A striatalis kapcsolatrendszerek vizsgálata a tanulással és motivációval összefüggésben

A striatalis kapcsolatrendszerek vizsgálata a tanulással és motivációval összefüggésben Doktori értekezés

Ádám Ágota

Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományok Doktori Iskola

Témavezetı:

Dr. Csillag András, egyetemi tanár, az MTA doktora

Hivatalos bírálók:

Dr. Halasy Katalin, egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Haller József, az MTA doktora

Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Nagy M. György, egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Tretter László, egyetemi docens, Ph.D. Dr. Katona István, Ph.D.

Budapest 2010

Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke……………………………..…………...………….……………..5 Bevezetés………………...………………………………………………………………6 Madármodellek használata a tanulás agyi folyamatainak kutatásában és a passzív ízelkerüléses tanulás…………………………...……….…………….….6 A passzív ízelkerüléses tanulás legfontosabb agyi központjai és a memória kialakulásának folyamata………………………………………………..9 A striatum összehasonlító morfológiája………………………………….….....13 Aminosav neurotranszmitterek lehetséges szerepe a csirke passzív elhárító tanulásában…………………………………………...………………...16 Az L-aszpartát, mint a központi idegrendszer lehetséges neurotranszmittere….17 Az Asp felszabadulás lehetséges mechanizmusa………………………..18 Az Asp funkcionális jelentısége………………………………………...19 Lehetséges Asp-erg pályarendszerek…………………………………...20 Az agyi jutalmazási rendszer és az addikció…………………………………...22 A mesolimbikus pálya és a dopamin szerepe…………………………...22 Az addikció……………………………………………………………...24 Az endogén kannabinoid rendszer……………………………………………...25 Endokannabinoidok és receptoraik a központi idegrendszerben….……25 Endokannabinoid rendszer madarakban……………………………….28 Kannabinoid receptor agonisták és antagonisták………………………29 Az endogén kannabinoid rendszer és a dopamin rendszer kapcsolata...31 Az endogén kannabinoid rendszer szerepe a viselkedés pozitív megerısítésében……………………...…………………………...32 Az

endogén

kannabinoid

rendszer

szerepe

az

alkoholfüggıség

kialakulásában…………..……………………………………….33 Az endogén kannabinoid rendszer és a tanulás………………….……….33 Célkitőzések………………………………...…………………………………………35 Anyagok és módszerek………………………………………………….…………….36 1. L-aszpartát és L-glutamát immunreaktív idegelemek eloszlása a házicsirke medialis striatumában és arcopalliumában……………………………………..36

2

1.1. Glu és Asp kettıs fénymikroszkópos immunhisztokémia…….…......36 1.2. Posztembedding elektronmikroszkópos immuncitokémia………….37 2. Az endogén kannabinoid rendszer szerepe a tanulásban és motivációban…..39 2.1. A CB1-típusú kannabinoid receptorok hatása az alkohol által kiváltott dopaminerg jutalmazási válaszra az egér nucleus accumbens-ben…………………………………...………………39 2.2. CB1 kannabinoid receptor antagonista hatása a csirke passzív elhárító tanulására………………..……………………………...42 Eredmények………………………………………………………………….………..44 1. L-aszpartát és L-glutamát immunreaktív idegelemek eloszlása a házicsirke medialis striatumában és arcopalliumában……………………………………..44 1.1. Glu és Asp kettıs fénymikroszkópos immunhisztokémia…….….....44 1.2. Posztembedding elektronmikroszkópos immuncitokémia………….47 2. Az endogén kannabinoid rendszer szerepe a tanulásban és motivációban…..54 2.1. A CB1-típusú kannabinoid receptorok hatása az alkohol által kiváltott dopaminerg jutalmazási válaszra az egér nucleus accumbens-ben……………………………..………………….…54 2.2. CB1 kannabinoid receptor antagonista hatása a csirke passzív elhárító tanulására…………………………..…………………...55 Megbeszélés………………………………………………………………………...….59 1. L-aszpartát és L-glutamát immunreaktív idegelemek eloszlása a házicsirke medialis striatumában és arcopalliumában……………………………………..59 Módszertani megfontolások……………………………………………59 Glutamát és aszpartát korábbi vizsgálatokban………………………...59 Funkcionális jelentıség………………..……………………………….61 2. Az endogén kannabinoid rendszer szerepe a tanulásban és motivációban…..62 2.1. A CB1-típusú kannabinoid receptorok hatása az alkohol által kiváltott dopaminerg jutalmazási válaszra az egér nucleus accumbens-ben…………..……………………………………….62 2.2. CB1 kannabinoid receptor antagonista hatása a csirke passzív elhárító tanulására…………………..……..…………………….63 Következtetések……………………………………………………………………….65

3

Összefoglalás…………………………………………………………………………..65 Abstract………………………………………………………………………………..67 Irodalomjegyzék………………………………………………………………………68 Saját publikációk jegyzéke…………………………………………………………...93 Köszönetnyilvánítás…………………………………………………………………...95

4

Rövidítések jegyzéke

Ac – nucleus accumbens ACSF – mesterséges cerebrospinális folyadék Asp – L-aszpartát BSA – bovine szérum albumin DA - dopamin DARPP-32 – dopamin és cAMP által regulált foszfoprotein DMSO – dimetil-szulfoxid DYN – dynorphin ENK - enkephalin FAAH - zsírsav-amid hidroláz (fatty acid amide hydrolase) GABA – γ–amino-vajsav Glu – L-glutamát LSt – lateralis striatum MeA – metilantranilát MGL - monoacil-glicerol-lipáz MSt – medialis striatum NGS – normál kecskeszérum NMDA – N-metil-D-aszpartát NPY – neuropeptid-Y PAL – passzív elhárító (ízelkerüléses) tanulás PB – foszfát puffer PBS – foszfát puffer és sóoldat PoA – posterior amygdaloid pallium SN – substantia nigra SNc – substantia nigra, pars compacta SP – substance P THC - ∆9-tetrahidrokannabinol VTA – ventral tegmental area

5

Bevezetés Madármodellek használata a tanulás agyi folyamatának kutatásában és a passzív ízelkerüléses tanulás

A naposcsirkék kísérleti állatként való használata a neurobiológiai kutatásokban számos elınyt hordoz magában: a frissen kikelt csirke – fészekhagyó madár lévén - már a tojásból való kibújás után mutatja a felnıtt madárra jellemzı viselkedésformák jelentıs részét, de az állat korábbi élete során szerzett tapasztalatai nem befolyásolják a viselkedését. A frissen kikelt állat agya már fejlett, de még képlékeny. A naposcsibe kísérleti állatként való alkalmazása a tanulás neurális hátterének vizsgálatában az 1960as években kezdıdött, amikor Bateson és kollegái a szülıi bevésıdést (filial imprinting) kezdték vizsgálni ezeken az állatokon. A bevésıdés egy gyors tanulási forma, amely során az emléknyom hosszú távra rögzül és csak egy rövid érzékeny idıszak, ún. „kritikus periódus” alatt lehetséges. Az imprinting folyamatával, mint a fészekhagyó madarak korai tanulásával és annak agyi hátterével számos kutatócsoport kezdett foglalkozni (áttekintı irodalom: Horn, 1985). Egy másik általánosan használt modell a tanulás folyamatának vizsgálatára a naposcsibék passzív elhárító (vagy ízelkerüléses) tanulása (Passive Avoidance Learning = PAL), amely egy korai adaptív tanulási forma. A csibék 1-2 napos korukban kezdik elsajátítani az ehetı és a nem ehetı, ill. kellemetlen íző objektumok megkülönböztetésének képességét. A kiscsirke ebben az életkorban spontán rácsíp minden – méretben bizonyos határok közt mozgó – tárgyra (természetes körülmények között leginkább rovarokra, magvakra), és tapasztalata alapján a jövıben vagy elkerüli, vagy ismét rácsíp az ugyanolyan vagy hasonló tulajdonságokkal bíró objektumra. Ennek alapján naposcsirkékre A. Cherkin dolgozta ki a PAL paradigmáját (Cherkin 1969), melyet S. P. Rose finomított tovább (Rose, 1991b). A laboratóriumi teszt során az 1-2 napos csirkék elé egy olyan gyöngyöt teszünk, amely egy kellemetlen íző anyagba, metilantranilátba (MeA) van mártva. A csirke rácsíp a gyöngyre, majd jellegzetes undorreakciót mutat: hátrál, rázza a fejét, törölgeti a csırét, és már egy próba után megtanulja, hogy többé ne csípjen rá a hasonló kinézető gyöngyre. A teszt elınye, hogy az állat természetes viselkedésére épül, továbbá egyszerően és gyorsan kivitelezhetı, és jól reprodukálható. A tanulás idıtartama jól behatárolható; a különféle

6

agyterületeken a tanulás hatására végbemenı változások a teszt után rögtön nyomon követhetık,

így

a

memória

kialakulásának

folyamatáról

viszonylag

pontos

információkat lehet győjteni (áttekintı irodalom: Rose, 2000). A madarak rendelkeznek az emlısök mellett a legfejlettebb agyi struktúrával. Agyuk fejlıdése az emlısökétıl eltérı vonalon zajlott, így létrejött egy szervezıdésben sok mindenben különbözı rendszer, amelyben azonban az egyes funkciókhoz kapcsolható struktúrák megfeleltethetık az emlısökben leírtaknak. A legfıbb különbség az emlıs- és a madáragy között a kortikális szervezıdés hiánya a madarakban. A madarak elıagyában – a rétegesen szervezıdött kéreg helyett - viszonylag jól körülhatárolható magokat találunk (1. és 2. ábra). A madáragy az evolúció során úgy fejlıdött, hogy magas szintő vizuális képességeket tegyen lehetıvé az állat számára, amely mind a tájékozódásban, mind a táplálékkeresésben, mind a faj- és egyedfelismerésben és a ragadozók elleni menekülésben megfelelıen segíti az egyedet. Egyes madárfajok emellett rendkívül fejlett asszociációs képességgel rendelkeznek (pl. a papagájok), amely arra utal, hogy a madáragy az eltérı telencephalikus szervezıdés ellenére képes olyan magas szintő funkciókat ellátni, mint az emlısök rétegzett kéreggel rendelkezı agya. Ventriculus lateralis

b

a

1. ábra. A madár telencephalon fıbb régióinak sematikus rajza – mediánsagittalis metszet. CA = commissura anterior, DLM = nucl. dorsolateralis medialis thalami, Ov = nucl. ovoidalis,

7

TSM= tractus septomesencephalicus. A 3. ábrán az ’a’ és ’b’ metszési síkokban látható a passzív elhárító tanulásban szerepet játszó agyterületek elhelyezkedése.

2. ábra. A házicsirke telencephalon felépítése, coronalis metszetek sematikus rajzán bemutatva. A jobb alsó sarkokban lévı számok az adott metszet rostrocaudalis irányú sztereotaxikus koordinátáira utalnak (Kuenzel és Masson csirkeagy atlaszából, 1988). Ac = nucleus accumbens, AD = arcopallium dorsale, AI = arcopallium intermedium, AM = arcopallium mediale, APH = area parahippocampalis, CDL = area corticoidea dorsolateralis, CPi = cortex piriformis, DA = tractus dorso-arcopallialis, Hp = hippocampus, L = Field L, LFM = lamina frontalis suprema, LFS = lamina frontalis superior, LSt = lateralis striatum, MSt = medialis striatum, PoA = posterior nucleus of pallial amygdala, QF = tractus quintofrontalis, TnA = taenial amygdala, TuO = tuberculum olfactorium.

8

A passzív ízelkerüléses tanulás legfontosabb agyi központjai és a memória kialakulásának folyamata

A PAL-ban szerepet játszó agyterületek és a memória kialakulásának idıbeli folyamatai – köszönhetıen annak, hogy a tanulás ideje könnyen behatárolható - mára jól körülírttá váltak. A PAL-ban szerepet játszó agyterületeket elıször molekuláris neurobiológiai technikákkal és léziós kísérletekkel vizsgálták. Megnézték, hogy mely agyterületeken figyelhetık meg változások (megnövekedett anyagcsere, génaktiváció) a PAL-t követıen, valamint vizsgálták, hogy egyes agyterületek eltávolítása ill. roncsolása milyen hatással van az állatok tanulási képességére. Három olyan agyi régiót találtak, amelyek kulcsfontosságúak a PAL-ban: az intermedialis medialis mesopallium (IMM; korábbi nevén: intermedalis medialis hyperstriatum ventrale / IMHV), az amygdaloid arcopallium és a MSt (3. ábra).

9

3. ábra. A passzív ízelkerüléses

a)

tanulással

kapcsolatos

fıbb

agyterületek elhelyezkedése és az intermedialis mesopallium

MV

medialis

medialis –

arcopallium

striatum

kapcsolatrendszere LM

telecephalonban,

LPS

neurális a

az

-

csirke 1.

ábrán

bemutatott síkokban (a, b). A: LSt

arcopallium; MSt

CP:

commissura

posterior; E: entopallium; HA: hyperpallium

apicale;

HD:

hyperpallium densocellulare; HIS: hyperpallium

b)

intercalatum;

Hp:

hippocampus; MV: mesopallium MV IMM

LM

ventrale;

IMM:

intermedialis

medialis

mesopallium;

LFS:

lamina frontalis superior; LFSM: lamina frontalis suprema; LM:

LPS

lamina mesopallialis; LPS: lamina

LSt

pallio-subpallialis; MSt: medialis GP

striatum; N: nidopallium; NC: nidopallium caudale; LSt: lateralis striatum; GP: globus pallidus; VL: ventriculus lateralis.

A tanítás után számos, idıben jól behatárolható biokémiai változás figyelhetı meg a csirke agyában (4. ábra). A rövid távú memóriához tranziens szinaptikus események és membránhoz kapcsolt folyamatok bekövetkezésére van szükség, míg a hosszú távú memória létrejöttekor a neurális hálózat hatékonysága is megváltozik, ami magában foglalja a már meglévı szinapszisok megerısítését, valamint új szinaptikus

10

kapcsolatok kialakítását is (Ng és Gibbs 1991). A PAL laboratóriumi teszt után két agyterületen találtak jelentıs molekuláris szintő változásokat: az IMM-ban és a MStban (Rose és Csillag 1985). A tanítás utáni percekben ezek a változások a bal oldali IMM-ban lokalizálódnak, majd az események áthelyezıdnek elıbb a jobb oldali IMMba, majd mindkét oldali MSt-ba (Patterson és Rose 1992). Az elsı változás már a tanítás után 5 perccel kimutatható: a bal oldali IMM-ban Glu-felszabadulás figyelhetı meg (Daisley és Rose 1998), amelyet az NMDA-receptor-kötés erısödése kísér (Steele és mtsai 1995). Ezzel egy idıben a GABA felszabadulás gátolt; ezen fázis alatt adott GABA agonisták (pl. muscimol) gátolják az emléknyom kialakulását (Clements és Bourne 1996). A tanítás utáni elsı órában kimutatható a B50 preszinaptikus membránfehérje foszforilációja, amely a protein-kináz C citoplazmából a membránhoz való transzlokációjának a következménye (Burchuladze és mtsai 1990). Ebben a korai fázisban, egy rövid és jól behatárolható idıintervallumon belül adott NOS (nitrogénoxid-szintáz) -inhibitor gátolja a memória kialakulását, ami arra utal, hogy a NO tölti be a szinapszison belüli retrográd jelátvivı anyag szerepét (Holscher és Rose 1993). Negyven perccel a tanítás után a hosszútávú memória kialakulásához szükséges génaktivációs folyamatok elkezdıdnek. Az ún. „korai gének” (IEG = immediate early genes) közül a c-fos és a c-jun gének fokozott expressziója figyelhetı meg, a kondicionálás után 40 perccel (Anokhin és Rose 1991). A fehérjeszintézist gátló anisomycin két fázisban tudja gátolni az emléknyom kialakulását: a tanítás utáni elsı órában és a 4-5. óra között, késleltetve alkalmazva, amely arra utal, hogy a memória kialakulásához szükséges fehérjeszintézis két hullámban zajlik. Az elsı hullám a tanítás utáni elsı óráig befejezıdik; a második hullám a „késıi gének” aktivációjával függ össze, amelyek a szinapszis tartós megerısítését szolgáló pre- és posztszinaptikus membrán glükoproteinek, a sejtadhéziós molekulák, mint pl. az NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule) exprimálódásáért felelısek (Freeman és Rose 1995). A PAL hatására a szinapszisokban is változások lépnek fel. A tanítás után 1 órával a szinaptikus denzitások méretbeli növekedése figyelhetı meg az IMM-ban.

11

4. ábra. A passzív ízelkerüléses tanulást követı molekuláris változások a csirke intermedialis medialis mesopalliumának pre- és posztszinaptikus neuronjaiban. IEG = „korai gének” immediate early genes, NCAM = neuronális sejtadhéziós molekula - neuronal cell adhesion molecule, NMDA-R = N-metil-D-aszpartát típusú receptor, NOS = nitrogén-oxid szintáz, PKC = protein-kináz C. (Készült: Rose és Stewart (1999) nyomán).

12

A legjelentısebb szinapszis-morfológiai átalakulások a kétoldali MSt-ban észlelhetık, 24 órával a tanítás után: a szinaptikus denzitások mellett az axonterminálisok méretében is nagymértékő növekedés tapasztalható, és ez a változás a tanítás után 48 órával is még megfigyelhetı (Stewart és mtsai 1987, Stewart és Rusakov 1995). Ezek a megfigyelések, valamint az a korai észlelet, miszerint a 2-deoxiglukózbeépülés, mint funkcionális marker éppen a medialis striatumban emelkedett a PAL-t követıen (Rose és Csillag 1985), egyre inkább a striatum kitüntetett szerepére irányították a figyelmet. Ez nem is meglepı az adott tanulási típusban, amely nem kognitív, hanem operáns jellegő (tkp. egy adaptív viselkedés, a csipegetés, automatikus végrehajtásának kondicionált gátlásáról van szó). Másrészt az utóbbi évtizedben egyre több új adat tanúsítja, hogy a striatum még a kognitív tanulási folyamatban is aktív szerepet játszhat (áttekintı irodalom: Packard és Knowlton 2002).

A striatum összehasonlító morfológiája

A törzsdúcok (basalis ganglionok) szerkezete a Magzatburkosokban (emlısök, madarak

és

hüllık)

nagyon

hasonló

a

neurális

kapcsolatrendszerük

és

a

neurotranszmitterek elhelyezkedése tekintetében, ami arra utal, hogy a törzsdúcok evolúciósan konzervatív agyterületek (áttekintı irodalom: Reiner 1998). A basalis ganglionok emlısökben, madarakban és hüllıkben egyaránt feloszthatók egy dorsalis szomatomotoros és egy ventralis limbikus részre. A dorsalis és a ventralis rész mindhárom állatcsoportban egy striatalis és egy pallidalis területre osztható; ez alapján a dorsalis basalis ganglionok közé tartozik a dorsalis striatum és a globus pallidus, míg a ventralis basalis ganglionok magukban foglalják a ventralis striatumot és a ventralis pallidumot, valamint a nucl. accumbens-t (Ac) és a tuberculum olfactoriumot. A törzsdúcok minden Magzatburkosban a telencephalon centralis és/vagy ventralis részén helyezkednek el, a pallialis területek alatt (subpallium). Sauropsidákban a striatum elhelyezkedése kissé különbözik az emlısökétıl. Emlısöknél a dorsalis striatum – a ’striatum’ - egy viszonylag nagy, kerekded terület az elıagy központjában, amelyet a capsula interna nucl. caudatus-ra és putamenre különít el. Madarakban és hüllıkben inkább ventralisan elterülı rész, melyet egy sejtmentes, fibrózus lemez (madarakban ez a lamina pallio-subpallialis) választ el a pallialis régióktól. A striatumnak mindhárom

13

állatcsoportban van egy medialis és egy lateralis része; madarakban: MSt (medialis striatum) ill. LSt (lateralis striatum). Madarakban a medialis striatum (MSt) – korábbi nevén: lobus parolfactorius – feleltethetı meg az emlıs dorsalis striatumnak, mind a kapcsolatrendszere, mind a neurotranszmitterek elhelyezkedése alapján (Reiner és mtsai 1998), ám a két terület nem minden vonatkozásban egyforma. Az egyik fı különbség a kimenetben van: míg az emlısökben a substantia nigrába (SN) és a pallidumba projiciáló neuronok szétszórtan helyezkednek el a nucleus caudatus és a putamen területén egyaránt, madarakban a MSt szinte kizárólag csak a SN-ba, míg a LSt inkább a dorsalis pallidumba (globus pallidus) projiciál. A madár MSt további sajátossága, hogy szórványosan megtalálhatók a területén a pallidumra jellemzı sajátságokkal bíró, magnocelluláris, nem tüskézett GABAerg, gátló típusú, a thalamusba projiciáló idegsejtek (Luo és Perkel 1999, Farries és Perkel 2002). A madarak LSt-a számos striatalis tulajdonsággal bír: jelentıs dopaminerg bemenet a SNc-ból, sok dopamin receptor, acetilkolinban gazdag neuropil, GABAerg, SP/DYN ill. ENK tartalmú interneuronok, projekció a globus pallidusba (Puelles és mtsai 2000). Mindezek alapján a madár LSt megfeleltethetı az emlıs striatum lateralis részének, a putamennek, de a madár LSt – az emlıs putamennel szemben – kevéssé projiciál a SN-ba, inkább a pallidumba. A törzsdúcok motoros kimeneti területe, a globus pallidus madarakban és emlısökben egymással homológnak tekinthetı. GABAerg, LANT6 neuropeptidet tartalmazó neuronok jellemzıek rá; a striatalis GABAerg SP/DYN ill. ENK-t tartalmazó neuronokból kapnak bemenetet. A striatum sejtjeinek többsége minden Magzatburkosban közepes mérető, tüskés dendritekkel rendelkezı, GABAerg projekciós neuron (ún. ’medium spiny neuron’). Ezen neuronok kb. felében SP és DYN peptidek kolokalizációja figyelhetı meg, míg a sejtek másik része ENK-t tartalmaz. A striatalis neuronok 5-10%-a interneuron, melyek három csoportra különülnek el: (1) nagy mérető, kerekded, dendrittüske nélküli, kolinerg neuronok; (2) közepes mérető, dendrittüske nélküli, szomatosztatin és neuropeptid-Y (NPY) tartalmú neuronok és (3) közepes mérető, dendrittüske nélküli, GABAerg neuronok (áttekintı irodalom: Reiner 2002).

14

Madarakban a ventrobasalis elıagy kitüntetett területe az ún. ventralis vagy viscerolimbikus striatum. Számos újabb fejlıdésbiológiai (Abellán és Medina 2009), hisztokémiai és hodológiai (Roberts és mtsai 2002, Bálint és Csillag 2007) vizsgálat igazolta, hogy a korábban egységesnek tekintett MSt egyes részei az emlıs Ac shell és core területekkel homológok. Bálint és Csillag egy harmadik alegység, az ún. „rostral pole” lokalizációját is bizonyították a csirkében (Bálint és Csillag 2007). Az Acreleváns terület jutalmazásban betöltött szerepét madarakban is számos vizsgálat bizonyítja, pl. öningerléses kísérletek galambokon (Delius és mtsai 1976). A ventralis MSt léziója csirkékben impulzív viselkedési válaszhoz vezet (Izawa és mtsai 2003, Aoki és mtsai 2006). Hasonló viselkedést találtak emlısben is az Ac core körülírt léziója után (Cardinal és mtsai 2001). A DA közvetlen szerepére utal, hogy csirkéken PAL-t követıen szignifikánsan megnövekszik a DA D1-receptor kötıdés (Stewart és mtsai 1996). Számos madárfajon végzett hodológiai vizsgálat bizonyította, hogy a madár MSt – beleértve a nucleus accumbenst (Ac) is – glutamáterg bemenetet kap a palliumból (Veenman és Reiner 1996, Csillag és mtsai 1997, Reiner és mtsai 2001, Ding és mtsai 2003, Ding és Perkel 2004, Farries és mtsai 2005), dopaminerg bemenetet az area ventralis tegmentalis-ból (VTA, ventral tegmental area) (Kitt és Brauth 1981, Mezey és Csillag 2002). A madár MSt ezeken kívül kap még – neurokémiailag ezidáig nem karakterizált - bemenetet a hippocampus-ból (Veenman és mtsai 1995, Székely és Krebs 1996, Atoji és mtsai 2002, Atoji és Wild 2004), a piriform cortexbıl (Veenman és mtsai 1995), az arcopalliumból (Davies és mtsai 1997, Dubbeldam és mtsai 1997), a posterior pallialis amygdalából (Atoji és mtsai 2006), a septumból (Atoji és Wild, 2004), a bed nucleus of the stria terminalis lateralis részérıl (Atoji és mtsai 2006), a hypothalamus lateralis részérıl (Berk és Hawkin, 1985), a nucl. parabrachialis-ból (Wild és mtsai 1990) és a nucleus tractus solitarii-ból (Arends és mtsai 1988, Bálint és Csillag 2007). További pályakövetéses vizsgálatok igazolták, hogy a MSt kap bemenetet a locus coerulus-ból is (Kitt és Brauth 1986), amelynek jelátvivı anyaga valószínőleg a noradrenalin (Bailhache és Balthazart 1993, Moons és mtsai 1995).

