IN SITU ELJÁ ELJÁRÁSOK
A sejttani kutatások fő módszerei
MIKROSZKÓ MIKROSZKÓPOS ÉRTÉ RTÉKELŐ KELŐ BERENDEZÉ BERENDEZÉSEK Fénymikroszkó nymikroszkóp hagyomá hagyományos, fluorescens, fluorescens, polarizá polarizáció ciós, fá fáziskontraszt, interferencia, konfoká konfokális Citofotomé Citofotométerek Transzmisszió Transzmissziós elektronmikroszkó elektronmikroszkóp Scanning elektronmikroszkó elektronmikroszkóp, mikroszondá mikroszondák Szá Számítógépes képanalizá panalizátor berendezé berendezések
Mikromanipulá Mikromanipulátor Mozgó Mozgókép-rögzí gzítő berendezé berendezések Sterilizá Sterilizáló és szö szövettenyé vettenyésztő sztő Elektrofizioló Elektrofiziológiai erő erősítő és adatrö adatrögzí gzítő berendezé berendezések
A vitális festés Az élő sejtek membrá membránjai a festé festékeket csak ré részben engedik át, ezé ezért az élő sejtek festé festésének korlá korlátozottak a lehető lehetőségei. A vitá vitális festé festési eljá eljárások nem a sejt általá ltalános szerkezeti felé felépítésének tanulmá tanulmányozá nyozására, sokkal inká inkább a festé festékek felvé felvételé telének, nek, kötődésének és leadá leadási mechanizmusainak vizsgá vizsgálatá latára alkalmasak.
Fixá Fixált sejtek vizsgá vizsgálata Fixá Fixálás, fagyasztá fagyasztás Beá Beágyazá gyazás, metszé metszés Festé Festés, kontrasztosí kontrasztosítás Citoké Citokémiai eljá eljárások: -Enzimcitoké Enzimcitokémia -immunocitoké immunocitokémia Autoradiográ Autoradiográfia EM rö röntgen mikroanalí mikroanalízis
Élő sejtek vizsgá vizsgálata Mikrokinematográ Mikrokinematográfia Egysejtű Egysejtűek vizsgá vizsgálata Vitá Vitális festé festés Mikromanipulá Mikromanipuláció ció Elektrofizioló Elektrofiziológiai módszerek patch clamp módszer SejtSejt- és szö szövettenyé vettenyészté sztés Sejthibridizá Sejthibridizáció ció
FRAKCIONÁLÁSI TEHNIKÁK Sejtek szepará szeparálása Sejtfrakció Sejtfrakciók izolá izolálása Molekulá Molekulák izolá izolálása Sejtek izolá izolálása Immunoló Immunológiai szepará szeparáció ció Sejtmentes rendszerek
Homogenizá Homogenizálás Centrifugá Centrifugálási techniká technikák Elektroforetikus módszerek
Molekulá Molekuláris szű szűrés Kromatográ Kromatográfiá fiás módszerek
A mikrokinematográ mikrokinematográfia és a mikrosebé mikrosebészet A mikrokinematográ mikrokinematográfia a sejtek mozgá mozgásainak tanulmá tanulmányozá nyozására alkalmas eljá eljárás. Lényege abban áll, hogy az élő sejtekrő sejtekről filmet ké készí szítenek, és azt gyorsí gyorsítva vagy lassí lassítva vetí vetítik le. Æ A sejtben lezajló lezajló mozgá mozgások ugyanis részben tú túl lassú lassúak vagy tú túl gyorsak ahhoz, hogy azokat mikroszkó mikroszkóppal közvetlenü zvetlenül tanulmá tanulmányozhassuk.
Az ecetmuslica embrionális sejtjének osztódása
1
A mikrosebé mikrosebészet eszkö eszköze a mikromanipulá mikromanipulátor
Lehető Lehetővé teszi a sejten belü belüli prepará preparáció ciós műveleteket Pl: Pl: sejtalkotó sejtalkotók eltá eltávolí volítása, sejtmag transzplantá transzplantáció ció stb.
