatnak (9. ábra). Neidigh és mts. kiválasztották ezek közül a hélix-képző aminosavak közül a Y3, W6, L7 és K8 aminosavakat, *
Az eredeti asszignáció szerint az újlenyomat régióban megjelent a Leu2 jelsorozata, a Ser20 jelsorozata viszont nem. Nálam ez fordítva volt. Így a korábban Leu2-ként azonosított csúcsokat a Ser20-hoz rendeltem.
- 28 -
és ezeknek a Hα CSD értékeknek az abszolútérték-összegét egy olyan mérőszámként alkalmazták, ami a fehérjében a hélix formálódás mértékéről ad számot (CSDhelix). Ha ez az érték nő, az azt jelenti, hogy nagyobb az α-hélixszel rendelkező populáció aránya az adott mutánsban, a többihez képest, tehát az α-hélixhez tartozó olvadási hő mérséklet megnőtt*. Az összehasonlíthatóság kedvéért a különböző spektrumok elemzésekor én is az így definiált CSDhelix összeget használtam, és rendre ezeket az értékeket hasonlítottam össze a mutánsok között. α protonjaira Másodlagos kémiai eltolódások a D9E Hα 1 0,5
ppm
0 -0,5
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 10 11 11 12 13 14 15 15 16 17 18 19 20
-1 -1,5
D9E
semleges
savas
CSDcage (ppm)
8,579
-
CSDhelix (ppm)
1,551
1,232
∆G11Hα (ppm)
1,917
1,203
-2
semleges
-2,5
savas
-3
aminosav sorszám
savas minor
9. ábra A TC5b_D9E mutáns Hα protonjaira számított másodlagos kémiai eltolódások a semleges és savas spektrumokban, valamint a Trp-kalitka kialakulását jellemző mérőszámok a savas és semleges spektrumok másodlagos kémiai eltolódásából számítva.
A 9. ábrán feltüntetett Hα másodlagos kémiai eltolódás diagramban a Gly11 metiléncsoport protonjelei különös figyelmet érdemelnek. Ezek a protonok közvetlen a Trp6 oldallánc alatt helyezkednek el, így az indol-csoport gyűrűáram hatása következtében megnő rajtuk az elektronsűrűség, ami a nagymértékű negatív kémiai eltolódásban nyilvánul meg. A két proton eltérő mértékben részesül ebbő l az effektusból, így a Hα1 és Hα2 jelek jelentős felhasadást mutatnak. A két proton kémiai eltolódásának különbsége érzékeny mérőszáma a feltekeredettség mértékének. Azokban az esetekben, ahol ez a különbség nagyobb, ott nagyobb a felgombolyodott populáció aránya, illetve stabilabb a szerkezet11. Szintén az indolcsoport keltette gyűrűáram van hatással a Trp6 felett elhelyezkedő Pro18 és kisebb mértékben a Pro19 protonjeleinek rezonanciafrekvenciájára. Az elő bbi Hα és Hβ2 protonok másodlagos kémiai eltolódása -1,89 illetve -1,95 ppm, az utóbbi Hδ1, Hδ2 protonoké -0,5 – -0,6 ppm. A Trp-oldallánc mágneses tere láthatóan számos proton eltolódására jelentős hatással van, így ezeknek a CSD-knek az összegébő l szintén lehet egy, a Trp-kalitka kialakulására jellemző *
Olvadási hőmérséklet (Tm)az a hőmérséklet, ahol egyenlő arányban van jelen a rendezett és rendezetlen szerkezettel jellemezhető populáció
- 29 -
mérőszámot definiálni. Neidigh és mts. munkájával megegyezően a következő proton eltolódásokat használom a CSDcage számításához: L7Hα, G11Hα2, R16Hα, P18Hα, P18Hβ2, P19Hδ1, P19Hδ2. Hasonlóan a CSDhelix-hez, minél nagyobb a CSDcage abszolútértékben vett összege, annál kompaktabb szerkezet, de míg az előbbi csak az α-hélixrő l ad felvilágosítást, addig az utóbbi a teljes Trp-kalitka motívum kialakulását jellemzi. Amennyiben rendelkezésre áll megfelelő referencia, akkor a CSD értékekbő l a rendezett (folded) populáció százalékos aránya is megbecsülhető42. Jelen esetben én referenciaként a TC5b_D9E CSD értékeit választottam 95%-os feltekeredettséget feltételezve. Ez alapján a folded (xF) és az unfolded (xU) frakció a következőképpen számítható: x F = 0,95 ⋅
CSDobs CSD ref
xU = 1 − x F
ahol a CSDobs a számított CSD érték, a CSDref pedig a referenciának választott CSD.
A TC5b_D9E savas körülmények között készült spektrumának az elemzése Savanyítás hatására a D9E mutáns spektrumában az egyértelműen azonosítható csúcsok száma lecsökkent (a Leu2 amid-protonja viszont megjelenik), a kémiai eltolódás értékek pedig a legtöbb esetben a random coil értékük felé tolódtak el (9. ábra, F-I. Táblázat), ami egyértelmű bizonyítéka a szerkezet globális destabilizálódásának. Ezzel összhangban csökken a CSDhelix és a ∆G11Hα mérőszámok értéke is. CSDcage összeget nem tudtam számítani a savas spektrumokban egyrészt azért, mert nem állt rendelkezésemre minden proton eltolódáshoz savas random coil érték – csak HN, Hα és Hβ protonokhoz –, másrészt a P18Hα és P18Hβ2 protonjeleket nem lehetett egyértelműen asszignálni a spektrumban. A CSDhelix-ből a rendezett frakciót kiszámítva azt kapjuk, hogy hozzávetőleg 20%-kal csökken a helikális rendezett populáció aránya a savanyítás hatására (95%-ról 75%-ra). A destabilizáció elsősorban a sóhíd megszűnésének a következménye. A Glu9 oldallánc ugyanis pH=2,7-en protonálódott formában van jelen, így töltés hiányában az argininnel nem hoz létre sóhidat (pKa,Glu = 4,25). Kis mértékben szerepe lehet a destabilizációban a C-terimális karboxilcsoport protonálódásának és az egyéb pH-függő folyamatoknak pl. H-hídképzés. E jelenségek mellett különös figyelmet érdemelnek a nagy számban megjelenő minor konformerhez tartozó jelsorozatok. Minor forma lévén ezek azonosítása a legtöbb esetben kétséges, így ezeknek a csúcsoknak körülbelül csak a felét lehetett azonosítani (F-I. Táblázat). Ezek egyrészt az α-hélixet alkotó aminosavak másodlagos jelei voltak (asn1, leu2, tyr3, ile4,
- 30 -
gln5, leu7, lys8)* másrészt a 310 hélixben levő bizonyos aminosavak jelei (gly10 vagy gly11, ser13, ser14). A minor jelek másodlagos kémiai eltolódását nézve (9. ábra) feltűnő az, hogy sok esetben nem a random coil értékhez közelebbi, hanem attól még eltérőbb – a semleges pH-n megfigyelthez hasonló – rezonanciafrekvenciánál jelentkeztek a csúcsok. Ebbő l arra lehet következtetni, hogy a minor konformer is rendelkezik α-helikális jellegű szerkezettel. A NOESY spektrumban a minor jelek között szekvenciális NOE-t lehetett megfigyelni, egyes esetekben egy adott aminosav major és minor csúcsai között is volt NOE, de szekvenciális major-minor NOE-ra is volt példa pl. Tyr3Hβ# – ile4HN.