15

Aminosav neurotranszmitterek lehetséges szerepe a csirke passzív elhárító tanulásában

A csirke PAL-ban részt vevı két legfontosabb agyterület, a MSt és az IMM között közvetlen neurális kapcsolat nem található; a két agyterület az emlıs amygdalával megfeleltethetı arcopalliumon keresztül áll összeköttetésben (Székely és mtsai 1994). Az arcopalliumból érkezı idegrostok excitatorikus típusú, aszimmetrikus szinapszisokat formálnak a MSt neuronjainak dendritjein (Csillag és mtsai 1999). Anterográd pályajelölı anyag (Phaseolus vulgaris leucoagglutinin) arcopalliumba való injektálása után a MSt-ban találhatók jelölt végzıdések, de ezekben glutamát (Glu) pozitivitás nem mutatható ki (Csillag és mtsai 1999). Ez a felfedezés vetette fel annak lehetıségét, hogy az arcopallium-MSt pálya egy Glu-on kívüli excitatorikus neurotranszmittert tartalmaz (5. ábra).

5. ábra. A passzív ízelkerüléses tanulásban résztvevı fıbb agyterületek neurális kapcsolatrendszere és ismert jelátvivı-anyagai házicsirkében. Az arcopallium medialis striatumba (MSt) projiciáló, excitatorikus szinapszist létrehozó neuronjai által használt neurotranszmitter ezidáig nem ismert; valószínősíthetı, hogy a jelátvitelben az L-aszpartátnak (Asp) van szerepe. IMM = intermedialis medialis mesopallium, SN = substantia nigra, VTA =

16

ventral tegmental area; DA = dopamin, DYN = dynorphin, ENK = enkephalin, SP = substance P.

Az L-aszpartát, mint a központi idegrendszer lehetséges neurotranszmittere

Ahhoz, hogy egy vegyületet neurotranszmitterként azonosítsunk, meg kell felelnie a következı kritériumoknak: (1) jelen kell lennie az axon terminálisokban, (2) szabályozott (pl. Ca2+-függı) exocitózissal kell ürülnie a szinaptikus résbe és (3) az ürülése után specifikus receptorokon keresztül választ kell kialakítania a célsejtben. Elsı ízben 1960-ban Curtis és Watkins vetette fel annak a lehetıségét, hogy az Laszpartát (Asp) mint neurotranszmitter funkcionálhat a központi idegrendszerben. Vizsgálatukban a központi idegrendszerbıl származó neuronokban Asp hatására membrán depolarizációt figyeltek meg (Curtis és Watkins 1960). Késıbbi vizsgálatok kimutatták, hogy az Asp az NMDA-típusú Glu receptorokon keresztül fejti ki a hatását, míg a többi ionotróp Glu receptorra nincs hatása (Patneau és Mayer 1990, Curras és Dingledine 1992). Az Asp axonterminálisokban való jelenlétének fixált szövetbıl történı

kimutathatóságára

vonatkozóan

ellentmondásos eredmények születtek. Egyes vizsgálatokban az axonterminálisokban nem találtak Asp-ot (Maxwell és mtsai 1990, Zhang és mtsai 1990, Ji és mtsai 1991, Montero 1994), míg mások kimutatták az Asp jelenlétét az idegvégzıdésekben (Merighi és mtsai 1991, Tracey és mtsai 1991, Van den Pol 1991, Usami és Ottersen 1996). Az ellentmondás oka valószínőleg abban keresendı, hogy ezek a vizsgálatok más-más agyi pályákat érintettek, valamint az alkalmazott módszerek érzékenysége is különbözı volt. 1998-ban Gundersen és munkatársai kimutatták, hogy az Asp koncentráltan jelen van az excitatorikus típusú idegvégzıdésekben és a szinaptikus vezikulák környékén feldúsulást mutat (Gundersen és mtsai 1998). A Ca2+-függı felszabadulásra Lada és munkatársai szolgáltattak közvetlen bizonyítékot, mikrodialízises vizsgálat segítségével (Lada és mtsai 1998). Az Asp a posztszinaptikus neuronban NMDA-receptor által mediált, gyors választ hoz létre (Fleck és mtsai 1993). Mindezek alapján mára már

17

széles körben elfogadott az az elképzelés, hogy egyes idegi mechanizmusokban az Asp, mint lehetséges neurotranszmitter szerepel. Az Asp felszabadulás lehetséges mechanizmusa

Az Asp és a Glu a preszinaptikus neuronból felszabadulhat exocitózissal, vagy specifikus,

membránban

lokalizált

transzporter-fehérjék

segítségével,

melyek

megtalálhatóak a gliasejteken, valamint az excitatorikus típusú szinapszist képezı neuronok végzıdésein is (Gundersen és mtsai 1993, 1996), és az Asp-ot a Glu-tal azonos affinitással szállítják (Balcar és Johnston 1972, Arriza és mtsai 1994). Exocitózist gátló ágensek hatására (pl. tetanusz vagy botulin toxin) az Aspfelszabadulás elmarad (Schiavo és mtsai 1992), amely a terminálisokból exocitózissal történı felszabadulást valószínősíti. A gliális Asp/Glu transzporter inhibitora, a GLT1 is gátolja az Asp felszabadulását (Arriza és mtsai 1994); ez alapján nem zárható ki a transzportfehérjéhez kötött release sem. Számos in vitro, hippocampusból származó agyszeleten végzett vizsgálat bizonyította, hogy a membrán depolarizáció által kiváltott Asp-felszabadulás Ca2+függı (Nadler és mtsai 1976, 1990; Burke és Nadler 1988, Szerb 1988, Martin és mtsai 1991, Roisin és mtsai 1991, Fleck és mtsai 1993, Zhou és mtsai 1995). Hasonlót tapasztaltak a kisagyból (Flint és mtsai 1981, Toggenburger és mtsai 1983, Sekiguchi és mtsai 1986, Vollenweider és mtsai 1990, Maura és mtsai 1991), a striatumból (Reubi és mtsai 1980, Umeda és Sumi 1989, Kimura és mtsai 1995) és a gerincvelıbıl (Kangrga és Randic 1990) származó agyszeletekben. Az Asp Ca2+-függı felszabadulását mikrodialízises vizsgálatok segítségével in vivo is sikerült igazolni. Az emlıs striatumban K+-által kiváltott Ca2+-függı Aspfelszabadulást írtak le (Girault és mtsai 1986, Paulsen és Fonnum 1989). Lada és munkatársai (1998) mikrodialízis segítségével a prefrontális kéreg elektromos stimulációját követıen a striatumból Ca2+-függı Asp-felszabadulást figyeltek meg. Az Asp exocitózissal történı felszabadulására direkt bizonyítékot szolgáltatna, ha sikerülne az Asp-ot kimutatni a szinaptikus vezikulákban, valamint azonosítani egy vezikuláris uptake mechanizmust. Izolált szinaptikus vezikulákban ezidáig nem sikerült kimutatni sem uptake-re utaló jeleket (Naito és Ueda 1983, Maycox és mtsai 1988, Fykse és mtsai 1992), sem magának az Asp-nak a jelenlétét (Burger és mtsai 1991).

18

Ezzel szemben, Gundersen és mtsai (1998) hippocampusból származó, fixált agyszöveten végzett elektronmikroszkópos immuncitokémiai vizsgálat során az Asphoz kapcsolt aranyszemcsék szinaptikus vezikulák körüli feldúsulását figyelték meg. Pinealocytákban az Asp-immunreaktivitás kolokalizációt mutatott egy szinaptikus membránfehérjével, a synaptophysinnel (Yatsushiro és mtsai 1997). Ezek alapján feltehetı, hogy a szinaptikus vezikulák in situ képesek az Asp felhalmozására, de ez a képességük az izoláció során elvész. A hippocampus-ból származó agyszeleteken végzett vizsgálatok eredményei miszerint az Asp a Glu-tól függetlenül szabadul fel - arra utalnak, hogy vagy léteznek külön Asp-ot és Glu-ot tartalmazó idegvégzıdések, vagy mindkét aminosav jelen van egy terminálison belül, de különbözı vezikulákban, melyek ürülése külön szabályozható. Gundersen és mtsai (1998) kimutatták, hogy az Asp és a Glu együttesen fordul

elı

a

hippocampus-ban

az

excitatorikus

típusú

szinapszist

képezı

axonterminálisokban. Kísérletükben nem találtak kizárólag Asp-ot tartalmazó idegvégzıdést. Ezzel szemben, a gerincvelı neuronjaiban kimutathatóak voltak olyan excitatorikus szinapszist alkotó axonterminálisok, amelyekben csak Asp volt jelen, Glu nem (Merighi és mtsai 1991, Valtschanoff és mtsai 1993).

Az Asp funkcionális jelentısége

Fleck és munkatársai (1993) kimutatták, hogy alacsony glükóz szint mellett a Schaffer-kollaterálisok stimulációját követı Asp-felszabadulás azonnali, gyors, NMDAreceptor-függı választ vált ki a posztszinaptikus neuronban. Az excitatorikus szinapszisokban található nem NMDA-típusú receptorokon az Asp nem képes hatni, így az Asp magában nem tudna részt venni a gyors szinaptikus jelátvitelben. Feltehetı, hogy az Asp szerepe inkább abban rejlik, hogy az NMDA-receptorokra hatva modulálja az excitatorikus típusú szinapszisokban a posztszinaptikus neuron válaszát. Ezek alapján elképzelhetı, hogy az Asp szerepet játszik az NMDA-függı LTP (long term potentiation) kialakításában. LTP kiváltása során a hippocampus CA1 régiójában Aspfelszabadulás mérhetı (Bliss és mtsai 1986). Egy másik elképzelés szerint, az Asp funkcionális jelentısége abban rejlik, hogy az NMDA-receptorok stimulációja révén metabolikus változásokat hoz létre az agyban.

19

Az NMDA-receptorok aktivációja nitrogén-oxid-szintáz enzim (NOS) által szabályozott nitrogén-oxid (NO) felszabaduláshoz vezet (Garthwaite 1991). A NOS megtalálható az excitatorikus típusú szinapszis képzésében részt vevı posztszinaptikus neuronokban (Aoki és mtsai 1993). Faraci és Breese (1993) kimutatták, hogy a megnövekedett szinaptikus aktivitás NO-felszabadulás által kiváltott lokális vazodilatációt okoz. Ezek alapján elképzelhetı, hogy az Asp fı szerepe nem más, minthogy az aktív szinapszisokban lokálisan fokozza átmenetileg az oxigénellátást és a glükózellátást. Madarakban az Asp-tartalmú neuronok eloszlását és lehetséges funkcióját ez idáig még nem vizsgálták.

Lehetséges Asp-erg pályarendszerek

Hippocampus:

A

hippocampus-ban

számos

vizsgálat

utal

az

Asp

neurotranszmitter szerepére a Schaffer-kollaterálisok végzıdéseiben. Ez az egyetlen olyan agyterület, melyben a kísérleti eredmények alapján kijelenthetı, hogy az Asp az összes

neurotranszmitter

kritériumot

teljesíti:

(1)

A

Schaffer-kollaterálisok

végzıdéseibıl az Asp Ca2+-függı módon ürül (Nadler és mtsai 1976, Burke és Nadler 1988). (2) Elektronmikroszkópos szinten sikerült kimutatni a terminálisokban a szinaptikus vezikulák felett (Gundersen és mtsai 1998). (3) A Schaffer-kollaterálisok elektromos stimulációja Asp által közvetített NMDA-választ fejt ki (Fleck és mtsai 1993). (4) Az NMDA-receptorok jelen vannak a Schaffer-kollaterálisok által képzett szinapszisok posztszinaptikus oldalán (Petralia és mtsai 1994a,b; Takumi és mtsai 1999). Striatum: A striatumban depolarizáció hatására történı, Ca2+-függı Aspfelszabadulást írtak le (Reubi és mtsai 1980, Girault és mtsai 1986, Paulsen és Fonnum 1989, Umeda és Sumi 1989, Kimura és mtsai 1995). A corticostriatalis pálya stimulációja a striatumban Asp-felszabadulához vezet (Lada és mtsai 1998). A striatum interneuronjaiban (Snyder és mtsai 1993, Pettersson és mtsai 1996) és a legtöbb corticostriatalis neuron terminálisában (Bellomo és mtsai 1998) fénymikroszkópos szinten Asp-immunpozitivitás figyelhetı meg. Ezidáig elektronmikroszkópos szinten még nem írtak le a striatumban Asp-immunpozitivitást. Jelen dolgozat egy része azon

20

vizsgálatunkat ismerteti, melyben Asp-tartalmú axonterminálisokat írunk le a házicsirke MSt-ában. Kisagy: Kisagyból származó agyszeleteken végzett vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy az Asp – a Glu-tal együtt – a kúszórostok fı neurotranszmittere (Wiklund és mtsai 1982, Toggenburger és mtsai 1983, Vollenweider és mtsai 1990).

Ezzel

szemben, fixált szövetbıl elektronmikroszkópos immuncitokémiai reakcióval ezidáig nem sikerült kimutatni az Asp-ot a kúszórostok terminálisaiban (Zhang és mtsai 1990), így ebben a pályában az Asp szerepe nem bizonyítható. Gerincvelı: Arra a kérdésre, hogy az Asp elıfordul-e a gerincvelı hátsó szarvába érkezı efferensek terminálisaiban, szintén ellentétes eredmények születtek. Maxwell és munkatársai macskán végzett vizsgálatukban (1990) nem találtak Aspimmunreaktivitást ezekben a terminálisokban, míg patkányban több pozitív eredmény is született (Merighi és mtsai 1991, Tracey és mtsai 1991). Kangrga és Randic (1990) gerincvelıi szeletekbıl elektromos stimuláció hatására a hátsó szarvból történı Ca2+függı Asp-felszabadulást írtak le, Gerber és munkatársai pedig NMDA-receptor aktivációt

tapasztaltak

(Gerber

és

Randic

1989,

Gerber

és

mtsai

1991).

Elektronmikroszkópos immuncitokémia és anterográd pályakövetés kombinációja során kimutatták, hogy az Asp jelen van a corticospinalis pálya terminálisaiban (Valtschanoff és mtsai 1993), bár a jelölıdés nem érte el a specifikus transzmitternek megfelelı mértéket, így az exocitózis bizonyítása döntı fontosságú lenne ahhoz, hogy az Asp-ot a corticospinalis pálya neurotanszmitterének tekinthessük.

Mindezekbıl kitőnik, hogy bár számos kutatási eredmény utal az Asp neurotranszmitter szerepére, ez mégsem tekinthetı széles körben elfogadottnak. Egyrészt hiányoznak bizonyos konklúzív bizonyítékok ezen aminosav specifikus szinaptikus hatásaival kapcsolatban, másrészt a szerteágazó agyi rendszereken kapott eredmények nem álltak össze olyan egységes képpé, amelynek alapján az Asp szerepe (mintegy ’nélkülözhetetlen’ volta) magyarázható. A jelen disszertációban bemutatott anyagunk új szempontok figyelembe vételével, korszerő neuromorfológiai módszerek segítségével, nem emlıs striatumban kísérli meg az ’aszpartát-kérdés’ továbbvitelét.

21

Az agyi jutalmazási rendszer és az addikció A mesolimbikus pálya és a dopamin szerepe

A jutalmazási rendszer alapvetı jelentıségő komponense a mesolimbikus dopaminerg pálya (áttekintı cikk: Ikemoto 2007), amely a középagyi VTA és a ventrobasalis elıagy, ezen belül a nucleus accumbens (Ac) között létesít összeköttetést (6. és 7. ábra). Ez a mesoaccumbalisnak is nevezhetı DAerg pályarendszer közvetíti a kokain, a heroin, vagy az alkohol addiktív hatásait (Wise és Bozarth 1982, Di Chiara és Imperato 1988; Samson és Harris 1992); a viselkedés jutalmazásra épülı befolyásolása révén. Néhány addiktív drog, mint az amphetamin és a kokain direkt hatást fejt ki a mesoaccumbalis pályára, a DA-erg neuronok Ac-beli végzıdésein, míg más drogok, mint pl. az opiátok indirekt hatnak a mesolimbikus rendszerre (Gardner 1997).

6. ábra. A mesolimbikus dopaminerg (DAerg) rendszer egérben. A mesolimbikus DAerg pálya kiindulópontja a középagyi area ventralis tegmentalis (VTA) DAerg neuronjai, fı elıagyi központja pedig a nucl. accumbens (Ac).

22

LSt

7. ábra. A madár mesolimbikus rendszer sematikus rajza. Az area ventralis tegmentalis-ból (VTA) kiinduló dopaminerg neuronok a medialis striatum (MSt) területére projiciálnak. CA = commissura anterior, Hp = hippocampus, HD = hyperpallium densocellulare, LaM = lamina mesopallialis, LFM = lamina frontalis suprema, LFS = lamina frontalis superior, LSt = lateralis striatum, NIII. = III. agyideg, Ov = nucl. ovoidalis, Ru = nucl. ruber, TO = tuberculum olfactorium, TSM = tractus septomesencephalicus.

A DA több központi idegrendszeri pálya alkotórésze, amelyek közé tartozik a lokomotor

szabályozást

befolyásoló

nigrostriatalis,

valamint

a

viselkedés

megerısítésében szerepet játszó, és a VTA-ból eredı mesolimbikus pálya. A DAerg bemenet permisszív hatású a striatum projekciós neuronjaira, amennyiben lehetıvé teszi bizonyos mozgási vagy viselkedési mintázatok kivitelezését. A DAerg axonterminálisok ugyanazokon a közepes mérető, tüskés projekciós neuronokon végzıdnek, amelyek serkentı pallialis bemenetet is kapnak (pl. corticostriatalis pálya az emlısagyban, pallium externumból és Wulstból érkezı bemenet madarakban). A közös célneuron egyfajta koincidencia-detektor szerepét tölti be, amelynek egyik lehetséges neurokémiai alapja a dopamin-cAMP-függı foszfoprotein (DARPP-32). Az utóbbi messenger-molekula kitüntett foszforilációs helyei révén kölcsönösen befolyásolni képes a különbözı Glu (ionotróp, metabotróp) ill. DA receptorok aktuális

23

kötéserısségét (Di Chiara és mtsai 1994), ami azt jelenti, hogy DA hatására mintegy optimalizálódik a Glu-receptor kötıképessége.

Az addikció

A jutalmazási rendszer azonban nemcsak pozitív hatást fejthet ki. Az addikció alapja a jutalmazási rendszer félresiklása. Az addikció olyan állapot, amelyben az egyed kényszeresen végrehajt egy bizonyos cselekvést, még abban az esetben is, ha az negatív következményekkel jár; mindaddig, amíg a cselekvést megerısítés (jutalom) kíséri. Az emberi gyógyászatból ismert drogfüggıségnek számos kísérleti állatmodelljét ismerjük, melyekben a függıség kialakulását olyan tesztek segítségével vizsgálják, mint a kondícionált hely-preferencia, és a drog intravénás ön-adagolásának mérése (Schuster és Woods 1968, Goldberg 1975, Goldberg és mtsai 1975, 1979, 1981; Spealman és Goldberg 1978, Katz és Goldberg 1988, Markou és mtsai 1993, Everitt és Robbins 2000, Schindler és mtsai 2002, Deroche-Gamonet és mtsai 2004, Vanderschuren és Everitt 2004). Az addikció napjaink nagy jelentıségő egészségügyi problémája. Felvetıdik a kérdés, hogy mi okozza azt, hogy egyes személyek képesek az addiktív szereket alkalomszerően használni és nem alakul ki bennük függıség, míg másoknál viszonylag könnyen kialakul egy önpusztító, kényszeres függıség. Kutatási eredmények alapján elmondható, hogy a függıség kialakulásában a genetikai tényezık több, mint 50%-ban vesznek részt (Uhl és mtsai 1993). Állatmodelleken bizonyították, hogy az addikcióra való genetikai hajlam a mesoaccumbalis DA rendszer csökkent mőködésével kapcsolatos (Beitner-Johnson és mtsai 1991, Guitart és mtsai 1992, 1993; Nestler 1993, Kosten és mtsai 1994, 1997; Self és Nestler 1995). Valószínősíthetı, hogy a csökkent mőködés nem az alacsony DA-szinttel, hanem a DA receptorok diszfunkciójával magyarázható (Blum és mtsai 1996a,b, Volkow és mtsai 1999, 2001, Thanos és mtsai 2001). A DA addikcióban betöltött szerepére utal az a megfigyelés is, miszerint a függıséget okozó drogok többsége a Ac-ben DA felszabadulást vált ki (Imperato és mtsai 1986, Pidoplichko és mtsai 1997), és a DA-erg rendszer gátlása csökkenti a pszichostimulánsok addiktív hatását (Koob 1992a,b). A DA - az addikcióban játszott

24

szerepe mellett - nagy jelentıséggel bír az egyes tanulási folyamatokban (Schultz és mtsai 1997, Schultz 2002), valamint a pszichoaktív drogok kényszeres hajhászásában is (Phillips és mtsai 2003). A marihuána (Cannabis sativa) a világon az egyik legrégebben és legszélesebb körben használt drog, melynek a fı hatóanyaga a ∆9-tetrahidrokannabinol (THC). A THC a neuronokon specifikus receptorhoz kapcsolva fejti ki pszichoaktív hatását. A szervezet természetes úton is termel olyan anyagokat, amelyek a THC-hez hasonló mechanizmussal képesek hatni a központi idegrendszerre. Ezeket az anyagokat endokannabinoidoknak nevezzük.

Az endogén kannabinoid rendszer

Endokannabinoidok és receptoraik a központi idegrendszerben

Az endokannabinoidok intercelluláris lipid jelátvivı anyagok (áttekintı irodalom: Lambert és Fowler 2005). Hatásukat elsısorban a posztszinaptikus sejtbıl felszabadulva a preszinaptikus neuronon fejtik ki, így a retrográd jelátvitelben játszanak szerepet. Lipofil molekulák lévén vízben nem oldódnak jól. Nem tárolódnak vezikulákban; minden valószínőség szerint csak akkor szintetizálódnak, amikor szükség van rájuk. Pontos hatásmechanizmusuk napjaink erısen kutatott témája. A kannabinoid rendszer kutatásában fontos mérföldkı volt 1992-ben az elsı endogén kannabinoid, az anandamide (arachidonoyl-etanolamin, AEA) izolálása sertés agyából, és annak bizonyítása, hogy ez a lipid természető anyag képes aktiválni a kannabinoid rendszert (Devane és mtsai 1992). Di Marzo és munkatársai kimutatták, hogy az anandamide természetes körülmények között is szintetizálódik a központi idegrendszerben (Di Marzo

és

mtsai

1994).

Az

anandamide

felfedezését

hamarosan

további

endokannabinoidok követték: a 2-arachidonyl-glicerol (2-AG), a 2-arachidonyl-gliceriléter (noladin-éter) és a virodhamine (O-arachidonoyl-etanolamin, OAE) (8. ábra). Utóbbi két endokannabinoidot a 2000-es években fedezték fel.

25

Anandamide

2-arachydonyl-glicerol

Noladin-éter

Virodhamine

8. ábra. Az endokannabinoidok molekuláris szerkezete. Közös jellemzıjük a többszörösen telítetlen zsírsav-rész (pl.: arachidonsav), valamint a poláris ’fej’, amely etanolaminból vagy glicerinbıl áll.

