A sarjadzó élesztõ sejtciklusának matematikai modellezése

BUDAPESTI MÛSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM

DOKTORI ÉRTEKEZÉS

A sarjadzó élesztõ sejtciklusának matematikai modellezése

Készítette:

Csikász-Nagy Attila okleveles biomérnök

Témavezetõ:

Dr. Novák Béla egyetemi tanár

Mezõgazdasági Kémiai Technológia Tanszék 2000

Tartalom

1. BEVEZETÉS ................................................................................. 2 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS........................................................... 4 2.1. A SEJTCIKLUS ÉS ANNAK SZABÁLYOZÓ MOLEKULÁI ........................ 4 2.2. A SARJADZÓ ÉLESZTÕ SEJTCIKLUSA .............................................10 2.3. A SEJTCIKLUS MATEMATIKAI MODELLEZÉSE .................................13 3. EREDMÉNYEK........................................................................... 16 3.1. A MINIMÁLIS EUKARIÓTA SEJTCIKLUS ..........................................16 3.1.1. A primitív APC-CDK szabályozó .........................................19 3.1.2. Fázissík diagram...................................................................20 3.1.3. A modell numerikus szimulációja..........................................23 3.1.4. Hiszterézis ...........................................................................24 3.2. A SARJADZÓ ÉLESZTÕ SEJTCIKLUSÁNAK MODELLJE .......................27 3.2.1. A modell numerikus szimulációja..........................................29 3.2.2. A sejtosztódás és a sejtnövekedés összehangolása..................31 3.2.3. Sejtciklus mutánsok szimulációja ..........................................34 3.2.4. Hiszterézis a sarjadzó élesztõ sejtciklusában ..........................36 3.3. A SARJADZÓ ÉLESZTÕ MODELL TOVÁBBFEJLESZTÉSE .....................39 4. ÖSSZEFOGLALÁS ..................................................................... 52 5. IRODALOMJEGYZÉK............................................................... 55 6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS....................................................... 59 7. MELLÉKLETEK (AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK KÜLÖNLENYOMATAI) ............ 60

1

1. Bevezetés Az élet alapegysége a sejt. A szaporodó sejtek „élete” osztódástól osztódásig tart. A két osztódás között lezajló folyamatok összességét sejtciklusnak nevezzük. A reprodukcióhoz minden sejtnek szüksége van egy olyan molekuláris szabályozó rendszerre, amely a szaporodást irányítja. Értekezésemben a Saccharomyces cerevisiae

(sarjadzó

élesztõ)

sejtciklusát

szabályozó

biokémiai

folyamatok

matematikai modellezésével foglalkozom.

A sarjadzó élesztõ a molekuláris biológusok egyik kedvenc tesztorganizmusa. Ez volt az elsõ eukarióta élõlény, melynek teljes DNS szekvenciáját feltárták (Goffeau et al., 1996). A sarjadzó élesztõ iparilag is jelentõs. A kenyérkelesztéstõl az alkohol tartalmú italok elõállításáig számos területen használják, s innen származik hétköznapi elnevezése: “pékélesztõ”.

A sejtciklust szabályozó reakcióháló számos fontos elemét ismerjük, és az egyes szabályozó fehérjék kölcsönhatásairól is sokat tudunk élesztõkben és emlõs sejtekben egyaránt (ld. Murray & Hunt, 1993) 1 . Az is ismert, hogy az élesztõsejtek szabályozó enzimei nagy hasonlóságot mutatnak (mind szerkezetileg, mind funkciójukban) az emlõssejtekben megtalálható társaikhoz. Ennek következtében az élesztõsejtek szabályozási mechanizmusának felderítése elõsegítheti az emlõssejtek sejtciklusának megismerését, valamint a hibás “mûködésbõl” származó betegségek megértését is. Az egyik legismertebb ilyen kóros állapot a rákbetegség, amikor valamilyen rendellenesség folytán a sejtszaporodás gátlása megszûnik, s a szabályozatlan osztódás sejtburjánzáshoz, illetve rákos daganathoz vezethet (Sherr, 1996).

A molekuláris biológusok kutatásai alapján ma már sokat tudunk a szabályozó rendszer elemeinek kölcsönhatásairól, de pusztán ezekbõl az eredményekbõl nehéz megjósolni egy sejt (vagy az azt leíró modell) idõbeli viselkedését. A szabályozó hálózat dinamikájának vizsgálatára a kémiai reakciókinetika azon matematikai módszereit érdemes alkalmazni, amelyeket összetett, például oszcilláló kémiai rendszerek tanulmányozására fejlesztettek ki. Egyenleteinkben biokémiai reakciók

2

sebességeit írjuk le, így talán módszerünk legszerencsésebb elnevezése: biokémiai reakciókinetika.

Ennek megfelelõen, egy feltételezett primitív eukarióta sejt (sejt)ciklusát szabályozó rendszer reakciókinetikai (matematikai) modelljébõl (Novák et al., 1998b) kiindulva és a sarjadzó élesztõben megismert egyéb szabályozó elemeket figyelembe véve, elkészítettük a Saccharomyces cerevisiae sejtciklusát szabályozó molekuláris hálózat matematikai modelljeit (Novák et al., 1999; Chen et al., 2000). Értekezésemben e modellek vizsgálatával kapcsolatos eredményeinket foglaltam össze. .

1

Az irodalmi hivatkozások számát megpróbáltam bizonyos korlát (kb.60) alatt tartani, ezért ahol csak lehetett összefoglaló cikkekre hivatkoztam, amit a szövegben ld. jelöléssel tüntettem fel. 3

2. Irodalmi áttekintés 2.1. A sejtciklus és annak szabályozó molekulái A sejtosztódási ciklus egy olyan szabályozott folyamat, amely során a sejt megduplázza minden sejtalkotójának a mennyiségét, majd elosztódik két sejtté (1.a. ábra). A legtöbb sejtalkotó szintézise (növekedés) folyamatos két sejtosztódás között, és osztódáskor többé kevésbé egyenlõen oszlanak meg a két utódsejt között (1.b. ábra). A genetikai információt hordozó DNS molekulák esetében azonban más a helyzet. Minden eukarióta sejt bonyolult mechanizmust tart fenn a DNS nukleotid sorrendjének pontos lemásolására (DNS replikáció) és a másolás eredményeként keletkezett ún. leánykromatidák precíz szétválasztására (mitózis). A DNS replikáció és mitózis precizitása biztosítja, hogy a leánysejtek csak a nekik járó DNS-t kapják, se többet, se kevesebbet (ld. Alberts et al., 1994). A növekvõ sejteknek azonban össze kell hangolniuk a növekedés folyamatosságát a kromoszóma replikáció és szegregáció periodikus folyamataival is (1.b. ábra).

A sejtciklus eseményeinek irányításáért egy komplikált szabályozási rendszer felelõs, amely nagyon hasonlóan mûködik valamennyi napjainkban élõ eukarióta sejtben. A sejtciklus „gépezet” legfontosabb tagjai: 1. egy (fejlettebb szervezetekben több) ciklin-dependens protein-kináz (Cdk) és az ezeket aktiváló ciklin molekulák 2 ; 2. kinázok és foszfatázok, melyek szabályozzák a CDK aktivitást; 3. a CDK komplexek sztöchiometrikus inhibitorai (CKI), 4. ezen szabályozó molekulák szintéziseiért felelõs transzkripciós faktorok, 5. a ciklinek és az inhibítorok lebomlásáért felelõs komplexek (SCF és APC). A ciklin és a Cdk kapcsolódása révén kialakuló aktív Cdk/ciklin komplexek képesek a sejtciklus bizonyos eseményeinek elindítására. Az esetek többségében a Cdk alegység koncentrációja nem, vagy csak keveset változik a sejtciklus folyamán. Ezzel szemben a ciklinek koncentrációja általában periodikusan változik a sejtciklus alatt, ezért is kapták a ciklizáló fehérje (ciklin) elnevezést.

2

Ezek után CDK-val jelölöm a Cdk/ciklin komplexeket. 4

a., sejtosztódás mitózis (M fázis)

G1

G2 DNS replikáció (S fázis)

b., sejtosztódás

2 sejttömeg növekedés

1

+

+

DNS 2 sejtmag

DNS szintézis

mitózis

1

G1

S

G2

M

1. ábra: A sejtosztódási ciklus a, A sejtciklus fázisai. A DNS megduplázódása a sejtciklus S fázisa, míg a leánykromatidák szétválasztása az M fázis (sejtmagosztódás vagy mitózis) alatt történik. Az S és M fázisok közé általában szünetek (G1 és G2 fázisok) ékelõdnek. b, A sejteknek el kell érniük egy bizonyos kritikus sejttömeget mind a DNS replikáció mind a mitózis megindításához. A nyilak ⊕ jellel a végüknél a sejtméretnek a DNS szintézis és a mitózis indítására gyakorolt pozitív hatását reprezentálják 3 . A ⊕ jellel ellátott nyilak a dolgozatban késõbb is arra utalnak, hogy a nyíl kiinduló pontjánál levõ komponens a nyíl fejénél levõ komponens aktivitására pozitív hatással van. A „-„ jellel ellátott nyilak pedig gátló (negatív) hatásra utalnak. 3

5

Mivel a ciklin kapcsolódása elengedhetetlenül szükséges a Cdk aktiválódásához, ezért a ciklin mennyiségének (koncentrációjának) szabályozásával a Cdk/ciklin (CDK) aktivitás befolyásolható (ld. Murray & Hunt, 1993). A ciklin fehérje koncentrációja pedig mind képzõdésének (szintézis), mind lebomlásának (degradáció) sebességével szabályozható (2. ábra).