A TC5b_R16hR semleges és savas spektrumának elemzése Ahhoz, hogy kiderítsük, hogy a D9E mutáns TC5b-hez képesti megnövekedett stabilitása vajon annak köszönhető-e, hogy a sóhíd összhossza megnőtt – így közelebb kerültek egymáshoz a töltött csoportok –, megvizsgáltuk azt az esetet, amikor a sóhíd másik tagját, az Arg16-t hosszabbítottuk meg egy metilén-csoporttal (homo-arginin). Az össz sóhídhossz így megegyezik a két variánsban. A TC5b_R16hR mutáns spektrumát hasonlóan elemeztem, mint a D9E mutáns spektrumait. Első ránézésre lényegesen kevesebb NOE csúcs van az R16hR NOESY spektrumában, mint a D9E esetében volt. A jeldiszperzitás hasonló mértékű, a legtöbb jel rezonancia frekvenciája nem változott sokat a mutáció hatására (F-I. Táblázat). Ezt tükrözi a nagymértékű hasonlóság a két mutáns másodlagos kémiai eltolódás mintázata között (9. és 10. ábra). A semleges pH-n készült spektrumokban ugyanazokat a jeleket tudtam azonosítani, mint a D9E esetében (itt sem jelent meg az Asn1HN és Leu2HN jele). A savas spektrumban itt is jelentkeztek minor csúcsok, de azok azonosítását nem tudtam elvégezni, mert nem adtak elegendő keresztcsúcsot egymás között. A minor jelek száma kevesebb volt. Feltételezhetően ezek a jelek is az α- és 310-hélix egy másik konformációs állapotából származnak, ám a kevés és azonosíthatatlan jel egy lényegesen flexibilisebb vagy szerkezet nélküli minor formára utal. A másodlagos kémiai eltolódások szempontjából az R16hR mutáció nem volt hatással a hélix kialakulására, ui. a CSDhelix érték nem változott szignifikánsan a D9E ugyanezen értékéhez képest sem a semleges sem a savas mintákban (10. ábra). A Trp-kalitka kialakulását tekintve viszont jelentősen lecsökken az ezt jellemző CSDcage érték: míg a D9E esetében ez 8,58 ppm volt, addig itt csupán 7,83 ppm. A feltekeredett frakcióban kifejezve (xF) ez 86%nak felel meg. Hasonló mértékben csökken a G11Hα protonjai közötti felhasadás is. Tehát *
A megkülönböztethetőség kedvéért a minor konformerhez tartozó aminosavak jeleit kis kezdőbetűvel szedem.
- 31 -
ebben a fehérjekonformációban kisebb a kölcsönhatás a Trp6 és a környező aminosavak között, ami egy flexibilisebb vagy kis mértékben rendezetlenebb szerkezetre utal. Másodlagos kémiai eltolódások a R16hR Hα α protonjaira 0,5
R16hR
semleges
CSDcage (ppm)
7,826
-
-1
CSDhelix (ppm)
1,554
1,294
-1,5
∆G11Hα (ppm)
1,713
1,110
(H ) ppm
0 -0,5
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 10 11 11 12 13 14 15 15 16 17 18 19 20
savas
-2
semleges
-2,5
savas
-3
aminosav sorszám
10. ábra A TC5b_R16hR mutáns Hα protonjaira számított másodlagos kémiai eltolódások a semleges és savas spektrumokban, valamint a Trp-kalitka kialakulását jellemző mérőszámok a savas és semleges spektrumok másodlagos kémiai eltolódásából számítva.
A TC5b_D9Aad_R16K semleges és savas spektrumának elemzése Ezek után elkészítettünk egy olyan TC5b_D9E variánst, amiben a már eleve hosszabbított Asp9 aminosavat még tovább hosszabbítottuk, és egy mesterséges aminosavat (adipinsav, Aad) tettünk a TC5b 9. pozíciójára. Ahhoz viszont, hogy a sóhíd összhosszát ne változtassuk meg, a 16. helyen levő aminosav oldalláncát meg kellett rövidíteni. Ezt egyfelő l lehet egy másik mesterséges aminosav, a metilén-rövidített nor-arginin beépítésével elő idézni, másrészt használhatunk az argininnél épp egy metilén-csoporttal rövidebb természetes aminosavat, egy lizint. Ez utóbbi esetben viszont számolni kell azzal a jelenséggel, hogy a pozitív töltés itt nem egy viszonylag kiterjedt guanidin-csoporton delokalizálódik, hanem csak egy lényegesen kisebb NH3+-csoporton. Mivel kereskedelmi forgalomban nem kapható norarginin, ezért a vizsgálódásainkat az R16K variánsra korlátoztuk. A D9Aad (vagyis a TC5b_D9Aad_R16K) mutáns a spektrumok alapján nagyobb hasonlóságot mutat mind a jelek helyét és intenzitását, mind az NOE jelek számát tekintve az R16hR-rel, mint a D9E mutánssal (11. ábra, F-I. Táblázat). A savas spektrumban itt is ugyanúgy, mint az R16hR-nél megjelennek az egy vagy több rendezetlen minor formához tartozó jelek, de ezek azonosítása ebben az esetben sem volt lehetséges.
- 32 -
Másodlagos kémiai eltolódások a D9Aad_R16K α protonjaira Hα 1
ppm
0,5 0
D9Aad_R16K
semleges
-0,5
CSDcage (ppm)
8,232
-
CSDhelix (ppm)
1,456
1,164
∆G11Hα (ppm)
1,807
1,114
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 10 11 11 12 13 14 15 15 16 17 18 19 20
-1 -1,5
savas
-2 -2,5
semleges
-3
aminosav sorszám
savas
11. ábra A TC5b_D9Aad_R16K mutáns Hα protonjaira számított másodlagos kémiai eltolódások a semleges és savas spektrumokban, valamint a Trp-kalitka kialakulását jellemző mérőszámok a savas és semleges spektrumok másodlagos kémiai eltolódásából számítva.
A CSD vizsgálatból az derül ki, hogy a CSDcage tekintetében ez a mutáns félúton van a D9E és az R16hR mutáns között, vagyis itt nagyobb a rendezett szerkezettel bíró populáció aránya (91%), mint az R16hR mutánsban (86%), de kisebb, mint a D9E mutánsban (95%). CSDhelix alapján viszont a D9E és R16hR-hez képest ebben a mutánsban kis mértékben nő a rendezetlen helikális szakasz aránya, xF(helix) = 89% szemben a D9E és R16hR mutáns 95%os hélix-tartalmával (11. ábra). Ekkora különbség azonban származhat a random coil értékek pontatlanságából is, így messzemenő következtetést csupán ennek az értéknek az ismeretében nem szabad levonni. Sokkal többet árul el a hélix-képződésről az NOE kényszerfeltételek alapján számított szerkezet, aminek bemutatására a következő fejezetben kerül sor.
A TC5b_D9S semleges és savas spektrumának elemzése A negatív design elvével élve elkészítettünk egy sóhíd-deficites D9S mutánst. A sóhíd egyik karjának az eliminálásával azt szerettük volna megvizsgálni, hogy mennyiben marad stabil a szerkezet a sóhíd hiányában, így közvetett információt kapunk annak szerepérő l. Savas körülmények között pedig azt lehet megtudni, hogy a pH-függő destabilizáció milyen mértékben köszönhető a sóhídnak, és mennyiben az egyéb járulékoknak. Itt, mivel nincs sóhíd, csak az egyéb járulékok destabilizáló hatása érvényesül. A NOESY és TOCSY spektrumok asszignációja az elő bbi spektrumok alapján könnyen elkészíthető volt, bár néhány protonjel jelentősen eltolódott, és a jeldiszperzitás is némileg lecsökkent (F-I. Táblázat). A spektrumban lényegesen kevesebb NOE jelent meg, mint a korábbi spektrumokban: míg az intrareziduális és szekvenciális NOE-k száma nem,
- 33 -
vagy csak kevéssé változott, addig a távoli NOE-k száma jelentősen lecsökkent (a különböző spektrumokban azonosított közeli és távoli NOE-k számáról felvilágosítást ad a következő fejezet 2. Táblázata). A sóhíd elimináció hatására a legtöbb jel a random coil értéke felé tolódott el, ami egyértelmű jele a destabilizációnak. CSD mintázatát tekintve azonban ez a mutáns is meglepően hasonló a többi sóhídoptimált mutánshoz. Itt is a legnagyobb CSD-t a Gly11Hα2 és a Pro18Hα protonja mutatta (12. ábra). A százalékos felgombolyodott frakciót kiszámítva a CSDcage és CSDhelix értékekbő l azt kapjuk, hogy ebben a mutánsban is még 83-85%-ban van jelen a rendezett szerkezetű populáció, ami viszonylag magas aránynak számít. Ezek szerint a sóhíd mindössze 10%-ban járul hozzá a szerkezet stabilizálásához. Savanyítás hatására a spektrum tovább egyszerűsödik, itt összesen 141 csúcsot lehetett asszignálni, és ebbő l csupán három darab távoli NOE volt, kettő a Tyr3 és Pro19 között, egy a Trp6 és Pro12 között. Ez a három NOE nem sok, mégis elég ahhoz, hogy megbizonyosodjunk afelő l, hogy a Trp-kalitka natívszerű topológiája továbbra is részlegesen fennmarad, de a fehérje olvadt-gombóc jelleget ölt. A részleges szerkezetre utal a savas spektrum CSD mintázata is, ami szerint az N-terminális szakasz továbbra is α-helikális jellegű (negatív CSD), és a Gly11 protonjeleit is a Trp6 gyűrűáram hatása befolyásolja, kémiai eltolódásuk 0,7 ppm felhasadást mutat (12. ábra). Az olvadt-gombóc állapotban egy fehérjének nincs merev harmadlagos szerkezete, az aminosav-oldalláncok nem illeszkednek szorosan egymáshoz, ezért nem alakul ki közöttük NOE jel. Egyes elméletek szerint az olvadt-gombóc állapotú fehérje térszerkezete nagymértékben megegyezik, a hődenaturációkor tapasztalt intermedier szerkezetével. A jelen esetben ez azt jelenti, hogy a TC5b_D9S mutáns a felgombolyodása során a hidrofób kollapszust követően natívszerű struktúrával rendelkezik. Ez az eredmény kísérletesen alátámasztja Snow és mts. molekuladinamikai szimulációit26. A savas NMR spektrumban azonosíthatatlan jelből csak néhányat találtam, amelyek nem mutattak sem egymással, sem a többi csúccsal korrelációt. Így feltételezhetően a D9S mutánsban nem formálódik minor konformer a savas denaturáció során.