Sejt és szö szövettenyé vettenyészté sztési eljá eljárások fontosabb felté feltételei: A szö szövetnek tenyé tenyészté sztésre alkalmasnak kell lennie A sejttenyé sejttenyészetnek fenntartható fenntarthatónak kell lennie A tá táptalajnak, tá tápoldatnak megfelelő megfelelőnek kell lennie Sterilitá Sterilitás biztosí biztosítása
A szomatikus sejtek hibridizá hibridizáció ciója:
Frakcioná Frakcionálási techniká technikák: Lépései:
a) A (nö (növényi, állati, speciá speciális) sejtek szepará szeparálása b) A szubcelluá szubcelluáris komponensek elkü elkülönítése - Homogenizá Homogenizálás ( PotterPotter- féle homogenizá homogenizátor) tor) - Centrifugá ál centrifugá Centrifugálás (Differenci (Differenciá centrifugálás)
Homogenizálás Első Első lépés a minta homogenizá homogenizálása vagy a sejtek összetö sszetörése. Ha a vizsgá vizsgálandó landó anyag a sejtbe van zárva, akkor a sejtet fel kell tö törni Æ a sejt eredeté eredetétől fü függő ggően igé igényel erő kevésbé sbé erő erőteljes eljá eljárást. erőteljes vagy kevé Kevé Kevésbé sbé erő erőteljes eljá eljárást igé igényel pl. a hemoglobin tisztí tisztítása
A sejtek feltá feltárása az esetek tú túlnyomó lnyomó részé szében sokkal nehezebb feladatot jelent. A sejtfal vagy membrá membrán szé széttö ttörésére sokszor alkalmazzá alkalmazzák az ultrahangos kezelé kezelést, st, mely a leghaté leghatékonyabb feltá feltárási módszerek kö közé tartozik. Î Az úgynevezett „french press” press” segí segítsé tségével a sejtszuszpenzió sejtszuszpenziót nagy nyomá nyomáson keskeny ré résen pré préselik át, így a sejtet mechanikus úton tá tárjá rják fel.
2
A homogenizáló készülékek A homogenizá homogenizáló készü szülékek általá ltalában csak a má már durvá durván felaprí felaprított szö szöveteket ké képesek elpé elpépesí pesíteni. Az egyik legegyszerű legegyszerűbb homogenizá homogenizáló készü szülék a PotterPotter- féle homogenizá homogenizátor. Î Ez egy vastag falú falú üvegcső vegcső, amelyben üveg vagy teflon
dugattyú dugattyú mozgatható mozgatható kézzel vagy motorral.
Î A cső cső fala és a dugattyú dugattyú közé szoruló szoruló szö szövetdarabká vetdarabkák
Az ultrahangos homogenizátorokat nem annyira szövethomogenizálásra, mint inkább tisztított sejtorganellumok beltartalmának feltárására használják, Æ mert ezzel az eljárással a mechanikailag el nem aprítható partikulumok is roncsolhatók.
szé szétkenő tkenődnek, sejtjeik összeroncsoló sszeroncsolódnak.
A centrifugálás • A frakció frakciók elkü elkülönítésének legá legáltalá ltalánosabb mó módszere • A centrifugá centrifugálás kö közben fellé fellépő centrifugá centrifugális erő erő a
szé szétvá tválasztandó lasztandó részecské szecskék sú súlyá lyának illetve a nyugalmi helyzetben mé mért gravitá gravitáció ciós gyorsulá gyorsulásnak sokszorosa.
• A forgá forgás kö közben fellé fellépő centrifugá centrifugális erő erő
következté vetkeztében a különbö nböző sűrűségű, mé méretű retű és alakú alakú részecské szecskék elté eltérő sebessé sebességgel ülepednek, lepednek, ezé ezért elté eltérő szedimentá szedimentáció ciós állandó llandóval jellemezhető jellemezhetők, függ a centrifuga fordulatszá fordulatszámától is.
Centrifugá Centrifugálási mó módszerek A sű sűrűséggrá ggrádensdens- centrifugá centrifugálás Lényege: hogy a centrifugacső centrifugacsőbe tö töltö ltött oldó oldószerben sűrűséggrá ggrádenst hozzunk lé létre, az oldó oldószer sű sűrűsége a felszí felszínen a legkisebb, a cső cső aljá alján a legnagyobb. A vizsgá vizsgálandó landó mintá mintát, mely tö több elté eltérő sűrűségű komponenst tartalmazhat, óvatosan az oldó oldószer tetejé tetejére ré rétegzik, majd a centrifugá centrifugát elindí elindítjá tják. Az oldatban lé lévő komponensek a megnö megnövekedett erő erőtér hatá hatására a centrifugá centrifugális erő erő irá irányá nyába, a cső cső alja felé felé kezdenek vá vándorolni.