Az endokannabinoidok ún. kannabinoid receptorokon keresztül fejtik ki hatásukat (áttekintı irodalom: Freund és mtsai 2003). A kannabinoid receptorok 7 transzmembrán alegységgel rendelkezı polipeptidek, melyek G-proteinhez kapcsolt jelátviteli úton át hatnak és számos molekuláris szintő változást tudnak elıidézni (Ca2+csatornák zárása, K+-csatornák nyitása, cAMP-szint csökkentése az adenil-cikláz enzim gátlása révén, egyes foszforilát-kinázok stimulálása). Az elsı kannabinoid receptort, a CB1 receptort 1990-ben klónozták, patkány agyából (Matsuda és mtsai), majd három évvel késıbb leírták a periférián található párját, a CB2 receptort is (Munro és mtsai 1993) (9. ábra). A CB1 receptor elsısorban a központi idegrendszerben található meg, míg a CB2 receptor az immunrendszer egyes sejtjein exprimálódik. Újabb kutatások még számos egyéb kannabinoid receptor jelenlétét feltételezik (Brown 2007). A kannabinoid receptorokon kívül az anandamide képes hatni az 1-es típusú vanilliod receptoron, a TRPV-1-en (transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 1), amely egy olyan nem-szelektív kation csatorna, melyet több endogén ligand is képes aktiválni és legfıbb szerepe a fájdalomérzet kialakításában van (áttekintı irdalom: Ross 2003).

26

9. ábra. A CB1 (zöld) és a CB2 (kék) – típusú kannabinoid receptor szerkezete. Mindkét receptor a 7 transzmembrán alegységgel rendelkezı, G-proteinhez kapcsolt jelátviteli úton keresztül ható receptorok családjához tartozik.

A CB1-típusú receptorok preszinaptikusan helyezkednek el, és az agy számos területén megtalálhatóak, mint a tuberculum olfactorium, a neocortex, a piriform cortex, a hippocampus, az amygdala, a törzsdúcok, a thalamus, a hypothalamus, a septum, a cerebellum

és

egyes

agytörzsi

magok

(Herkenham

és

mtsai

1990).

Az

endokannabinoidok depolarizáció hatására ürülnek a posztszinaptikus neuronból, majd retrográd messengerként hatva a preszinaptikus neuronban modulálják a transzmitter felszabadulást. Az endokannabinoidok inaktivációjában két mechanizmusnak van szerepe: a sejten belüli hidrolízisnek és a vivımolekula-által mediált, sejten belülre történı transzportnak. Az anandamide és a 2-AG paszív transzporttal képes bejutni a sejtbe, de ezt a folyamatot gyorsíthatja egy azonnali választ biztosító, szelektív transzportrendszer, amely a gliasejteken és a neuronokon egyaránt megtalálható (Beltramo és mtsai 1997, Hilard és mtsai 1997). Az endokannabinoid transzport a Na+-grádienstıl független, ami arra utal, hogy a folyamatban valószínőleg facilitált diffúzió játszik szerepet (Beltramo és mtsai 1997, Hilard és mtsai 1997). A carrier molekula megtalálására jelenleg is számos vizsgálat zajlik, ám ezidáig ennek meglétét nem sikerült igazolni (Ligresti és mtsai 2010). Az anandamide sejten belüli lebontásában egy membránhoz kötött enzim, a FAAH (zsírsav-amid hidroláz: fatty acid amide hydrolase) játszik szerepet, amely az

27

anandamide-ot arachidonsavra és etanolaminra bontja (Cravatt és mtsai 1996). A 2-AG lebontásában pedig a monoacil-glicerol-lipáz (MGL) a kulcsenzim. Míg a FAAH a posztszinaptikus sejtben található meg, a MGL elsısorban preszinaptikusan, az axonterminálisokban helyezkedik el (Dinh és mtsai 2002).

Endokannabinoid rendszer madarakban

A CB1 receptor szekvenciája a gerincesekben erısen konzervatív. A humán CB1 receptor szekvenciájával 97%-ban megegyezik a patkány, 91%-ban a zebrapinty és 83%-ban a tarajos gıte CB1 receptora (McPartland és Glass, 2003, Soderstrom és Johnson 2000). A közelmúltban számos kutatás irányult annak eldöntésére, hogy a CB1 receptor agyi elıfordulása is hasonlóan konzervatív-e az egyes gerinces csoportokban. A madarak kannabinoid rendszerének kutatása elsı ízben énekesmadarakon zajlott. A CB1 receptort kódoló mRNS jelenlétét zebrapinty énektanulással kapcsolatos agyterületein vizsgálták (Soderstrom és Johnson 2000). CB1 receptor agonistával való kezelés az énektanulást, valamint magát az éneklést hátrányosan befolyásolta (Soderstrom és Johnson 2001). Alonso-Ferrero és munkatársai hullámos papagáj agyában autoradiográfiás módszerekkel vizsgálták a CB1 receptorok sőrőségét különbözı agyterületeken (Alonso-Ferrero és mtsai 2006). Stincic és Hyson in situ hibridizáció segítségével feltérképezték a CB1 mRNS eloszlását a házicsirke agyában (Stincic és Hyson 2008), és eredményeik arra utalnak, hogy a CB1 mRNS eloszlása a madár és az emlıs agyban meglehetısen hasonló. Jelenleg is folyó vizsgálatunk elızetes eredményei a CB1 receptor jelenlétére utalnak a csirke PAL-ban szereplı agyterületein (Ádám, Wenger, Hungund és Csillag, 2005, Abstract; Symposium on the Cannabinoids, Burlington, Vermont, ICRS, p. 92) (10. ábra).

28

10.

ábra.

CB1

immunpozitivitás

receptor a

házi-

csirke striatumában. Immunhisztokémia 60 µm vastag, úszó vibratom metszeteken; nyúlban

termeltetett

anti-

CB1 antitest (Neuromics), 1:1000;

elıhívás:

ABC-

reakció,

nikkel-DAB).

A

nyilak a CB1-immunpozitív neuronokra sejtmagot

mutatnak. kihagyó,

A peri-

karionok peremén megjelenı immunjelzés a receptorokra jellemzı. Lépték = 100 µm.

Kannabinoid receptor agonisták és antagonisták

Az endogén kannabinoid rendszer jobb megismeréséhez nélkülözhetetlen volt olyan farmakológiai ágensek felfedezése, melyek szelektíven hatnak a kannabinoid receptorokra (Hillard és mtsai 1999, Rinaldi-Carmona és mtsai 1994). A CB1 receptor elsı felfedezett szelektív antagonistája a rimonabant (régi nevén: SR 141716A; RinaldiCarmona és mtsai 1994), melynek felfedezése után rövidesen terápiás célokra való felhasználása is felmerült (Black 2004, Fernandez és Allison 2004, Carai és mtsai 2005). A rimonabant-ot a Sanofi-Aventis (Franciaország) gyógyszergyártó vállalat 2006-ban, mint elhízás ellenes készítményt hozta forgalomba. A gyógyszer az étvágy csökkentése által fejtette ki hatását. 2008-ban betiltották a szer forgalmazását, a potenciális súlyos pszichiátriai mellékhatások – esetenként akár öngyilkosság – miatt. A CB1 receptor antagonisták esetleges gyógyszerként való felhasználása emellett számos lehetıséggel kecsegtet: a jövıben szerepe lehet az alkoholizmus gyógyításában, a dohányzásról való leszokás segítésében, és a drogaddikciók gyógyításában is (áttekintı irodalom: Beardsley és mtsai 2009). A CB2 receptor

29

antagonisták potenciális klinikai felhasználása pedig az immunrendszert moduláló képességükben rejlik (Rinaldi-Carmona és mtsai 1998). Az eddig leírt fıbb kannabinoid receptor agonisták és antagonisták kémiai szerkezetét a 11. ábra foglalja össze.

11. ábra. A kannabinoid receptorokon ható fıbb, növényi eredető és szintetikus vegyületek kémiai szerkezete. a: Kannabinoid receptor agonisták, amelyek a CB1 és a CB2 receptorokon egyaránt hatást fejtenek ki. (THC = tetrahidrokannabinol) b: A szelektív CB1 antagonista rimonabant és szelektív CB2 antagonista SR144528 szerkezete. c: Szelektív CB1 agonista ACEA (arachidonoyl-2′kloroethanolamide) és CB2 agonista AM1241.

A célzott génmódosítást lehetıvé tevı “knock out” technika segítségével olyan transzgenikus egereket lehet létrehozni, amelyekben tanulmányozhatóvá válik a CB1 receptort kódoló gén hiánya. Zimmer és munkatársai kimutatták, hogy a CB1-knockout (CB1-/-) egerek csökkent mozgás aktivitással bírnak; fájdalomküszöbük magas (hypoalgesia), mortalitásuk pedig jóval meghaladja a vad típusét (CB1+/+) (Zimmer és mtsai 1999).

30

Az endogén kannabinoid rendszer és a dopamin rendszer kapcsolata

A mesocorticolimbikus pályarendszerben a DAerg jelátvitel és a kannabinoid rendszer kapcsolatát számos kísérleti rendszerben kimutatták (Chen és mtsai 1990, French 1997, Gessa és mtsai 1998, Tanda és mtsai 1999, Wu és French 2000). A VTA DAerg neuronjain nem található CB1-receptor, ami kizárja a kannabinoid rendszernek az Ac-ben történı DA felszabadulásra gyakorolt közvetlen hatását (Herkenham és mtsai 1990, 1994, Matsuda és mtsai 1993, Tsou és mtsai 1998). A striatumban a CB1 receptorok és a tyrozin-hidoxiláz kolokalizációja sem volt megfigyelhetı (Julian és mtsai 2003). Feltételezhetı, hogy a CB1 receptor a Ac-ben modulálja a Glu-erg és GABAerg neurotranszmissziót (Hoffman és Lupica 2001, Manzoni és Bockaert 2001, Robbe és mtsai 2001, 2002, Julian és mtsai 2003). A CB1 receptorok jelen vannak a Ac-ben azokon a Glu-erg végzıdéseken, amelyek a közepes mérető, tüskés, GABAerg neuronokkal alkotnak szinapszist (Robbe és mtsai 2001) (12. ábra). Feltehetı, hogy a kannabinoid rendszer aktivációja modulálja a striatum/Ac GABAerg 'medium spiny' neuronjaira ható Glu felszabadulását. A VTA DAerg neuronjaira irányuló GABAerg hatás csökkenése révén pedig növekedhet az Ac-ben a DA-felszabadulás (Van der Stelt és Di Marzo 2003). Mikrodialízises

vizsgálatokkal

kimutatták,

hogy

patkányokban

intraperitoneálisan bejuttatott etanol hatására a Ac-bıl származó dializátumok DAszintje nıtt (Di Chiara és Imperato 1988, Yim és mtsai 1998). A CB1 receptorok aktivációja serkenti a VTA DAerg neuronjait, ezáltal növeli a Ac-ben a DAfelszabadulást. (Tanda és mtsai 1997, Gessa és mtsai 1998). Ezek alapján feltételezhetı, hogy a Ac neuronjainak DA-felszabadulása összefügg az endogén kannabinoid rendszer aktivációjával. Az endokannabinoid rendszer a DA rendszerrel való szoros kapcsolatának következménye, hogy fontos szerepet játszik a jutalmazásos tanulásban ill. a viselkedés pozitív megerısítésében.

31

12. ábra. Az endogén kannabinoid rendszer

szerepe

striatumban.

A

a

ventralis

CB1

receptorok

preszinaptikusan helyezkednek el, a corticostriatalis, glutamáterg projekciós neuronokon.

A

striatum

közepes

mérető, tüskés, GABAerg neuronjaiból az

endokannabinoid

(anandamide)

felszabadulva retrográd módon hat a preszinaptikus sejtre és befolyásolja az abból

történı

felszabadulást.

glutamát Az

(Glu)

anandamide

inaktivációjáért a FAAH (fatty acid amyloid hydroxilase) enzim felelıs.

Az endogén kannabinoid rendszer szerepe a viselkedés pozitív megerısítésében

CB1 receptor agonisták felerısítik az addiktív szerek, mint az alkohol (Gallate és mtsai 1999, Colombo és mtsai 2002), a heroin (Solinas és mtsai 2005) és a nikotin (Valjent és mtsai 2002) függıséget kiváltó hatását, míg az antagonisták számos rendszerben csökkentik (Arnone és mtsai 1997, Navarro és mtsai 2001, Solinas és mtsai 2003, Vinklerova és mtsai 2002, Singh és mtsai 2004). A táplálkozással kapcsolatos pozitív megerısítésben is szerepet játszik a kannabinoid rendszer. A THC növeli a felvett táplálék mennyiségét (Williams és mtsai 1998), különös tekintettel az édes íző ételekre (Berridge és Robinson 1998). Patkányokban kimutatták, hogy CB1 agonisták hatására az állatok több édes oldatot fogyasztanak (Gallate és mtsai 1999), és a keserő ízekkel szembeni averziójuk is csökken (Jarett és mtsai 2005, 2007). A kutatási eredmények alapján szóbajön a CB1 agonisták klinikai felhasználásának lehetısége az anorexia gyógyításában (Gaetani és mtsai 2008). CB1 antagonisták - mint pl. a rimonabant - csökkentik a táplálékfelvételt (Arnone és mtsai 1997, Colombo és mtsai 1998, Similand és mtsai 1998, Freedland és mtsai 2001, Thornton-Jones és mtsai 2005, 2006, 2007). Amennyiben egereknek a

32

születésük utáni elsı 24 órában rimonabant-ot adtak, az szinte teljes mértékben gátolta az anyatej-felvételt és az állatok elhullásához vezetett (Fride és mtsai 2001, 2003). A rimonabant ezen tulajdonsága vezetett ahhoz, hogy a klinikumban az elhízás kezelésére alkalmas gyógyszerként jelenjen meg (Padwal és Majumdar 2007).

Az endogén kannabinoid rendszer szerepe az alkoholfüggıség kialakulásában

Az alkoholfüggıség kialakulásában is a mezolimbikus DAerg pálya bír kulcsfontosságú szereppel (Tabakoff és Hoffman 1996). Emellett, számos kísérleti bizonyíték áll rendelkezésre arról, hogy az endogén kannabinoid rendszer szerepet játszik az alkohol egyes hatásainak kialakításában (Hungund és mtsai 2002). CB1 receptor gátlása csökkenti az alkoholfelvételt (Arnone és mtsai 1997, Colombo és mtsai 1998, Rodriguez de Fonseca és mtsai 1999, Rinaldi-Carmona és mtsai 2004). Patkányokon végzett kísérletben azt tapasztalták, hogy az állatok sörfogyasztása CB1 agonista hatására nıtt, míg CB1 antagonista hatására csökkent (Gallate és McGregor 1999, Gallate és mtsai 1999, 2004). Hasonló hatást írtak le egerekben is (Poncelet és mtsai 2003). CB1 receptorhiányos egerekben csökkent az alkoholfogyasztás és gyengült az alkollal kiváltott helypreferencia (Wang és mtsai 2003, Thanos és mtsai 2005). Krónikus alkoholhatásra megnı az anandamide és 2-AG termelıdésének mértéke (Basavarajappa és Hungund 1999b, Basavarajappa és mtsai 2000). Dolgozatom ide vonatkozó része egy olyan kísérletet mutat be, melyben transzgenikus CB1 vad típusú (CB1+/+) és CB1-génkiiktatott (CB1-/-) egereken vizsgáltuk, hogy a CB1 receptor milyen szerepet játszik az Ac-bıl etanol hatására történı DA-felszabadulásban.

Az endogén kannabinoid rendszer és a tanulás

Az endogén kannabinoid rendszer tanulásban és memóriában betöltött szerepe napjaink széles körben kutatott témája. A CB1 receptorok szerepe a jutalmazásos tanulásban (Gardner 2005, Solinas és mtsai 2008), az averzív memóriában (Marsicano és mtsai 2002), a striatalis LTD kialakításában (Singla és mtsai 2007), a GABAerg

33

transzmisszióban (Freund és mtsai 2003), valamint a striatum Gluerg és DAerg bemenetének interakciójában (Kreitzer és Malenka 2005) jól ismert. Humán vizsgálatok megállapították, hogy akut marihuána hatásra a rövidtávú memória romlik (Miller és Branconnier 1983, Chait és Perry 1992, Ranganathan és D’Souza 2006). Kannabinoidok adása rontja a patkányok teljesítményét számos tanulási tesztben (Hampson és Deadwyler 1998, Varvel és mtsai 2005). Kannabinoid antagonisták tanulásra gyakorolt hatását számos kísérletben vizsgálták. Elsıként Terranova és mtsai (1996) vetették fel annak a lehetıségét, hogy a rimonabant-nak pozitív hatása lehet a memóriára. Vizsgálatukban patkányok rövidtávú olfaktorikus memóriája - szociális felismerési tesztben - subcutan rimonabant hatására javult. A rimonabant memóriajavító hatását térbeli memóriát vizsgáló (sugárlabirintus és T-labirintus) tesztekben is megfigyelték (Lichtman 2000, Takahashi és mtsai 2005, Wise és mtsai 2007). Általánosságban elmondható, hogy a legtöbb tesztben a CB1 antagonisták pozitív vagy semleges hatást gyakoroltak a memóriára (áttekintı irodalom: Varvel és mtsai 2009). Bilkei-Gorzo és munkatársai ellenben megfigyelték, hogy felnıtt CB1-/- egerek számos tanulási tesztben gyengébben teljesítenek, mint vad típusú társaik (Bilkei-Gorzo és mtsai 2005). CB1-/- egerekben a kondícionált félelmi válasz hiányzik, a tesztelési fázis elıtt adott CB1 antagonista pedig csökkenti a vad típusú egerek félelmi reakcióját (Mikics és mtsai 2006). A rimonabant a kisagy által irányított motoros tanulásban is memóriagátló hatással bírt (Kishimoto és Kano 2006). Az antagonisták memóriára gyakorolt hatása minden valószínőséggel a szinaptikus plaszticitás befolyásolása révén valósul meg. In vitro kísérletekben, prefrontális kéregbıl (Auclair és mtsai 2000) ill. hippocampus-ból (Hoffman és mtsai 2007) származó agyszeletekben megfigyelték, hogy a rimonabant elısegíti az LTP kialakulását.

Jelen dolgozatban a CB1-típusú kannabinoid receptorok tanulásban és motivációban

betöltött

lehetséges

szerepét

két

rendszerben

tanulmányoztuk:

transzgenikus egérben etanollal kiváltható dopamin-felszabadulás követése, valamint házicsirkék passzív ízelkerüléses tanulása.

34

Célkitőzések Jelen dolgozatban vizsgálatunk fı céljául a striatum tanulásban és motivációban betöltött szerepének alaposabb megismerését tőztük ki. Ennek érdekében különbözı kísérleti megközelítéseket alkalmaztunk madár és emlıs rendszerekben. A következı kérdésekre kerestük a választ:

1.

Hogyan

írható

le

házicsirkében

a

medialis

striatum/nucleus

accumbens

szinapszisainak végzıdési mintázata, továbbá milyen arányban mutatható ki L-aszpartát és L-glutamát a serkentı típusú szinapszisokban? Felvethetı-e az L-aszpartát transzmitter szerepe a passzív elhárító tanulásért felelıs striatalis pályarendszerben?

2. Van-e összefüggés a kannabinoid rendszer és a jutalmazással kiváltott dopamin felszabadulás között az egér nucleus accumbens-ben? Hogy hat a kannabinoid receptorok gyógyszeres gátlása az alkohol által kiváltott dopamin válaszra?

3. Szerepet játszhat-e az endogén kannabinoid rendszer a házicsirke passzív elhárító tanulását irányító idegi mechanizmusban?

35

Anyagok és módszerek A disszertációban szereplı Semmelweis Egyetem Állatkísérleti Tudományos Etikai Tanácsa (22.1/3453/003/2009-es számú határozata) és a Budapest Fıvárosi Állategészségügyi és Élelemiszer Ellenırzı Állomás állatkísérleti engedélyével az „Állatok védelmérıl és kíméletérıl” szóló 1998. évi XXVIII. törvény (243/1998) 32. § (3) alapján folytattuk.

1. L-aszpartát és L-glutamát immunreaktív idegelemek eloszlása a házicsirke medialis striatumában és arcopalliumában

Jelen kísérletünkben megvizsgáltuk a házicsirke arcopallium ill. MSt régióiban az Asp- és Glu-immunreaktív idegelemek eloszlását, fény-és elektronmikroszkópos szinten. A kísérlethez 13 db 2 hetes házicsirkét használtunk. A termékenyített tyúktojásokat a Gödöllıi Állattenyésztési Kutatóintézettıl vásároltuk, és helyben keltettük ki keltetıgéppel.

1.1. Glu és Asp kettıs fénymikroszkópos immunhisztokémia

Kilenc db 2 hetes házicsirkét használtunk. Az állatokat ketaminnal és xylazinnal történt mély altatás után transzkardiálisan perfundáltuk 4% paraformaldehidet, valamint 1% glutáraldehidet tartalmazó 0,1 M Na-foszfát pufferrel (PB, pH: 7,4). Az agyat eltávolítottuk, majd egy éjszakán át utófixáltuk 4% paraformaldehidet tartalmazó 0,1 M PB-ben. Vibratom segítségével 60 µm vastagságú coronalis metszeteket készítettünk. A szabadon-úszó metszeteket sóoldatot tartalmazó foszfát pufferben (PBS) történt mosás, majd 5% normál kecskeszérummal (NGS; PBS-ben, 30 percig szobahımérsékleten) való elıkezelés után egérben termeltetett monoklonális anti-Glu antitesttel (Swant, Bellinzona, Switzerland; 1:1000 hígítás; 0,3 % Triton-X-et és 1% NGS-t tartalmazó PBS-ben) inkubáltuk, 48 órán keresztül, hőtıszekrényben. A metszeteket többszöri, PBS-ben történt átmosás után Cy3-mal konjugált anti-egér szekunder antitesttel (Jackson

Immunoresearch,

West

Grove,

36

PA;

1:250

hígítás)

kezeltük,

szobahımérsékleten, 3 órán keresztül. Többszörös PBS-ben történı átmosás után a metszeteket nyúlban termeltetett poliklonális anti-Asp antiszérummal kezeltük (Sigma, St. Lois, MO; 1:1000 hígítás; 0,3 % Triton-X-et és 1% NGS-t tartalmazó PBS-ben) 48 órán keretszül, hőtıszekrényben, majd fluoreszcens markerként Alexa Fluor 488 antinyúl

antitestet

(Molecular

Probes,

Eugene,

OR;

1:500

hígítás;

3

óra

szobahımérsékleten) használtunk. A metszeteket tárgylemezre húztuk és PBS:glicerin 1:1 arányú keverékével fedtük le. A jelölt sejtek vizualizálása kettıs fluoreszcens mikroszkópia segítségével történt. A sejteket Olympus BX 50 fluoreszcens mikroszkóp ill. Bio-Rad Rainbow 2000 konfokális lézer scanning mikroszkóp segítségével vizsgáltuk. Néhány - az arcopalliumot is magában foglaló – metszetet kiválasztottunk és Nissl-festést hajtottunk rajta végre (immunreakció nélkül), hogy felhasználhassuk a vizsgálathoz szükséges kvantitatív elemzés során. Az immunreaktív sejteket manuálisan számoltuk meg az arcopalliumról készült egymást követı optikai felvételeken. A sejtek számát összehasonlítottuk az azonos régióból készült Nissl-festett metszetek analízisével nyert sejtsőrőség adatokkal. A neuronok számolását egy virtuális mérıkeret segítségével végeztük, amelyet a vizsgált agyterületrıl származó számos, egymással nem szomszédos metszetek sorozatáról készült felvételekre fektettünk. Területi összehasonlítás céljából azonos metszeten, a szomszédos nidopallium területén is megszámoltunk a jelölt neuronokat. A keretbe esı neuronok számolása után a kapott adatokra Abercrombie-féle korrekciót alkalmaztunk, a metszetvastagságra és az átlagos részecske átmérıre vonatkozóan. A kapott értékek statisztikai elemzésére Wilcoxon-tesztet használtunk, amelyet SPSS 10.0 szoftver segítségével hajtottunk végre. Az így kapott adatok a neuronok térfogatsőrőségére utalnak, és nem a teljes populációméretet jelölik.

1.2. Posztembedding elektonmikroszkópos immuncitokémia

Négy db 2 hetes házicsirkét használtunk a vizsgálathoz. Az állatokat transzkardiálisan perfundáltuk 4% paraformaldehidet, valamint 1% glutáraldehidet tartalmazó 0.1 M PB oldattal. A MSt-ot tartalmazó agyterületet kimetszettük, egy órán keresztül 1% ozmium-oxiddal kezeltük, majd felszálló alkoholsorral és propilén-oxiddal víztelenítettük

és

Durcupánba

(Fluka)

37

ágyaztuk.