- 34 -
Másodlagos eltolódáasok a D9S Hα α protonjaira 0,5 0
ppm
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 10 11 11 12 13 14 15 15 16 17 18 19 20
D9S
semleges
-1
CSDcage (ppm)
7,491
-
-1,5
CSDhelix (ppm)
1,405
1,083
∆G11Hα (ppm)
1,244
0,703
-0,5
-2
savas
semleges
-2,5
savas
-3
aminosav sorszám
12. ábra A TC5b_D9S mutáns Hα protonjaira számított másodlagos kémiai eltolódások a semleges és savas spektrumokban, valamint a Trp-kalitka kialakulását jellemző mérőszámok a savas és semleges spektrumok másodlagos kémiai eltolódásából számítva.
Összességében a spektrumok elemzése alapján elmondható, hogy mindegyik vizsgált fehérje ugyanazt a foldot (Trp-kalitka) veszi fel a felgombolyodása során, mivel a CSD mintázatuk szembetűnően hasonló (13. ábra, F-I ábra). A kismértékű különbség a feltekeredett populáció arányainak különbségébő l illetve a CSD számítás bizonytalanságából származik. A savanyításra is hasonlóan reagáltak a fehérjék, a jelek szinte teljesen megegyező mértékben tolódtak el a random coil értékük felé (14. ábra, F-II ábra). Savas körülmények között részlegesen letekeredett konformerhez tartozó jeleket egyedül a D9E mutánsban lehetett asszignálni, a D9Aad és R16hR mutánsban is jelentkeztek efféle jelek, de azok azonosítására nem volt mód, a sóhíd eliminált D9S mutáns savas spektrumában pedig nem utaltak a jelek minor konformer létére. Tehát, ha nincs a szerkezetben eleve sóhíd, akkor nincs minor konformer. Vagyis a sóhíd többlépésessé teszi a gombolyodás folyamatát. Másodlagos kémiai eltolódások a vizsgált mutánsok Hα α protonjaira semleges pH-n 1 0,5
ppm
0 -0,5
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 10 11 11 12 13 14 15 15 16 17 18 19 20
-1 -1,5
D9Aad
-2
D9E
-2,5
R16hR
-3
aminosav sorszám
D9S
13. ábra Összesített diagram a semleges pH-n készült spektrumok Hα CSD értékeiből
- 35 -
Másodlagos kémiai eltolódások a vizsgált mutánsok Hα α protonjaira savas pH-n 1
ppm
0,5 0 -0,5
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 10 11 11 12 13 14 15 15 16 17 18 19 20
-1
D9Aad
-1,5
D9E
-2
R16hR
-2,5
aminosav sorszám
D9S
14. ábra Összesített diagram a savas pH-n készült spektrumok Hα CSD értékeiből
- 36 -
A szerkezetszámításból származó eredmények A spektrumok asszignációját és kémiai eltolódás szerinti elemzését követően az NOE jelekbő l távolságjellegű kényszerfeltételeket készítettem, és ezek alapján geometriaoptimálást hajtottam végre a különböző mutánsokra. Egyedül a D9S fehérje savas spektrumából nem tudtam elegendő kényszerfeltételt gyűjteni a szerkezetszámításhoz, így annak elemzésével ebben a fejezetben nem foglalkozom. A különböző NOESY spektrumokból gyűjtött intra- és interreziduális NOE-k számáról, és az ezek alapján számított szerkezetsokaságok szórásáról ad felvilágosítást az alábbi táblázat. TC5b variánsok
Körülmények
Intrareziduális, szekvenciális és távoli NOE-k
RMSD (Å) minden gerinc atom
pH
T (K)
Σ
i→ →i
TC5b_D9E
6,7
280
426
170
111
26
33
18
68
1,919
0,077
TC5b_D9E
3,2
280
209
125
52
3
12
3
14
2,220
0,728
TC5b_R16hR
6,7
280
274
139
58
9
17
15
36
2,121
0,269
TC5b_R16hR
2,9
280
248
131
64
9
16
7
21
2,455
0,770
TC5b_D9Aad_R16K
6,7
280
302
152
62
12
25
9
42
1,827
0,432
TC5b_D9Aad_R16K
2,9
280
211
116
50
7
15
4
19
2,488
1,224
TC5b_D9S
6,7
280
211
135
39
3
11
6
17
2,202
1,159
TC5b_D9S
2,8
280
141
113
24
0
1
0
3
n.a.
n.a.
i→ →i+1 i→ →i+2 i→ →i+3 i→ →i+4 i→ →i+n
2. Táblázat A vizsgált mutánsok NOESY spektrumaiból származó intra- és interreziduális NOE-k száma, és az ez alapján számított sokaságok szerkezeti szórása. A gerinc RMSD-t a 3-19. aminosavak Cα, C, N atomjaira számítottam
A TC5b_D9E szerkezetének elemzése A 2. Táblázatban vastaggal szedett számok különös figyelmet érdemelnek. Ezek a D9E mutáns semleges spektrumából gyűjtött össz NOE valamint a távoli NOE-k száma és az ezek alapján számított szerkezetek egymáshoz képesti szórása. A 426 összes és 68 távoli NOE rendkívül soknak számít egy ekkora fehérje esetében, és arra utal, hogy a szerkezet igen stabil és meglehetősen rigid az adott körülmények között. Ennek következtében a számított
- 37 -
sokaságnak is kicsi a szórása, a gerincet alkotó atomokra nézve csak 0,077Å. Savanyítás hatására láthatóan drasztikusan lecsökken mind az össz NOE, mind a távoli NOE-k száma, előbbi felére, utóbbi ötödére (!)*. A legfontosabb távoli NOE kapcsolatok azonban itt is megmaradnak (Trp6 – Pro12; Leu2 – Pro19; Tyr3 – Pro19), és ezért a savas spektrumból számított konformersokaság is alapjában Trp-kalitka szerkezetű (15. ábra), a különbség fő leg a sokaság szórásában van. Lazul a globális szerkezet is, a hidrofób mag nyitottabb, az oldószernek jobban kitett lesz. A sóhíd elemzése szempontjából érdekes az a tény, hogy az indolgyűrű és az arginin oldallánca között részben megmarad a hidrofób kölcsönhatás (2 NOE csúcs van a Trp6 és az Arg16 között a savas spektrumban), tehát savas közegben is az arginin pozíciója viszonylag fix, míg a glutaminsav mozgékonysága megnő a protonálódás következtében.