Az egyes ciklinek szintézise különbözõ transzkripciós faktorok aktivitásától függ. A transzkripciós faktorok többsége állandóan jelen van a sejtciklus folyamán, aktivitásuk viszont csak a sejtciklus egy adott szakaszán figyelhetõ meg. Ha egy adott ciklin transzkripciós faktora aktiválódik, akkor elkezdõdik az adott ciklin szintézise és a képzõdõ ciklin molekula a Cdk-val kapcsolódik (ld. Futcher, 1996). A képzõdött komplex felelõs lehet mind a DNS replikáció mind a mitózis megindításáért.

A

DNS

replikáció

eredményeként

képzõdõ

leánykromatidákat

az

ún.

ragasztófehérjék (kohézinek) tartják össze a mitózis anafázisáig. Az anafázis elején azonban ezek a kohézin molekulák hirtelen lebomlanak és ennek eredményeként a leánykromatidák a sejt ellentétes pólusai felé mozognak (ld. Zachariae & Nasmyth, 1999). A ragasztófehérjék lebontására azonban csak akkor kerülhet sor, ha az összes kromoszóma hozzákapcsolódott már a húzóerõt kifejtõ mitózisos orsóhoz. A ragasztófehérjéket a szeparin nevû proteáz bontja szét, amit sarjadzó élesztõben Esp1-nek hívnak (3. ábra). Az Esp1-t azonban a Pds1 nevû szekurin inaktívan tartja az egész ciklus alatt egészen az anafázisig. Az anafázis kezdetén a Pds1 hirtelen lebomlik, amit ubikvitinezése okoz. Eukarióta sejtekben az ubikvitinezett fehérjéket a proteaszóma bontja le és a folyamat sebességmeghatározó lépése az ubikvitin (pontosabban poliubikvitin) hozzákapcsolása a lebontásra ítélt fehérjéhez. A Pds1 ubikvitinezéséért és ezáltal az anafázis megkezdéséért az Anafázis Serkentõ Komplex (APC = Anaphase Promoting Complex (Irniger et al., 1995)) felelõs. Az APC egy nagyon bonyolult fehérjekomplex, amelynek komponensei (alegységei) ugyancsak konzerváltak az evolúció során (Kramer et al., 1998). Az APC szubsztrátjainak (pl. Pds1) felismeréséhez segédmolekulákat igényel, sarjadzó élesztõben a Pds1 felismerését a Cdc20 fehérje segíti elõ (Shirayama et al., 1999).

6

aminosavak

TRANSZKRIPCIÓS FAKTOROK

ciklin C AP

Cdk

inaktív

P

Cdk

Cdk

foszfatáz

aktív

ciklin

CKI

CKI

ciklin

kináz

lebomlott ciklin

Cdk

ciklin

inaktív

2. ábra: A Cdk/ciklin komplex aktivitásának szabályozása. A Cdk/ciklin komplex aktivitása a ciklin alegység szintézisével (transzkripciós faktorokkal) és lebomlásával (B-típusú ciklinek esetén APC-vel) szabályozódik. A Cdk/ciklin komplex aktivitását CKI sztöchiometrikus kapcsolódása vagy gátló foszforilezés is megszüntetheti.

3.ábra: Az anafázis lépései. Zachariae & Nasmyth (1999) 3.ábrájából. Az APC a Cdc20 segítségével felismeri a Pds1 fehérjét (szekurin) és poliubikvitinezi, így azt a proteaszóma (kékes szürke komplex az ábrán) gyorsan lebontja. Ezáltal szabaddá válik az Esp1 (szeparin), amely szétbontja a kromoszómákat összetartó „ragasztófehérjéket” (kohézin).

7

Eukarióta sejtekben többfajta ciklin molekula is létezik, ezek közül a B-típusúak lebontásáért ugyancsak az APC felelõs, ezért az APC-t szokás cikloszómának is nevezni. A B-típusú ciklinek felismeréséhez azonban az APC-nek egyéb segédfehérjékre van szüksége és sarjadzó élesztõben ezek közül a Hct1 (más néven Cdh1) a legfontosabb (Schwab et al., 1997). Késõbb látni fogjuk annak jelentõségét, hogy ugyanaz az enzimkomplex (APC) felelõs a leánykromatidák elválasztásáért és a ciklin lebontás révén a CDK inaktiválásáért (4.ábra) (ld. Zachariae & Nasmyth, 1999).

kromoszóma szegregáció

Cdc20

C AP

szegregációs apparátushoz nem tapadt kromoszómák

Hct1 Cdk ciklin

Cdk +

ciklin lebontás

4. ábra: Az Anafázis Serkentõ Faktor (APC) kettõs szerepe a mitózisban. Az APC elindítja mind a kromoszómákat összetartó „ragasztó fehérjék” (közvetve) mind a mitózisos ciklinek (közvetlenül) ubikvitinezését és ezáltal gyors lebomlásra készteti azokat. A kromoszómák szétválasztásához a Cdc20 segédfehérjének, míg a ciklin lebontáshoz a Hct1 segédfehérjének kell aktiválódnia. Egyik folyamat sem játszódhat le addig, amíg a kromoszómák nem álltak fel a metafázisos síkra. Ekkor ugyanis megszûnik a gátló hatás, ami a nem felállt kromoszómáktól származik. Más ciklinek lebontása ugyancsak ubikvitinezéssel történik, ezeket azonban egy másik enzimkomplex (az ún. SCF) ubikvitinezi (ld. Zachariae & Nasmyth, 1999).

A sejtek tehát egyrészt a CDK regulációs alegység (ciklin) koncentrációjának változtatásával tudják szabályozni a Cdk/ciklin komplex mennyiségét (2. ábra). A Cdk és a ciklin kapcsolódása révén kialakuló komplex azonban nem feltétlenül aktív, mert a sejtek képesek a komplex aktivitásának szabályozására is. A Cdk/ciklin komplex

(CDK)

átmenetileg

inaktiválható 8

a

katalitikus

alegység

(Cdk)

foszforilezésével annak aktív centrumában4 (Gould & Nurse, 1989; Novák et al., 1998a), valamint gátló (inhibitor) fehérje kapcsolódásával is (2.ábra). Ezek az utóbbi években felfedezett ún. Ciklin dependens Kináz Inhibitorok (CKI) (Moreno & Nurse, 1994) a Cdk/ciklin komplexhez történõ kapcsolódásuk révén gátolják annak kináz aktivitását.

4

Mivel a sarjadzó élesztõ sejtciklusában a Cdk/ciklin komplex foszforilezésének nincs nagy szerepe, így erre itt nem térek ki részletesen. 9

2.2. A sarjadzó élesztõ sejtciklusa A S. cerevisiae vagy más néven sarjadzó élesztõ, amint azt a neve is mutatja, sarjadzással szaporodik (5. ábra). Az osztódás révén született kisméretû „leánysejtek” folyamatosan növelik a méretüket, ha a környezeti körülmények megfelelõek, vagyis elegendõ tápanyag áll rendelkezésükre. A sejtciklus G1 fázisában a sejtek a ciklus nem-sarjadzó szakaszában vannak. Amikor ezek a növekvõ sejtek elérnek egy kritikus méretet akkor megjelenik rajtuk egy sarjkezdemény, és ezzel egyidõben megkezdik a DNS replikációt is (S fázis). A sarjadzás és a DNS replikáció egyidejû megkezdését szokás a sarjadzó élesztõ sejtciklusának „Start” eseményének is nevezni. Nagyon fontos, hogy a sarj megjelenése után minden növekedés a sarjra koncentrálódik és az anyasejt már nem növeli a méretét. A DNS replikációt követõen a sejtmag az anya és a leánysejt közötti „nyak”-ba vándorol. Ezt követi a mitózis (M fázis). A leánykromatidák a mitózis anafázisa során válnak szét, amit a maganyag megduplázódásából és magosztódásból álló ciklus befejezõ lépésének („Finis”) lehet tekinteni. Ezután a sarj leválik az anyasejtrõl és a sejtosztódás után pedig az egész folyamat kezdõdik elölrõl. Fontos észrevenni, hogy az osztódással keletkezõ sejtek nem egyformák, vagyis az osztódás aszimmetrikus: a sarjból keletkezõ leánysejt kisebb mint az anyasejt (ld. Murray & Hunt, 1993).

mag vándorlás

kromoszómák e l v á l á s a, magosztódás

DNS replikáció

sarj megjelenése sejtosztódás

Növekedés

5. ábra: A sarjadzó élesztõ sejtciklusának legfontosabb eseményei.

10

A sarjadzó élesztõben kétféle ciklin csoportot (ld.

Futcher, 1996)

lehet

megkülönböztetni (6. ábra). Az egyik a Cln típusú ciklinek, amelyek közé három különbözõ ciklin molekula is tartozik (Cln1-3). A Cdk1 (a sarjadzó élesztõ egyetlen Cdk-ja, amit gyakran Cdc28-nak is neveznek) ezen ciklinekkel alkotott komplexei felelõsek több transzkripciós faktor aktiválásáért, valamint a sarjnövekedés elindításáért. A ciklinek másik csoportja a B-típusú ciklinek, vagy röviden Clb-ek amelyekbõl összesen hatféle van a sarjadzó élesztõ sejtekben (Clb1-6) 5 . A Clb-ek ugyanúgy a Cdk1-gyel alkotnak komplexet és ezek a Cdk1/Clb komplexek felelõsek a kromoszómás ciklus egyes eseményeinek (S és M fázis) meghatározott sorrendben történõ bekövetkezéséért. Konkrétan a Cdk1/Clb5 és a Cdk1/Clb6 a DNS replikáció indításáért, a Cdk1/Clb3-4 a magorsófonalak kialakulásáért, míg a Cdk1/Clb1-2 a mitózis egyéb eseményeinek lejátszódásáért felelõs.

sarjadzás + szintézis

+

Cdk1 Cln

lebomlás

Cdk1 Clb

lebomlás

+

transzkripciós faktorok

+

+ szintézis

+

+

DNS replikáció

mitózis

6. ábra: A sarjadzó élesztõ sejtciklusának Cdk/ciklin szabályozói. A S. cerevisiae egyetlen Cdk-ja (Cdk1) két különbözõ típusú ciklinnel kapcsolódhat. A Cln-ekkel alkotott komplexe a sarjadzás elindításáért, a Clb-ekkel alkotott pedig a DNS replikáció és a mitózis elindításáért felelõs. Mindkét fajta ciklin szintje a szintézis és a lebomlás sebességével szabályozható.