Ultramikrotom

segítségével

ultravékony metszeteket készítettünk, majd Formvar-hordozóhártyás egy lyukú nikkel gridre helyeztük. A posztembedding immuncitokémia során Somogyi és Hodgson (1985) kolloid arany módszere szerint jártunk el. A metszeteket elıször 1%-os perjódsavval (6 percen át) ozmium mentesítettük, majd 1%-os nátrium-metaperjodáttal (7 percen keresztül) kezeltük. Ezt követıen 1% ovalbumint tartalmazó PBS-oldattal kezeltük (30 percig), a nem specifikus immunreakció visszaszorítása végett. Ezután a metszeteket egérben termeltetett monoklonális anti-Glu antitesttel (Swant, Bellinzona, Switzerland;

1:1500

hígítás;

1%

NGS-t

tartalmazó

PBS-ben;

2

órán

át

szobahımérsékleten) és nyúlban termeltetett poliklonális anti-Asp antiszérummal kezeltük (Sigma, St. Lois, MO; 1:7000 hígítás; 1% NGS-t tartalmazó PBS-ben; 2 órán át szobahımérsékleten) kezeltük. Szekunder antitestként elıször kolloid arannyal konjugált anti-egér IgG-t használtunk (British Biocell; szemcseméret: 10 nm; 1:20 hígítás, 1 % BSA-t és 0.5 térfogat % Tween-20-at is tartalmazó 0.05 M Tris-HCl-ben; 20 percig szobahımérsékleten), majd kolloid arannyal konjugált anti-nyúl IgG-vel kezeltük a metszeteket (British Biocell; szemcseméret: 15 nm; 1:25 hígítás, 1 % BSA-t és 0.5 térfogat % Tween-20-at is tartalmazó 0.05 M Tris-HCl-ben; 20 percig szobahımérsékleten). Többszöri desztillált vizes mosás után a metszeteket uranilacetáttal és ólom-citráttal kontrasztoztuk. Kísérletünkben döntı fontossággal bírt annak bizonyítása, hogy a kísérleti körülményeink között az általunk használt mindkét antitest specifikusan és kizárólag a megfelelı epitópjával reagált. Ez a kérdés az elektronmikroszkópos vizsgálatunk során még kritikusabb volt. Az antitest specifikus kötıdésének és az immunreakció szelektivitásának bizonyítására Ottersen és munkatársai által bevezetett (Ottersen és mtsai 1992) ún. „szendvics módszert” használtuk. A teszt „szendvicseket” Prof. Ole Ottersen bocsájtotta rendelkezésünkre. A „szendvics” különféle aminosavat tartalmazó csíkokból állt, amelyben az egyes aminosav csíkokat agyszövet választotta el (Ottersen 1987). A teszt szendvicseken a vizsgált madár agyszövettel teljesen megegyezı módon hajtottuk végre az elektronmikroszkópos posztembedding immuncitokémiai reakciót. Megszámoltuk az egyes fehérjéket tartalmazó csíkok fölé esı arany szemcséket és a kapott értékeket db/területegység formában fejeztük ki. Az elektronmikroszkópos felvételeken NIH Image szoftver segítségével mértük meg a terület nagyságát. Vizsgálatunkban manuálisan megszámoltuk a bizonyíthatóan

38

meghatározható szövetrész fölé (axonterminálisok szinapszissal, dendritek, neuronok sejttestei) esı aranyszemcsék számát, és összevetettük a „maradék” területre (gliasejtek, sejttöredékek, vérerek, stb.) esı szemcsék számával. A „háttér” meghatározására megszámoltuk az üres gyanta fölé területegységre esı szemcsék számát az adott metszeten. A jelölt és a nem jelölt szövetelemek összehasonlításánál a számolásba vett elemeket random választottuk ki, egy képzeletbeli háló segítségével, amit az elektronmikroszkópos felvételre fektettünk. Csak azokat az idegelemeket vettük figyelembe, amelyek a virtuális hálónk csomópontjaiba estek. Akkor tekintettük a kérdéses idegelemet jelzettnek, ha a területegységre esı aranyszemcsék száma az idegelemen

belül

szignifikánsan

meghaladta

az

üres

gyanta

felett

mért

szemcsesőrőséget. A mitochondriumok fölé esı szemcséket nem vettük figyelembe, mivel a mitochondriumok az Asp és a Glu metabolikus pool-jai, így bennük az általunk vizsgált aminosavak nem szelektív feldúsulása figyelhetı meg.

2. Az endogén kannabinoid rendszer szerepe a tanulásban és motivációban

2.1. A CB1-típusú kannabinoid receptorok hatása az alkohol által kiváltott dopaminerg jutalmazási válaszra az egér nucleus accumbens-ben

Mikrodialízis szonda

Az in vivo mikrodialízis módszer módot ad arra, hogy élı állatban kövessük a neurotranszmitterek felszabadulását. Az elaltatott állat agyába mintavevı szondát (’probe’) ültetünk, amelynek az a néhány milliméteres szakasza, amely a vizsgálni kívánt agyterületbe süllyed, féligáteresztı hártyából áll. Ezen keresztül

a

kis

molekulasúlyú

anyagok

a

koncentrációgradiensnek megfelelıen átléphetnek, így válnak mérhetıvé az érintett agyterület

extracelluláris

terébıl

származó

neurotranszmitterek,

illetve

azok

anyagcseretermékei. Koncentrációjuk mérésével információkat szerezhetünk az élı állat agyában zajló ingerület-átviteli folyamatokról. Vizsgálatunkban homozigóta CB1-/- (knock out) egereket hasonlítottunk össze homozigóta CB1+/+ (vad típusú) egerekkel, melyeket a Nathan Kline Institute

39

(Orangeburg, NY, USA) saját állatházában tenyésztettünk ki, Dr. Andreas Zimmer (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) által rendelkezésünkre bocsájtott CB1+/- heterozigóta egerekbıl. Az egerek genotípusos meghatározását Dr. Mariko Saito és Mr. Ratnakumar Yalamanchili (Nathan Kline Institute) végezték. A vizsgálathoz kizárólag hím egereket használtunk, hogy az ösztrogénnek a nemi ciklussal összefüggı, és a mikrodializátumokból mérhetı DA szintre gyakorolt potenciális hatását kizárjuk. A vizsgálathoz használt egereket ketamin (100 mg/ttkg i.p.) és xylazin (10 mg/ttkg i.p.) keverékével elaltattuk, majd sztereotaxikus eszközön rögzítettük. Franklin és Paxinos atlasza (1997) alapján a felkeresni kívánt agyterületnek, a Ac-nek a megfelelı koordináták (anterioposterior: + 1,3 mm a bregmától; mediolateralisan: + 0,9 mm a középvonaltól) szerint lyukat fúrtunk a koponyába; átlyukasztottuk a kemény agyburkot, majd a mintavevı szonda (’probe’) vezetıkanüljét (’guide cannula’, CMA/7 guide, CMA Microdialysis, North Chelmsford, MA, USA) a megfelelı mélységi koordináta (- 5,2 mm a koponyafelszíntıl) szerint bevezettük az állat bal Ac-ébe. Az apparátust ezután - Olive és munkatársai által leírt módszer szerint (Olive és mtsai 2000) - fogászati cementtel rögzítettük az állat fején (13. ábra, A, B). A mikrodialízis mintavevıt (CMA/7 probe, külsı átmérı: 0,24mm, 2 mm hosszú cuprofen membrán; CMA Microdialysis) 5-6 nappal a mőtétet követıen helyeztük be a vezetıkanülbe, majd rajta keresztül mikrodialízis pumpa segítségével (CMA/100) 0,5 µl/perc sebességgel egy éjszakán át steril mesterséges cerebrospinalis folyadékot áramoltattunk (ACSF = artificial cerebrospinal fluid; összetétel: 147 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 0,85 mM MgC12) (14. ábra). A kísérlet reggelén az áramlási sebességet 1 µl/perc-re emeltük fel. A dializátumokat 20 percenként győjtöttük és a minták DA-tartalmát a győjtés után azonnal meghatároztuk HPLC-ECD (elektrokémiai detekció) segítségével. Az intraperitoneális injekcióhoz az alkohol-oldatot 95 v/v %-os etanol (Pharmaco Products, Brookfield, CT, USA) fiziológiás sóoldatban való hígításával nyertük. A CB1-receptor antagonista rimonabant-ot (korábbi neve: SR 141716A; Sanofi Laboratories, Franciaország) elıször abszolút alkoholban oldottuk, majd az oldathoz Tween 80-at adtunk. Ezt követıen az alkoholt teljesen elpárologtattuk az oldatból, hogy végül 1 : 39 (Tween 80 : fiz.só) arányú oldatot kapjunk, amelyet intraperitoneálisan, 5 ml/ttkg térfogatban (3 mg/ttkg rimonabant koncentrációban) adtunk be az állatoknak.

40

13. ábra. A mikrodialízis vezetıkanül mőtéti úton történı beültetése agycélzó készülék segítségével. Az egér fejét altatás után a sztereotaxikus eszközön rögzítettük, majd a bır és a kemény agyburok feltárása után a vezetıkanült a megfelelı koordináták szerint bevezettük a nucleus accumbens területére. A szerkezetet végül mikrocsavarok és fogászati cement segítségével rögzítettük az állat fején. (saját felvételek)

14. Mintagyőjtı fiola

Kísérleti

ábra.

elrendezésünk az in vivo mikrodialízis egeret

során.

egy

plexiüveg

edényben

helyeztük

amelynek

felsı

rögzítettük

a

fiolát.

Az

Az

el,

részéhez

mintagyőjtı állat

fején

elhelyezett berendezés és a hozzá kapcsolódó csövek az állatot nem gátolták a szabad mozgásban. folyadékot

A

dializáló

(mesterséges

cerebrospinális mikrodialízis

folyadék) pumpa

ára-

moltatta. (saját felvétel; az ábra nem az ezen kísérlethez használt

CB1-/-

egeret,

hanem egy FAAH-/- egeret Mikrodialízis pumpa

41

mutat)

A mikrodialízis probe pontos helyének megállapításához terminális anesztéziát

mpa

követıen az agyat eltávolítottuk, majd 4 %-os paraformaldehid-oldatban történı fixálást követıen 50 µm vastag vibratom metszeteket készítettünk. A metszeteket a szövettani analízishez krezilibolyával festettük meg. Az eredményeket csak akkor használtuk fel, ha a probe pozíciója megfelelı volt. A dializátumok DA-tartalmának meghatározására a mintákat a győjtés után azonnal elektrokémiai detektorhoz (Epsilon e5, Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN, USA) kapcsolt HPLC berendezésbe (C18 UniJet Microbore column, Bioanalytical Systems) injektáltuk. Az elektródát + 650 mV-ra állítottuk be. A mobil fázis 25 mM Na2HPO4, 50 mM Na-citrát, 27 µM Na2-EDTA, 2,2 mM 1-oktánszulfonsav nátrium só, 3% metanol (v/v) and 2,1% acetonitril kombinációjából (pH = 3,5) állt, melyet 0,1 ml/perc sebességgel áramoltattunk. A mikrodialízis adatok statisztikai elemzése varianciaanalízissel (General linear model repeated measures ANOVA) történt, melyhez SPSS 11.0 statisztikai programcsomagot használtunk. A statisztikai szignifikancia határát p > 0,05-nél húztuk meg.

2.2. CB1 kannabinoid receptor antagonista hatása a csirke passzív elhárító tanulására

A következı kísérletben azt vizsgáltuk, hogy az endogén kannabinoid rendszernek van-e szerepe az általunk használt tanulási modellben, a házicsirke passzív elhárító tanulásában. Ennek eldöntésére CB1 receptor antagonista rimonabant-tal kezeltük az állatokat a PAL különbözı fázisaiban és figyeltük a kezelés memóriára gyakorolt hatását. A kísérlet során összesen 90 db egy napos házicsirkét használtunk. Az állatokat párosával nyitott tetejő ketrecekbe helyeztük, majd a korábbiakban vázolt PAL lépései szerint jártunk el. Az elıkondicionálás során, a csípési kedv elısegítésére, három alkalommal desztillált vízbe mártott, fehér színő gyöngyöt kínáltunk minden állatnak. Azokat az állatokat, amelyek nem csíptek rá a gyöngyre legalább 2 alkalommal, kizártuk a vizsgálatból. A tanítást 90 perccel az elıkondicionálás után kezdtük. A kondicionálás során a csirkéknek egy fém drót végén lévı, 3mm átmérıjő króm gyöngyöt mutattunk, amelyet MeA-ba mártottunk. A kontroll csoport állatai egy külsıre

42

ugyanolyan, desztillált vízbe mártott gyöngyöt kaptak. Azokat az állatokat, amelyek 30 másodpercen belül nem csíptek rá a gyöngyre, kizártuk a kísérletbıl. A memória elıhívása (’recall’) 6 órával a tanítás után zajlott, amelynek során az állatokat ugyanolyan, csak száraz, króm gyönggyel teszteltük. Azokat az állatokat tekintettük „tanultnak”, amelyek ezt elkerülték. Két vizsgálatot végeztünk. Az elsı kísérletben azt vizsgáltuk, hogy az intraperitoneálisan adott CB1 antagonistának van-e hatása a tanulási vagy a memória elıhívási folyamatra. Ennek eldöntésére i.p. CB1 antagonista rimonabant-ot adtunk az állatoknak, 1 mg/ttkg dózisban (200 µl térfogatban, DMSO-ban oldva), 30 perccel a tanítás elıtt (1. kezelési csoport; N=10) ill. 30 perccel a memória elıhívása elıtt (2. kezelési csoport; N=10). A kontroll csoportot (N=10) csak a vivıanyaggal (DMSO) injektáltuk. A második kísérletet az elsı kísérlet eredményei alapján terveztük. Vizsgálataink alapján a rimonabant kizárólag a memória elıhívási fázisra volt hatással, így a második kísérletben kizárólag a ’recall’ elıtt adtunk rimonabant-ot, és a különféle dózisok által kiváltott hatásokat hasonlítottuk össze. A kontroll csoport (N=7) mellett három kezelési csoportot alakítottunk ki: az 1. csoport (N=7) 1 mg/ttkg, a 2. csoport (N=8) 0,1 mg/ttkg, a 3. csoport (N=8) 0,01 mg/ttkg dózisú rimonabant kezelésben részesült. Az eredmények kiértékeléséhez Fisher-féle exact tesztet használtunk, p < 0,05 szignifikancia-szinttel.

43

Eredmények 1. L-aszpartát és L-glutamát immunreaktív idegelemek eloszlása a házicsirke medialis striatumában és arcopalliumában

1.1. Glu és Asp kettıs fénymikroszkópos immunhisztokémia

Bár célunk nem egy átfogó, leíró jellegő vizsgálat volt, mégis fontos megemlítenünk, hogy a telencephalonban számos egyéb, általunk részletesen nem vizsgált agyterület is Asp immunpozitivitást mutatott. Kiemelkedıen sok jelölt sejtet és rostot találtunk a MSt-ban, a globus pallidus-ban, nucl. intrapeduncularisban, a nidopallium egyes területein és a hippocampus-ban. Erıs immunreakciót találtunk a fasciculus prosencephali lateralis rostjaiban, valamint sok vizuális mőködéssel összefüggı agyterületen (a tectofugalis látórendszer thalamus-beli átkapcsoló állomását képezı nucl. rotundus, az okulomotor magok, a járulékos látórendszer tagjai közé tartozó nucl. of the basal optic root, a tectum opticummal reciprok kapcsolatban lévı, valószínőleg az intratectalis kommunikációban fontos szerepet betöltı nucl. isthmi pars parvocellularis-ban. Az – érdeklıdésünk középpontjában lévı - arcopalliumban elsısorban közepes mérető (23-24 µm átmérıjő), kerekded sejttestek jelölıdtek (16. ábra, A-F). A proximalis dendritek jelölıdése az arcopallium jelölt sejtjeinél nem volt megfigyelhetı, míg számos magnocellularis területen (pl. pretectum, (16. ábra, G) oculomotoros magvak, globus pallidus) a proximalis dendritek erıs festıdése mintegy kirajzolta a neuronok poligonális jellegét. Az arcopallium jelölt neuronjainak többsége kettıs jelölést mutatott; ezekben Asp és Glu immunpozitivitás egyaránt megfigyelhetı volt. A jelölt sejtek 15,0 ± 1,3 %-a (N = 6) kizárólag Asp-pozitivitást mutatott, míg a kizárólag Glu-immunpozitív sejtek aránya mindössze 1,4 ± 0,4 % volt (N=7) (15. ábra). Referencia területnek a szomszédos nidopalliumot használtuk. A nidopallium területén szignifikánsan kevesebb (p < 0,05) neuron mutatott kizárólag Asp-immunpozitivitást (5,3 ± 0,8 %; N = 6).

44

15. ábra. L-aszpartát (Asp) ill.

L-glutamát

immunpozitív

(Glu) neuronok

százalékos aránya a teljes jelzett (Asp-pozitív, ill. Glu83,6 % kettısen jelölt

94,1 % kettısen jelölt

pozitív)

sejtpopulációra

vonatkoztatva.

A

jelzett

neuronok többsége kettıs immunpozitivitást mutatott. Az arcopalliumban a jelzett neuronok 15%-a kizárólag Asp-pozitív volt, míg 1,4%-uk csak Glu-immunpozitivitást mutatott (N=7). Ezzel szemben, a szomszédos nidopallium területén a kizárólag Asp-pozitív neuronok aránya csupán 5,3% (N=6).

45

16. ábra. A-F: Konfokális mikroszkóppal készített felvételek a házicsirke arcopalliumában található Asp-immunpozitív (A, D), Glu-immunpozitív (B, E), valamint mindkét aminosavra pozitív (C, F) idegelemekrıl. Az A és a D ábrán az Asp+ neuronok zöld színben, míg a B és E ábrán a Glu+ neuronok piros színben jelennek meg. Amennyiben a két aminosav kolokalizációja figyelhetı meg, akkor a sejt narancssága színben látszik (kék nyilak). Az ábrán a fehér nyilak olyan neuronokra mutatnak, amelyek kizárólag Asp-immunpozitivitást mutatnak, míg a kék nyilak a kettısen jelölt sejteket emelik ki. A legtöbb neuron kettısen jelzett, ám egy jelentıs rész kizárólag Asp-immunpozitivitást mutat. G: A pretectum Asp-pozitív idegelemeirıl készült konfokális mikroszkópos felvétel. A képen jól látható a principális dendritek jelölıdése. H: Asp-immunpozitív idegelemek a csirke medialis striatumában. A nyilak Asp+ poligonális ill. kerekded sejttestekre mutatnak. Lépték = 50 µm.

46

Az arcopalliumon belül az Asp-pozitív neuronok egyenlıtlen eloszlását figyeltük meg. A posterior amygdaloid pallium (PoA) neuronjainak kb. 20%-a mutatott Asp-immunpozitivitást, míg az arcopallium egyéb területein a jelölt sejtek százalékos aránya 25% és 42% között mozgott (1. táblázat). A legnagyobb arányban a dorsalis arcopallium területén találtunk Asp-pozitív neuronokat; ezen az agyterületen a neuronok 41,6%-ában találtunk immunjelzést.

1. táblázat. Asp-pozitív neuronok térfogategységre vonatkoztatott sőrősége a házicsirke arcopalliumának és posterior pallial amygdalájának (PoA) egyes alrégióiban. Asp-pozitív sejtek

Agyterület 3

3

Asp-pozitív sejtek

Sejtek száma / mm

száma / mm

aránya % / összes sejt

AA

6852,2

1945,6

28,4

AD

5572,2

2317,8

41,6

AM

5163,3

1315,6

25,5

Av(PoA)

7643,3

1595,6

20,9

Ap(PoA)

8307,8

1712,2

20,6

A térfogategységre (mm3) esı teljes sejtsőrőséget Nissl-festett metszeteken, míg az Asp-pozitív sejtek sőrőségét anti-Asp antitesttel kezelt, fluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgált vibratom metszeteken számoltuk. A neuronok számolását egy virtuális mérıkeret segítségével végeztük, amelyet a vizsgált agyterületrıl származó számos, egymással nem szomszédos metszetek sorozatáról készült felvételekre fektettünk. A keretbe esı neuronok számolása után a kapott adatokra Abercrombie-féle korrekciót alkalmaztunk, a metszetvastagságra és az átlagos részecske átmérıre vonatkozóan. AA = anterior arcopallium, AD = dorsalis arcopallium, AM = medialis arcopallium, Av (PoA) = posterior pallial amygdala (korábbi nevén: ventralis archistriatum), Ap(PoA) = posterior pallial amygdala (korábbi nevén: posterior archistriatum).

1.2. Posztembedding elektronmikroszkópos immuncitokémia

A ’teszt szendvics’ alkalmazása során egyértelmően bizonyítást nyert, hogy kísérleti körülményeink között az általunk használt Asp és Glu antitest specifikusan az adott aminosavat jelöli (17. ábra). Az Asp elleni antitest egy nagyságrenddel erısebb jelölést mutatott az Asp-ot tartalmazó csíkon, mint a Glu-t tartalmazó csíkon, míg egyik

47

antitest sem mutatott feldúsulást az elválasztó, szabad aminosavat nem tartalmazó agyszöveti részen (2. táblázat).

2. táblázat. Kolloid aranyszemcsék eloszlása a „teszt szendvics” egyes aminosavakkal átitatott szövet-homogenizátum sávjain Asp és Glu posztembedding immuncitokémiai reakciót követıen. Aminosav

Asp-hoz kapcsolt

Glu-hoz kapcsolt 2

aranyszemcsék száma / µm

aranyszemcsék száma / µm2

GABA

15,1

2,2

L-glutamát (Glu)

2,2

201,1

taurin

5,8

6,7

glicin

6,4

3,4

üres

6,4

4,2

L-aszpartát (Asp)

76,4

3,3

glutamin

5,1

5,6

A szemcsesőrőségre vonatkozó adatokat 25 elektronmikroszkópos felvétel elemzésével nyertük, összesen 947 µm2 nagyságú területrıl.

48

17. ábra. A-E: Az Asp ill. Glu posztembedding immunjelzés szelektivitásának vizsgálatára szolgáló teszt „szendvics”. Az E ábra egy áttekintı képen mutatja be a teszt szendvics felépítését: az egyes aminosavakkal elıkezelt homogenizátumokat - amelyek képen elektrondenz foltokként jelennek meg – intakt agyszövetbıl készült csíkok választják el egymástól. A: Asp-tartalmú folt, anti-Asp antitesttel kezelve, a kísérleti rendszerünk szerint. (15 nm átmérıjő aranyszemcsék). B: Glu-tartalmú folt, anti-Asp antiszérummal kezelve, a kísérleti protokollunk szerint (15 nm átmérıjő aranyszemcsék). C: Glu-tartalmú foltok, anti-Glu antitesttel kezelve (10 nm átmérıjő aranyszemcsék), D: Asp-tartalmú foltok, anti-Glu antitesttel kezelve (10 nm átmérıjő aranyszemcsék). Lépték = 200 nm.

Az általunk használt posztembedding immuncitokémiai módszer lehetıvé tette az Asp és Glu elektronmikroszkópos szinten történı együttes vizsgálatát, mivel a 10, ill.

49

15 nm átmérıjő aranyszemcsék egymástól jól elkülöníthetıek voltak, még abban az esetben is, amikor a két markert szimultán használtuk, ugyanazon a metszeten. Az Asp és a Glu esetében is egyértelmő feldúsulás volt megfigyelhetı az axonterminálisokban, míg a dendritekben csak kismértékő feldúsulást láttunk. A sejttestek jelölıdésének mértéke csak alig haladta meg a hátterét (3. táblázat).

3. táblázat. Asp- ill. Glu immunjelzéshez kapcsolódó relatív szemcsesőrőség a csirke medialis striatum idegelemei felett. Axonterminális / háttér

Dendrit / háttér

Sejttest / háttér

3,37

1,85

1,38

3,48

1,99

1,1

Asp-hoz kötıdı aranyszemcsék Glu-hoz kötıdı aranyszemcsék

Az adatokat 4 csirke agyából származó 82 elektronmikroszkópos felvétel elemzésével nyertük, összesen 626,35 µm2 nagyságú területrıl.

Az MSt területén alkalmazott egyszeres Asp-immuncitokémia során Asppozitivitást olyan axonterminálisokban találtunk, amelyek kör alakú vezikulumokat tartalmaztak és aszimmetrikus szinapszisokat hoztak létre (18. ábra, A-D). A megfigyelt Asp-pozitív terminálisok kölönféle típusú szinapszisokhoz tartoztak: axospinosus (18. ábra, A, B), axoszomatikus (18. ábra, C) és axodendritikus (18. ábra, D) típushoz. A kolloid aranyszemcsék gyakran a szinaptikus vezikulumok felett helyezkedtek el. Általános jelenség volt a mitokondriumok erıs jelzettsége (18. ábra, B). Asp jelölés dendritekben is megtalálható volt (18. ábra, D, E). Néhány esetben megfigyeltünk olyan perikarionokat, amelyek kifejezetten erıs jelzést mutattak (18. ábra, G).