15. ábra A TC5b_D9E semleges (kék) és savas (olajzöld) spektruma alapján számított szerkezetsokaságok
A Trp-kalitka foldot az N-terminális α-hélix (2-9. aminosav), a 310-hélix kanyar régió (10-14. aminosav) és a PPII C-terminális szakasz (16-19. aminosav) jellemzi. A TC5b szerkezetével analóg módon a stabil konformert itt is számos H-híd stabilizálja: az α-hélix Hhídjai mellett a legtöbb számított szerkezetben H-híd alakul ki az indol-NHε1 → O=C-Arg16, a Ser13/Ser14-NH → O=C-Gly10 a Gly11-NH → O=C-Trp6 atomok között (16.A ábra). A központi Trp6 aminosav köré szerveződik a hidrofób mag, melyben a Pro12 és a Pro18 két oldalról közrezárja az indolgyűrűt, és erre pakolódik a Leu7 oldallánca és a Tyr3-Pro19 aminosavak alkotta hidrofób klaszter (16.B ábra). Az indolgyűrűt a túloldalról (Hδ1 Hε1 protonok felő l) az Arg16 oldallánca védi az oldószerkitettségtől, így az arginin, mint a sóhíd és a hidrofób mag alkotója kétszeresen is hozzájárul a szerkezet stabilitásához. Az NOE kényszerfeltételekből számított szerkezetekbő l a sóhíd pontos helyzetére azonban nem tudunk *
A minor formák adta NOE jeleket nem számoltam bele a 2. Táblázatban felsorolt NOE-khoz, mert azok egy másik konformer szerkezetéhez tartoznak.
- 38 -
következtetni, mert az NMR spektrumban nem jelenik a két sóhíd-alkotó aminosav oldallánca között keresztcsúcs. Amennyiben a számítás során beiktatunk egy plusz kényszerfeltételt a sóhíd összetartására, akkor a korábbi szerkezettel teljesen konzisztens eredményt kapunk, tehát a sóhíd potenciálisan létrejöhet a feltekeredés során, csak annak léte 1H-NMR-rel detektálhatatlan marad.
13
C jelölt minta NMR spektrumából a sóhíd pontos geometriájára
közvetlenül is következtethetnénk.
16. ábra A A TC5b_D9E mutáns gerinc modellje, zöld összekötővonalak a H-hidak helyét jelzik B A TC5b_D9E szalagmodellje, a hidrofób mag kulcs aminosavai vannak külön feltüntetve: Y3 (narancs), I4 (lila), P12, P18, P19 (zöld). C A TC5b (zöld) és a TC5b_D9E (kék) egymásra illesztett gerincmodellje.
A szerkezetelemzés során összehasonlítottam a D9E optimált szerkezetét a Neidigh és mts. által publikált TC5b szerkezettel (PDB: 1L2Y), és a fold kompaktságát illetően néhány lényeges különbséget találtam (16.C ábra). A D9E mutáns esetében a hidrofób mag zártabb, közelebb kerül az indolgyűrűhöz a Pro12, a Pro18, és a Tyr3 oldallánca is, és erősödik a kölcsönhatás a Leu2 és Pro19 között is. Az Arg16 oldallánca közelebb kerül a 310 hélixhez, és a guanidin-csoport Hε protonja Arg16Hε → Oγ-Ser14 H-híd létrehozásával stabilizálja a kanyar régiót. A Glu9 oldallánca feltételezhetően részt vesz mind az α-hélix, mind a hidrofób mag stabilizálásában. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a QxxxE szekvenciális elrendeződés hélix stabilizáló hatású, mivel H-híd tud kialakulni az i. glutamin transz aminprotonja és az i+4. glutaminsav karboxil oxigénje között43. Így számolhatunk az itt is a Q5 és E9 között efféle kölcsönhatással. A Glu9 ezért várhatóan váltakozva vesz részt a sóhíd illetve a hélix-stabilizáló H-híd formálásában. A sóhíd-képzés közben oldalláncával kismértékben hozzájárul a hidrofób mag kialakulásához is.
- 39 -
Ezek az effektusok mind alátámasztják azt a tényt, hogy a D9E mutációval a TC5b szerkezete stabilizálódott. A stabilizáció mértékére (∆∆rGF) viszont csak további kísérletekbő l (CSD olvadási görbék felvétele, 1H/2H NH-kicserélődés vizsgálat) lehetne következtetni.
A TC5b_R16hR szerkezetének elemzése A TC5b_R16hR mutáns szerkezetét 274 NOE felhasználásával számítottam, amelybő l 135 volt interreziduális NOE. Ezek alapján egy közepes szórású szerkezetsokaságot kaptam (RMSDallatom = 2,12 Å), ami a D9E mutáns szerkezetétől néhány ponton különbözik (17.A ábra). A két szerkezet egymáshoz képesti szórása minden atomra nézve 2,92 Å, a gerincet alkotó atomokra nézve 1,27 Å. Az R16hR mutáns szerkezetében a Trp6 oldallánca szemmel láthatóan kissé kihúzódott a Y3, P12, P18 alkotta hidrofób zsebbő l, és közelebb került a hR16 hosszú oldalláncához, vagyis nőtt a hidrofób kölcsönhatás e két aminosav között (7 NOE csúcsot tudtam asszignálni a Trp6 és hR16 között). Emellett a Tyr3 oldallánc pozíciója jelentősen megváltozott, kisebb hidrofób kontaktust mutatva a Trp6 és Tyr3 aminosavak között (a két oldallánc között mindössze 3 NOE alakult ki). Nőtt a távolság a P12/P18 és Trp6 között is, ami szintén a hidrofób mag átrendeződését támasztja alá. A homo-arginin oldallánca elég hosszú ahhoz, hogy kiterjedt kölcsönhatást mutasson a környező aminosavakkal – NOE alakul ki a hArg16 és Trp6, Ser13, Ser14, Gly15 aminosavak között – így aktívan részt vesz a hidrofób mag és a 310-hélix stabilizálásában. A megfigyelt jelenségek összhangban vannak a CSD számításokból kapott eredménnyel, ami szerint összességében nagyobb a rendezetlen szerkezettel jellemezhető konformerek aránya az R16hR mutánsban, mint a D9E mutánsban.
17. ábra A TC5b_D9E (kék) és a TC5b_R16hR (narancs) egymásra illesztett gerincmodellje, (a Y3, W6, P12, P18 aminosavakat külön kiemeltem), RMSD = 1,27 Å; valamint a TC5b_R16hR semleges (narancs) és savas (olajzöld) spektruma alapján számított szerkezetsokaságok.
- 40 -
Savanyítás hatására ebben az esetben is lazul a globális szerkezet és megnő a 9-11. és 13-16. aminosavak flexibilitása (17. ábra), nem formálódik 310-hélix, de megmaradnak a Trpkalitka fold szempontjából kulcs kontaktusok. Így 11 NOE csúcsot lehet asszignálni a Pro12 és Trp6 között, 2 NOE-t a Pro18 és Trp6 között, egyet-egyet a Leu2-Pro19 és Tyr3-Pro19 között. Hasonlóan, mint a D9E mutáns esetében, itt is találtam NOE csúcsokat a Trp6 Hδ1 és Hε1 valamint a hArg16 Hβ# és Hδ# protonjai között a savas spektrumban. A savas és semleges szerkezetsokaságok közötti gerincalkotó atomokra számított RMSD 2,12 Å, tehát ilyen mértékben változik meg a Trp-kalitka stabil konformere savanyú közegben. Ám ez a viszonylag nagy RMSD eltérés származhat abból a hibából is, hogy a savas spektrumokban jelentkező minor formák csúcsait helytelenül, mint a major forma csúcsát azonosítottam, és ebbő l következően a szerkezet eltorzult. További szerkezetfinomítási lépésekkel esetlegesen javítani lehet a szerkezet atomi felbontásán.