5

Érdemes megjegyezni, hogy a ciklinek számára vonatkozó adatok a sarjadzó élesztõ esetében a teljes genom szekvenciájának ismeretében teljesen pontosak. 11

A sarjadzó élesztõ Clb-jei redundánsak, ami azt jelenti, hogy

1. a fenti párokban (pl. Clb5-6) a két ciklinnek ugyanaz a funkciója, tehát csak az egyik gén jelenléte elég a szükséges folyamatok elindításához; 2. továbbá a fenti párok bizonyos mértékben egymás helyettesítésére is képesek: így pl. Clb5-6 hiányában a DNS replikációt a Clb1-4 indítja el.

A Cdk/Clb komplexek is képesek transzkripciós faktorokat aktiválni. A Cdk1 (Cdc28) szintje többé-kevésbé állandó a sarjadzó élesztõ sejtciklusa alatt, és koncentrációja sokkal nagyobb mint a ciklinek koncentrációinak összege, vagyis a Cdk1 mennyisége nem limitáló. Ezzel szemben mind a Cln-ek mind a Clb-ek koncentrációja jellegzetesen

változik

a

sejtciklus

alatt,

szabályozásával magyarázható (6.ábra).

12

ami

szintézisük

és

lebomlásuk

2.3. A sejtciklus matematikai modellezése A sejtciklust szabályozó molekuláris hálózat bonyolultsága felveti azt a kérdést, hogy a szabályozó molekulák kölcsönhatásainak ismeretében miként lehetne megjósolni egy sejt viselkedését. Más szavakkal megfogalmazva: hogyan lehetne ellenõrizni azt, hogy molekuláris ismereteink összhangban állnak-e a fiziológiai kísérletek eredményeivel? Ennek megválaszolásában a biokémiai reakciókinetika lehet segítségünkre. A módszer alapja az, hogy a molekuláris mechanizmus minden egyes lépéséhez

reakciósebességi

egyenletet

rendelünk,

s

így

a

komponensek

koncentrációjának idõbeli változását egy-egy differenciálegyenlettel írjuk le.

1991-ben John Tyson (1991) használta elõször ezt a módszert a sejtciklus leírására. Késõbb témavezetõmmel együttmûködve számos újabb sejtciklus modellt dolgoztak ki a biokémiai reakciókinetika alapjainak felhasználásával és ezek dinamikai tulajdonságait a nemlineáris rendszerek elméletével vizsgálták (Novák & Tyson, 1993; Novák & Tyson, 1997; Tyson et al., 1996). Doktori témámmal ebbe a kutatómunkába kapcsolódtam be én is.

Az alábbiakban egy egyszerû példán mutatom be a reakciókinetika alkalmazását a sejtciklus szabályozási hálózat leírására (7. ábra). A sarjadzó élesztõ egyik fontos szabályozó fehérjéje a Cln2 ciklin. A Cln2 szintéziséért az SBF nevû transzkripciós faktor felelõs. Ha az SBF aktív, a Cln2 mRNS szintézise gyors, ha viszont inaktív, akkor a Cln2 szintézise lassú. (ld. Nasmyth, 1996) A Cln2 mRNS és fehérje, valamint a Cdk1/Cln2 komplex koncentrációjának idõbeni változását leírhatjuk az alábbi differenciálegyenletekkel: d [mRNS] = k1 ’ + k1 ”∗[SBF] – k5∗[mRNS] dt

(1)

d [Cln2] = k2 ∗[mRNS] – k3 ∗[Cdk1]∗[Cln2] – k4 ∗[Cln2] dt

(2)

d [Cdk1/Cln2] = k3 ∗[Cdk1]∗[Cln2] – k4 ∗[Cdk1/Cln2] dt

(3)

A mRNS képzõdésében megkülönböztettünk egy SBF koncentrációtól független (k1 ’), és egy attól függõ (k1 ”) tagot. Továbbá feltételeztük, hogy a Cln2 egyforma sebességi 13

együtthatóval bomlik szabad és komplex formából egyaránt. Mivel a fehérjeszintézis (transzláció) szabályozásáról semmit nem tudni, ezért feltételezzük, hogy a fehérje koncentrációja jól követi a mRNS-ét. Ez könnyen belátható, ha feltételezzük, hogy az mRNS a rövid felezésideje (k5 nagy) miatt gyorsan követi az SBF változását, ekkor:

[mRNS] =

k 1' + k 1" ∗ [SBF] k5

Ha bevezetjük a [Cln2T ] = [Cln2] + [Cdk1/Cln2] változót (összeadjuk a 2. és 3. egyenletet) és az mRNS fenti kifejezését ebbe behelyettesítjük, akkor a: d[Cln2 T ] k ' + k 1" ∗ [SBF] = k2 1 − k 4 ∗ [Cln2 T ] dt kd egyenlet fogja leírni a Cln2 fehérje összkoncentrációjának idõbeli változását. Mivel a Cdk1 feleslegben van jelen a ciklinekhez képest és gyorsan kapcsolódik azokkal, ezért a Cln2 szabad forma koncentrációja közel nulla lesz és szinte minden Cln2 (Cln2 T ) komplex formában (Cdk1/Cln2) lesz jelen, vagyis a fenti egyenlet a Cln2 kináz aktivitás változását is leírja.

(5) (4) SBF riboszóma

DNS

(1)

Cdk1 Cdk1 Cln2

Cln2

mRNS

transzkripció

(2) transzláció

(3)

(4)

komplex képzés

7.ábra: A Cln2 koncentrációját szabályozó hálózat. Az SBF transzkripciós faktor aktivitásától függõ sebességgel képzõdik a Cln2 mRNS a DNS-en levõ génjérõl (1). A Cln2 fehérje a riboszómákon képzõdik az mRNS felhasználásával (2), és a Cln2 fehérje a Cdk1-gyel gyorsan komplexet képez (3). A Cln2 mind szabad, mind kötött formájából azonos sebességi állandóval bomlik (4). Feltételezzük, hogy a Cdk1/Cln2 képzõdésének sebesség-meghatározó lépése a transzkripció.

14

Mivel az egyszerû levezetés bármelyik ciklinre alkalmazható, ezért a továbbiakban a ciklin nevével nemcsak annak koncentrációjára, hanem Cdk1-gyel alkotott komplexére is fogok utalni.

Mivel egyenleteinket egy sejtre vonatkoztatjuk, vagyis az egyes fehérjék sejten belüli koncentrációjára írjuk fel azokat és ez gyakran igen kis értékû lehet, így felmerülhet a sztochasztikus modellezés igénye. Tekintve azonban, hogy a sztochasztikus modellek várható értékei a determinisztikus modell eredményeit szolgáltatják (Nyeste et al., 1978), valamint vizsgálódásainkban a szabályozási rendszer viselkedését akartuk megérteni, nem pedig a sztochasztikus fluktuációk okozta változásokat, így eltekintettünk a sztochasztikus modellezéstõl. Tehát modelljeink az „átlagsejt” viselkedését írják le.

Az egyes szabályozó fehérjék egy sejtre vonatkozó koncentrációiról nincsenek irodalmi adatok, így modelljeinkben dimenziómentes koncentrációkat használtunk. Ebbõl adódóan az összes sebességi állandónk dimenziója min-1 lett. (A sebességi állandók meghatározásának részletei a 2. melléklet „Appendix A” fejezetében (385387. oldal) találhatóak.) A sejttömeg és a sejtciklus egyes eseményei között eltelt idõ vizsgálódásaink fõ célpontjai voltak. Ezért az idõt nem dimenziómentesítettük, a sejttömeg dimenziója önkényes, „szimulációs” egység, melyet a sarjadzó élesztõ mutánsok vizsgálatakor, a vad típusú sejtekre normálva, átváltottunk femtoliterre.

Ha egy komplex szabályozóhálózat minden elemére felírunk a fentiekhez hasonló egyenletet, akkor egy zárt differenciálegyenlet rendszert kapunk. Ennek analitikus megoldása két változó fölött már igen bonyolult, sõt általában lehetetlen, ezért az ilyen egyenletrendszerek számítógép segítségével numerikusan oldhatóak meg. Ilyen numerikus szimulációkkal vizsgáltam több eukarióta organizmus sejtciklus modelljét (Chen et al., 2000; Novák et al., 1998a; Novák et al., 1998b; Novák et al., 1999; Sveiczer et al., 2000)

15

3. Eredmények 3.1. A minimális eukarióta sejtciklus Az eukarióta sejtek a DNS állományukat több helyrõl (replikációs origó) kezdik el másolni. Minden egyes DNS szakasznak azonban csak egyszer szabad lemásolódnia két egymást követõ mitózis között, de ez az egy másolás mindenképpen be kell, hogy következzen. Tehát minden replikációs origó legfeljebb csak egyszer aktiválódhat egy sejtciklus alatt (pontosabban a „Start” és a „Finis” között). A replikációs origók aktiválódásának szabályozásáért eukarióta sejtekben az ún. „Licensing Factor”-ok (LF), vagy „engedély fehérjék”, felelõsek (ld. Blow, 1993). A replikációs origók aktiválódásának szükséges feltétele, hogy elõzetesen LF-ok kapcsolódjanak hozzájuk. Erre a sejtciklus G1 fázisában kerül sor, amikor a sejtekben nincs illetve nagyon kicsi a Cdk/ciklin (CDK) aktivitás. Ennek az a magyarázata, hogy a CDK foszforilezi a LFokat és ezáltal serkenti a ubikvitinezéses lebontásukat 6 , ezért a LF-ok csak akkor vannak számottevõ mennyiségben jelen amikor a CDK aktivitás kicsi (G1 fázis).