50

18. ábra. Elektronmikroszkópos felvételek a házicsirke medialis striatumából Aspposztembedding immuncitokémiai reakciót követıen. Az immunpozitivitást a kolloid arany szemcsék feldúsulása jelzi. A: Kettıs aszimmetrikus axodendritikus szinapszist (nyilak) képezı Asp+ axonterminális (at) kerek szinaptikus vezikulumokkal. ds = dendrittüske (dendritic spine). B: Egy Asp-immunpozitív axon terminális (at) hosszú, aszimmetrikus szinapszist (nyilak) képez egy dendrittüskével (ds). A környezı mitokondriumok (mt) felett is megfigyelhetı az aranyszemcsék dúsulása. C: Szinaptikus vezikulumokkal teli, Asp+ varikozitás, amely

51

aszimmetrikus szinapszist (nyilak) alkot egy durvaszemcsés endoplazmatikus retikulumot (rer) tartalmazó perikarionnal. Az endoplazmatikus retikulum ciszternáiban is megtalálhatók az Asphoz kapcsolt aranyszemcsék. Ezzel szemben a képen – a bal oldalon – található másik perikarionban csak elhanyagolható mennyiségő (háttér) aranyszemcse található. D, E: Erısen jelzett dendritek (d). Az E jelzéső képen bemutatott dendrit egy aszimmetrikus axodendritikus szinapszis kialakításában vesz részt. F: Hosszú, megnyúlt axonterminális (at), amely egy dendrittel (d) képez aszimmetrikus szinapszist. G: Erısen jelzett, hosszúkás sejttest (*). Lépték = 200 nm.

Kettıs immunjelölést használva megfigyelhetı volt, hogy a Glu olyan terminálisokban található meg, amelyek aszimmetrikus szinapszist hoznak létre. Ez összhangban állt a munkacsoport korábbi megfigyelésével (Csillag és mtsai 1997). Általánosságban elmondható, hogy a Glu és az Asp axonterminálisokban való megjelenése hasonló volt és a legtöbb jelzett terminális kettıs jelölést mutatott. Ezen felül egy jelentıs százaléka a jelölt végzıdéseknek kizárólag Asp-immunjelölést tartalmazott (19. ábra, B). Kizárólag Asp-immunreaktivitást mutató dendritek is megfigyelhetıek voltak (19. ábra, C). A szövetelemek véletlenszerő számlálása során (a mitokondriumok feletti feldúsulás figyelmen kívül hagyása mellett) az összes axonterminális 17%-a, a dendritek 26%-a, ill. a sejttestek 7%-a mutatott kizárólag Asppozitivitást (4. táblázat).

52

19. ábra. Elektronmikroszkópos felvételek a csirke medialis striatumából kettıs Asp- (nagyobb, 15 nm átmérıjő szemcsék) és Glu (kisebb, 10 nm átmérıjő szemcsék) posztembedding immuncitokémiai reakciót követıen. A: Egy dendittüskével (ds) aszimmetrikus szinapszist (nyilak)

alkotó

axonterminális,

szinaptikus

vezikulumokkal,

amelyben

Glu-és

Asp-

immunreaktivitás egyaránt megfigyelhetı. A kisebb (10 nm átmérıjő) szemcséket az üres nyílhegyek jelölik. B: Axodendritikus, aszimmetrikus szinapszist képezı axonterminális, melyben kizárólag a nagyobb, Asp-immunreaktivitáshoz kapcsolt 15 nm átmérıjő aranyszemcsék figyelhetık meg. A kisebb, 10 nm átmérıjő, Glu-immunreaktivitást jelzı szemcséket a környezı struktúrákban találhatunk (üres nyílhegyek). d = dendrit, mt = mitokondrium. C: Asp-immunpozitivitást mutató dendrit (d). Glu-hoz kapcsolt aranyszemcsék nem láthatók a dendrit felett, de megtalálhatóak a szomszédos mitokondriumban (mt; üres

53

nyílhegyek). D: Az A ábrán bemutatott axonterminális felnagyított képe, amelyen jól elkülöníthetıek a kétféle mérető aranyszemcsék. A 10 nm átmérıjő szemcséket üres nyílhegyekkel jelöltük. ds = dendrittüske. Lépték = 200 nm (A-C) ill. 100 nm a D ábrán.

4. táblázat. Asp- ill. Glu-immunreaktív idegelemek eloszlása a csirke medialis striatumában, posztembedding elektonmikroszkópos immuncitokémiai vizsgálat során. Kizárólag Asp+

Kizárólag Glu+

Kettısen jelölt

Jelöletlen

idegelemek

idegelemek

idegelemek

idegelemek

száma

száma

axonterminális

15

9

18

48

dendrit

27

3

14

60

sejttest

2

0

7

19

A táblázatban található adatokat 39 véletlenszerően kiválasztott elektronmikroszkópos felvétel (20000 x nagyítású) elemzésével nyertük. A felvételre egy virtuális rácsot helyeztünk, és a számolás során a rács metszéspontjaiba esı elemeket vettük figyelembe. A mitokondriumok fölé esı szemcséket nem vettük bele a számolásba.

2. Az endogén kannabinoid rendszer szerepe a tanulásban és motivációban

2.1. A CB1-típusú kannabinoid receptorok hatása az alkohol által kiváltott dopaminerg jutalmazási válaszra az egér nucleus accumbens-ben

A szövettani vizsgálatok igazolták, hogy a mikrodialízises mintavétel elsısorban a Ac core régiójából történt (20. ábra). Az Ac-bıl származó dializátumokból mért DA alap szintje a CB1+/+ hím egerekben 1,62 ± 0,22, a CB1 -/- egerekben 1,5 ± 0,22 nM volt (átlag ± SEM). Intraperitoneálisan adott alkohol injekció hatására (1,5 g/ttkg) a dializátumokban a DA koncentrációja szignifikánsan nıtt a CB1+/+ egerekben, míg a CB1-/- egerekbıl származó mintákban nem volt változás (p < 0,001) (21. ábra, A).

54

20.

ábra.

A

mikrodialízis

mintavevı

szondáink (probe) elhelyezkedésének sémás rajza. Színes vonalak jelölik a probe aktív régióját. A probe-ok az egér ventralis striatumából,

elsısorban

a

nucleus

accumbens core régiójáról győjtötték a mintákat. CPu = caudato-putamen, VL = ventriculus lateralis, CA = commissura anterior.

1 mm

Amennyiben az egereket 40 perccel az alkoholkezelés (1,5 g/ttkg) elıtt CB1 antagonista rimonabant-tal (3 mg/ttkg) kezeltük, a CB1+/+ egerekben sem figyelhettünk meg alkohol hatására DA felszabadulást. (21. ábra, B).

55

21. ábra. Alkohol hatása

Dopamin (nM)

A CB1+/+ CB1-/-

a DA felszabadulásra a

***

nucl.

accumbensben,

CB1+/+ Fiz.só

EtOH

ill.

egerekben. A: Az egerek fiziológiás sóoldat, majd etanol (EtOH; 1,5 g/ttkg) i.p.

injekciót

miközben

a

kaptak, kezelés

hatását in vivo mikro-

Idı (perc)

dialízis

B

segítségével

vizsgáltuk.

CB1+/+ CB1-/Dopamin (nM)

CB1-/-

hatására

Alkohol szignifikánsan

nıtt a CB1+/+ egerekbıl Vivıanyag RB

származó

EtOH

dializátumok-

ban a DA koncentrációja, míg a CB1-/- egerekben szignifikáns

emelkedés

nem volt megfigyelhetı. Idı (perc)

Az adatpontok a mért DA értékek átlagát és az ahhoz tartozó standard hibát (± SEM) mutatják. ■ CB1+/+ egerekbıl származó adatok (N = 6); ▲ CB1–/– egerekbıl származó adatok (N = 6). B: Az egereket a vivıanyag, mint kontroll, beinjektálása után, 40 perccel az alkoholkezelést (1,5 g/ttkg i.p.) megelızıen, CB1 receptor antagonista rimonabant-tal kezeltük (RB) (3 mg/ttkg). A rimonabant gátolta a vad típusú egerekben az alkohol által kiváltott DA-választ ■ CB1+/+ egerekbıl származó adatok (N = 6); ▲ CB1–/– egerekbıl származó adatok (N = 3). *** p < 0.001 (GLM repeated measures ANOVA).

2.2. CB1 kannabinoid receptor antagonista hatása a csirke passzív elhárító tanulására

Az elsı kísérletben a két kezelési csoport közül csak a második csoportban találtunk szignifikáns különbséget a tanulásban a kontrollcsoporthoz képest (22. ábra). Az elsı kezelési csoport összes állata, amelyek 30 perccel a tanítás elıtt kapták a rimonabant injekciót, sikeresen teljesítették a passzív ízelkerüléses tesztet, azaz a

56

memória elıhívási fázisban elkerülték a vízbe mártott króm gyöngyöt. Ezzel szemben a második kezelési csoportban, ahol az állatok az elıhívási fázis elıtt 30 perccel kapták a rimonabant injekciót, a csirkék többsége (60%-a) a tesztelés során rácsípett a gyöngyre, tehát a vizsgálat szempontjából nem tekinthetı tanultnak (Fisher-féle exact teszt, p < 0,05).

1. csoport RB tanítás elıtt

Tanult állatok aránya (%)

kontroll

* 2. csoport RB recall elıtt

Kezelési csoportok

22. ábra. CB1 antagonista rimonabant hatása a házicsirke passzív elhárító tanulására, a tanulás különbözı fázisaiban. Az elsı kezelési csoport állatait (N = 10) a tanítás elıtt 30 perccel, a második kezelési csoport (N = 10) állatait a memória elıhívási fázisa (’recall’) elıtt 30 perccel kezeltük i.p. CB1 antagonista rimonabant-tal, 1 mg/ttkg dózisban. A kontroll csoport egyedeit csak vivıanyaggal injektáltuk. Az averzív stimulus elıtt 30 perccel adott CB1-antagonistának nem volt hatása a tanulásra. Ezzel szemben, ha a rimonabant-ot a recall elıtt 30 perccel adtuk, szignifikánsan kevesebb csirke kerülte el a kellemetlen ízélményhez kapcsolódó gyöngyöt, azaz a retenció átlagos szintje csökkent. (Fisher exact teszt, * p < 0.05). RB = rimonabant.

A második kísérletben az elızıekben megfigyelt hatás, a ’recall’ fázis elıtt adott rimonabant amnéziát okozó hatásának dózisfüggıségét vizsgáltuk. Míg a 0,01 mg/ttkg dózisnak nem volt hatása a tanulásra, a 0,1 mg/ttkg és az 1 mg/ttkg dózisok szignifikáns hatással voltak a passzív ízelkerüléses tanulásra (Fisher-féle exact teszt, p < 0,05) (23. ábra).

57

kontroll Tanult állatok aránya (%)

0,01 mg/ttkg

*

*

0,1 mg/ttkg 1 mg/ttkg

Kezelési csoportok

23. ábra. Különbözı dózisokban adagolt CB1-antagonista rimonabant hatása a házicsirke passzív elhárító tanulásának memória elıhívási (’recall’) fázisára. Az állatokat a ’recall’ elıtt 30 perccel kezeltük rimonabant-tal, a következı dózisokban: 1 mg/ttkg (N = 7), 1,0 mg/ttkg (N = 8) és 0,01 mg/ttkg (N = 7). A kontroll csoport egyedeit csak vivıanyaggal injektáltuk. Míg a 0,1 mg/ttkg és 1 mg/ttkg dózisú rimonabant-nak szignifikáns hatása volt a memóriára, ez a hatás a 0,01 mg/ttkg dózisnál nem volt megfigyelhetı. (Fisher Exact teszt, * p < 0.05).

58

Megbeszélés 1. L-aszpartát és L-glutamát immunreaktív idegelemek eloszlása a házicsirke medialis striatumában és arcopalliumában

Módszertani megfontolások

A Glu és az Asp nemcsak neurotranszmitterként van jelen a központi idegrendszerben, hanem aktív részesei a sejtek anyagcsere-folyamatainak, így a fixált szöveten immuncitokémiai eljárással kimutatott Asp és Glu a neurotranszmitter-pool-t és a metabolikus-pool-t egyaránt jelöli (Ottersen és Storm-Mathisen 1985). Az Asp és a Glu

fénymikroszkópos

immunhisztokémiával

való

kimutathatósága

viszont

mindenképpen a feldúsulásra utal az adott aminosavra immunreaktív neuronban, amely valószínősíti az Asp. Ill. Glu fokozott felhasználását és speciális jelentıségét. Az elektronmikroszkópos szinten az axonterminálisokban ill. a szinaptikus vezikulumoknál észlelt immunreaktivitás arra utal, hogy ezekben a neuronokban az Asp funkcionálhat neurotranszmitterként.

Ehhez

hasonló

elektronmikroszkópos

immuncitokémiai

módszerekkel vizsgálták a Glu neurotranszmitter jellegét korábbi kísérletekben (Somogyi és mtsai 1986, Ottersen 1989).

Glutamát és aszpartát korábbi vizsgálatokban

A

Glu

a

kortikostriatalis

és

a

thalamostriatalis

pályarendszer

fı

neurotranszmittere; az emlıs amygdala projekciós neuronjaiban is megtalálható (Kocsis és mtsai 2003). Az emlıs törzsdúcok neuronjairól kimutatták, hogy az excitátoros bemenetre 3 féle ionotróp Glu receptoron keresztül válaszolnak: az AMPA (L-amino-3hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionsav) típusú, az NMDA (N-metil-D-aszpartát) típusú, valamint a kainát típusú receptoron keresztül (Götz és mtsai 1997, Calabresi és mtsai 1998, Stefani és mtsai 1998). E receptorok jelenlétét számos madárfajban is igazolták (Cornil és mtsai 2000, Toledo és mtsai 2002a,b). A madár AMPA receptor mind a négy alegységének, valamint az NMDA receptor néhány alegységének a genetikai szerkezete is ismert (Ottinger és mtsai 1995, Paperna és mtsai 1996, Ravindranathan és mtsai 1996,

59

Wada és mtsai 2004). A Glu receptor alegységek eloszlására néhány madárfajban is vannak adatok (Reiner 2002, Wada és mtsai 2004), például a GluR1 receptor megtalálható az énekléssel kapcsolatos agyterületeken, beleértve a nucl. robustus arcopallialis területét is (Wada és mtsai 2004). Az ionotróp Glu receptorok egyes alegységeinek eloszlását galambokban részletesen leírták (Laverghetta és mtsai 2006). Ez utóbbi vizsgálat tényleges bizonyítékkal szolgál a Glu receptor immunpozitivitásra a striatum excitatorikus típusú, axodendritikus szinapszis alkotásában résztvevı dendritjeiben. Ismereteink szerint eddig még nem írtak le madarakban Asp-immunreaktív neuronokat ill. axon terminálisokat. Emlısökben viszont vannak adatok olyan Aspimmunpozitív idegelemekrıl, amelyek a Glu-pozitív struktúráktól egyértelmően elkülöníthetık (Frassoni és mtsai 1997). Frassoni és munkacsoportja patkány medialis thalamusát vizsgálva arra a meglepı felfedezésre jutott, hogy a kérdéses agyterületen az Asp-pozitív és a Glu-pozitív neuronok teljesen elkülönülnek; a két aminosav kolokalizációja szinte egyáltalán nem fordul elı. Másrészrıl, a két aminosav ilyen formájú elkülönülése egyáltalán nem jellemzı az emlısagyra. Gundersen és munkatársai patkány hippocampus-t vizsgálták kvantitatív elektronmikroszkópos immuncitokémiai módszerrel, és azt találták, hogy a Glu – ill. Asp-tartalmú terminálisok teljes mértékben átfedést mutatnak (Gundersen és mtsai 1998). A patkány neostriatumban relatíve kevés Asp-pozitív sejttestet írtak le; az Aspimmunoreaktivitást egyértelmően felerısítette a dopaminerg rendszer stimulációja (Petterson és mtsai 1996).

Petterson és munkacsoportja, morfológiai jellemzık és

kolokalizációs vizsgálatok eredményeire alapozva, azt a lehetıséget vetették fel, hogy a neostriatum specifikusan Asp jelölıdést mutató neuronjai vagy az NPY-t tartalmazó interneuronok csoportjába, vagy esetleg a közepes mérető, tüskés neuronok közé tartoznak, amelyekben GABA és Glu/Asp kolokalizáció figyelhetı meg. Ezzel szemben a vizsgálatukban az NPY és az Asp együttes elıfordulása csak kis százalékban (max. 10-20%) volt megfigyelhetı. A madár MSt-ban a közepes mérető, tüskés GABAerg neuronok SP-t vagy ENK-t tartalmaznak (Anderson és Reiner 1991), de az Asp jelenlétét ezekben a neuronokban ezidáig nem vizsgálták. Elképzelhetı, hogy az általunk

a

csirke

MSt-ában

megfigyelt

szórványos

Asp-pozitív

sejttestek

megfeleltethetıek a patkány – madár MSt-ával homológ - neostriatumában leírt hasonló

60

tulajdonsággal bíró sejteknek. Lehetséges, hogy az általunk leírt egyes Aspimmunpozitív dendritek a madár MSt-ban gyakran elıforduló tüske nélküli, GABA-t tartalmazó dendritekkel (Csillag és mtsai 1997) azonosak, felvetve ezzel a GABA-Asp kolokalizáció lehetıségét. Ilyesfajta kolokalizáció emlıs agyban már korábban bizonyítást nyert (Ottersen és Storm-Mathisen 1985, Gundersen és mtsai 2004).

Funkcionális jelentıség

A madáragy korábban ’archistriatalis komplexum’-nak nevezett területét az újonnan bevezetett nevezéktan szerint felosztották amygdaloid és egyéb alrégiókra (Reiner és mtsai 2004). Az amygdaloid területbe beletartozik a korábban ventralis és posterior archistriatum, amelyet az új nevezéktan posterior amygdaloid pallium (PoA) névvel illet. A PoA-MSt pálya az emlısök amygdaloaccumbens ill. amygdalostriatalis pályájának felel meg (Csillag és mtsai 1997), bár az arcopallium más alrégiói, mint pl. a dorsalis arcopallium is projiciál a MSt-ba (Davies és mtsai 1997). Az arcopallium/PoAMSt pálya a házicsirke passzív ízelkerüléses tanulásában fontos szerepet tölt be (Rose 1985, Csillag 1999). Ezen vizsgálatunk csak valószínősíti az arcopallium/PoA Asppozitív neuronjainak és az MSt Asp-pozitív terminálisainak kapcsolatát, ám direkt bizonyítékkal nem szolgál. Korábbi anterográd pályajelölési vizsgálatokból kiderült (Csillag és mtsai 1997), hogy a ventralis arcopallumból a MSt területére érkezı axonok excitatorikus típusú, aszimmetrikus szinapszisokban végzıdnek a MSt neuronjainak dendritjein, de ezek a terminálisok nem tartalmaznak Glu-ot, felvetve ezzel annak a lehetıségét, hogy egy Glu-tól különbözı excitatorikus aminosav szerepel ebben a rendszerben neurotranszmitterként. Jelen kutatás egyik célja ennek pontosabb feltárása, amelyhez

a

késıbbiekben

még

további

vizsgálatok,

pályakövetés

és

elektronmikroszkópos immuncitokémia kombinációjára lesz szükség. Az arcopallium kétoldali elektromos léziója gátolta a PAL-ban a memória kialakulását (Lowndes és Davies 1994). A MSt léziója a memória elıhívási fázisát gátolja (Gilbert és mtsai 1991), de a MSt a memória elıhívásában játszott kizárólagos szerepét késıbbi vizsgálatok nem erısítették meg. Izawa és munkatársai eredményei szerint a MSt inkább a memória kialakulásában, mintsem az emléknyom elıhívásában játszik fı szerepet (Izawa és mtsai 2002). A MSt caudalis részének kétoldali kémiai

61

léziója házicsirkében impulzív viselkedési választ okoz, ami arra utal, hogy a terület inkább a jutalom anticipációjában játszik szerepet (Izawa és mtsai 2003). Jelen kísérlet eredményei alapján feltehetı, hogy az Asp szerepet játszik a házicsirke

tanulással

és

memóriával

kapcsolatos

pályarendszereiben.

Az

arcopallium/PoA-MSt pálya fontos részét képezi a PAL-ban szerepet játszó IMMarcopallium/PoA-MSt pályarendszernek (Csillag 1999). Az a feltevés, hogy az Asp, mint lehetséges neurotranszmitter szerepel ebben a rendszerben, egy újszerő megközelítést jelenthet a korai adaptív tanulásban és motivációban szerepet játszó idegi folyamatok vizsgálatában.

2. Az endogén kannabinoid rendszer szerepe a tanulásban és motivációban

2.1. A CB1-típusú kannabinoid receptorok hatása az alkohol által kiváltott dopaminerg jutalmazási válaszra az egér nucleus accumbens-ben

Eredményeink egyértelmően arra utalnak, hogy a kannabinoid rendszernek jelentıs szerepe van az alkohol által a Ac-ben kiváltott DA-felszabadulás folyamatában. Míg a CB1+/+ egerekben i.p. etanol hatására a Ac-ben DA szabadult fel, a CB1-/egerekben az alkohol által kiváltott DA-felszabadulás teljesen hiányzott. Az általunk tapasztalthoz hasonló jelenséget írtak le a Ac-ben Mascia és munkatársai, akik a morfin DA-felszabadulásra gyakorolt hatását vizsgálták CB1+/+ és CB1-/- egerekben (Mascia és mtsai 1999). A morfin által kiváltott DA-válasz a CB1-/- egerek Ac-ében elmaradt, míg Soria és munkatársai (2005) a kokainra adott DA-válaszban nem találtak csökkenést CB1-/- egerekben a vad típushoz képest. Hipotézisük szerint az endogén kannabinoid rendszer meghatározó szerepet játszik a kokainfüggıség kialakulásában, de nem a Ac-ben tapasztalt akut DA-felszabadulás befolyásolása által, hanem attól eltérı agyi folyamatok segítségével. Szabó és munkatársai kimutatták, hogy kannabinoidok hatására a patkány striatumban és Ac-ben DA szabadul fel in vitro (Szabó és mtsai 1999). A D2-típusú DA receptorok aktivációjának hatására a striatumban anandamide felszabadulás mérhetı (Giuffrida és mtsai 1999). D2-receptor antagonistával történı krónikus kezelés hatására patkány striatumban nı a CB1 receptorok expressziója (Mailleux és Vanderhaeghen

62

1993). A fentiekbıl arra következtethetünk, hogy a mezolimbikus DAerg rendszer és az endogén kannabinoid rendszer egymással szoros kapcsolatban áll; a jutalmazásos tanuláshoz, ill. a viselkedés megerısítéséért felelıs DA-válaszhoz a CB1-típusú kannabinoid receptorok jelenléte szükséges. A két rendszer kapcsolatának alapja a D2 típusú DA receptorok és az anandamide posztszinaptikus interakciója lehet (Giuffrida és mtsai 1999). Megfigyelésünk összhangban áll a korábbi vizsgálatokkal, melyek az endogén kannabinoid rendszer szerepét feltételezik az alkohol idegrendszeri hatásának modulálásában (Arnone és mtsai 1997, Basavarajappa és mtsai 1998, Colombo és mtsai 1998, Basavarajappa és Hungund 1999a,b, Hungund és mtsai 2002). Rimonabant hatására C57BL/6 egértörzsben az állatok alkoholpreferenciája csökkent (Arnone és mtsai 1997). Ugyanezt a hatást patkányokban is megfigyelték (Colombo és mtsai 1998, Freedland és mtsai 2001). Kísérletünkben a szisztémásan adott CB1 antagonista rimonabant gátolta az alkohol által kiváltott DA-választ az egér Ac-ben. Ezt egybevetve a korábbi adatokkal megállapítható, hogy a kannabinoid rendszer gyógyszerekkel való modulálása befolyásolja az alkoholfüggıség kialakulását. A CB1 receptor terápiás célpontként való használata új utat jelenthet az alkoholizmus gyógyításában. Ennek vizsgálata napjaink széles körben kutatott témája (Colombo és mtsai 2007, Maccioni és mtsai 2010, Olive 2010).