A TC5b_D9Aad_R16K szerkezetének elemzése A D9Aad mutáns geometriaoptimálása során elegendő kényszerfeltétel (302) állt rendelkezésre ahhoz, hogy egy jól-meghatározott, kis szórású szerkezetsokaságot kapjak (RMSDallatom = 1,83 Å, RMSDgerinc = 0,43 Å). A számított globális szerkezet nagyban hasonlít a D9E mutánsra, csupán néhány aminosav pozíciója változott meg kis mértékben. A hidrofób magban kevesebb tartós kontaktus áll fenn, így a D9E-hez képest valamivel kevesebb NOE jelentkezett a Trp6 és a környező aminosavak között, ennek következtében a számított hidrofób mag is kicsit lazább, flexibilisebb. Míg az aszparaginsav rövid oldallánca alig, a glutaminsav egy metilén-csoporttal hosszabb oldallánca részben, addig az adipinsav még egy metilén-csoporttal hosszabb oldallánca nagyobb mértékben hat kölcsön a hidrofób mag aminosavaival elősegítve ezzel a mag stabilizálódását. Trp6 és a 9. aminosav oldallánca között a D9Aad mutánsnál 3 NOE jelet, a D9E mutánsnál 1, az R16hR mutánsnál szintén 1 jelet tudtam azonosítani. Az Arg16 → Lys16 mutációval nem tapasztaltam stabilitás csökkenést a 310-hélix aminosavai között – jóllehet nem alakul ki a kedvező H-híd a Ser14 Oγ és az Arg16 Hε között –, a Lys16 alkalmasnak bizonyult a hidrofób kölcsönhatás stabilizálására és a sóhíd kialakítására. A CSD elemzésből származó eredmény szerint a D9Aad mutánsban csökkent az α-hélix arány a többi sóhíd-optimált mutánshoz képest. Ennek eldöntésére összehasonlítottam a szerkezetsokaságok Ramachandran térképeit (F-II – F VIII ábra). Ezek szerint az Aad9 mutánsban a Y3-K8 aminosavak ϕ,ψ torziósszögei az α-hélixre
- 41 -
jellemző tartományba esnek hasonlóan, mint a D9E és az R16hR mutáns esetében, azonban a torziósszögek szórása a D9Aad mutáns esetében nagyobb.
18. ábra A TC5b_D9E (kék) és a TC5b_D9Aad_R16hR (rózsaszín) egymásra illesztett gerincmodellje (a Y3, W6, P12, P18 aminosavakat külön kiemeltem), RMSD = 1,13 Å; valamint a TC5b_D9Aad_R16K semleges (rózsaszín) és savas (kék) spektruma alapján számított szerkezetsokaságok szalagmodellje.
Savas közegben, hasonlóan, mint a D9E és az R16hR mutáns, a 310-régió destabilizálódik a legnagyobb mértékben. A G10, G11, S13 és S14 aminosavak csak egy-egy nemszekvenciális NOE keresztcsúcsot mutatnak a NOESY spektrumban, míg a semleges spektrumban 14 NOE csúcsot tudtam asszignálni ezekhez az aminosavakhoz. A kisszámú NOE következtében nagy a számított sokaság szórása (RMSDallatom = 2,45 Å).
A TC5b_D9S szerkezetének elemzése A TC5b_D9S mutáns NOE kényszerfeltételeinek számát és az azokból számított szerkezetet tekintve hasonlatos a savas sóhíd variánsokhoz. A szerkezetoptimálást 76 interreziduális kényszerfeltétel felhasználásával végeztem el, melybő l csak 17 volt távoli NOE (2. Táblázat), ennek következtében a sokaság szórása nagy, 2,20 Å az összes atomra nézve, 1,59 Å a gerinc atomjaira nézve (19. ábra). A D9E mutánshoz képest a D9S átlagszerkezete jelentősen lazul, kevés a szerkezet stabilitását jellemző tartós harmadlagos kontaktus, de még így is helikális jellegű a peptid Nterminális régiója, és megfigyelhető a triptofán köré szerveződő hidrofób mag. Az Arg16 ebben az esetben sóhidat nem tud képezni, így csak a hidrofób mag formálásában vesz részt (3 NOE van a Trp6Hδ1 és az Arg16 oldallánca között). Sóhíd hiányában azonban a 310 hélixet sem tudja az arginin stabilizálni, ugyanis egy NOE csúcs sem jelentkezett az Arg16 oldallánc
- 42 -
és a 13-15. aminosavak között. A számított átlagszerkezet ϕ,ψ torziósszögei szerint a 4-9. aminosavak a Ramachandran térkép α-hélixre jellemző tartományába esnek, a 12-14. aminosavak ellenben rendezetlen szerkezetre utalnak, ui. a térkép nem-megengedett tartományába kerültek az elemzés során.
19. ábra A TC5b_D9E (kék) és a TC5b_D9S (arany) egymásra illesztett gerincmodellje (a Y3, W6, P12, P18 aminosavakat külön kiemeltem), RMSD = 2,01 Å; a TC5b_D9S semleges spektruma alapján számított szerkezetsokaság szalagmodellje, valamint a D9S semleges (arany) és D9E (kék), D9Aad (rózsaszín), R16hR (zöld) savas szerkezetek egymásra illesztett gerincmodellje.
- 43 -
Összefoglalás, kitekintés A munkám során megvizsgáltam, hogy milyen hatással van egy sóhídalkotó metiléncsoport helyzetének a változtatása a TC5b minifehérje sóhíd-optimált D9E mutánsának a globális stabilitására. A fehérjéket a 2D NMR spektrumukban mutatkozó különbségek alapján közvetlen (CSD) és közvetett módszerekkel (NOE alapú szerkezetszámítás) értékeltem. A másodlagos kémiai eltolódás (CSD) mintázatukat tekintve a három sóhíd variáns (TC5b_D9E, TC5b_R16hR és TC5b_D9Aad_R16K) nagyon hasonló, mégis van bennük annyi eltérés, hogy százalékosan meg lehessen becsülni melyik mutánsban mennyi a rendezett (folded) és rendezetlen (unfolded) szerkezettel rendelkező populáció aránya. Ennek a számításához a G11Hα1 és Hα2 protonjeleinek a különbségét használtam, valamint a Neidigh és mts. által bevezetett a CSDhelix és CSDcage mérőszámokat. Ezek szerint a három sóhíd variáns hélix tartalma közel azonos, globálisan viszont legnagyobb arányban a D9E mutáns veszi fel a natív térszerkezetét. A sóhíd eliminált D9S mutáns esetében bemutattam, hogy a sóhíd megszüntetése kb. 10%-os destabilizációt jelent (ennyivel nagyobb a rendezetlen szerkezettel rendelkező populáció aránya adott hőmérsékleten). Savas körülmények között is végeztem méréseket, hogy a sóhíd megszűnést egy másik szempontból is megvizsgáljam. Az NMR spektrumokban ekkor számos, egy vagy több minor formára utaló jel jelent meg. A legtöbb, és leginkább azonosítható minor jelek a D9E mutáns savas spektrumában jelentkeztek, az R16hR és a D9Aad mutáns esetében a számuk kevesebb volt, és azonosítani nem lehetett őket, a D9S savanyú spektrumában pedig nem volt minor formára utaló jel. Ezek szerint az Asp9, Glu9 vagy Aad9 protonálódásával egy új, részlegesen rendezett konformer jön létre, aminek az α-hélix régiója jelentősen eltér a major forma szerkezetétől. A minor forma struktúrájára csak a kémiai eltolódásokból lehet következtetni, NOE-alapú szerkezetbecslés nem volt lehetséges, mert a minor jelekhez nem tartozott elegendő NOE jel. A minor forma léte jelentheti azt, hogy a Trp-kalitka minifehérje gombolyodása tényleg nem egy kétállapotú folyamat, hanem annál bonyolultabb, minimum egy intermedieren keresztül vezet az út a stabil szerkezet eléréséhez. Minden mutáns esetében elvégeztem a semleges és savas NOESY spektrumok alapján a NOE-alapú szerkezetbecslést. A semleges pH-n a mutánsok mindegyike hasonló, stabil térszerkezetet vesz fel (Trp-kalitka fold). A mutánsok egymástól legfőképpen a 10-11, 13-15 aminosavak pozíciójában különböztek. Tekintettel arra, hogy a kanyar régió ezen aminosavaihoz milyen kevés NOE tartozott, az itt tapasztalható szerkezetbeli különbségek - 44 -
nem jelentősek. Kivételt képez a D9S mutáns, ahol az egész kanyar-régió alakja szignifikánsan különbözött a Trp-kalitkára jellemző 310-hélixtő l, és inkább a savas pH-n tapasztalt Trp-kalitka konformerhez hasonlított. Megállapítottam, hogy a D9Aad mutáns esetében az R16K mutációnak nem volt jelentősebb hatása a szerkezetstabilitásra, a sóhíd és a hidrofób mag képzésére a beépített lizin megfelelő alternatíva. Ezekkel a mérésekkel kvalitatív képet tudtunk kialakítani a TC5b_D9E szerkezetét stabilizáló erőkről. Ahhoz, hogy kvantitatívan is meg tudjuk határozni, hogy mekkora a stabilziáció mértéke a TC5b-hez vagy a többi sóhídvariánshoz képest, ahhoz még több mérést kellene elvégezni. Különböző hőmérsékleteken felvett NMR (vagy CD) spektrumok segítségével meg lehetne határozni a fehérjék olvadási hő mérsékletét, és ennek segítségével a gombolyodás szabadentalpia-változását (∆rGF). A feltekeredett frakció (xF) becslésének megbízhatóbb módszere az amid proton 1H/2H kicserélődésének NMR-rel való követése. Az így kapott számértékbő l (PF, protecting factor) a stabilizáció energetikájára szintén lehet következtetni. A hosszú távú terveink közt szerepel a TC5b sóhídvariánsok mintáinak az elkészítése, és NMR-rel való elemzése.