Amint azt már korábban említettem, a DNS szintézis megkezdéséhez a CDK aktivitás megjelenésére van szükség. A CDK aktivitás megjelenése a sejtciklus „Start” eseményénél következik be, és a replikációs apparátus bizonyos fehérjéinek foszforilezésével indítja el a DNS replikáció folyamatát. De a CDK a DNS szintézis elindításán túlmenõen megindítja a LF molekulák ubikvitinezéses lebontását is (ld. fentebb). Így mindaddig, amíg a CDK aktivitás jelen van a sejtben, a replikációs origók nem képesek még egyszer aktiválódni.

Amikor minden kromoszóma teljesen megduplázódott és a mitózisos orsóhoz kapcsolódott, aktiválódik az APC (Anafázis Serkentõ Komplex) és lejátszódik a sejtciklus „Finis” eseménye: a leánykromatidákat összetartó „ragasztófehérjék” és a Cdk/ciklin komplexek ciklin alegységeinek lebontása. Az APC-t a Cdc20 illetve a Hct1 segédfehérjéi teszik alkalmassá az elsõ illetve a második folyamat elindítására. A leánykromatidák szétválásával egyidõben lecsökken a CDK aktivitás a sejtben, így a replikációs origókon újra megjelennek a LF molekulák, engedélyt adva ezzel egy következõ DNS replikációra. Ahhoz azonban, hogy a következõ „Start” esemény 6

A foszforilezett LF molekulákat ugyanaz az SCF ismeri fel és ubikvitinezi, amelyik a CKI és a Cln-ek ubikvitenézéért felelõs. 16

bekövetkezzen, a ciklin-lebontó APC aktivitást ki kell kapcsolni, hogy a CDK aktivitás újra megjelenhessen. Ez az APC segédfehérjéinek (Cdc20 és Hct1) lebontásával, illetve inaktiválásával történik meg.

Növekedés

+

+

“Start” +

+ „G1” C AP

+

„S/M” Cdk

APC

+

Cdk ciklin

+

+

“Finis” Nem replikált DNS Nem felállt kromoszómák

8. ábra: A sejtciklus szíve, az APC-CDK antagonizmus A növekedés hatására a CDK feldúsul a sejtmagban, ahol foszforilezéssel inaktiválja az APC segédfehérjéjét (Hct1), valamint foszforilezi a replikációs komplexeket és ezzel elindítja a DNS szintézist. A foszforilezett replikációs komplexek replikációkor inaktiválódnak és amíg CDK aktivitás van jelen, nem tudnak újra képzõdni. Amikor a kromoszómák felálltak a metafázisos síkra, az APC aktiválódik, és elindítja a kromoszómákat összetartó ragasztófehérjék lebontását, valamint lebontja a CDK ciklin alegységét. Így a replikációs komplexek újra össze tudnak állni és várnak a DNS szintézist indító foszforilezésre. A sejtciklust alapvetõen két részre lehet osztani: -

G1 fázisban a kromoszómák nem-replikált állapotban vannak, az APC aktivitás nagy, a CDK aktivitás pedig kicsi.

-

Ezzel szemben az S/M fázisban a kromoszóma replikáció folyamatban van, illetve befejezõdött, az APC aktivitás kicsi, ezért a CDK aktivitás viszont nagy.

Nem szükséges, hogy felismerhetõ G2 fázis legyen egy egyszerû eukarióta sejtben, mivel a mitózis egyes eseményei (profázis és metafázis) elkezdõdhetnek a „Start”-ot követõen, és a DNS szintézissel párhuzamosan lejátszódhatnak egészen a metafázisig bezárólag, akárcsak a mai sarjadzó élesztõben. A DNS replikáció (S fázis) és a mitózis kezdeti eseményeinek átlapolására azért van lehetõség, mert a kis genom 17

méret nem igényel intenzív kromoszóma kondenzációt az M fázis alatt. Ezzel szemben a sejtciklus „Finis” eseményére akkor és csak akkor kerülhet sor, amikor a DNS replikáció már teljesen befejezõdött és minden egyes kromoszóma a mitózisos orsóhoz tapadt.

Kim Nasmyth (1995; 1996) szerint ez a legprimitívebb eukarióta sejtciklus szabályozási rendszer a „Start”-nál billen a G1-bõl az S/M állapotba 7 és a „Finis” során pedig onnan vissza a G1-be. A két állapot periodikus váltakozása révén a „Start” és a „Finis” felváltva következnek be, ami biztosítja a kromoszóma replikáció és a leánykromatidák elválasztásának alternálását. Ez a primitív sejtciklus szabályozás nem feltétlenül az evolúciósan elõször kialakult rendszer, de a mai eukarióták sejtciklus irányításának az alapja. Az a minimális rendszer, ami már a sejtosztódás és sejtnövekedés összehangolását megvalósította.

Nasmyth (1995) felismervén a primitív eukarióta sejtciklus ezen két állapotát, arra a következtetésre jutott, hogy ezt a két állapotot az APC és a CDK antagonisztikus versengése hozza létre. Az APC lebontja a CDK ciklin alegységét és ezáltal negatív hatást gyakorol a CDK-ra. Az antagonizmus feltételezésébõl kiindulva, Nasmyth prognosztizálta, hogy a CDK is negatív hatást fejt ki az APC-re, amit a késõbbi kísérletek igazoltak is: a CDK foszforilezéssel inaktiválja az APC ciklin felismerõ Hct1 alegységét (ld. Zachariae & Nasmyth, 1999). A CDK és az APC antagonisztikus versengése lehet az eukarióta sejtciklus „szíve” (8. ábra), mivel ez a mechanizmus biztosítja a kromoszóma replikáció és szegregáció periodikus bekövetkezését.

Ezt a feltételezését, hogy a sejtciklust a legkorábbi eukariótákban az APC és a CDK antagonisztikus viselkedése szabályozta, öntöttük matematikai formába (Novák et al., 1998b, ld. 1. melléklet), amit az alábbiakban röviden ismertetek.

7

A szabályozó rendszer állapotai megfeleltethetõek a sejtciklus egyes fázisainak. Ennek megfelelõen az elkövetkezõkben a G1 és S/M „állapotok” a szabályozó rendszer állapotára utalnak, míg a G1 és S/M „fázisok” a sejtciklus szakaszait jelölik. 18

3.1.1. A primitív APC-CDK szabályozó A primitív eukarióta sejtciklus szabályozás leírására alkalmazott mechanizmus (9.ábra) az APC és a CDK antagonisztikus viselkedésén alapszik: a CDK inaktiválja az APC-t, ezzel szemben az APC aktív formája megindítja a Cdk/ciklin dimerek ciklin alegységének degradációját. Tegyük fel, hogy a CDK katalitikus alegysége (Cdk) stabilis és állandó koncentrációban van jelen a sejtben, valamint a Cdk és a ciklin kapcsolódása gyors folyamat. Ebben az esetben a CDK és az APC közötti antagonisztikus kölcsönhatás leírható az alábbi két kinetikai egyenlettel: d[CDK] = k1 ∗ mass − (k '2 ∗ (1 − [APC]) + k"2 ∗ [APC])∗ [CDK] dt

(1a)

d[APC] (k'3 + k"3 ∗[ACT] ) ∗ (1 − [APC]) k 4 ∗ [CDK]* [APC] = − dt J 3 + 1 − [APC] J 4 + [APC]

(1b)

ahol [CDK] = [Cdk/ciklin dimerek a sejtmagban] és [APC] = az APC aktív hányada. Ezekben az egyenletekben k1 , k2 ’, stb. sebességi állandók, és a „mass” a citoplazma tömegének egy önkényes egységben vett mérõszáma. kas

kad

apoACT

nem felállt kromoszómák

+

nem replikált DNS

+

kai

kaa

lebomlott aktivátor

+

ACT

Sejtmag

inaktív

k3 APC

C AP

k4 +

+

aktív

Cdk

Cdk ciklin

k2

lebomlott ciklin

Cdk Cdk ciklin

asszociáció (gyors)

Ciklin

k1

Aminosavak

9. ábra: A primitív APC-CDK szabályzó. A ciklin alegység (ovális) szintézisét (1. lépés) követõen, gyorsan és irreverzibilisen köt a Cdk alegységhez (téglalap), ezután az aktív dimer azonnal a sejtmagba jut. A ciklin alegység az APC (Pac-Man ikon) által lebomlik (2. lépés). Az APC-t a Cdk/ciklin dimer kikapcsolja (4. lépés), míg az „aktivátor” (ACT) bekapcsolja (3. lépés). Az aktivátor (zöld csillag) állandó sebességgel képzõdik egy inaktív (apo) formában (as. lépés), és az APC bontja le (ad. lépés). Az újonnan képzõdött aktivátornak az aktív formába kell jutnia (aa. lépés), amit a nem replikált DNS-rõl és a mitózisos orsókhoz még nem tapadt kromoszómákról érkezõ jelek gátolnak (ai. lépés). 19

A ciklin a citoplazmában a citoplazma méretével arányos mértékben (k1 ∗mass) szintetizálódik, gyorsan hozzáköt a feleslegben jelenlévõ szabad kináz (Cdk) alegységekhez és a kész dimer (CDK) a sejtmagba kerül és ott felhalmozódik. A CDK aktivitás a ciklin lebomlás hatására tûnik el. A lebomlás sebességét az határozza meg, hogy az APC milyen arányban oszlik meg a két formája közt: k2 ’ és k2 ” azok a sebességi állandók, amelyek a kevésbé aktív és az aktívabb formát jellemzik (Feltételezzük, hogy az enzimes folyamatban az enzim (APC) nincs telítve a szubsztrátjával (CDK).) Az APC aktiválás és inaktiválás leírására Michaelis-Menten kinetikát használunk: a (k3 ’+ k3 ”∗[ACT]) és k4 ∗[CDK] az aktiválás és inaktiválás Vmax-ai (ACT és CDK a folyamatokat katalizáló enzimek). Egységnyinek vettük az összes APC koncentrációt és a Michaelis konstansokat (J3 és J4 ) pedig az összes APC szinthez képest alacsonynak vettük, így az APC aktivitás egy nagyon érzékeny kapcsolóként viselkedik (Goldbeter & Koshland, 1981). A rendszer vizsgálatához egyelõre vegyük az APC-t inaktíváló enzim (ACT) aktivitását egy paraméternek 8 .