2.2. CB1 kannabinoid receptor antagonista hatása a csirke passzív elhárító tanulására

Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a CB1 receptor antagonista rimonabant szisztémás alkalmazása dózisfüggıen gyengíti a memória kialakulását a házicsirke passzív elhárító tanulásában. Ez a hatás csak abban az esetben volt megfigyelhetı, ha a rimonabant-ot a memória elıhívási fázisa elıtt 30 perccel (vagyis a tanítás után 5,5 órával) adtuk. A tanítás elıtt 30 perccel adott rimonabant hatástalannak bizonyult. A hatás idıbelisége alapján figyelemre méltó, hogy a rimonabant a PAL során leírt molekuláris változások (12. o., 4. ábra) folyamatában a fehérjeszintézis második hullámával egy idıben fejti ki a memóriára gyakorolt gátló hatását.

63

Azon észleletünk, hogy a rimonabant a kondicionálás elıtt adva nem befolyásolja az emléknyom kialakulását, míg a memória elıhívási fázisa elıtt alkalmazva gátolja a memóriát, némileg magyarázattal szolgálhat arra vonatkozóan, hogy miért olyan ellentmondásosak a CB1 receptor tanulási folyamatokban betöltött szerepével kapcsolatos eredmények a különféle kísérleti rendszerekben. Az általunk alkalmazott PAL modellnek nagy elınye, hogy ebben a rendszerben a memória kialakulásának egyes fázisai idıben élesen elkülöníthetıek; a kondicionálás és a memória elıhívása is mindössze egy alkalomból áll, így a tanulás ideje jól behatárolható. A csirke modellünk további elınye, hogy a memória kialakulását egy passzív tevékenység, a csípéstıl való tartózkodás jelzi, míg a nem tanult állatok a memória elıhívási fázisában továbbra is rácsípnek az eléjük tartott gyöngyre. Ebben a kísérleti modellben az általunk tapasztalt memóriacsökkentı hatást nem lehet összetéveszteni a rimonabant éberségre, ill. általános aktivitásra gyakorolt potenciális negatív hatásával. Sıt, eredményeink egyértelmően azt mutatják, hogy az általunk alkalmazott koncentrációban szisztémásan adott rimonabant nem befolyásolja az állat csípési kedvét. Általánosságban elmondható, hogy az eddig vizsgált kísérletes modellek többségében a CB1 receptor antagonisták pozitívan hatottak a memória kialakulására, ill. konszolidációjára (Kobilo és mtsai 2007, Varvel és mtsai 2009). Egyes kísérleti rendszerekben viszont a rimonabant tanulást gátló hatását figyelték meg (Mansbach és mtsai 1996, Kishimoto és Kano 2006, Mikics és mtsai 2006). Fontos megemlítenünk, hogy saját kísérletünkben úgy tőnt, hogy a tanítás elıtt 30 perccel adott rimonabant pozitívan hat a memóriára, bár ez a hatás nem volt szignifikáns (22. ábra). A látszólag ellentmondásos eredmények arra utalnak, hogy a kannabinoid receptorok tanulásban betöltött szerepe nagyban függ a kísérleti rendszertıl: tanulás fajtájától, a tanulás mögött álló agyi pályarendszerek sajátosságaitól, valamint a kísérleti állat fajától és korától. Eredményeink arra utalnak, hogy az endogén kannabinoid rendszer vagy a memória konszolidációjának folyamatába avatkozik be, vagy az emléknyom elıhívására gyakorolt közvetlen hatásával játszik szerepet a csirke passzív elhárító tanulásában.

64

Következtetések •

Aszpartát immunreaktív területek az emlısagyhoz hasonlóan a madáragyban is megtalálhatók. Az aszpartát-immunpozitív agyterületeken glutamát is jelen van, és sejtszinten is a legtöbb agyterületen a két immunreakció teljes átfedést mutat. Ezzel szemben, az arcopalliumban fénymikroszkópos szinten megfigyelhetı az aszpartát- és a glutamát-immunpozitív neuronok részleges elkülönülése, ami az aszpartát speciális szerepére utal ezen az agyterületen.

•

Elektronmikroszkópos

posztembedding

immuncitokémiai

vizsgálatok

alapján megállapítható, hogy a csirkeagy medialis striatum ill. nucl. accumbens területén az aszimmetrikus (morfológiailag excitatórikus) szinapszist képezı axonterminálisokban specifikusan kimutatható aszpartát immunreaktivitás, esetenként glutamát immunreaktivitással kolokalizáltan. A fénymikroszkópos észleletekkel egybevetve feltételezhetı, hogy az emlıs amygdalostriatalis pályának megfelelı arcopallium/PoA-MSt kapcsolatban az aszpartát neurotranszmitterként vagy szignál-molekulaként szerepelhet. •

CB1 receptor hiányos egerekben, az akut alkoholkezelést követı dopamin felszabadulás a nucleus accumbens-ben elmarad, ami az endogén kannabinoid rendszer jutalmazásos tanulásban betöltött szerepére utal. Vadtípusú egerekben, CB1 antagonista rimonabant kezelést követıen a korábban megfigyelt alkohol-indukált dopamin felszabadulás nem tapasztalható, ami felveti a CB1 receptor, mint terápiás támadáspont lehetıségét az alkoholfüggıség kezelésében.

•

Az endogén kannabinoid rendszer szerepet játszik a csirke passzív elhárító tanulása során a memória kialakulásában. Szelektív CB1 receptor antagonista

a

memória

elıhívási

fázisa

elıtt

alkalmazva

koncentrációfüggıen gátolja a memória retenciót, ami arra utal, hogy a kannabinoid rendszer vagy a memória konszolidációjával összefüggı fehérjeszintézis-hullám folyamatába avatkozik be, vagy a CB1 receptor közvetlen hatást gyakorol az emléknyom elıhívására.

65

Összefoglalás Jelen dolgozat a striatum jutalmazásos tanulásban betöltött szerepének egyes kérdéseit emeli ki. Vizsgáltuk a házicsirke passzív ízelkerüléses tanulásában szerepet játszó striatalis pályarendszereket, valamint a jutalmazásos tanulás és az endogén kannabinoid rendszer kapcsolatát emlıs és madár modellrendszerben. A munka elsı részében az L-aszpartát (Asp) - mint feltételezett neurotranszmitter- a csirke passzív elhárító tanulásában szerepet játszó arcopallium - medialis striatum/nucl. accumbens (Ac) pálya mőködésében betöltött lehetséges szerepét vizsgáltuk, fény- és elektronmikroszkópos Asp és L-glutamát (Glu) immuncitokémia segítségével. Az arcopallium Asp és Glu immunreaktív neuronjait konfokális lézermikroszkóppal azonosítottuk. Noha mindkét transzmitter együttesen elıfordult az arcopalliális neuronok többségében, a csak Aspjelölt sejtek számaránya 14.99 % volt, szemben a szomszédos nidopallium hasonló sejtjeinek számarányával (5,34 %). Elektronmikroszkópos immuncitokémia alapján az Asp jelen van a medialis striatum/Ac kerek, üres vezikulákkal és aszimmetrikus junkcióval jellemezhetı axonterminálisaiban. A boutonok 80 %-a kettısen jelölıdött, míg a csak Asp-t ill. csak Glu-t tartalmazó végzıdések számaránya 15 ill. 5 % volt. Emellett a dendrit-profilok 23,8 %-a, valamint egyes perikarionok csak Asp-tal jelölıdtek, Glu-tal nem. Az eredmények arra utalnak, hogy az Asp sajátos, a Glu-étól különbözı, szerepet játszhat a madár tanulásában mőködı striatalis pályarendszerekben. A munka további részében a cannabinoid (CB1) receptoroknak az alkohollal kiváltott dopamin (DA) felszabadulásra kifejtett hatását vizsgáltuk, CB1 receptorgén-hiányos (CB1-/-) egereken. Az utóbbi állatokon elmarad az alkohol-indukált DA felszabadulás a Ac-ben, ellentétben a vad típusú állatokkal, ahol viszont a specifikus CB1 receptor antagonista hatású rimonabant vált ki ilyen hatást. Eredményeink alapján megállapítható, hogy a CB1 receptor rendszer fontos szerepet játszik az alkohol pozitív viselkedés-megerısítı hatásának szabályozásában. Ezután fiatal csirkében is megvizsgáltuk, hogyan hat a CB1 receptor antagonista rimonabant a memória kialakulására és konszolidációjára a passzív elhárító tanulás során. Rimonabant 1 mg/ttkg dózisban, szisztémásan adva, nem befolyásolja a tanulást 30 perccel kondicionálás elıtt, míg ugyanilyen kezelés a memória felidézése (recall) elıtt 30 perccel (tehát 5,5 órával a kondicionálást követıen) adva az állatok 60 %-ában gátolta a memória retencióját. A megfigyelt hatás dózisfüggést mutat. Eredményeink azt valószínősítik, hogy a CB1 receptorok a memória konszolidációjában mőködnek közre, legalábbis az adott tanulási paradigmában.

66

Abstract The present work focuses on reward-related issues of the avian and mammalian striatum. We investigated a striatal pathway instrumental in passive avoidance learning in dayold domestic chicks, and the role of the endocannabinoid system in reward-related behaviors in avian and mammalian systems. The putative role of L-aspartate (Asp) as a neurotransmitter in the arcopallial-medial striatal pathway - which is known to be involved in passive avoidance learning in domestic chicks - was investigated. Double immunocytochemistry against Asp and L-glutamate (Glu) was performed at both light and electron microscopic levels. Asp and Glu immunoreactive neurons in the arcopallium were identified and counted using the confocal laser scanning microscope. Although both transmitter amino acids were co-localized in the majority of labeled neurons of arcopallium, the percentage of single-labeled Asp immunopositive cells was 14.99%, as opposed to the percentage counted in the neighboring telencephalic region, nidopallium (5.34%). Immuno-electronmicroscopy confirmed that Asp was present in axon terminals in the medial striatum, with clear and round vesicles and asymmetric junctions. The majority of boutons (80%) were double labeled. Axon terminals single labeled against Asp or Glu as percent of total amounted to 15% or 5%, respectively. In addition, selected neuronal perikarya and 23.8% of all dendritic profiles appeared to be labeled specifically with Asp but not Glu. The results indicate that Asp may play a specific role (as distinct from that of Glu) in the intrinsic and extrinsic circuits instrumental in avian learning and memory. We evaluated the role of cannabinoid (CB1) receptors in acute alcohol-induced dopamine (DA) release in the nucleus accumbens (Ac), using mice that lack the CB1 receptor gene (CB1–/–). CB1–/– mice exhibited lack of alcohol-induced DA release in the Ac, as compared to wild-type mice. The acute alcohol-induced increase in DA in Ac dialysates in wildtype mice was completely abolished by pretreatment with the specific CB1 receptor antagonist rimonabant. These results strongly suggest that the CB1 receptor system plays an important role in regulating the positive reinforcing properties of alcohol. We investigated the effect of the CB1 receptor antagonist rimonabant upon the acquisition and consolidation of memory in young domestic chicks, using the passive avoidance paradigm. Systemic administration of rimonabant in a dose of 1 mg/bwkg 30 minutes before the training failed to affect learning, but a similar treatment 30 minutes before the recall (5.5 h after training) attenuated the retention in 60 % of animals. The observed effect was dose-dependent. Our results suggest that CB1-receptors have a mediating role in the consolidation of memory in the passive avoidance task in day-old chicks.

67

Irodalomjegyzék Abellán A, Medina L. (2009) Subdivisions and derivatives of the chicken subpallium based on expression of LIM and other regulatory genes and markers of neuron subpopulations during development. J Comp Neurol, 515 :465-501. Alonso-Ferrero ME, Paniagua MA, Mostany R, Pilar-Cuéllar F, Díez-Alarcia R, Pazos A, Fernández-López A. (2006) Cannabinoid system in the budgerigar brain. Brain Res, 1087: 105-13. Anderson KD, Reiner A. (1991) Striatonigral projection neurons: a retrograde labeling study of the percentages that contain substance P or enkephalin in pigeons. J Comp Neurol, 303: 658-673. Anokhin KV, Rose SPR. (1991) Learning-induced increase of immediate early gene messenger RNA in the chick forebrain. Eur J Neurosci, 3: 162–7. Aoki C, Fenstemaker S, Lubin M, Go CG. (1993) Nitric oxide synthase in the visual cortex of monocular monkeys as revealed by light and electron microscopic immunocytochemistry. Brain Res, 620: 97-113. Aoki N, Csillag A, Matsushima T. (2006) Localized lesions of arcopallium intermedium of the lateral forebrain caused a handling-cost aversion in the domestic chick performing a binary choice task. Eur J Neurosci, 24: 2314-26. Aoki E, Semba R, Kato K, Kashiwamata S. (1987) Purification of specific antibody against aspartate and immunocytochemical localization of aspatergic neurons in the rat brain. Neuroscience, 21:755-765. Aoki N, Izawa E, Yanagihara S, Matsushima T. (2003) Neural correlates of memorized associations and cued movements in archistriatum of the domestic chick. Eur J Neurosci, 17: 1935-1946. Arends JJ, Wild JM, Zeigler HP. (1988) Projections of the nucleus of the tractus solitarius in the pigeon (Columba livia). J Comp Neurol, 278: 405-429. Arnone M, Maruani J, Chaperon F, Thiebot M, Poncelet M, Soubrie P, Le Fur G. (1997) Selective inhibition of sucrose and ethanol intake by SR 141716, an antagonist of central cannabinoid (CB1) receptors. Psychopharmacology, 132: 104–106.

68

Arriza JL, Fairman WA, Wadiche JI, Murdoch GH, Kavanaugh ME Amara SG. (1994) Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex. J Neurosci, 14: 5559-5569. Atoji Y, Wild M. (2004) Fiber connections of the hippocampal formation and septum and subdivisions of the hippocampal formation in the pigeon as revealed by tract tracing and kainic acid lesions. J Comp Neurol, 475: 426-461. Atoji Y, Wild M, Yamamoto Y, Suzuki Y. (2002) Intratelencephalic connections of the hippocampus in pigeons (Columba livia). J Comp Neurol, 447: 177-199. Atoji Y, Saito S, Wild JM. (2006) Fiber connections of the compact division of the posterior pallial amygdala and lateral part of the bed nucleus of the stria terminalis in the pigeon (Columba livia). J Comp Neurol, 499: 161-82. Auclair N, Otani S, Soubrie P, Crepel F. (2000) Cannabinoids modulate synaptic strength and plasticity at glutamatergic synapses of rat prefrontal cortex pyramidal neurons. J Neurophysiol, 83: 3287–3293. Bailhache T, Balthazart J. (1993) The catecholamimnergic system of the quail brain: immunocytochemical

studies

of

dopamine-b-hydroxylase

and

tyrosine

hydroxylase. J Comp Neurol, 329: 230-256. Balcar VJ, Johnston GA. (1972) The structural specificity of the high affinity uptake of L-glutamate and L-aspartate by rat brain slices. J Neurochem, 19: 2657-2666. Bálint E, Csillag A. (2007) Nucleus accumbens subregions: hodological and immunohistochemical study in the domestic chick (Gallus domesticus). Cell Tissue Res, 327: 221-30. Basavarajappa BS, Cooper TB, Hungund BL. (1998) Chronic ethanol administration down-regulates cannabinoid receptors in mouse brain synaptic plasma membrane. Brain Res, 793: 212–218. Basavarajappa BS, Hungund BL. (1999a) Down-regulation of cannabinoid receptor agonist-stimulated [35S] GTPcS binding in synaptic plasma membrane from chronic ethanol exposed mouse. Brain Res, 815: 89–97. Basavarajappa BS, Hungund BL. (1999b) Chronic ethanol increases the cannabinoid receptor agonist, anandamide and its precursor N-arachidonyl phosphatidyl ethanolamine in SK-N-SH cells. J. Neurochem, 72: 522–528.

69

Basavarajappa BS, Saito M, Cooper TB, Hungund BL. (2000) Stimulation of cannabinoid receptor agonist 2-arachidonylglycerol by chronic ethanol and its modulation by specific neuromodulators in cerebellar granule neurons. Biochim Biophys Acta, 1535: 78–86. Baughman RW, Gilbert CD. (1980) Aspartate and glutamate as possible neurotransmitters of cells in layer 6 of the visual cortex. Nature, 287: 848-850. Beardsley PM, Thomas BF, McMahon LR. (2009) Cannabinoid CB1 receptor antagonists as potential pharmacotherapies for drug abuse disorders. Int Rev Psychiatry, 21: 134-42. Beitner-Johnson D, Guitart X, Nestler EJ. (1999) Dopaminergic brain reward regions of Lewis and Fischer rats display different levels of tyrosine hydroxylase and other morphine- and cocaine-regulated phosphoproteins. Brain Res, 561: 147–50. Bellomo M, Giuffrida R, Palmeri A, Sapienza S. (1998) Excitatory amino acids as neurotransmitters of corticostriatal projections: immunocytochemical evidence in the rat. Arch Ital Biol, 136: 215-223. Beltramo M, Stella N, Calignano A, Lin SY, Makriyannis A, Piomelli D. (1997) Functional role of high-affinity anandamide transport, as revealed by selective inhibition. Science, 277: 1094-7. Berk ML, Hawkin RF. (1985) Ascending projections of the mammillary region in the pigeon: emphasis on telencephalic connections. J Comp Neurol, 239: 330-40. Berridge KC, Robinson TE. (1998) What is the role of dopamine in reward: hedonic impact, reward learning, or incentive salience? Brain Res Brain Res Rev, 28: 309– 369 Bilkei-Gorzo A, Racz I, Valverde O, Otto M, Michel K, Sastre M, Zimmer A. (2005) Early age-related cognitive impairment in mice lacking cannabinoid CB1 receptors. Proc Natl Acad Sci USA, 102: 15670–15675. Black SC. (2004) Cannabinoid receptor antagonists and obesity. Curr Opin Investig Drugs, 5: 389–394. Bliss TV, Douglas RM, Errington ML, Lynch MA. (1986) Correlation between longterm potentiation and release of endogenous amino acids from dentate gyrus of anaesthetized rats. J Physiol, 377: 391-408.

70

Blum K, Cull JG, Braverman ER, Comings DE. (1996a) Reward deficiency syndrome. Am Sci, 84: 132–45. Blum K, Sheridan PJ, Wood RC, Braverman ER, Chen TJ, Cull JG, Comings DE. (1996b) The D2 dopamine receptor gene as a determinant of reward deficiency syndrome. J R Soc Med, 89: 396– 400. Brown AJ. (2007) Novel cannabinoid receptors Br J Pharmacol, 152: 567–575. Burchuladze R, Potter J, Rose SPR. (1990) Memory formation in the chick depends on membrane-bound protein kinase C. Brain Res, 535: 131–138. Burger PM, Hell J, Mehl E, Krasel C, Lottspeich F, Jahn R. (1991) GABA and glycine in synaptic vesicles: storage and transport characteristics. Neuron, 7: 287-293. Burke SR, Nadler JV. (1988) Regulation of glutamate and aspartate release from slices of the hippocampal CA1 area: effects of adenosine and baclofen. J Neurochem, 51: 1541-1551. Carai MA, Colombo G, Gessa GL. (2005) Rimonabant: the first therapeutically relevant cannabinoid antagonist. Life Sci, 77: 2339-50. Cardinal RN, Pennicott DR, Sugathapala CL, Robbins TW, Everitt BJ. (2001) Impulsive choice induced in rats by lesions of the nucleus accumbens core. Science, 292: 2499-501. Chait LD, Perry JL. (1992) Factors influencing self-administration of, and subjective response to, placebo marijuana. Behav Pharmacol, 3: 545-552. Chen JP, Paredes W, Li J, Smith D, Lowinson J, Gardner EL. (1990) Delta-9tetrahydrocannabinol produces naloxone-blockable enhancement of presynaptic basal dopamine efflux in nucleus accumbens of conscious, freely-moving rats as measured by intracerebral microdialysis. Psychopharmacology, 102: 156-162. Cherkin A. (1969) Kinetics of memory consolidation: role of amnestic treatment parameters. Proc Natl Acad Sci, USA, 63: 1094-1101. Colombo G, Agabio R, Fa M, Guano L, Lobina C, Loche A, Reali R, Gessa G. (1998) Reduction of voluntary ethanol intake inethanol-preferring sP rats by the cannabinoid antagonist SR-141716. Alcohol Alcohol, 33: 126–130. Colombo G, Serra S, Brunetti G, Gomez R, Melis S, Vacca G. (2002) Stimulation of voluntary ethanol intake by cannabinoid receptor agonists in ethanol-preferring sP rats. Psychopharmacol, 159: 181–187.

71

Colombo G, Orrù A, Lai P, Cabras C, Maccioni P, Rubio M, Gessa GL, Carai MA. (2007) The cannabinoid CB1 receptor antagonist, rimonabant, as a promising pharmacotherapy for alcohol dependence: preclinical evidence. Mol Neurobiol, 36: 102-12. Csillag A, Székely AD, Stewart MG. (1997) Synaptic terminals immunolabelled against glutamate in the lobus parolfactorius of domestic chicks (Gallus domesticus) in relation of afferents from the archistriatum. Brain Res, 750: 171-179. Csillag A. (1999) Striato-telencephalic and striato-tegmental circuits: relevance to learning in domestic chicks. Behav Brain Res, 98: 227-236. Clements MP, Bourne RC. (1996) Passive avoidance learning in the day old chick is modulated by GABAergic agents. Pharmacol Biochem Behav, 53: 629–634. Cravatt BF, Giang DK, Mayfield SP, Boger DL, Lerner RA, Gilula NB. (1996) Molecular characterization of an enzyme that degrades neuromodulatory fatty-acid amides. Nature, 384: 83–87. Curras MC, Dingledine R. (1992) Selectivity of amino acid transmitters acting at Nmethyl-D-aspartate

and

amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionate

receptors. Mol Pharmacol, 41: 520-526. Curtis DR, Watkins JC. (1960) The excitation and depression of spinal neurons by structurally related amino acids. J Neurochem, 6: 117-141. Daisley JN, Rose SPR. (1998) The effect of a passive avoidance task on the release of amino acids in vitro from the left IMHV of the day old chick. Biochem Trans, 22: 160S. Davies DC, Csillag A, Székely AD, Kabai P. (1997) Efferent connections of the domestic chick archistriatum: a Phaseolus lectin anterograde tracing study. J Comp Neurol, 389: 679-693. Delius JD, Perchard RJ, Emmerton J. (1976) Polarized light discrimination by pigeons and an electroretinographic correlate. J Comp Physiol Psychol, 90: 560-71. Deroche-Gamonet V, Belin D, Piazza PV. (2004) Evidence for addiction-like behavior in the rat. Science, 305: 1014–1017. Devane WA, Hanus L, Breuer A, Pertwee RG, Stevenson LA, Griffin G, Gibson D, Mandelbaum A, Etinger A, Mechoulam R. (1992) Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science, 258: 1946-9.

72

Di Chiara G, Imperato A. (1988) Drugs abused by humans preferentially increase synaptic dopamine concentrations in the mesolimbic system of freely moving rats. Proc Natl Acad Sci, USA, 85: 5274–5278. Di Chiara G, Morelli M, Consolo S. (1994) Modulatory functions of neurotransmitters in the striatum: ACh/dopamine/NMDA interactions. Trends Neurosci, 17: 228-33. Di Marzo V, Fontana A, Cadas H, Schinelli S, Cimino G, Schwartz JC, Piomelli D. (1994) Formation and inactivation of endogenous cannabinoid anandamide in central neurons. Nature, 372: 686-91. Ding L, Perkel DJ, Farries MA. (2003) Presynaptic depression of glutamatergic synaptic transmission by D1-like dopamine receptor activation in the avian basal ganglia. J Neurosci, 23: 6086-95. Ding L, Perkel DJ. (2004) Long-term potentiation in an avian basal ganglia nucleus essential for vocal learning. J Neurosci, 24: 488-94. Dinh TP, Carpenter D, Leslie FM, Freund TF, Katona I, Sensi SL, Kathuria S, Piomelli D. (2002) Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid inactivation. Proc Natl Acad Sci U S A, 99: 10819-24. Dubbeldam JL, De Boer-Visser AM, Bout RG. (1997) Organization and efferent connections of the archistriatum of the mallard, Anas platyrynchos: an anterograd pathway tracing study. J Comp Neurol, 389: 679-693. Everitt BJ, Robbins TW. (2000) Second-order schedules of drug reinforcement in rats and monkeys: measurement of reinforcing efficacy and drug-seeking behaviour. Psychopharmacology, 153: 17–30. Fagg GE, Foster AC. (1983) Amino acid neurotransmitters and their pathways in the mammalian central nervous system. Neuroscience, 9: 701-719. Faraci FM, Breese KR. (1993) Nitric oxide mediates vasodilatation in response to activation of N-methyl-D-aspartate receptors in brain. Circ Res, 72: 476-480. Farries MA, Perkel DJ. (2002) A telencephalic nucleus essential for song learning contains neurons with physiological characteristics of both striatum and globus pallidus. J Neurosci, 22: 3776-3787. Farries MA, Ding L, Perkel DJ. (2005) Evidence for "direct" and "indirect" pathways through the song system basal ganglia. J Comp Neurol, 484: 93-104.