- 45 -
13
C jelölt
Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Tóth Gábornak, a Szegedi Tudományegyetem Általános Orvosi Kar Orvosi Vegytani Intézet vezetőjének és munkatársának a vizsgált minifehérjék szintéziséért. Köszönetet mondok Dr. Perczel Andrásnak a témavezetésért, az ösztönzésért, valamint hogy elvégezte a minifehérjék NMR-méréseit. Hálásan köszönöm Czajlik Andrásnak, Kiss Róbertnek és Várnai Csillának, hogy bevezettek az NMR spektrumok jelhozzárendelésének és a szerkezetszámításnak a rejtelmeibe. Köszönetet mondok a Kémiai Intézet Szerkezeti Kémia és Biológia Laboratóriuma összes tagjának a számtalan kisebbnagyobb segítségért, és hogy lelkesítettek és támogattak munkám során. A TDK munkám nem jöhetett volna létre, ha nincs mellettem állandó biztatással és fogós kérdéseivel párom, Nagy Kálmán, valamint testvérem Zita. Köszönöm nekik is a segítséget!
- 46 -
Rövidítésjegyzék Aad AMBER Boc But C, Cys CD CIDNP CNS COSY CSD D, Asp Da, kDa DSC DSS δ E, Glu EX-4 FCS FID Fmoc G G, Gly ∆ rG ∆rGF HPLC hR, hArg ∆ rH I, Ile K, Lys L, Leu MD N, Asn NMR NOE NOESY NP Obut OPLS P, Pro Pbf PDB PERLA PF PPII Q, Gln
adipinsav Assisted Model Building and Energy Refinement terc-butoxikarbonil terc-butil cisztein Cirkuláris Diokroizmus Spektroszkópia Chemically Induced Dynamic Nuclear Polarization Crystallography and NMR System Correlation Spectroscopy Chemical Shift Deviation, másodlagos kémiai eltolódás aszparaginsav Dalton, kilo-Dalton Differntial Scannning Calorimetry 2,2-dimetil-2-szilapentán-5-szulfonsav relatív kémiai eltolódás glutaminsav exendin-4 Flurescence Correlation Spectroscopy Free Induction Decay, interferrogramm 9-fluorenilmetoxikarbonil szabadentalpia glicin egy rendszer moláris szabad entalpia változása a feltekeredés moláris szabad entalpia változása High Pressure Liquid Chromatography, Nagynyomású folyadékkoratográfia homo-arginin egy rendszer moláris entalpia változása izoleucin lizin leucin molekuladinamika aszparagin Nuclear Magnetic Resonance, Mágneses magrezonancia Nukleáris Overhauser effektus Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Nemdeterminisztikus, polinomiális terc-butilészter Optimized Potential for Liquid Simutaion prolin 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofuran-5-szulfonil Protein Database, Fehérje adatbázis Protein Engineering Rotamer Library Algorithm Protecting Factor kettes típusú poliprolin lánc glutamin - 47 -
R, Arg REMD RMSD RP S, Ser ∆ rS T Tm τmix TC TOCSY Trt UV W, Trp xF xU Y, Tyr
arginin Replica exchange molecular dinamics Root Mean Square Deviation Reverse Phase, fordított fázisú szerin egy rendszer moláris entrópia változása abszolút hőmérséklet olvadási hő mérséklet keverési idő a NOESY pulzusszekvenciában Trytophan Cage, triptofán kalitka Total Correlation Spectroscopy tritil ultraibolya triptofán folded fraction, feltekeredett frakció unfolded fraction, leterkedett frakció tirozin
- 48 -
Függelék F-I. Táblázat Kémiai eltolódások a TC5b_D9Aad_R16K, a TC5b_D9E, a TC5b_R16hR és a TC5b_D9S semleges és savas körülmények között felvett spektrumában. Referencia a DSS jele. D9Aad pH Asn1 Leu2 Leu2 Leu2 Leu2 Leu2 Leu2 Leu2 Tyr3 Tyr3 Tyr3 Tyr3 Tyr3 Tyr3 Ile4 Ile4 Ile4 Ile4 Ile4 Ile4 Ile4 Gln5 Gln5 Gln5 Gln5 Gln5 Gln5 Gln5 Trp6 Trp6 Trp6 Trp6 Trp6 Trp6 Trp6 Trp6 Trp6 Trp6 Leu7 Leu7 Leu7 Leu7
HN HA HB1 HB2 HD1# HD2# HG HN HA HB1 HB2 HD# HE# HN HA HB HD1# HG11 HG12 HG21 HN HA HB1 HB2 HE21 HE22 HG# HN HA HB1 HB2 HD1 HE1 HE3 HH2 HN HZ2 HZ3 HA HB1 HB2 HD1#
6,7
2,9
6,7
4,187 1,774 1,774 0,967 0,909 1,482
4,048 1,652 1,652 0,824 0,779 1,313
4,200 3,135 3,135 7,057 6,842 8,588 3,789 1,951
4,287 1,705 1,705 0,938 0,897 1,512 8,908 4,291 3,079 3,079 7,070 6,833 8,563 3,862 1,886
1,687 1,366 0,933 8,100 4,059 2,143 2,143 6,944 7,703 2,416 7,995 4,310 3,524 3,225 7,149 9,725 7,172 7,219 8,106 7,251 7,125 3,500 1,858 1,579 0,924
1,600 1,330 0,856 8,178 4,076 2,087 2,087 6,995 7,594 2,393 8,046 4,411 3,469 3,211 7,153 9,865 7,310 7,229 8,142 7,322 7,133 3,694 1,737 1,524 0,904
4,035 2,991 2,991 6,896 6,685 8,457 3,637 1,805 0,690 1,539 1,233 0,787 7,960 3,891 2,022 1,947 6,792 7,869 2,259 7,787 4,107 3,393 3,018 6,896 9,569 7,002 6,976 7,890 7,106 7,087 3,362 1,721 1,436 0,786
D9E 3,2 major 4,274 1,706 1,706 0,954 0,908 1,507 8,914 4,274 3,076 3,076 7,065 6,834 8,550 3,856 1,895 1,603 1,333 0,873 8,162 4,075 2,082 2,082 7,001 7,589 2,372 8,000 4,378 3,483 3,198 7,124 9,833 7,288 7,218 8,110 7,317 7,128 3,667 1,754 1,537 0,828
- 49 -
R16hR 3,2 minor 9,148 1,772 1,772
6,7
2,9
6,7
2,8
4,206 1,781 1,781 0,967 0,916 1,478
4,155 1,776 1,552 0,966 0,914 1,474
4,189 3,134 3,134 7,042 6,833 8,599 3,783 1,937
4,287 1,730 1,730 0,950 0,908 1,514 8,937 4,257 3,091 3,091 7,055 6,834 8,566 3,848 1,912
4,282 1,678 1,678 0,943 0,900 1,494 8,906 4,301 3,064 3,064 7,067 6,828 8,578 3,869 1,856
1,682 1,370 0,929 8,094 3,950 2,139 2,139 6,999 7,870 2,423 7,971 4,380 3,524 3,203 7,136 9,692 7,170 7,217 8,133 7,265 7,131 3,506 1,856 1,583 0,925
1,623 1,366 0,899 8,175 4,028 2,104 2,104 7,055 7,573 2,407 7,993 4,389 3,5 3,21 7,155 9,787 7,264 7,225 8,13 7,318 7,139 3,627 1,761 1,539 0,886
1,692 1,366 0,933 8,158 4,058 2,475 2,424 6,954 7,573 2,142 8,097 4,308 3,578 3,227 7,116 9,72 7,192 7,236 8,233 7,286 7,137 3,489 1,817 1,555 0,917
9,030
6,990 8,429 3,771 2,025 0,940 1,724 1,496 0,999 8,063 4,007 2,229 2,229 7,018 7,531 2,490 7,692
3,370 1,861 1,861
D9S
4,200 3,138 3,138 7,050 6,839 8,576 3,792 1,957