3.1.2. Fázissík diagram Egy pár nemlineáris közönséges differenciálegyenlet (ODE) tanulmányozására a fázissík technika az egyik legalkalmasabb módszer (Edelstein-Keshet, 1987). A fázissík jelen esetben egy olyan derékszögû koordináta rendszer, ahol a [CDK] az [APC] függvényében van ábrázolva. Minden egyes biokémiailag reális [CDK], [APC] koncentráció, aktivitás pár meghatározza a szabályozó rendszer egy állapotát és megfelel a fázissík egy pontjának. Az ODE-k határozzák meg minden egyes pontban, hogy milyen gyorsan változik a CDK és az APC aktivitása. Geometriailag az ODE-k egy kis nyilat rendelnek minden ponthoz és ezt a nyílhalmazt hívjuk vektorsíknak. Ahol a ciklin szintézis és degradáció tökéletes egyensúlyban van, ott dCDK/dt=0, tehát a vektorsík vertikális. A fázissík ezen pontjainak halmazát CDK egyensúlyi görbének nevezzük, ami a következõ egyenlettel adható meg: [CDK] =

k1 ∗mass k '2 ∗ (1 − [APC]) + k "2 ∗ [APC] (2a)

8

Amelyik egyenletben ACT-t használok, ott paraméternek, ahol pedig [ACT]-t, ott változónak tekintem az aktivátort. 20

Hasonlóan, ahol az APC aktiválás sebessége megegyezik az inaktiválás sebességével, ott horizontális a vektorsík, és ezt az ún. APC egyensúlyi görbét az alábbi egyenlet adja meg: [ CDK] =

(k '3 + k "3 ∗ ACT) ∗ (1 − [APC]) J + [APC] ∗ 4 " k 4 ∗ [APC] J 3 + 1 − [APC] (2b)

A matematikai zsargon ezeket az egyensúlyi görbéket nullklínáknak nevezi. Ezt a két egyensúlyi görbét (nullklínát) ábrázoltuk a 10. ábrán. Ahol az egyensúlyi görbék metszik egymást, ott a szabályozó rendszer állandósult állapotban van. A állandósult állapot stabilis, ha bármilyen kis CDK ill. APC változtatásra a rendszer visszatér az eredeti állapotába, egyébként pedig instabilis. A 10A. ábrán a paraméterek úgy vannak megválasztva, hogy az egyensúlyi görbék három ponton is metszik egymást: az egyik stabilis állandósult állapotban az APC aktív és ezért kicsi a CDK aktivitás; míg a másik stabilis állandósult állapotban éppen fordítva, az APC inaktív és így nagy a CDK aktivitása. Az instabilis állandósult állapot köztes APC és CDK koncentrációkkal jellemezhetõ. A matematikusok ezeket a stabilis állandósult állapotokat

„csomópontoknak”,

az

instabilis

állandósult

állapotot

pedig

„nyeregpontnak” hívják. A két csomópont megfelel a korábban említett G1 illetve S/M állapotoknak. 1.2

A

G1

1

APC

APC

1.2

mass = 1 ACT tot = 0.05 kai = 0.5

0.8

B

1

mass = 1.6 ACT tot = 0.05 kai = 0.5

0.8

0.6

0.6

0.4

0.4 0.2

0.2

S/M

S/M 0

0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0

1.6

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

CDK

1.6

1.2

1.2

D

G1

1

APC

APC

1.4

CDK

C

G1

1

mass = 1.75 ACT tot = 1 kai = 7

0.8

0.8

mass = 2 ACT tot = 1.5 kai = 0.5

0.6

0.4

0.6 0.4 0.2

0.2

S/M 0

0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0

1.6

CDK

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

CDK

10. ábra: Az APC-CDK szabályozó fázissík görbéi a sejtciklus során. Mind a négy mezõben a Cdk egyensúlyi görbét (kék) és az APC egyensúlyi görbét (piros) ábrázoltuk. A metszéspontokban stabilis csomópontok (•) és instabilis

nyeregpontok (ο) jönnek létre. Az ábrán jelöltem, hogy az adott metszéspontok mely paraméter értékeknél adódnak. 21

A szabályozó rendszer attól függõen, hogy a 10A. ábrán milyen kezdeti értékektõl indul, el fogja érni vagy az egyik vagy a másik stabilis állandósult állapotot és ott marad mindaddig, amíg valami nagy változás nem történik. Ez lehet egy kellõen nagy fluktuáció az egyik változóban, vagy egy nagy változás az egyik paraméterben. Tételezzük fel, hogy a szabályozási rendszer a G1 állapotban tartózkodik. Forgatókönyvünk szerint a „Start" az a kritikus esemény, ami a sejtnövekedés hatására a sejtet G1-bõl S/M-be löki. Amint a sejttömeg (mass) növekszik, a CDK egyensúlyi görbe jobbra felfelé mozdul, és ezáltal a G1 csomópont és az instabil nyeregpont összeütközik, majd eltûnik (10B. ábra). A matematikusok ezt nyeregcsomó bifurkációnak (Noszticzius & Wittmann, 1992) hívják. Esetünkben a sejttömeg (mass) nevezhetõ ún. bifurkációs paraméternek. A „Start"-hoz szükséges kritikus sejttömeget a „mass” értéke adja meg a bifurkációpontban és bármely ennél nagyobb „mass” érték esetén csak egy stabilis állandósult (S/M) állapot létezik, ahova a rendszernek tartania kell. A „Start" átmenet során az APC inaktiválódik, a CDK pedig aktiválódik, mert a G1 állapot eltûnik és csak az S/M stabilis állandósult állapot marad a rendszer számára.

A „Finis" az az esemény, amely visszalöki a sejtet S/M-bõl G1-be. Feltételeztük, hogy ez egy „aktivátor" (ACT a 9. ábrán) hatására történik meg, ami ellensúlyozza a CDK gátló hatását az APC-n. Modellünkben ez az aktivátor folyamatosan szintetizálódik és az APC hatására lebomlik. Az újonnan szintetizált „aktivátor" egy hatástalan „apo” formában képzõdik, amit poszt-transzlációsan módosítani kell, hogy aktív legyen. Ezt a két ellentétes irányú reakciót „aa”-val ill. „ai”-vel jelöltem a 9. ábrán. A Start-ot követõen az ACT akkumulálódik, mert bomlása APC függõ és a Start-nál az APC inaktiválódik. Az ACT molekulák többsége azonban hatástalan („apo” formában) marad mindaddig, amíg a DNS replikáció folyik vagy míg a kromoszómák össze nem kapcsolódtak a magorsó fonalakkal, mert ezen idõ alatt az „ai” lépés sebessége nagyobb mint az „aa” lépésé (ld. 10C. ábra). Amikor mindezen folyamatok lejátszódtak, akkor az ACT molekulák inaktiválódási sebessége („ai” lépés) lecsökken az eredeti értékre, ezért az apoACT átalakul ACT-vé és aktiválja az APC-t. A fázissíkon (10D. ábra) ez megfelel az APC egyensúlyi görbe jobbra tolódásának, ami az S/M állapot nyereg-csomó bifurkáció általi eltûnését okozza, ezért a szabályozó rendszer visszatér a G1 állapotba. Amint a sejt elosztódik (mass→mass/2) és az ACT-

22

t lebontja az APC, akkor mind a CDK mind az APC egyensúlyi görbe visszatér a 10a. ábrán látható eredeti pozícióba és a ciklus kezdõdik elölrõl.

3.1.3. A modell numerikus szimulációja A 9. ábrán látható mechanizmus teljes leírásához az 1a-1b. egyenleteket ki kell egészíteni az alábbi differenciálegyenletekkel:

dmass = ì ∗ mass dt (1c) d[ACTT ] = k as − (k'ad ∗(1 − [APC]) + k"ad ∗[APC]) ∗ [ACTT ] dt (1d) d[ACT] = k aa ∗ ([ACTT ] − [ACT] ) − k ai ∗ [ACT] − (k'ad ∗(1 − [APC]) + k"ad ∗[APC]) ∗ [ACT] dt (1e)

ahol [ACT](t)=[ACT] és [ACTT ](t)=[ACT]+[ApoACT]. A kai egy függvény, ami a nem replikált DNS és a nem felállt kromoszómák hatását írja le a modellben, aminek értékét jellegzetesen változtatjuk a sejtciklus alatt (1. melléklet 3. ábra).

Az 1. melléklet 4. ábrája az 1a-e egyenletek egy tipikus „oszcillációs” megoldását mutatja. Különbözõ növekedési sebességeknél (µ) végzett szimulációk azt mutatják, hogy a két egymást követõ sejtosztódás között eltelt ciklusidõ mindig egyenlõ a tömeg duplázódási idõvel, (ln2)/µ, aminek kiegyensúlyozott növekedésnél mindig igaznak kell lennie. Ez a növekedési sebesség megegyezik a sejtpopulációra vonatkozó fajlagos növekedési sebességgel, így adott körülmények között állandónak tekinthetjük.

A

modell

azért

rendelkezik

a

kiegyensúlyozott

növekedés

tulajdonságával, mert a „Start" átmenetet a sejtméret szabályozza. Mivel az anyasejt tökéletesen félbe osztódik, a két egymást követõ „Start" közötti idõ pontosan megegyezik a tömeg duplázódási idõvel.