Az ultracentrifuga Amikor azonban elé elérik azt az oldó oldószerré szerréteget, amelynek sű sűrűsége megegyezik sajá saját sű sűrűségükkel, tová tovább nem vá vándorolnak: mert a felhajtó felhajtó erő erő azonos lesz a nehé nehézsé zségi erő erővel. Az egyensú egyensúlyi helyzet beá beállta utá után a centrifugá centrifugát leá leállí llítjá tják, a cső cső tartalmá tartalmát té térfogati frakció frakciókra bontva óvatosan leszí leszívjá vják Æ ezzel tiszta formá formában izolá izolálható lhatók az elté eltérő sűrűségű komponensek.
segí segítsé tségével nagy pontossá pontossággal lehet meghatá meghatározni a makromolekulá makromolekulák molekulatö molekulatömegé megét. A centrifugá centrifugában kialakuló kialakuló igen nagy gravitá gravitáció ciós tér a forgó forgórész speciá speciális kié kiépítését és meghajtá meghajtását teszi szü szüksé kségessé gessé. Az ultracentrifuga mé mérőcellá cellája kvarc ablakokkal zárt, így a rotor forgá forgása kö közben folyamatosan mérhető rhető a cella teljes hosszá hosszában a fé fényelnyelé nyelnyelés.
3
Centrifugák Amint azonban a rotor elindul, a molekula vándorolni kezd a centrifugá centrifugális té térérő irá irányá nyába Æ Ez azt eredmé eredményezi, hogy megvá megváltozik a cellá cellán belü belül a homogenitá homogenitás. A molekula vá vándorlá ndorlásának sebessé sebessége (szedimentá (szedimentáció ciós sebessé sebesség) így fotometriá fotometriásan követhető vethető
Mikrocentrifugák
Ultracentrifuga
Differenciál centrifugálás
Elválasztás méret alapján A dialí dialízis: --A --A molekulamé molekulaméret szerinti legegyszerű legegyszerűbb elvá elválasztá lasztás a fé félig áteresztő teresztő hártyá rtyák tulajdonsá Æ tulajdonságán alapul ma is fontos eszkö eszköz a laborató laboratóriumi gyakorlatban. A dialí dialízis segí segítsé tségével viszonylag kö könnyen választhatjuk el a kis és nagymolekulá nagymolekulákat, --sz étvá --szé tválasztandó lasztandó molekulakeveré molekulakeverékünket két frakció frakcióban kapjuk meg.
4
--A --A dialí dialízist első elsősorban akkor alkalmazzá alkalmazzák, ha pé példá ldául szervetlen só sóktó któl, valamilyen oldó molekulatömegű megű oldószertő szertől, esetleg kis molekulatö gátló tló komponenstő komponenstől kívánjuk megszabadí megszabadítani a tová tovább tisztí tisztítandó tandó makromolekulá makromolekulát tartalmazó tartalmazó oldatot.
A membránszűrés Az edé edénybe bemé bemért, kü különbö nböző méretű retű molekulá molekulákat tartalmazó tartalmazó oldatot az edé edény aljá alját elzá elzáró membrá membránon nyomatjá nyomatják keresztü keresztül. A membrá membrán pó pórusmé rusmérete adott, enné ennél kisebb molekulá molekulák a membrá membránon átjutnak, ezzel a keveré keverék ké két ré részre bontható bontható. Pl. az átfolyó tfolyó frakció frakcióban van minden molekula, melynek a molekulatö molekulatömege 10. 000 alatti, alatti, a felső felső térben marad minden molekula, molekula, melynek molekulatö molekulatömege 10. 000 feletti.
A gélkromatográfiás eljárások A gé gélszemcse csak bizonyos mé méretű retű molekulá molekulák szá számára já járható rható át. Æ Enné Ennél nagyobb mé méretű retű részecské szecskék csak a szemcse mellett tudnak elmozdulni. Ha egy oszlopot ilyen szemcsé szemcsékkel tö töltü ltünk meg, a szemcse belsejé belsején áthaladó thaladó kisebb részecské szecskéknek hosszabb utat kell megtenniü megtenniük az oszlop aljá aljáig, ig, mint a szemcsé szemcsék kö közötti té térben mozgó mozgó molekulá molekuláknak, knak, így az oszlop mosá mosása sorá során má más- más té térfogatban jelentkeznek.
Elvá Elválasztá lasztás specifikus tö tölté ltés alapjá alapján A bioló biológiai makromolekulá makromolekulák nagy ré része tö tölté ltést hordoz • Ezt a töltést, illetve töltésváltozást a molekulák frakcionálásánál jól ki lehet használni. • A preparálási és az analitikai módszerek sok esetben a molekulák különbözőségére alapoznak.