73

Fernandez JR, Allison DB. (2004) Rimonabant Sanofi-Synthelabo. Curr Opin Investig Drugs, 5: 430–435. Fleck MW, Henze DA, Barrionuevo G, Palmer AM. (1993) Aspartate and glutamate mediate excitatory synaptic transmission in area CA1 of the hippocampus. J Neurosci, 13: 3944-3955. Flint RS, Rea MA, McBride WJ. (1981) In vitro release of endogenous amino acids from granule cell-, stellate cell-, and climbing fiber-deficient cerebella. J Neurochem, 37: 1425-1430. Frassoni C, Spreafico R, Bentivoglio M. (1997) Glutamate, aspartate and colocalization with calbindin in the medial thalamus. An immunohistochemical study in the rat. Exp Brain Res, 115: 95-104. Freedland CS, Sharpe AL, Samson HH, Porrino LJ. (2001) Effects of SR141716A on ethanol and sucrose self-administration. Alcohol Clin Exp Res, 25: 277–282. Freeman FM, Rose SPR. (1995) Two time windows of anisomycin-induced amnesia for passive avoidance training in the day old chick. Neurobiol Learn Mem, 63: 291–5. French ED. (1997) Delta9-tetrahydrocannabinol excites rat VTA dopamine neurons through activation of cannabinoid CB1 but not opioid receptors. Neurosci Lett, 226: 159-162. Freund TF, Katona I, Piomelli D. (2003) Role of endogenous cannabinoids in synaptic signaling. Physiol Rev, 83: 1017-66. Fykse EM, Iversen EG, Fonnum F. (1992) Inhibition of L-glutamate uptake into synaptic vesicles. Neurosci Lett, 135: 125-128. Gaetani S, Kaye WH, Cuomo V, Piomelli D. (2008) Role of endocannabinoids and their analogues in obesity and eating disorders. Eat Weight Disord, 13: e42-8. Gallate JE, Mallet PE, McGregor IS. (2004) Combined low dose treatment with opioid and cannabinoid receptor antagonists synergistically reduces the motivation to consume alcohol in rats. Psychopharmacology, 173: 210–216. Gallate JE, McGregor IS. (1999) The motivation for beer in rats: effects of ritanserin, naloxone and SR 141716. Psychopharmacology, 142: 302–308. Gallate JE, Saharov T, Mallet PE, McGregor IS. (1999) Increased motivation for beer in rats following administration of a cannabinoid CB1 receptor agonist. Eur J Pharmacol, 370: 233–240.

74

Gardner EL. (1997) Brain reward mechanisms. In: Lowinson JH, Ruiz P, Millman RB, Langrod JG, editors. Substance abuse: a comprehensive textbook, 3rd edn. Baltimore’ Williams & Wilkins; 1997. p. 51– 85. Gardner EL. (2005) Endocannabinoid signaling system and brain reward: emphasis on dopamine. Pharmacol Biochem Behav, 81: 263-284. Garthwaite J. (1991) Glutamate, nitric oxide and cell-cell signalling in the nervous system. Trends Neurosci, 14: 60-67. Gerber G, Randic M. (1989) Participation of excitatory amino acid receptors in the slow excitatory synaptic transmission in the rat spinal dorsal horn in vitro. Neurosci Lett, 106: 220-228. Gerber G, Cerne R, Randic M. (1991) Participation of excitatory amino acid receptors in the slow excitatory synaptic transmission in rat spinal dorsal horn. Brain Res, 561: 236-251. Gessa GL, Melis M, Muntoni AL, Diana M (1998) Cannabinoids activate mesolimbic dopamine neurons by an action on cannabinoid CB1 receeptors. Eur J Pharmacol, 341: 39-44. Gilbert BD, Patterson TA, Rose SPR. (1991) Dissociation of brain sites necessary for registration and storage of memory for a one-trial passive avoidance task in the chick. Behav Neurosci, 105: 553-561. Girault JA, Barbeito L, Spampinato U, Gozlan H, Glowinski J, Besson MJ. (1986) In vivo release of endogenous amino acids from the rat striatum: further evidence for a role of glutamate and aspartate in corticostriatal neurotransmission. J Neurochem, 47: 98-106. Giuffrida A, Parsons LH, Kerr TM, Rodriguez de Fonseca F, Navarro M, Piomelli D. (1999) Dopamine activation of endogenous cannabinoid signaling in dorsal striatum. Nat Neurosci, 2: 358–363. Goldberg SR. (1975) Stimuli associated with drug injections as events that control behavior. Pharmacol Rev, 27: 325–340. Goldberg SR, Kelleher RT, Goldberg DM. (1981) Fixed-ratio responding under secondorder schedules of food presentation or cocaine injection. J Pharmacol Exp Ther, 218: 271–281.

75

Goldberg SR, Kelleher RT, Morse WH. (1975) Second-order schedules of drug injection. Fed Proc, 34: 1771–1776. Goldberg SR, Spealman RD, Goldberg DM. (1981) Persistent behavior at high rates maintained by intravenous self-administration of nicotine. Science, 214: 573–575. Guitart X, Beitner-Johnson D, Marby DW, Kosten TA, Nestler EJ. (1992) Fischer and Lewis rat strains differ in basal levels of neurofilament proteins and in their regulation by chronic morphine in the mesolimbic dopamine system. Synapse, 12: 242– 53. Guitart X, Kogan JH, Berhow M, Terwilliger RZ, Aghajanian GK, Nestler EJ. (1993) Lewis

and

Fischer

rat

strains

display

differences

in

biochemical,

electrophysiological and behavioral parameters: studies in the nucleus accumbens and locus coeruleus of drug naive and morphine-treated animals. Brain Res, 611: 7– 17. Gundersen V, Danbolt NC, Ottersen OP, Storm-Mathisen J. (1993) Demonstration of glutamate/aspartate uptake activity in nerve endings by use of antibodies recognizing exogenous D-aspartate. Neuroscience, 57: 97-111. Gundersen V, Ottersen OP, Storm-Mathisen J. (1996) Selective excitatory amino acid uptake in glutamatergic nerve terminals and in glia in the rat striatum: quantitative electron microscopic immunocytochemistry of exogenous (D)-aspartate and endogenous glutamate and GABA. Eur J Neurosci, 8: 758-765. Gundersen V, Chaudhry FA, Bjaalle JG, Fonnum F, Ottersen OP, Storm-Mathisen J. (1998) Synaptic vesicular localization and exocytosis of L-aspartate in excitatory nerve terminals: a quantitative immunogold analysis in rat hippocampus. J Neurosci, 18: 6059-6070. Gundersen V, Storm-Mathisen J. (2000) Aspartate – Neurochemical evidence for transmitter role. In: Ottersen OP, Storm-Mathisen J. (Eds.) Handbook of Chemical Neuroanatomy 18. – Glutamate. Elsevier, North Holland, pp. 45-62. Gundersen V, Holten AT, Storm-Mathisen J. (2004) GABAergic synapses in hippocampus exocytose aspartate on to NMDA receptors: quantitative immunogold evidence for co-transmission. Mol Cell Neurosci, 26: 156-165. Hampson RE, Deadwyler SA. (1998) Role of cannabinoid receptors in memory storage. Neurobiol Dis, 5: 474–48

76

Herkenham M, Lynn AB, Little MD, Johnson MR, Melvin LS, de Costa BR, Rice KC. (1990) Cannabinoid receptor localization in brain. Proc Natl Acad Sci, USA, 87: 1932-6. Herkenham M, Lynn AB, De Costa BR, Richfield EK. (1994) Neuronal localization of cannabinoid receptor sin the basal ganglia of rat brain. Brain Res, 547: 267-274. Hoffman AF, Lupica CR. (2001) Direct actions of cannabinoids on synaptic transmission in the nucleus accumbens: a comparison with opioids. J Neurophysiol, 85: 72-83. Hillard CJ, Edgemond WS, Jarrahian A, Campbell WB. (1997) Accumulation of Narachidonoylethanolamine (anandamide) into cerebellar granule cells occurs via facilitated diffusion. J Neurochem, 69: 631–638. Hillard CJ, Manna S, Greenberg MJ, DiCamelli R, Ross RA, Stevenson LA, Murphy V, Pertwee RG, Campbell WB. (1999) Synthesis and characterization of potent and selective agonists of the neuronal cannabinoid receptor (CB1). J Pharmacol Exp Ther, 289: 1427-33. Hoffman AF, Oz M, Yang R, Lichtman AH, Lupica CR. (2007) Opposing actions of chronic δ9-tetrahydrocannabinol and cannabinoid antagonists on hippocampal long-term potentiation. Learn Mem, 14: 63–74. Holscher C, Rose SPR. (1993) Inhibiting synthesis of the putative retrograde messenger nitric oxide results in amnesia in a passive avoidance task in the chick. Brain Res, 619: 189–94. Horn G. (1985) Memory, imprinting and the brain. Oxford, UK: Oxford University Press. Hungund BL, Basavarajappa BS, Vadasz C, Kunos G, Rodriguez de Fonseca F, Colombo G, Serra S, Parsons L, Koob GF. (2002) Ethanol, endocannabinoids and cannabinoidergic signaling system. Alcohol Clin Exp Res, 26: 565–574. Ikemoto S. (2007) Dopamine reward circuitry: two projection systems from the ventral midbrain to the nucleus accumbens-olfactory tubercle complex. Brain Res Rev, 56: 27-78. Imperato A, Mulas A, and Di Chiara G. (1986) Nicotine preferentially stimulates dopamine release in the limbic system of freely moving rats. Eur J Pharmacol, 132: 337–338.

77

Izawa E, Zachar G, Aoki N, Koga K, Matsushima T. (2002) Lesions of the ventromedial basal ganglia impair the reinforcement but not the recall of memorized color discrimination in domestic chicks. Behav Brain Res, 136: 405-414. Izawa E, Zachar G, Yanagihara S, Matsushima T. (2003) Localized lesions of caudal part of lobus parolfactorius caused impulsive choice in the domestic chick: evolutionarily conserved function of ventral striatum. J Neurosci, 23: 1894-1902. Jarrett MM, Limebeer CL, Parker LA. (2005) Effect of delta9- tetrahydrocannabinol on sucrose palatability as measured by the taste reactivity test. Physiol Behav, 86: 475–479. Jarrett MM, Scantlebury J, Parker LA. (2007) Effect of delta9- tetrahydrocannabinol on quinine palatability and AM251 on sucrose and quinine palatability using the taste reactivity test. Physiol Behav, 90: 425–430. Jarvis ED, Güntürkün O, Bruce L, Csillag A, Karten H, Kuenzel W, Medina L, Paxinos G, Perkel DJ, Shimizu T, Striedter G, Wild JM, Ball GF, Dugas-Ford J, Durand SE, Hough GE, Husband S, Kubikova L, Lee DW, Mello CV, Powers A, Siang C, Smulders TV, Wada K, White SA, Yamamoto K, Yu J, Reiner A, Butler AB. Avian Brain Nomenclature Consortium, (2005) Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat Rev Neurosci, 6: 151-159. Ji ZQ, Aas JE, Laake J, Walberg F, Ottersen OP. (1991) An electron microscopic, immunogold analysis of glutamate and glutamine in terminals of rat spinocerebellar fibers. J Comp Neurol, 307 :296-310. Julian MD, Martin AB, Cuellar B, Rodriguez De Fonseca F, Navarro M, Moratalla R, Garcia-Seguera LM. (2003) Neuroanatomical relationship between type 1 cannabinoid receptors and dopaminergic systems in the rat basal ganglia. Neuroscience, 119: 309-318. Kangrga I, Randic M. (1990) Tachykinins and calcitonin gene-related peptide enhance release of endogenous glutamate and aspartate from the rat spinal dorsal horn slice. J Neurosci, 10: 2026-2038. Katz JL, Goldberg SR. (1988) Preclinical assessment of abuse liability of drugs. Agents Actions, 23: 18–26. Kimura M, Yamanishi Y, Hanada T, Kagaya T, Kuwada M, Watanabe T, Katayama K, Nishizawa Y. (1995) Involvement of P-type calcium channels in high potassium-

78

elicited release of neurotransmitters from rat brain slices. Neuroscience, 66: 609615. Kitt CA, Brauth SE. (1981) Projections of the paleostriatum upon the midbrain tegmentum in the pigeon. Neuroscience, 6: 1551-1566. Kishimoto Y, Kano M. (2006) Endogenous cannabinoid signaling through the CB1 receptor is essential for cerebellum-dependent discrete motor learning. J Neurosci 26: 8829–8837. Koob GF. (1992a) Dopamine, addiction and reward. Semin Neurosci, 4: 139–148. Koob GF. (1992b) Drugs of abuse: anatomy, pharmacology and function of reward pathways. Trends Pharmacol Sci, 13: 177–184. Kobilo T, Hazvi S, Dudai Y. (2007) Role of cortical cannabinoid CB1 receptor in conditioned taste aversion memory. Eur J Neurosci, 25: 3417–3421. Kosten TA, Miserendino MJ, Chi S, Nestler EJ. (1994) Fischer and Lewis rat strains show differential cocaine effects in conditioned place preference and behavioral sensitization but not in locomotor activity or conditioned taste aversion. J Pharmacol Exp Ther, 269: 137–44. Kosten TA, Miserendino MJ, Haile CN, DeCaprio JL, Jatlow PI, Nestler EJ. (1997) Acquisition and maintenance of intravenous cocaine self-administration in Lewis and Fischer inbred rat strains. Brain Res, 778: 418–29. Kreitzer AC, Malenka RC. (2005) Dopamine modulation of state-dependent endocannabinoid release and long-term depression in the striatum. J Neurosci, 25: 10537–10545. Kuenzel WJ, Masson M. (1988) A stereotaxic atlas of the brain of the chick (Gallus domesticus). Baltimore: Johns Hopkins University Press. Lada MW, Vickroy TW, Kennedy RT. (1998) Evidence for neuronal origin and metabotropic receptor-mediated regulation of extracellular glutamate and aspartate in rat striatum in vivo following electrical stimulation of the prefrontal cortex. J Neurochem, 70: 617-625. Lambert DM, Fowler CJ. (2005) The endocannabinoid system: drug targets, lead compounds, and potential therapeutic applications. J Med Chem, 48 :5059-87. Lichtman AH. (2000) SR 141716A enhances spatial memory as assessed in a radial-arm maze task in rats. Eur J Pharmacol, 404: 175–179.

79

Ligresti A, De Petrocellis L, Hernán Pérez de la Ossa D, Aberturas R, Cristino L, Moriello AS, Finizio A, Gil ME, Torres AI, Molpeceres J, Di Marzo V. (2010) Exploiting nanotechnologies and TRPV1 channels to investigate the putative anandamide membrane transporter. PLoS One, 5(4):e10239. Lowndes M, Davies DC. (1994) The effects of archistriatal lesions on one-trial passive avoidance learning in the chick. Eur J Neurosci, 6: 525-30. Luo M, Perkel DJ. (1999) A GABAergic, strongly inhibitory projection to a thalamic nucleus in the zebra finch song system. J Neurosci, 19: 6700-6711. Maccioni P, Colombo G, Carai MA. (2010) Blockade of the cannabinoid CB1 receptor and alcohol dependence: preclinical evidence and preliminary clinical data. CNS Neurol Disord Drug Targets, 9: 55-9. Mailleux P, Vanderhaeghen JJ. (1993) Dopaminergic regulation of cannabinoid receptor mRNA levels in the rat caudate-putamen: an in situ hybridization study. J Neurochem, 61: 1705–1712. Manzoni OJ, Bockaert J. (2001) Cannabinoids inhibit GABAergic synaptic transmission in mice nucleus accumbens. Eur J Pharmacol, 412: R3-R5. Markou A, Weiss F, Gold LH, Caine B, Schulteis G, Koob GF. (1993) Animal models of drug craving. Psychopharmacology, 112: 163–182. Marsicano G, Wotjak CT, Azad SC, Bisogno T, Rammes G, Cascio MG, Hermann H, Tang J, Hofmann C, Zieglgänsberger W, Di Marzo V, Lutz B. (2002) The endogenous cannabinoid system controls extinction of aversive memories. Nature 418: 530-4. Martin D, Bustos GA, Bowe MA, Bray SD, Nadler JV. (1991) Autoreceptor regulation of glutamate and aspartate release from slices of the hippocampal CA1 area. J Neurochem, 56: 1647-1655. Mascia MS, Obinu MC, Ledent C, Parmentier M, Bohme GA, Imperato A, Fratta W. (1999) Lack of morphine-induced dopamine release in the nucleus accumbens of cannabinoid CB(1) receptor knockout mice. Eur J Pharmacol, 383: R1–R2. Maura G, Barzizza A, Folghera S, Raiteri M. (1991) Release of endogenous aspartate from rat cerebellum slices and synaptosomes: inhibition mediated by a 5-HT2 receptor and by a 5-HT1 receptor of a possibly novel subtype. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 343: 229-236.

80

Matsuda LA, Lolait SJ, Brownstein MJ, Young AC, Bonner TI. (1990) Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA. Nature, 346: 561-4. Matsuda LA, Bonner TI, Lolait SJ. (1993) Localization of cannabinoid receptor mRNA in rat brain. J Comp Neurol, 327: 535-550. Maxwell DJ, Christie WM, Ottersen OP, Storm-Mathisen J. (1990) Terminals of group Ia primary afferent fibres in Clarke's column are enriched with L-glutamate-like immunoreactivity. Brain Res, 510: 346-350. Maycox PR, Deckwerth T, Hell JW, Jahn R. (1988) Glutamate uptake by brain synaptic vesicles. Energy dependence of transport and functional reconstitution in proteoliposomes. J Biol Chem, 263: 15423-15428. McPartland JM, Glass M. (2003) Functional mapping of cannabinoid receptor homologs in mammals, other vertebrates, and invertebrates. Gene, 312: 297–303. Merighi A, Polak JM, Theodosis DT. (1991) Ultrastructural visualization of glutamate and aspartate immunoreactivities in the rat dorsal horn, with special reference to the co-localization of glutamate, substance P and calcitonin-gene related peptide. Neuroscience, 40: 67-80. Mezey S, Csillag A. (2002) Selective striatal connections of midbrain dopaminergic nuclei in the chick (Gallus domesticus). Cell Tissue Res, 308: 35-46. Mikics E, Dombi T, Barsvári B, Varga B, Ledent C, Freund TF, Haller J. (2006) The effects of cannabinoids on contextual conditioned fear in CB1 knockout and CD1 mice. Behav Pharmacol, 17: 223-30. Miller LL, Branconnier RJ. (1983) Cannabis: Effects on memory and the cholinergic limbic system. Psychol. Bull, 93: 441–456. Moons L, D’Hondt E, Pijcke K, Vandesande F. (1995) Noradrenergic system in the chicken brain: immunocytochemical study with antibodies to noradrenaline and dopamine-β-hydroxylase. J Comp Neurol, 360: 331-348. Montero VM. (1994) Quantitative immunogold evidence for enrichment of glutamate but not aspartate in synaptic terminals of retino-geniculate, geniculo- cortical, and cortico-geniculate axons in the cat. Vis Neurosci, 11: 675-681. Munro S, Thomas KL, Abu-Shaar M. (1993) Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids. Nature, 365: 61-5.

81

Nadler JV, Vaca KV, White WF, Lynch GS, Cotman CV. (1976) Aspartate and glutamate as possible neurotransmitter of excitatory hippocampal afferents. Nature, 260: 538-540. Nadler JV, Martin D, Bustos GA, Burke SR Bowe MA. (1990) Regulation of glutamate and aspartate release from the Schaffer collaterals and other projections of CA3 hippocampal pyramidal cells. Prog Brain Res, 83: 115-130. Naito S, Ueda T. (1983) Adenosine triphosphate-dependent uptake of glutamate into protein I-associated synaptic vesicles. J Biol Chem, 258: 696-699. Navarro M, Carrera MR, FrattaW, Valverde O, Cossu G, Fattore L. (2001) Functional interaction between opioid and cannabinoid receptors in drug self-administration. J Neurosci, 21: 5344–5350. Nestler EJ. (1993) Molecular mechanisms of drug addiction in the mesolimbic dopamine pathway. Semin Neurosci, 5: 369– 76. Ng KT, Gibbs ME. (1991) Stages in memory formation: a review. In R. J. Andrew (Ed.), Neural and Behavioural Plasticity: The Use of the Domestic Chick as a Model. (pp. 351-369.). Oxford, UK: Oxford University Press. Olive MF. (2010) Pharmacotherapies for alcoholism: the old and the new. CNS Neurol Disord Drug Targets, 9:2-4. Olive MF, Mehmert KK, Hodge CW. (2000) Microdialysis in the mouse nucleus accumbens:

a method

for detection

of

monoamine and

amino

acid

neurotransmitters with simultaneous assessment of locomotor activity. Brain Res Brain Res Protoc, 5: 16–24. Ottersen OP, Storm-Mathisen J. (1985) Different neuronal localization of aspartate-like and glutamate-like immunoreactivities in the hippocampus of the rat, guinea-pig and senegalese baboon (Papio papio) with a note on the distribution of gammaaminobutyrate. Neuroscience, 16: 589-606. Ottersen OP. (1989) Postembedding immunogold labelling of fixed glutamate: an electron microscopic analysis of the relationship between gold particle density and antigen concentration. J Chem Neuroanat, 2: 57-66. Ottersen OP, Zhang N, Walberg F. (1992) Metabolic compartmentalization of glutamate and

glutamine:

morphological

evidence

obtained

by

immunocytochemistry in rat cerebellum. Neuroscience, 46: 519-534.

82

quantitative

Packard MG, Knowlton BJ. (2002) Learning and memory functions of the basal ganglia. Annu Rev Neurosci, 25: 563-593. Patneau DK, Mayer ML. (1990) Structure-activity relationships for amino acid transmitter candidates acting at N-methyl-D-aspartate and quisqualate receptors. J Neurosci, 10: 2385-2399. Patterson TA, Rose SPR. (1992) Memory in the chick: multiple clues, distinct brain locations. Behav Neurosci, 106: 465-470. Paulsen RE, Fonnum F. (1989) Role of glial cells for the basal and Ca2+-dependent K+evoked release of transmitter amino acids investigated by microdialysis. J Neurochem, 52: 1823-1829. Petralia RS, Yokotani N, Wenthold RJ. (1994a) Light and electron microscope distribution of the NMDA receptor subunit NMDAR1 in the rat nervous system using a selective anti-peptide antibody. J Neurosci, 14: 667-696. Petralia RS, Wang Y-X, Wenthold RJ. (1994b) The NMDA receptor subunits NR2A and NR2B show histological and ultrastructural localization patterns similar to those of NR1. J Neurosci ,14: 6102-6120. Pettersson E, Herrera-Marschitz M, Rodriguez-Puertas R, Xu Z-Q, You Z-B, Hughes J, Elde RP, Ungerstedt U, Hökfelt T. (1996) Evidence for aspartate-immunoreactive neurons in the neostriatum of the rat: modulation by the mesencephalic dopamine pathway via D1-subtype of receptor. Neuroscience, 74: 51-66. Phillips PE, Stuber GD, Heien ML, Wightman RM, Carelli RM. (2003) Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking. Nature, 422: 614–618. Pidoplichko VI, DeBiasi M, Williams JT, and Dani JA. (1997) Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature, 390: 401–404. Poncelet M, Maruani J, Calassi R, Soubrie P. (2003) Overeating, alcohol and sucrose consumption decrease in CB1 receptor deleted mice. Neurosci Lett, 343: 216–218. Puelles L, Kuwana E, Puelles E, Bulfone A, Shimamura K, Keleher J, Smiga S, Rubenstein JL. (2000) Pallial and subpallial derivatives on the embryonic chick and mouse thelencephalon, traced by the expression of the genes Dlx-2, Emx-1, Nkx-2.1, Pax-6, and Tbr-1. J Comp Neurol, 424: 409-438. Ranganathan M, D’Souza DC. (2006) The acute effects of cannabinoids on memory in humans: a review. Psychopharmacology, 188: 425–444.