23

3.1.4. Hiszterézis A primitív eukarióta ciklust jól meg lehet feleltetni egy hiszterézis hurok (Farkas et al., 1992) körüli forgásnak. Hiszterézis olyan rendszerekben fordul elõ, amelyeknek több állandósult állapotuk van, és arra a tényre utal, hogy a rendszer megfigyelt állapota nemcsak a paramétereinek az értékén alapszik, hanem a „történetétõl” is függ (a rendszer elõzõ állapotától). A hiszterézis hurok illusztrálásához visszatérek a két komponensû rendszerhez (1a,b egyenletek). Az APC állandósult állapotának értékeit a mass/(k3 ’+k3 ”∗ACT) függvényében ábrázolva, miközben az összes többi paraméter értéke

állandó,

egy

bifurkációs

diagram

kapható.

Azért

választottuk

a

mass/(k3 ’+k3 ”∗ACT)-t bifurkációs paraméternek, mert így a számlálóban a „Start”, a nevezõben a „Finis” átmenetért felelõs „paraméterek” szerepelnek. A (2a,b) egyenletekbõl esetén mass/(k3 ’+k3 ”∗ACT) kifejezhetõ, mint az APC állandósult állapotának függvénye:

(

)

mass k '2 ∗ (1 − [APC]) + k "2 ∗ [APC] ∗ (1 − [APC]) ∗ (J 4 + [APC]) = k '3 + k "3 ∗ ACT k 1 ∗ k "4 ∗ [APC] ∗ (J 3 + 1 − [APC])

amit a 11. ábrán ábrázoltunk. A bifurkációs paraméter bizonyos értékeinél az APCnek három alternatív állandósult állapota van: két csomópont, amit egy nyeregpont választ el. A kisméretû, újszülött, G1 fázisú sejtek az A pontban tartózkodnak, mert az APC aktív (11. ábra). Amint a sejttömeg (mass) növekszik, a szabályozó rendszer a felsõ szaggatott vonallal jelzett pályán mozog, miközben a sejt G1 fázisban marad (aktív APC), mindaddig amíg a sejt el nem ér egy kritikus sejttömeget. Kritikus sejttömeg elérésekor a G1 állapot egy nyereg-csomó bifurkációval eltûnik (B pont) és a szabályozó rendszer a C pontba kerül: APC inaktiválódik és ennek következtében a CDK aktiválódik. Ez a sejtciklus „Start" átmenete. A „Start"-ot követõen, miután a DNS replikáció befejezõdött és a kromoszómák felálltak a metafázisos síkra, az ACT értéke hirtelen megnövekszik, ezért a bifurkációs paraméter lecsökken. Az S/M állapot eltûnik egy nyereg-csomó bifurkációval a D pontban és az APC aktiválódik, ami a szabályozó rendszert visszabillenti G1 állapotba („Finis" átmenet).

24

A sejtciklus átmenetek ebben a forgatókönyvben az instabilis állandósult állapothoz (nyeregponthoz) kapcsolódnak, ami egy integráns része a hiszterézis huroknak. Ahogy a mass/(k3 ’+k3 ”∗ACT) értéke a sejtnövekedés és a kromoszómás ciklus hatására változik, a nyeregpont elõre-hátra ingázik, „elpusztítva” elõbb a G1 állapotot, majd az S/M állapotot. A hiszterézis hurok nyereg-csomó bifurkációi az ACT és a sejttömeg (mass) lassú, lépésszerû változásait gyors átmenetekké („Start" és a „Finis") alakítják át. Tehát a mass/(k3 ’+k3 ”∗ACT) arány periódikus változásai „lökdösik körbe” a sejtet a sejtciklus hiszterézis hurkán. Ez az arány szoros kapcsolatot mutat a ún. nukleo-citoplazmás aránnyal, ami bizonyítottan (Novák & Tyson, 1993) a növekedõ sejtek ciklusait szabályozza. Csupán nem növekedõ, embrionális sejtek (sejt)ciklusánál tapasztalhatunk spontán oszcillációt, növekedõ sejtek ezt a hiszterézis hurkot járják körbe sejtciklusuk folyamán. Hiszterézis hurok A

növekedés

1 APC

B

csomó

0.8

APC

0.6

0.4

“Finis”

n

r ye

“Start”

eg

0.2

APC

C

csomó

D

0

DNS repl. & kromoszóma felállás -0.2 0

2

4

6

8

10

mass / (k3 ’+k3”*ACT)

11. ábra: Az APC-Cdk szabályozó bifurkációs diagramja. Az abszcisszán a bifurkációs paraméter: mass/(k3’+k3”∗ACT) szerepel, az ordinátán pedig az APC állandósult állapota látható. A bifurkációs paraméter értékek egy tartományában (1.8 < mass/(k3 ’+k3” ∗ACT) < 6.9) az APC-nek (és ebbõl kifolyólag a Cdk-nak is) három lehetséges állandósult állapota létezhet. B és D pontoknál az APCaktív és APC-inaktív állapotok egy-egy nyeregcsomó bifurkációval alakulnak egymásba. Az ábrán a hiszterézis hurok számolt, a trajektória pedig sematikus.

25

Ez az egy egyszerû modell, amit eddig tárgyaltunk rendelkezik egy eukarióta sejtciklus minden lényeges tulajdonságával: pre-replikatív és poszt-replikatív állapotokkal, a „Start"-nál ható méretkontrollal és egy ellenõrzõ mechanizmussal, ami összekapcsolja a kromoszómás ciklust a „Finis” átmenettel.

Az elõzõekben bemutatott primitív modellt kiegészítettük egy ciklin dependens kináz inhibitorral (CKI), valamint a CDK foszforilezéses inaktiválásával (Novák et al., 1998b). Késõbb ezekbõl az egyszerû modellekbõl kiindulva elkészítettük mind a hasadó mind a sarjadzó élesztõ sejtciklusának részletes matematikai modelljeit (Chen et al., 2000; Novák et al., 1998a; Novák et al., 1999; Sveiczer et al., 2000).

A hasadó élesztõ sejtciklusának mindhárom szabályozópontját tartalmazó modell (Novák et al., 1998a) megalkotása után az abban feltételezett mechanizmusunkat igazolták is (Martin-Castellanos et al., 2000). A modellt továbbfejlesztettük, és ezzel az új modellel (Sveiczer et al., 2000) már a hasadó élesztõ egy rendkívül érdekes mutánsának viselkedését is le tudtuk írni (Sveiczer et al., 1996).

Értekezésem további részében a hasadó élesztõ modellekre nem térek ki részletesen, csak a sarjadzó élesztõre vonatkozó modelljeinket mutatom be.

26

3.2. A sarjadzó élesztõ sejtciklusának modellje A primitív eukarióta sejtciklus elõzõekben ismertetett modelljét kiegészítettük egy CDK inhibitorral (CKI). Ehhez a modellhez a sarjadzó élesztõ különbözõ ciklinjeit, transzkripciós faktorait, APC szabályozóit hozzáadva megalkottuk a sarjadzó élesztõ sejtciklusának egy olyan modelljét, amellyel igen részletesen leírható nemcsak a vad típusú sejt fiziológiai viselkedése, hanem számos mutáns sejté is. A matematikai modell alapját képezõ szabályozási hálózat egyszerûsített vázlata a 12. ábrán9 látható és a 2. melléklet bevezetõjében (370-372. oldal) olvasható indoklás a részleteket illetõen. Röviden összefoglalva, a sarjadzó élesztõ kilenc ciklinje közül négyet különböztettünk meg, ami jól megfelel a korábban már ismertetett redundanciának. Két Cln-t veszünk figyelembe (Cln3 és Cln2), mert a Cln1 szerepe azonos a Cln2ével. A Clb5-6 és a Clb1-2 párokból csak a Clb5-öt és Clb2-öt szerepeltetjük a modellben, mivel a Clb3 és Clb4 hiányában a sejtciklus teljesen normálisan fut, így ezeket egyszerûen elhagyjuk.

A primitív eukarióta sejtciklus modell jellegzetes antagonizmusa a sarjadzó élesztõben a Cdk1/Clb2 és az APC/Hct1 (más néven APC/Cdh1) versengésében érvényesül. Érdemes megfigyelni azonban, hogy ehhez az antagonizmushoz (pozitív visszacsatolás) a sarjadzó élesztõ sejtciklus szabályozásában egy újabb antagonizmus társul: a sarjadzó élesztõ CKI-je (Sic1) sztöchiometrikusan gátolja a Cdk1/Clb2,5 komplexeket, amelyek viszont foszforilezéssel serkentik a Sic1 lebontását.

Az elõzõekben bemutatott módszerrel a 12. ábrán látható komponensek mindegyikére egy egyenletet felírva, a szabályozó hálózatot egy nemlineáris közönséges differenciálegyenlet rendszerré alakítottuk (2. melléklet 1. táblázat). Az egyenleteket most is a komponensek (fehérjemolekulák) koncentrációira írtuk fel, úgy ahogy azt a 2.3. pontban tárgyaltuk, összevonva a transzkripció (génátírás) és transzláció (fehérjeszintézis) folyamatát.