Az elektroforé elektroforézis Ezek kö közül ké két olyan mó módszercsoport van, mely a molekulá molekulák tö tölté ltésének elté eltérésére építi az
Ez az első első olyan
elvá elválasztá lasztást:
módszer,
- az elektroforé elektroforézis - és az ioncseré ioncserélő kromatográ kromatográfia Az elvá elválasztá lasztásban a molekula mé mérete és az
amit
sikerrel alkalmaztak a
fehé fehérjé rjék
elvá elválasztá lasztására. TiseliusTiselius-féle
elvá elválasztó lasztó közeggel kialakult kö kölcsö lcsönhatá nhatásai is
elektroforé elektroforézises
közrejá zrejátszanak.
rendszer
5
Papí Papírelektroforé relektroforézis
A papí papírelektroforé relektroforézis módszere
Az elektroforé elektroforézis első első sikere akkor kö következett be, amikor oldat helyett megfelelő megfelelő hordozó hordozót haszná használtak kö közegké zegként, mely biztosí biztosította, hogy az elektroforé elektroforézis befejezté befejeztével a zó zónák ne tudjanak szé szétdiffundá tdiffundálni. Hordozó Hordozóként
elő előszö ször
speciá speciális
szű szűrőpapí papírt
alkalmaztak, amit pufferrel átnedvesí tnedvesítettek.
A gélelektroforé lelektroforézis A gé gél pó pórusmé rusmérete meghatá meghatározható rozható (a ké két Hordozó Hordozóként gé gélt haszná használnak, mely az elvá anyaggal nem lé elválasztandó lasztandó lép kölcsö lcsönhatá nhatásba. Leggyakrabban kemé keményí nyítő, az polimerek.
alkalmazott agaró agaróz, az
gé a gél akrilamid
A gé gél nagyobb felbontá felbontású elvá elválasztá lasztást tesz lehető ő v é , mint a papí í r, a diffú lehet pap diffúzió ziós hatá hatások kevé kevésbé sbé érvé rvényesü nyesülnek.
monomer ará arányá nyát a cé célnak megfelelő megfelelően szabjá szabják befolyásolja a komponensek
meg)
mozgását. Grá Grádiensdiens-elektroforé elektroforézis: zis: A gé gél pó pórusmé rusméreté retét a két elektró elektróda kö között egy intervallumon belü belül folyamatosan
vá változtatjá ltoztatják,
pórusgrá rusgrádienst
hoznak lé létre.
Elektroforézis poliakrilamid gélen
Izoelektromos fó fókuszá kuszálás
A gélelektroforé lelektroforézis alkalmas a molekulatö molekulatömeg meghatá meghatározá rozására. Elé Elérhető rhető, hogy kü különbö nböző molekulatö molekulatömegű megű komponensekbő komponensekből álló lló keveré keverék minden eleme azonos specifikus tö tölté ltéssel rendelkezzé rendelkezzék. Az elektroforetikus mozgé mozgékonysá konyságot első elsődlegesen a gé gélben lé létesí tesített té térhá rháló–méret változá ltozása fogja megszabni. Grá Grádiens gélben meghatá meghatározható rozhatók molekulatö molekulatömegei.
a
mozgé mozgékonysá konyság alapjá alapján a komponensek
6
Az ioncseré ioncserélő kromatográ kromatográfia elve
Az ioncseré ioncserélő kromatográ kromatográfia A tö tölté ltéskü skülönbsé nbségek alapjá alapján egymá á stó ó l komponenseket. egym st
vá választ
el
Oszlopés vé Oszlopvékonyré konyrétegteg-kromatográ kromatográfiá fiás változatban haszná á ljá á k. haszn lj Az ioncseré ioncserélő komponens lehet anioncseré anioncserélő vagy kationcseré kationcserélő .
Fehé Fehérjé rjék elvá elválasztá lasztására leggyakrabban az anioncseré anioncserélő DEAEDEAE-celluló cellulózt (DiEtilAminoEtil) DiEtilAminoEtil) vagy a kationcseré CMkationcserélő CM-celluló cellulózt (CarboxyMethyl) CarboxyMethyl) haszná használjá lják, de nagy szá számban alkalmaznak egyé egyéb ioncseré ioncserélő tulajdonsá tulajdonságú anyagokat is. + H C2H5 cellulóz CH2 CH2 N C2H5
O cellulóz
CH2
C
O
-
Karboximetilcellulóz
•A
vékonyrétegen kivitelezett ioncserélő elválasztást elsősorban aminosavak elkülönítésére alkalmazzák.