83

Reiner A. (1998) Structural and functional evolution of the basal ganglia in vertebrates. Brain Res Brain Res Rev, 28: 235-285. Reiner A, Stern EA, Wilson CJ. (2001) Physiology and morphology of intratelencephalically projecting corticostriatal-type neurons in pigeons as revealed by intracellular recording and cell filling. Brain Behav Evol, 58: 10114. Reiner A. (2002) Functional circuitry of the avian basal ganglia: Implications for basal ganglia organization in stem amniotes. Brain Res Bull, 57: 513-528. Reiner A, Perera M, Paullus R, Medina L. (1998) Immunohistochemical localization of DARPP32 in striatal projection neurons and striatal interneurons in pigeons. J. Chem. Neuroanat, 16: 17-33. Reiner A, Perkel DJ, Bruce LL, Butler AB, Csillag A, Kuenzel W, Medina L, Paxinos G, Shimizu T, Striedter G, Wild M, Ball GF, Durand S, Gunturkun O, Lee DW, Mello CV, Powers A, White SA, Hough G, Kubikova L, Smulders TV, Wada K, Dugas-Ford J, Husband S, Yamamoto K, Yu J, Siang C, Jarvis ED, Avian Brain Nomenclature Forum, (2004) Revised nomenclature for avian telencephalon and some related brainstem nuclei. J Comp Neurol, 473: 377-414. Reubi JC, Toggenburger G, Cuénod M. (1980) Asparagine as precursor for transmitter aspartate in corticostriatal fibres. J Neurochem, 35: 1015-1017. Rinaldi-Carmona M, Barth F, Héaulme M, Shire D, Calandra B, Congy C, Martinez S, Maruani J, Néliat G, Caput D, Ferrara P, Soubrie P, Breliere JC, LeFur G. (1994) SR141716A, a potent and selective antagonist of the brain cannabinoid receptor. FEBS Lett, 350: 240-4. Rinaldi-Carmona M., Barth F, Millan J, Derocq JM, Casellas P, Congy C, Oustric D, Sarran M, Bouaboula M, Calandra B, Portier M, Shire D, Breliere JC, Le Fur GL. (1998) SR 144528, the first potent and selective antagonist of the CB2 cannabinoid receptor. J Pharmacol Exp Ther, 284: 644–650. Rinaldi-Carmona M, Barth F, Congy C, Martinez S, Oustric D, Perio A, Poncelet M, Maruani J, Arnone M, Finance O, Soubrié P, Le Fur G. (2004) SR147778 [5-(4bromophenyl)-1- (2,4-dichlorophenyl)-4-ethyl-N-(1-piperidinyl)-1H-pyrazole-3carboxamide], a new potent and selective antagonist of the CB1 cannabinoid

84

receptor. Biochemical and pharmacological characterization. J Pharmacol Exp Ther, 310: 905–914. Robbe D, Alonso G, Duchamp F, Bockaert J, Manzoni OJ. (2001). Localization and mechanisms of action of cannabinoid receptors at the glutamatergic synapses of the mouse nucleus accumbens. J Neurosi, 21: 109-116. Robbe D, Kopf M, Remaury A, Bockaert J, Manzoni OJ. (2002) Endogenous cannabinoids mediate long-term synaptic depression in the nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci, USA, 99: 8384-8388. Roberts TF, Hall WS, Brauth SE. (2002) Organization of the avian basal forebrain: chemical anatomy in the parrot (Melopsittacus undulatus). J Comp Neurol, 454: 383-408. Rodriguez de Fonseca F, Roberts AJ, Bilbao A, Koob GF, and Navarro M. (1999) Cannabinoid receptor antagonist SR141716A decreases operant ethanol self administration in rats exposed to ethanol-vapor chambers. Zhongguo Yao Li Xue Bao, 20: 1109–1114. Roisin MR Brassart JL, Charton G, Crepel V, Ben AY. (1991) A new method for the measurement of endogenous transmitter release in localized regions of hippocampal slices. J Neurosci Methods, 37: 183-189. Rose SPR. (1985) Passive avoidance training in the chick: a model for the analysis of the cell biology of memory storage. In DL Alkon and CD Woody (Eds.) Neural mechanism of Conditioning, Plenum Press, New York, pp. 232-248. Rose SPR. (1991a) Memory - The brain's rosetta stone? Concepts in Neurosci, 2: 43-64. Rose SPR. (1991b) Biochemical mechanisms involved in memory formation in the chick. In R. J. Andrew (Ed.), Neural and Behavioural Plasticity: The Use of the Domestic Chick as a Model. (pp. 277-304.). Oxford: Oxford University Press. Rose SPR. (2000) God's organism? The chick as a model system for memory studies. Learn Mem, 7: 1-17. Rose SPR, Csillag A. (1985) Passive avoidance training results in lasting changes in deoxyglucose metabolism in left hemisphere regions of chick brain. Behav Neural Biol, 44: 315-324. Ross RA. (2003) Anandamide and vanilloid TRPV1 receptors. Br J Pharmacol, 140: 790-801.

85

Samson HH, Harris RA. (1992) Neurobiology of alcohol abuse. Trends Pharmacol Sci, 13: 206–211. Schiavo G, Benfenati F, Poulain B, Rossetto O, Polverino L, DasGupta BR, Montecucco

C.

(1992)

Tetanus

and

botulinum-B

neurotoxins

block

neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature, 359: 832-835. Schindler CW, Panlilio LV, Goldberg SR. (2002) Second-order schedules of drug selfadministration in animals. Psychopharmacology, 163: 327–344. Schultz W. (2002) Getting formal with dopamine and reward. Neuron, 36: 241–263. Schultz W, Dayan P, and Montague PR. (1997) A neural substrate of prediction and reward. Science, 275: 1593–1599. Schuster CR, Woods JH. (1968) The conditioned reinforcing effects of stimuli associated with morphine reinforcement. Int J Addict, 3: 223–230. Self DW, Nestler EJ. (1995) Molecular mechanisms of drug reinforcement and addiction. Annu Rev Neurosci, 18: 463–95. Sekiguchi M, Okamoto K, Sakai Y. (1986) Release of endogenous aspartate and glutamate induced by electrical stimulation in guinea pig cerebellar slices. Brain Res, 378: 174-178. Simiand J, Keane M, Keane PE, Soubrie P. (1998) SR 141716, a CB1 cannabinoid receptor antagonist, selectively reduces sweet food intake in marmoset. Behav Pharmacol, 9: 179–181. Singh ME, Verty AN, McGregor IS, Mallet PE. (2004) A cannabinoid receptor antagonist attenuates conditioned place preference but not behavioural sensitization to morphine. Brain Res, 1026: 244–253. Singla S, Kreitzer AC, Malenka RC. (2007) Mechanisms for synapse specificity during striatal long-term depression. J Neurosci, 27: 5260 –5264. Snyder GL, Fisone G, Morino P, Gundersen V, Ottersen OR Hökfelt T, Greengard P. (1993) Regulation by the neuropeptide cholecystokinin (CCK-8S) of protein phosphorylation in the neostriatum. Proc Natl Acad Sci, USA, 90: 11277-11281. Soderstrom K, Johnson F. (2001) Zebra finch CB1 cannabinoid receptor: pharmacology and in vivo and in vitro effects of activation. J Pharmacol Exp Ther, 297: 18997.

86

Soderstrom K, Johnson F. (2000) CB1 cannabinoid receptor expression in brain regions associated with zebra finch song control. Brain Res, 857: 151-7. Solinas M, Goldberg SR. (2005) Motivational effects of cannabinoids and opioids on food reinforcement depend on simultaneous activation of cannabinoid and opioid systems. Neuropsychopharmacol, 30: 2035–2045. Solinas M, Goldberg SR, Piomelli D. (2008) The endocannabinoid system in brain reward processes. Br J Pharmacol, 154: 369-383. Solinas M, Panlilio LV, Antoniou K, Pappas LA, Goldberg SR. (2003) The cannabinoid CB1

antagonist

N-piperidinyl-5-(4-chlorophenyl)-1-(2,4-dichlorophenyl)-4-

methylpyrazole-3-carboxamide

(SR-141716A)

differentially

alters

the

reinforcing effects of heroin under continuous reinforcement, fixed ratio, and progressive ratio schedules of drug self-administration in rats. J Pharmacol Exp Ther, 306: 93–102. Somogyi P, Hodgson AJ. (1985) Antiserum to γ-aminobutyric acid. III. Demonstration of GABA in Glogi impregnated neurons and in conventional electron microscopic sections of cat striate cortex. J Histochem Cytochem, 33: 249-257. Somogyi P, Halasy K, Somogyi J, Storm-Mathisen J, Ottersen OP. (1986) Quantification if immunogold labelling reveals enrichment of glutamate in mossy and paralell fibre terminals in cat cerebellum. Neuroscience, 19: 10451050. Soria G, Mendizábál V, Turino C, Robledo P, Ledent C, Parmentier M, Maldonado R, Valverde O. (2005) Lack of CB1 cannabinoid receptor impairs cocaine selfadministration. Neuropsychopharmacol, 30: 1670–1680. Spealman RD, Goldberg SR. (1978) Drug self-administration by laboratory animals: Control by schedules of reinforcement. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 18: 313– 339. Steele RJ, Stewart MG, Rose SPR. (1995) Increases in NMDA receptor binding are specifically related to memory formation for a passive avoidance task in the chick: a quantitative autoradiographic study. Brain Res, 674: 352–6. Stewart MG, Csillag A, Rose SP. (1987) Alterations in synaptic structure in the paleostriatal complex of the domestic chick, Gallus domesticus, following passive avoidance training. Brain Res, 426: 69-81.

87

Stewart MG, Rusakov DA. (1995) Morphological changes associated with stages of memory formation in the chick following passive avoidance training. Behav Brain Res, 66: 21-28. Stewart MG, Kabai P, Harrison E, Steele RJ, Kossut M, Gierdalski M, Csillag A. (1996) The involvement of dopamine in the striatum in passive avoidance training in the chick. Neuroscience, 70: 7-14. Stincic TL, Hyson RL. (2008) Localization of CB1 cannabinoid receptor mRNA in the brain of the chick (Gallus domesticus). Brain Res, 1245: 61-73. Szabó B, Muller T, Koch H. (1999) Effects of cannabinoids on dopamine release in the corpus striatum and the nucleus accumbens in vitro. J Neurochem, 73: 1084– 1089. Székely AD, Boxer MI, Stewart MG, Csillag A. (1994) Connectivity of the lobus parolfactorius of the domestic chicken (Gallus domesticus): an anterograde and retrograde pathway tracing study. J Comp Neurol, 348: 374-393. Székely AD, Krebs JR. (1996) Efferent connectivity of the hippocampal formation of the zebra finch (Taeniopygia guttata): an anterograd pathway tracing study using Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. J Comp Neurol, 368: 198-214. Szerb JC. (1988) Changes in the relative amounts of aspartate and glutamate released and retained in hippocampal slices during stimulation. J Neurochem, 50: 219224. Tabakoff B, Hoffman PL. (1996) Alcohol addiction: an enigma among us. Neuron, 16: 909–912. Takahashi RN, Pamplona FA, Fernandes MS. (2005) The cannabinoid antagonist SR141716A facilitates memory acquisition and consolidation in the mouse elevated T-maze. Neurosci Lett, 380: 270–275. Takumi Y, Ramírez-León V, Laake R, Rinvik E, Ottersen OP. (1999) Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat Neurosci, 2: 618-624. Tanda G, Loddo P, Di Chiara G. (1999) Dependence of mesolimbic dopamine transmission on delte9-tetrahydrocannabinol. Eur J Pharmacol, 376: 23-26.

88

Thanos PK, Volkow ND, Freimuth P, Umegaki H, Ikari H, Roth G. (2001) Overexpression of dopamine D2 receptors reduces alcohol selfadministration. J Neurochem, 78: 1094–103. Thanos PK, Dimitrakakis ES, Rice O, Gifford A, Volkow ND. (2005) Ethanol selfadministration and ethanol conditioned place preference are reduced in mice lacking cannabinoid CB1 receptors. Behav Brain Res, 164: 206–213. Thornton-Jones ZD, Kennett GA, Benwell KR, Revell DF, Misra A, Sellwood DM. (2006) The cannabinoid CB1 receptor inverse agonist, rimonabant, modifies body weight and adiponectin function in diet-induced obese rats as a consequence of reduced food intake. Pharmacol Biochem Behav, 84: 353–359. Thornton-Jones ZD, Kennett GA, Vickers SP, Clifton PG. (2007) A comparison of the effects of the CB(1) receptor antagonist SR141716A, pre-feeding and changed palatability on the microstructure of ingestive behaviour. Psychopharmacol, 193: 1–9. Thornton-Jones ZD, Vickers SP, Clifton PG. (2005). The cannabinoid CB1 receptor antagonist SR141716A reduces appetitive and consummatory responses for food. Psychopharmacol, 179: 452–460. Toggenburger G, Wiklund L, Henke H, Cu6nod M. (1983) Release of endogenous and accumulated exogenous amino acids from slices of normal and climbing fibredeprived rat cerebellar slices. J Neurochem, 41: 1606-1613. Tracey DJ, De BS, Phend K, Rustioni A. (1991) Aspartate-like immunoreactivity in primary afferent neurons. Neuroscience, 40: 673-686. Tsou

K,

Brown

S,

Sanudo-Pena

MC,

Mackie

K,

Walker

JM.

(1998).

Immunohistochemical distribution of cannabinoid CB1 receptors in the rat central nervous system. Neuroscience, 83: 393-411. Uhl G, Blum K, Noble E, Smith S. (1993) Substance abuse vulnerability and D2 receptor genes. Trends Neurosci, 16:83 –8. Umeda Y, Sumi T. (1989) Evoked release of endogenous amino acids from rat striatal slices and its modulation. Eur J Pharmacol, 163: 291-297. Usami S, Ottersen OP. (1996) Aspartate is enriched in sensory cells and subpopulations of non-neuronal cells in the guinea pig inner ear: a quantitative immunoelectron microscopic analysis. Brain Res, 742: 43-49.

89

Valjent E, Mitchell JM, Besson MJ, Caboche J, Maldonado R. (2002) Behavioural and biochemical evidence for interactions between delta 9-tetrahydrocannabinol and nicotine. Br J Pharmacol, 135: 564–578. Valtschanoff JG, Weinberg RJ, Rustioni A. (1993) Amino acid immunoreactivity in corticospinal terminals. Exp Brain Res, 93: 95-103. Van den Pol AN. (1991) Glutamate and aspartate immunoreactivity in hypothalamic presynaptic axons. J Neurosci, 11: 2087-2101. Vanderschuren LJ, Everitt BJ. (2004) Drug seeking becomes compulsive after prolonged cocaine self-administration. Science, 305: 1017–1019. Van der Stelt M, Di Marzo V. (2003) The endocannabinoid system in the basal ganglia and in the mesolimbic reward system: implications for neurological and psychiatric disorders. Eur J Pharmacol, 480: 133-150. Varvel SA, Anum EA, Lichtman AH. (2005) Disruption of CB1 receptor signaling impairs extinction of spatial memory in mice. Psychopharmacology, 179: 863– 872. Varvel SA, Wise LE, Lichtman AH. (2009) Are CB(1) Receptor Antagonists Nootropic or Cognitive Impairing Agents? Drug Dev Res, 70: 555-565. Veenman CL, Reiner A. (1996) Ultrastructural morphology of synapses formed by corticostriatal terminals in the avian striatum. Brain Res, 707: 1-12. Veenman CL, Wild JM, Reiner A. (1995) Organization of the avian “corticostriatal” projection system: a retrograde and anterograde pathway tracing study in pigeons. J Comp Neurol, 354: 87-126. Vinklerova J, Novakova J, Sulcova A. (2002) Inhibition of methamphetamine selfadministration in rats by cannabinoid receptor antagonist AM 251. J Psychopharmacol, 16: 139–143. Volkow ND, Wang G-J, Fowler JS, Logan J, Gatley SJ, Gifford A, Hitzemann R, Ding YS, Pappas N. (1999) Prediction of reinforcing responses to psychostimulants in humans by brain dopamine D2 receptor levels. Am J Psychiatry, 156: 1440 –3. Volkow ND, Chang L, Wang G-J, Fowler JS, Ding Y-S, Sedler M, Logan J, Franceschi D, Gatley J, Hitzemann R, Gifford A, Wong C, Pappas N. (2001) Low level of brain dopamine D2 receptors in methamphetamine abusers: association with metabolism in the orbitofrontal cortex. Am J Psychiatry, 158: 2015 –21.

90

Vollenweider FX, Cuénod M, Do KQ. (1990) Effect of climbing fiber deprivation on release of endogenous aspartate, glutamate, and homocysteate in slices of rat cerebellar hemispheres and vermis. J Neurochem, 54: 1533-1540. Wang L, Liu J, Harvey-White J, Zimmer A, Kunos G. (2003) Endocannabinoid signaling via cannabinoid receptor 1 is involved in ethanol preference and its age-dependent decline in mice. Proc Natl Acad Sci USA,100: 1393–1398. Wild JM, Arends JJ, Zeigler HP. (1990) Projections of the parabrachial nucleus in the pigeon (Columba livia). J Comp Neurol, 293: 499-523. Williams CM, Rogers PJ, Kirkham TC. (1998) Hyperphagia in pre-fed rats following oral delta9-THC. Physiol Behav, 65: 343–346. Wiklund L, Toggenburger G, Cuénod M. (1982) Aspartate: possible neurotransmitter in cerebellar climbing fibers. Science, 216: 78-80. Wise RA, Bozarth MA. (1982) Action of drugs of abuse on brain reward systems: An update with specific attention to opiates. Pharmacol Biochem Behav, 17: 239243. Wise LE, Iredale PA, Stokes RJ, Lichtman AH. (2007) Combination of rimonabant and donepezil prolongs spatial memory duration. Neuropsychopharmacology, 32: 1805–1812. Vollenweider FX, Cuénod M, Do KQ. (1990) Effect of climbing fiber deprivation on release of endogenous aspartate, glutamate, and homocysteate in slices of rat cerebellar hemispheres and vermis. J Neurochem, 54: 1533-1540. Wu X, French ED. (2000). Effects of chronic delta9-tetrahydrocannabinol on rat midbrain

dopamine

neurons:

an

electrophysiological

assessment.

Neuropharmacology, 39: 391-398. Yatsushiro S, Yamada H, Kozaki S, Kumon H, Michibata H, Yamamoto A, Moriyama Y. (1997) L-aspartate but not the D form is secreted through microvesiclemediated exocytosis and is sequestered through Na+-dependent transporter in rat pinealocytes. J Neurochem, 69: 340-347. Yim HJ, Schallert T, Randall PK, Gonzales RA. (1998) Comparison of local and systemic ethanol effects on extracellular dopamine concentration in rat nucleus accumbens by microdialysis. Alcohol Clin Exp Res, 22: 367-74.

91

Zhang N, Walberg F, Laake JH, Meldrum BS, Ottersen OP. (1990), Aspartate-like and glutamate-like immunoreactivities in the inferior olive and climbing fibre system: a light microscopic and semiquantitative electron microscopic study in rat and baboon (Papio anubis). Neuroscience, 38: 61-80. Zhou M, Peterson CL, Lu YB, Nadler JV. (1995) Release of glutamate and aspartate from CA1 synaptosomes: selective modulation of aspartate release by ionotropic glutamate receptor ligands. J Neurochem, 64: 1556-1566. Zimmer A, Zimmer AM, Hohmann AG, Herkenham M, Bonner TI. (1999) Increased mortality, hypoactivity, and hypoalgesia in cannabinoid CB1 receptor knockout mice. Proc Natl Acad Sci, USA, 96: 5780-5.

92

Saját publikációk jegyzéke

Az értekezés témájában megjelent közlemények: Ádám ÁS, Wenger T, Csillag A. (2008) The cannabinoid CB1 receptor antagonist rimonabant dose-dependently inhibits memory recall in the passive avoidance task in domestic chicks (Gallus domesticus). Brain Res Bull.15;76(3):272-4.

Ádám ÁS, Csillag A. (2006) Differential distribution of L-aspartate- and L-glutamateimmunoreactive structures in the arcopallium and medial striatum of the domestic chick (Gallus domesticus). J Comp Neurol. 10;498(2):266-76.

Ádám Á, Wenger T, Hungund BL, Csillag A. (2005) Localization of CB1 cannabinoid receptor in the chick brain and its implications in passive avoidance training. Abstract; Symposium on the Cannabinoids, Burlington, Vermont, ICRS, p. 92).

Hungund BL, Szakáll I, Ádám Á, Basavarajappa BS, Vadász C. (2003) Cannabinoid CB1 receptor knockout mice exhibit markedly reduced voluntary alcohol consumption and lack alcohol-induced dopamine release in the nucleus accumbens. J Neurochem. 84(4):698-704.

Egyéb, a dolgozat témájához szorosan nem kapcsolódó közlemények:

Csillag A, Bálint E, Ádám Á, Zachar G. (2008) The organisation of the basal ganglia in the domestic chick (Gallus domesticus): anatomical localisation of DARPP-32 in relation to glutamate. Brain Res Bull. 15;76(3):183-91.

Bálint E, Kitka T, Zachar G, Ádám Á, Hemmings HC Jr, Csillag A. (2004) Abundance and location of DARPP-32 in striato-tegmental circuits of domestic chicks. J Chem Neuroanat. 28(1-2):27-36.

93

Montagnese CM, Székely AD, Ádám Á, Csillag A. (2004) Efferent connections of septal nuclei of the domestic chick (Gallus domesticus): an anterograde pathway tracing study with a bearing on functional circuits. J Comp Neurol. 469(3):437-56.

94

Köszönetnyilvánítás Elsısorban témavezetımnek, Prof. Csillag Andrásnak tartozom köszönettel, akitıl tudományos diákkörös, majd PhD hallgató éveim alatt számtalan szakmai és emberi segítséget kaptam. Hálás vagyok, hogy az általa teremtett derős és inspiráló légkörben ismerhettem meg a tudományos kutatás alapjait. Végtelen türelme és segítıkészsége nagyban hozzájárult a dolgozat megszületéséhez. Köszönöm. Értekezésem nagyobb része a Semmelweis Egyetem Anatómiai, Szövet- és Fejlıdéstani Intézetében készült. Munkám során sok ember támogató segítségét élvezhettem, amit ezúton köszönök. Külön köszönettel tartozom az Intézet munkatársai közül Deák Szilviának, a mőtétekben való segítségéért és az állatokkal kapcsolatos munkájáért, valamint Tóth Ferencné Jutkának, aki az adminisztrációs dolgokban mindig készségesen segített. Munkám egy részét a New York állam-beli Nathan Kline Pszichiátriai Kutatóintézetben végeztem, ahol rengeteg segítséget kaptam. Köszönöm Dr. Vadász Csabának és Dr. Appa Hungundnak segítı támogatását; Dr. Mariko Saito-nak, hogy megtanított az analitikai mérésekhez szükséges precíz laboratóriumi munkára. Továbbá köszönettel tartozom Dr. Szakáll Istvánnak és Piturca Jánosnak az egerekkel kapcsolatos segítségéért. Hálásan köszönöm Prof. Wenger Tibornak a kannabinoid rendszerrel kapcsolatos vizsgálatunkban nyújtott segítségét, és az értékes beszélgetéseket, melyekkel nagy segítségemre volt az eredményeink megértésében és publikálásában. Hálával tartozom a ’Csillag Labor’ minden munkatársának. Szász Istvánné Marcsinak, aki bevezetett a laboratóriumi munka rejtelmeibe, és felbecsülhetetlen segítséget nyújtott az elektronmikroszkópos munkában. Köszönöm Dr. Székely Andreának, Dr. Bálint Eszternek, Dr. Mezey Szilviának, Dr. Catherine Montagnese-nek, Dr. Zachar Gergelynek és Dr. Hanics Jánosnak, hogy a munkám során számtalan hasznos tanáccsal láttak el, folyamatosan segítették munkámat és lehetıvé tették, hogy baráti légkörben dolgozhassam. Ez a dolgozat nem jöhetett volna létre Szüleim önzetlen, szeretı támogatása nélkül, akik mindvégig mindenben igyekeztek segítségemre lenni, és mindig hittek bennem. Köszönöm Juditnak, Orsinak és Rékának, hogy lelket öntöttek belém, amikor szükségem volt rá. Végül, de nem utolsó sorban, köszönöm Férjemnek, Péternek, szeretı támogatását, bíztatását. Külön köszönöm a kézirat gondos átolvasását, építı javaslatait és az ábrák elkészítésében nyújtott segítségét. Köszönöm lányaimnak, Kincsınek és Kírának, hogy megértéssel és türelemmel viselték az értekezés megírásának idıigényes szakaszát. De legfıképp azt, hogy Belılük minden nap erıt meríthetek.

95