9

Az elõzõekben APC-vel jelölt ciklin lebontó komplexet innentõl a ciklin lebontásért felelõs szabályozójával, a Hct1-gyel (más ismert neve: Cdh1) jelölöm. Míg az eddigiekben ACT-vel jelölt aktivátort Cdc20-szal, mivel ismert, hogy a S. cerevisiae-ban az APC/Cdc20 az az aktivátor, ami az APC/Hct1-et aktiválja. 27

A kísérleti eredményekkel összhangban feltételeztük, hogy a Cdk1 alegység feleslegben (nem limitáló koncentrációban) van jelen, ezért az egyes Cdk1/ciklin komplexek koncentrációja megegyezik az adott ciklin koncentrációjával. Ennek megfelelõen a késõbbi tárgyalásban az adott ciklin nevével a Cdk1/ciklin komplexre is utalunk. lebomlott Cdc20

apoCdc20

+

replikálatlan DNS és magorsóhoz nem tapadt kromoszómák

Cdc20

inaktív

Hct1

Hc

Cdk1

t1

aktív

+ +

Cln2

+

lebomlott Clb2

+

MCM1

Cdk1

Clb2 Sic1

Cdk1 Cdk1

mitózis

Clb2

lebomlott Sic1

Sic1

Sic1

+

P

SCF

gyors

Sic1

+ Cdk1

Clb5

Cdk1

lebomlott Clb5

Cdk1

MBF

Clb5

+

DNS replikáció Cdk1

SBF Cdk1

Cln3

+

Cln2 +

sarjadzás

lebomlott Cln2

12. ábra: A sarjadzó élesztõ sejtciklus szabályozóinak kölcsönhatásai. A sejtnövekedés hatására a Cdk1/Cln3 szintje a sejtmagban elér egy kritikus értéket és bekapcsolja az SBF és MBF transzkripciós faktorokat. Az SBF elindítja a Cln2 szintézisét, ami a sarjadzás elindításához szükséges. Az MBF felelõs a Clb5 képzõdéséért, és a Cdk1/Clb5 aktivitás a DNS szintézis elkezdéséhez vezet. A Cdk1/Clb5 aktivitás elõször azonban még gátlódik a Sic1 (CKI) révén. Azonban, ahogy a Cln2 szintje tovább nõ, elkezdi a Sic1 foszforilezését, ami az SCF által gyorsan lebomlik, így felszabadul a Clb5. A Cdk1/Cln2 másik szerepe, hogy kikapcsolja a Clb2 (a mitózis indításáért felelõs ciklin) lebontásáért felelõs Hct1 nevû, APC szabályzó fehérjét. Ezzel lehetõvé teszi, hogy a Cdk1/Clb2 pozitív visszacsatolással aktiválja saját szintézisét az MCM1 nevû transzkripciós faktoron keresztül. A Cdk1/Clb2 azontúl, hogy elindítja a mitózist, kikapcsolja a Cln2 szintézisét is, és elindítja a Cdc20 (az APC másik szabályzója) szintézisét. A Cdc20 azonban csak akkor aktiválódik, amikor a kromoszómák felálltak a metafázisos síkra. A Cdc20 ekkor elindítja a kromoszómák szegregálását (ábrán nincs feltüntetve) és aktiválja a Hct1-et, és ezzel elindítja a Clb2 lebontását. 28

3.2.1. A modell numerikus szimulációja A differenciálegyenlet-rendszert numerikus szimuláció módszerével vizsgáltuk számítógépen. A számítógépes szimulációhoz azonban ismernünk kell a modellben szereplõ reakciósebességi állandók és egyéb paraméterek értékeit. Szerencsére a modell felállításához felhasznált irodalmi adatokból meg lehetett határozni a paraméterek egy részének értékét (ld. 2. melléklet 385-387. old.). Az irodalmi adatokból nem meghatározható paramétereket pedig úgy próbáltuk beállítani, hogy a szimulációk során kapott idõgörbék minél tökéletesebb hasonlóságot mutassanak az egyes komponensek irodalomból megismert változásával. A szimulációkhoz használt paraméter értékekrõl a 2. melléklet 2. táblázata ad áttekintést.

A 13. ábra egy ilyen számítógépes szimuláció alapján mutatja három különbözõ ciklin (Cln2, Clb2 és Clb5) koncentráció változását egy sarjadzó élesztõ leánysejtjének sejtciklusa alatt. Természetesen a program számolja a 12. ábrán mutatott összes komponens idõbeli változását, de itt az egyszerûség kedvéért csak erre a háromra, illetve a sejt méretére szeretnék koncentrálni. A 2. melléklet 3. ábráján több komponens változása is nyomon követhetõ a sejtciklus alatt.

2

anyasejt Sejttömeg Clb2 1

leánysejt

Cln2

Clb5 0 0

50

100

150

200

250

300

Idõ ( perc )

13. ábra: A sarjadzó élesztõ sejtciklusának szimulációja. A 12. ábrán látható rendszert leíró egyenleteket a vad típusú sejtnek megfelelõ paraméterekkel megoldva (2. melléklet 1-2. táblázat) kaptuk ezt az eredményt. A kis leánysejtben egy kritikus méretnél megjelenik a Cln2 és a Clb5 aktivitás, ami elindítja a sarjadzást és a DNS szintézist, majd a Clb2 iniciálja a mitózist. Osztódás után az anyasejt nagyobbnak születik, így elõbb eléri a kritikus méretet, így ciklusideje rövidebb lesz. A leánysejt ciklusa az elõzõével megegyezõ lesz. 29

A kisméretû, újszülött leánysejt G1 fázisban van, és ilyenkor egyik ciklin sem mutatható ki (ld. Futcher, 1996). Amikor azonban a sejt elér egy kritikus méretet, akkor a Cln3 sejtmagbeli szintje is elér egy olyan szintet, hogy aktiválni tudja a Cln2 és a Clb5 transzkripcióját. Mivel a Cln2 indítja el a sarjadzást, ezért ilyenkor megjelenik a sarjképzõdmény a sejten. A Cln2-nek azonban más esszenciális hatásai is vannak. Foszforilezéssel eltünteti a Clb2 és a Clb5 inhibitorát (Sic1) és kikapcsolja a Clb2 lebontását. Ennek következtében mindkét B-típusú ciklinnek (Clb2 és Clb5) megnõ a koncentrációja. A Clb5 koncentrációja azonban sokkal elõbb növekszik, mint a Clb2-é, mert a Clb5 transzkripciós faktorát (MBF) is a Cln3 aktiválja, míg a Clb2-nek saját magának kell aktiválnia a transzkripciós faktorát (MCM1) és ez a pozitív visszacsatolás a mechanizmusban lassú. A két B-típusú ciklin megjelenésében tapasztalható különbség jó összhangban van azzal a ténnyel, hogy Clb5 a DNS replikáció, míg a Clb2 a késõbb lejátszódó mitózis elindításában játszik szerepet (ld. Nasmyth, 1996).

A Clb2 azonban nemcsak aktiválja a saját szintézisét, hanem serkenti a saját lebontását is (negatív visszacsatolás). A negatív visszacsatolás azonban a primitív eukarióta sejt modelljéhez képest eltérõen valósul meg. A 9. ábrán látható modellben az APC lebontja az õt aktiváló ACT molekulákat, ami egy negatív visszacsatolást jelent. Láthatóan ez a hatás a 12. ábráról hiányzik, mert a sarjadzó élesztõ Cdc20 nevû fehérjéjét (ami az ACT-nak felel meg) az APC/Hct1 nem bontja. Ezzel szemben a Cdk1/Clb2 serkenti a Cdc20 szintézisét, ami ugyanazt a negatív visszacsatolást eredményezi, hiszen a Cdc20 aktiválja az APC/Hct1-t, ami lebontja a Clb2-t. Ennek a változtatásnak az a magyarázata, hogy a negatív visszacsatolást a primitív eukarióta sejtciklus

modell

felállításánál

konkrét

kísérleti

adatok

hiányában

csak

prognosztizálni tudtuk, de konkrét megvalósulási formáját nem ismerhettük. Az idõközben megismert irodalmi adatok a Cdc20 szintjének szabályozásáról, sokkal inkább a szintézis, mint a lebomlás szabályozására utalnak (Hwang et al., 1998).

Az APC/Cdc20 aktiválása csak akkor következhet be, ha már felálltak a kromoszómák a metafázisos síkra (Hwang et al., 1998). Ekkor a Cdc20 aktiválódik és elindítja az anafázist, valamint a Hct1 aktiválódását, ami a Clb-ek lebomlásához vezet. A Clb2 szintjének csökkenése váltja ki a sejtosztódást, ami két különbözõ méretû sejtet eredményez: egy kis leánysejtet és egy nagyobb anyasejtet (Hartwell & 30

Unger, 1977). A modell segítségével könnyen vizsgálható mind a leánysejt, mind az anyasejt ezt követõ sejtciklusa. Szimulációk során az osztódáskor választhatunk, hogy az anya, vagy a leánysejt következõ sejtciklusát kövessük nyomon. Az anyasejt, mivel jóval nagyobb, szinte azonnal elkezd újra sarjadzani, rövid G1 fázisa lesz és ezért sokkal rövidebb lesz a következõ ciklusa. Ha viszont a kisméretû leánysejtet követjük, akkor természetesen ugyanazt a ciklust kapjuk, amit az elõbb láttunk, tehát hosszú, sarj nélküli G1 fázis figyelhetõ meg, ami az anyasejt ciklusánál egy jóval hosszabb ciklust eredményez. Az anyasejt ciklusideje rövidebb, míg a leánysejté hosszabb lesz a tömegduplázódási idõnél.

3.2.2. A sejtosztódás és a sejtnövekedés összehangolása A sejtosztódás és a sejtnövekedés összehangolásának illusztrálására nézzük meg, hogyan változik a sejtciklus nem sarjadzó szakasza, a G1 fázis, ha különbözõ méretû kis sarjsejteket kezdünk szaporítani. A 14. ábrán a folytonos vonallal a szimulációs eredményeket, pontokkal pedig Johnston és munkatársai (1977) mérési adatait mutatjuk be. Láthatóan a kapcsolat hiperbola jellegû, vagyis minél kisebbek a sejtek annál hosszabb a nem sarjadó, G1 fázisuk. Meg kell jegyezni, hogy a kezdeti sejtméret a sarjadzó periódus (S/M) hosszára nincs hatással.