• A kromatográfia kationcserélő típusú, a hordozó alapanyaga szulfonált polisztirol. •A vékonyrétegen kivitelezett ioncserélő elválasztást elsősorban aminosavak elkülönítésére alkalmazzák.
Dietilaminoetil-cellulóz
AminoAminosavak elvá elválasztá lasztá sa FIXION vékonyré konyrétegen
Elvá Elválasztá lasztás adszorpció adszorpciós tulajdonsá tulajdonságok alapjá á n alapj A ma alkalmazott kromatográ kromatográfiá fiás eljá eljárások az adszorpció adszorpciós kromatográ kromatográfiá fiából fejlő fejlődtek ki. Az adszorpció adszorpciós kromatográ kromatográfia alapja a nem ionos molekulá molekuláris kö kölcsö lcsönhatá nhatás a molekula és valamilyen adszorbens kö között. A kromatográ kromatográfia haté hatékonysá konysága fü függ attó attól, hogy az adszorbenst milyen finom szemcsemé szemcseméretben tudjá tudják elő előállí llítani.
7
Anná Annál haté hatékonyabb az eljá eljárás, miné minél nagyobb az adszorbens aktí aktív felü felülete. Ezt mechanikai őrlé rléssel el lehet érni, de az őrlé sorá keletkezett szemcsé rlés során szemcsék összetö sszetöredeznek, majd mé még tová tovább tö töredeznek, végül haszná használhatatlanná lhatatlanná teszik az eszkö eszközt azá azáltal, hogy a kromatográ kromatográfiá fiás oszlopot eltö eltömítik.
A polimerizá polimerizáció ciós technika fejlő fejlődött A gömbszimmetria lehetővé tette , hogy nagy aktív felületű, viszonylag kis térfogatú oszlopokat készítsenek, melyek feloldóképessége rendkívül finom különbségek érzékelését teszi lehetővé. •A nagy nyomás alkalmazása miatt ezeket a módszereket HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) módszerként tartják nyílván.
A HPLC módszer Preparatí Preparatív és analitikai alkalmazá alkalmazása megfelel azoknak az igé igényeknek, melyeket a korszerű korszerű analitikai és preparatí laborató preparatív laboratóriumok támasztanak.
Az affinitá affinitáskromatográ skromatográfia A kromatográ kromatográfiá fiás eljá eljárásokná soknál kihaszná kihasználható lhatók azok a specifikus kö kölcsö lcsönhatá nhatások, melyek pl. enzimmű enzimműködés, vagy receptorhatá receptorhatás alapjá alapját képezik.
Lehető Lehetővé tette, hogy kis mennyisé mennyiségben kinyert fehé szerkezetvizsgá szü fehérjé rjék szerkezetvizsgálatá latához szüksé kséges enzimes bontá bontás termé termékeit megtisztí megtisztítsá tsák.
Az enzimek mű működésének alapja: az adott enzim csak egy adott szubsztrá szubsztráttal tud reagá reagálni, azt átalakí talakítani.
Ezt a techniká technikát vé vékonyré konyrétegen is megoldottá megoldották. Ezt a mó módszert OPLC (Over (Over Pressure Liquid Chromatography) Chromatography) né néven tartjá tartják szá számon.
Hasonló Hasonló elven mű működnek a receptorok is: egyegyegy receptor specifikusan ké képes megkö megkötni azt a kis molekulá molekulát, melynek kö kötése indí indítja el a hormonhatá hormonhatás esemé eseményeit.
Autoradiográ Autoradiográfia Az affinitá affinitáskromatográ kromatográfia elve
Gyakran alkalmazott mó módszer. Haszná Használata: ha a mintá mintában elő előforduló forduló anyagok némelyike radioaktí radioaktív anyaggal jelö jelölt, és a tová továbbiakban csak annak a komponensnek a viselkedé viselkedését akarjá akarják vizsgá vizsgálni. A megszá megszárított szű szűrőpapí papírt rö röntgenfilmmel fedik le, majd a radioaktivitá radioaktivitás erő erőssé sségétől fü függő ggő idő idő eltelte utá után a filmet elő előhívjá vják. A film megfeketedik azon a helyen, ahol a papí papíron radioaktí í v komponens volt jelen. radioakt
8