1,587 1,300 0,832 8,217 4,094 2,41 2,352 7,015 7,629 2,379 8,137 4,431 3,467 3,215 7,163 9,895 7,349 8,261 7,354 7,232 3,760 1,688 1,688 0,900
Leu7 Leu7 Leu7 Lys8 Lys8 Lys8 Lys8 Lys8 Lys8 Lys8 Lys8 Lys8 Lys8 Ser9 Ser9 Ser9 Ser9 Asp9 Asp9 Asp9 Asp9 Glu9 Glu9 Glu9 Glu9 Glu9 Glu9 Aad9 Aad9 Aad9 Aad9 Aad9 Aad9 Gly10 Gly10 Gly10 Gly11 Gly11 Gly11 Pro12 Pro12 Pro12 Pro12 Pro12 Pro12 Ser13 Ser13 Ser13 Ser13 Ser14 Ser14 Ser14 Ser14 Gly15
HD2# HG HN HA HB1 HB2 HD1 HD2 HE# HG1 HG2 HN HZ HA HB1 HB2 HN HA HB1 HB2 HN HA HB1 HB2 HG1 HG2 HN HA HB1 HB2 HD# HG# HN HA1 HA2 HN HA1 HA2 HN HA HB1 HB2 HD1 HD2 HG# HA HB1 HB2 HN HA HB1 HB2 HN HA1
0,822 1,386 8,408 4,012 1,930 1,930 1,657 1,555 2,949 1,412 1,412 8,260
0,823 1,430 8,338 4,078 1,881 1,881 1,665 1,515 2,981 1,426 1,426 8,234 7,603
0,686 1,252 8,239 3,853 1,803 1,803 1,513 1,513 2,800 1,412 1,261 8,142
0,825 1,438 8,346 4,061 1,969 1,887 1,668 1,526 2,987 1,595 1,595 8,266 7,615
8,506
0,828 1,391 8,321 3,964 1,908 1,908 1,651 1,538 2,932 1,431 1,431 8,241
7,089
0,859 1,454 8,356 4,052 1,866 1,866 1,655 1,528 2,962 1,427 1,427 8,286 7,607
0,855 1,478 8,605 4,066 1,889 1,889 1,646 1,573 2,942 1,454 1,454 8,442 4,459 3,947 3,947 7,765
4,200 2,201 1,928 1,623 1,784 7,735 4,162 3,540 7,716 3,210 1,451 8,160 4,576 2,045 2,483 3,755 3,397 2,136 4,442 3,924 3,924 7,953 4,255 3,897 3,601 8,190 4,184
4,035 2,078 1,813 2,348 2,348 7,604
4,301 2,187 2,076 2,539 2,539 7,853
4,019 3,380 7,507 3,023 1,154 8,110 4,439 1,889 2,333 3,624 3,237 1,976 4,307 3,782 3,782 7,744 4,100 3,720 3,463 8,068 4,100
4,105 3,660 7,890 3,366 2,163 8,170 4,529 2,023 2,424 3,697 3,387 2,088 4,456 3,916 3,916 8,125 4,314 3,920 3,704 8,236 4,129
4,567 2,8 2,721 8,061
4,695 2,996 2,923 8,027
4,145 3,552 7,636 3,173 1,508 8,276 4,555 2,036 2,477 3,725 3,313 2,123 4,437 3,925 3,925 7,987 4,279 3,885 3,663 8,143 4,200
4,113 3,648 7,853 3,218 2,108 8,141 4,513 2,016 2,423 3,667 3,299 2,067 4,453 3,916 3,916 8,107 4,318 3,920 3,738 8,193 4,143
0,848 1,499 8,455 4,111 1,846 1,846 1,662 1,662 2,951 1,496 1,496 8,376 7,616 4,451 3,937 3,937 7,973
4,303 1,873 1,873 1,739 7,878 4,096 3,677 7,943 3,404 2,290 8,161 4,535 2,02 2,417 3,692 3,401 2,087 4,447 3,916 3,916 8,189 4,318 3,913 3,711 8,271 4,119
- 50 -
4,492 3,934 7,799 4,203 3,551 7,559
3,958 3,958 8,043 3,949 3,949 8,434
4,148 3,597 7,745 3,052 1,856 7,945 4,528 2,018 2,447 3,655 3,177 2,071 4,452 3,915 3,915 7,977 4,296 3,925 3,702 8,164 4,177
4,109 3,739 8,041 3,376 2,673 8,049 4,493 2,389 3,640 3,297 2,017 4,328 3,875 3,875 8,302 4,094 3,755 3,755 8,263 4,352
Gly15 Gly15 Arg16 Arg16 Arg16 Arg16 Arg16 Arg16 Arg16 Arg16 Arg16 Lys16 Lys16 Lys16 Lys16 Lys16 Lys16 Lys16 Lys16 Pro17 Pro17 Pro17 Pro17 Pro17 Pro17 Pro18 Pro18 Pro18 Pro18 Pro18 Pro18 Pro18 Pro19 Pro19 Pro19 Pro19 Pro19 Pro19 Ser20 Ser20 Ser20 Ser20
HA2 HN HA HB1 HB2 HD# HE HG1 HG2 HH# HN HA HB1 HB2 HD1 HD2 HE# HG# HN HA HB1 HB2 HD1 HD2 HG# HA HB1 HB2 HD1 HD2 HG1 HG2 HA HB1 HB2 HD1 HD2 HG# HA HB1 HB2 HN
3,870 8,066
4,811 1,960 1,960 1,776 1,776 3,036 1,470 8,071 4,701 1,802 2,275 3,863 3,670 2,005 2,917 1,448 0,833 3,529 3,529 1,766 1,766 4,336 2,248 1,951 3,22 3,069 1,864 4,172 3,787 3,787 7,988
3,907 8,193
4,730 1,906 1,906 1,737 1,737 3,015 1,452 8,140 4,661 1,820 2,278 3,836 3,637 2,011 1,849 3,613 3,523 2,010 2,010 4,403 2,267 1,919 3,403 3,231 1,818 4,226 3,982 3,982 8,098
3,705 7,893 4,771 1,708 1,708 3,116 1,599 1,513
3,898 8,181 4,776 1,907 1,907 3,23 7,322 1,761 1,676
3,859 8,053 4,783 1,933 1,770 1,443 3,21 1,675 1,675
7,955
8,114
8,073
4,582 1,639 2,164 3,715 3,510 1,843 2,651 1,267 0,512 3,386 3,386 1,647 1,570 4,201 2,078 1,809 3,026 2,884 1,686 4,032 3,638 3,638 7,801
4,673 1,814 2,283 3,842 3,613 1,999
4,703 1,793 2,274 3,872 3,662 2,012 2,925 1,436 0,920 3,538 3,538 1,435 1,435 4,336 2,241 1,944 3,201 3,038 1,849 4,171 3,782 3,782 7,978
3,521 1,825 1,825 4,388 2,262 1,978 3,35 3,207 1,896 4,243 3,834 3,834 7,999
- 51 -
3,899 8,145 4,733 1,897 1,748 1,433 3,219 1,648 1,582 7,22 8,08
4,664 1,802 2,266 3,852 3,637 2,005 1,540 1,142 3,576 3,52 1,804 1,804 4,392 2,26 1,945 3,336 3,186 1,886 4,328 3,911 3,812 8,289
3,876 8,101 4,785 1,918 1,783 3,252
3,919 8,256 4,708 1,872 1,872 3,219
1,677 1,677 7,33 8,103
1,738 1,652 7,288 8,148
4,664 1,796 2,265 3,855 3,637 1,992 2,908 1,495 0,641 3,511 3,511 1,792 1,792 4,336 2,241 1,947 3,244 3,104 1,867 4,183 3,784 3,784 7,957
4,653 1,828 2,279 3,833 3,612 2,000 1,639 3,540 3,540 1,847 1,847 4,397 2,274 1,938 3,442 3,286
F-I Ábra Másodlagos kémiai eltolódások a TC5b_D9E, a TC5b_R16hR, a TC5b_D9Aad és a TC5b_D9S amid protonjaira semleges és savas körülmények között. Másodlagos kémiai eltolódások a D9E HN protonjaira
Másodlagos kémiai eltolódások a R16hR HN protonjaira 0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2 0 -0,2
1
-0,4
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
13
14
15
16
20
(HN) ppm
ppm
1 0,8
0,2 0 -0,2 -0,4
-0,6 -0,8 -1
semleges
-0,6
savas
-0,8
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
13
14
15
16
20
16
20
semleges
-1
savas minor
aminosav sorszám
1
savas aminosav sorszám
Másodlagos kémiai eltolódások a D9Aad_R16K HN protonjaira
Másodlagos eltolódáasok a D9S HN protonjaira
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
ppm
ppm
0,8
0,8
0,2 0 -0,2
0 -0,2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
13
14
15
16
20
-0,4
1
2
4
5
6
7
8
9
10
11
13
14
15
-0,6
-0,6
semleges
-0,8
semleges
-0,8
aminosav sorszám
savas
-1
savas
aminosav sorszám
Másodlagos kémiai eltolódások a vizsgált mutánsok HN protonjaira semleges pH-n
Másodlagos kémiai eltolódások a vizsgált mutánsok HN protonjaira savas pH-n
1 0,8 0,6
1 0,8 0,6
0,4 0,2 0 -0,2 -0,4
0,4 0,2 0 -0,2 -0,4
ppm
ppm
3
-0,4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
-0,6 -0,8 -1
11
13
14
15
16
D9Aad D9E aminosav sorszám
R16hR
20
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
-0,6 -0,8 -1
13
14
15
D9E R16hR D9S
- 52 -
16
D9Aad
aminosav sorszám
D9S
11
20
F-II Ábra A TC5b_D9E mutáns szerkezetsokaságának Ramachandran térképe (pH = 6,7)
- 53 -
F-III Ábra A TC5b_D9E mutáns szerkezetsokaságának Ramachandran térképe (pH = 2,9)
- 54 -
F-IV Ábra A TC5b_R16hR mutáns szerkezetsokaságának Ramachandran térképe (pH = 6,7)
- 55 -
F-V Ábra A TC5b_R16hR mutáns szerkezetsokaságának Ramachandran térképe (pH = 2,9)
- 56 -
F-VI Ábra A TC5b_D9Aad_R16K mutáns szerkezetsokaságának Ramachandran térképe (pH= 6,7)
- 57 -
F-VII Ábra A TC5b_D9Aad_R16K mutáns szerkezetsokaságának Ramachandran térképe (pH = 2,9)
- 58 -
F-VIII Ábra A TC5b_D9S mutáns szerkezetsokaságának Ramachandran térképe (pH = 6,7)
- 59 -
Felhasznált irodalom 1
Neidigh J. W., Fesinmeyer R. M., Andersen N. H., Nat. Struct. Biol. 2002, 9, 425-430. Hudáky P., Stráner P., Farkas V., Váradi Gy., Tóth G., Perczel A., Biochemistry 2008, 47, 1007-1016. 3 Anfinsen, C. B., Science, 1973, 181, 223-230. 4 Imperiali B., Ottesen J. J., Biopolymers 1998, 47, 23-29. 5 Vriend G. J. Molec. Graph. 1990, 8, 52. 6 López de la Paz M., Lacroix E., Ramírez-Alvarado M., Serrano L. J. Mol. Biol. 2001, 312, 229-246. 7 Hecht M. H., Richardson J. S., Richardson D. C., Ogden R. C., 1990, 249, 884-891. 8 Richardson J. S., Richardson D. C., Tweedy, N. B., Gernert, K., M., Quinn, T. P., Hecht, M. H., Erickson, B. W., Yan, Y., McClain, R. D., Donlan, M. E., Surles, M. C., Biophys. J. 1992, 63, 1186-1209. 9 Dahiyat, B. I., Mayo, S. L. Science, 1997, 278, 82-87. 10 Huyghues-Despointes, B. M., Klinger, T. M., Baldwin, R. L. Biochemistry 1995, 34, 13267-13271. 11 Barua B., Lin J. C., Williams V. D., Kummler P., Neidigh J. W., Andersen N. H., Protein Eng. Des. Sel. 2008, 21 (3), 171-185. 12 Qui L., Pabit, S. A., Roitberg, A. E., Hagen S. J., J. Am. Chem. Soc, 2002, 124, 1295212953. 13 Creighton T. E, Protein Folding, W. H. Freeman and Company, New York. 3-6. (1992) 14 Karplus D., Weaver D. L., Nature, 1976, 260, 404-406. 15 Abkevich V. I., Gutin A. M., Shankovich E. I., Biochemistry, 1994, 33, 10026-10036. 16 Creighton T. E., J. Phys. Chem., 1985, 89, 2452-2457. 17 Shoemaker K. R., Kim P. S., York E. Y., Stewart J. M., Baldwin R. L., Nature, 1987, 326, 563-568. 18 Baldwin R. L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 8069-8072. 19 Streicher W. W., Makhatadze G. I., Biochemistry, 2007, 46, 2876-2880. 20 Ahmed Z., Beta I. A., Mikhonin, A. V., Asher S. A., J. Am Chem. Soc., 2005, 127, 1094310950. 21 Neuweiler H., Doose S., Sauer, M., Proc. Natl Acad. Sci. USA., 2005, 102, 16650-16655. 22 Mok K. H., Kuhn L. T., Goez M, Day I. J., Lin J. C., Andersen N. H., Hore P. J., Nature, 2007, 447, 106-109. 23 Simmerling C., Strockbine B., Roitberg A. E., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 11258-11259. 24 Wang, J. M., Cieplak, P., Kollman, P. A., J. Comp. Chem. 2000, 21, 1047-1049. 25 Still, W. C., Tempczyk, A., Hawley, R. C., Hendrickson, T., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 6127-6129. 26 Snow, C. D., Zagrovich, B., Pande, V. S., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14548-14549. 27 Jorgensen, W. L., Tirado-Rives, J., J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 1657-1666. 28 Zagrovich, B., Snow, C. D., Khaliq, S., Shirts, M. R., Pande, V. S. J. Mol. Biol. 2002, 323. 153-164. 29 Linhananta, A., Boer, J., MacKay, I., J. Chem. Phys., 2005, 122, 114901. 30 Chen, J. H., Im, W. P., Brooks, C. L., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 3728-3836. 31 Sugita, Y., Okamoto, Y., Chem. Phys. Lett., 1999, 314, 141-151. 32 Juraszek J., Bolhuis P. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103, 15859-15864. 33 Wüthrich: NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley (1986) 2
- 60 -
34
Ernst, R. R, Bodenhausen, G, Wokaun, A: Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions, International Series of Monographs on Chemistry, Oxford Science Press (1990) 35 Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G. W., Zhu, G., Pfeifer, J., Bax, A. J. Biomol. NMR, 1995, 6, 277-293. 36 Goddard, T. D., Kneller, D. G., SPARKY 3, University of California, Sanfrancisco, CA (1999) 37 Bundi, A., Wütricht, K., Biopolymers, 1979, 18, 285-297. 38 Fesinmeyer, R. M., Hudson, F. M., Andersen, N. H., J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 72387243. 39 Schwarzinger, S., Kroon, G. J. A., Foss, T. R., Wright, P. E., Dyson, H. J., J. Biomol. NMR, 2000, 18, 43-48. 40 Brunger, A. T., Adams, P. D., Clore, G. M., Delano, W. L., Gros, P., Grosse-Kunstleve, R. W., Jiang, J. S., Kuszewski, J., Nilges, N., Pannu, N. S., Read, R. J., Rice, L. M., Simonson, T., Warren, G. L., Acta Cryst. D 1998, 54, 905-921. 41 Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblat, D. M., Meng, E. C., Ferrin T. E. J. Comput. Chem. 2004, 25(13), 1605-1612. 42 Liu, Y., Liu, Z., Androphy, E., Chen, J., Balea, J. D. Biochemistry, 2004, 43, 7421-7433. 43 Scholz, J. M., Qian, H., Robbins, V. H., Baldwin, R. L. Biochemistry, 1993, 32, 9668-9676.
- 61 -