1.2

Johnston et al. (1977)

Születési méret

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0 0

100

200

300

400

Sarj nélküli periódus (min) 14. ábra: A méretkontroll igazolása sarjadzó élesztõben. Johnston et al. (1977) kísérleti eredményeinek összehasonlítása a modell szimulációk eredményeivel. A születési mérettõl függ a sarj nélküli periódus hossza, mert a sarjadzás elindítása egy adott mérethez kötött. 31

A születéskori méret és a nem sarjadzó fázis hossza közötti kapcsolatnak egyszerûen az a magyarázata, hogy a sejteknek egy kritikus méretet kell elérniük, hogy a sarjadzást elkezdhessék. Ez a méretkontroll mechanizmus (Donachie, 1968; Sveiczer et al., 1996) biztosítja a sejtnövekedés és a sejtosztódás összehangoltságát a sarjadzó élesztõben is. Itt a méretkontrollt a Cln2 és Clb5 ciklinek szintézisének megindításáért felelõs Cln3 ciklin sejtmagbeli, ezáltal a mérettõl függõ, szintjének koncentrációja szabja meg (ld. Futcher, 1996).

Nézzük ezek után, miként hat a tömegduplázódási idõ a ciklusidõre a sarjadzó élesztõnél? Elõre kell bocsátani, hogy a sarjadzó élesztõnél az aszimmetrikus osztódás miatt ez a kapcsolat sokkal komplikáltabb, mint a szimmetrikusan osztódó sejteknél. A sejttömeg duplázódási ideje a környezeti feltételekkel (pl. táptalaj összetétel, vagy hõmérséklet) egyszerûen változtatható. Az 15. ábra a tömegduplázódási idõ függvényében mutatja a leány- illetve az anyasejt ciklusidejét a modellel történt numerikus szimuláció (egyenesek) és mérési adatok (szimbólumok) (Lord & Wheals, 1980) alapján. Látható, hogy ha nagyon gyorsan szaporítjuk az élesztõt, akkor a leánysejtek sejtciklusa szinte azonos hosszúságú az anyasejtekével, sõt sejtciklusuk hossza a tömegduplázódási idõvel is közel azonos. Ilyenkor az anya és leánysejtek nemcsak ciklusidejükben hasonlóak, hanem sejtméretükben sem látható különbség, vagyis a leánysejtek közel akkora mérettel születnek, mint amekkora az anyasejtek mérete, vagyis az osztódás közel szimmetrikus.

350 300

Leánysejt

Idõ (min)

250

td Anyasejt

200

150 100 50

Sarjadzó fázis

0 60

100

140

180

220

260

Tömegduplázódási idõ (min)

15. ábra: A tömegduplázási idõ hatása a leány- és az anya-sejtek sejtciklusának hosszára. Lord és Wheals (1980) különbözõ táptalajokkal végzett kísérleti adatainak (pontok) összehasonlítása a modell szimulációs eredményeivel (folytonos vonalak). Szaggatott vonallal a tömegduplázódási idõt jelöltem, ami egy +1-es meredekségû egyenes. 32

Vegyük észre, hogy minél nagyobb a tömegduplázódási idõ, azaz minél rosszabb táptalajon szaporodnak a sejtek, annál nagyobb lesz a különbség az anya- és a leánysejtek sejtciklusának hossza között. Amíg ugyanis a leánysejtek ciklusideje hosszabb a tömegduplázódási idõnél, addig az anyasejteké annál rövidebb. Ez utóbbi következtében az anyasejt mérete a ciklus alatt nem tud megduplázódni és a képzõdött leánysejtek kisebbek lesznek az anyasejtnél. Vagyis lassú növekedési sebességeknél a sarjadzó élesztõ osztódása aszimmetrikussá válik. Mi ennek a magyarázata? Láthatóan a növekedési sebesség (ami a tömegduplázódási idõ reciprokával arányos) nem, vagy csak kevéssé változtatja a sarjadzó fázis hosszát. A leánysejt méretét a sarjadzó fázis hossza határozza meg, mivel a sarjadzó fázis alatt minden sejtnövekedés a sarjba irányul, amibõl leánysejt keletkezik. Mivel a sarjadzó fázis hossza lassú növekedési sebességeknél jelentõsen rövidebb a tömegduplázódási idõnél, ezért ezen idõ alatt a sejttömeg nem tud megduplázódni és a leánysejt kisebb lesz mint az õt létrehozó anyasejt. A kis leánysejteknek ezt a sejtméret „hiányt” a következõ ciklusban pótolniuk kell, ezért ciklusuk hosszabb lesz a tömegduplázódási idõnél.

33

3.2.3. Sejtciklus mutánsok szimulációja Nagy elõnye egy ilyen matematikai modellnek, hogy segítségével gyorsan lehet tesztelni a szabályozó mechanizmus viselkedését nemcsak a normális, hanem attól eltérõ esetekben is. Ehhez nem kell mást tenni, mint megváltoztatni bizonyos sebességi állandók értékét. Ha például egy komponens szintézisének sebességét nulla értékûnek tekintjük, akkor ez megfelel egy olyan mutáns sejtnek, amelyben az adott komponenst kódoló génszakaszt eltávolítják, illetve mûködésképtelenné teszik. Ha pedig egy komponens szintézisének sebességi állandóját a normális érték többszörösére növeljük, akkor az adott fehérjét túltermelõ sejtet tudjuk szimulálni. Természetesen egyszerre nemcsak egy paraméter érték változtatható, és a fenti esetek kombinációi is értelmezhetõk vagyis többszörös mutánsok is vizsgálhatók. Ilyen számítógépes szimulációkkal olyan mutánsok fiziológiai tulajdonságait is meg lehet jósolni, amelyeket még genetikai módszerekkel létre se hoztak.

Az 1. táblázatban csak szemléltetésként, összefoglaltam néhány ilyen mutáns tulajdonságait, nevezetesen, hogy az egyes sejtciklus események milyen sejtméretnél játszódnak le. Elsõsorban olyan mutációkat tüntettem fel, amelyek a különbözõ ciklin génekben történtek. Mint látható a különbözõ sejtciklus események kísérletesen megállapított méretfüggése, és a modell szimulációk alapján kapott, majd az élesztõ méretére normált adatok, a vad típusnál és több Cln, illetve Clb mutánsnál is nagymértékben egyeznek. Ezen felül predikciókat is tudtunk adni, eddig még nem elég alaposan vizsgált, vagy még meg sem konstruált mutánsok tulajdonságaira is. A szimulációval vizsgált összes mutáns fenotípusos jellegzetességei a 2. melléklet 3-6. táblázataiban találhatóak meg.

34

1. táblázat: Sejtciklus mutánsok fenotípusa. Genotípus Referencia

Fenotípus Irodalmi sejttérfogat a ciklus különbözõ állapotaiban (femtoliter)

Változtatott paraméter

Szimuláció Sejtméret a ciklus különbözõ állapotaiban (a szimuláció egységében (sze) és femtoliterben) (1sze = 17fL)

Vad típus Születés = 10 Sarj megj. = 19 DNS szint. = 19 Osztódás = 29 cln3 (Dirick et al., 1995)

cln1 cln2 (Dirick et al., 1995).

cln1 cln2 cln3 (Richardson et al., 1989) clb5 clb6 (Schwob & Nasmyth, 1993).

clb1 clb2 (Surana et al., 1991).

clb1 clb2 GAL-CLB2 (Surana et al., 1993).

Születés = 0.63 (11) Sarj megj. = 1.1 (19) DNS szint. = 1.15 (20) Osztódás = 1.7 (29)

Születés = 17 Sarj megj. = 45 DNS szint. = 45 Osztódás = 52

k s,n3 = 0



k's,n2 = 0 k" s,n2 = 0


Életképtelen G1 fázisban áll meg

k s,n3 = 0 k's,n2 = 0 k" s,n2 = 0



k's,b5 = 0 k" s,b5 = 0



k's,b2 = 0 k" s,b2 = 0


Életképes

k's,b2 = 0.07 k" s,b2 = 0


k's,b2 = 0.07 k" s,b2 = 0 k's,n2 = 0.08 k" s,n2 = 0


clb1 clb2 GAL-CLB2 cln1 cln2 MET-CLN2 Még kísérletesen nem vizsgált.

35

3.2.4. Hiszterézis a sarjadzó élesztõ sejtciklusában Szimulációs vizsgálataink arra utalnak, hogy a sarjadzó élesztõ sejtciklusában is megfigyelhetõ a hiszterézis (16. ábra), hiszen ez a modell is a primitív eukarióta sejtciklus modelljén alapul, ami szintén rendelkezett ezzel a tulajdonsággal. A hiszterézis tulajdonságot a pozitív visszacsatolási mechanizmusok okozzák. A már korábban bemutatatott CDK és APC antagonizmusát a sarjadzó élesztõnél a Cdk/Clb és a Sic1 antagonizmusa tovább erõsít.

A hiszterézis illusztrálására egy olyan bifurkációs diagramot használtunk, amelyen bifurkációs paraméternek a két átmenetért („Start” és „Finis”) felelõs kulcsenzimek (Cln2 és Cdc20) koncentrációjának az arányát választottuk, az ordinátán pedig az összesített Clb aktivitást ábrázoljuk vázlatosan (16. ábra). Ha a sejteket G1, vagy S/M fázisban a megfelelõ sejtciklus gátlószerrel megállítjuk, akkor egyik esetben sem lesz jelen se Cln2, se Cdc20 aktivitás, így a sejtek ennél a neutrális A/B bifurkációs paraméter értéknél két különbözõ fázisban is lehetnek; és az, hogy adott esetben hol lesznek, csak a sejt elõzõ állapotától fog függeni.

Osztódás után a görbe alsó ágán kis Clb aktivitással G1 fázisban tartózkodik a sejt (az ábrán G1 pontban), és ahogy a sejt növekedése folytán a Cln2 aktivitás növekszik, a bifurkációs paraméter is nõ, és a rendszer jobbra mozdul el az ábrán, egészen addig, amíg el nem tûnik a görbe alsó ága (a pont).

Ekkor a Clb aktivitás hirtelen

növekedésével átjutunk a görbe felsõ ágára. („Start” átmenet). Mivel a Clb-ek kikapcsolják a Cln2 szintézisét, ezért a Cln aktivitás leesik és a rendszer visszajut a kiindulási bifurkációs paraméter értékhez, az S/M pontba. A különbség csak az, hogy most a Clb aktivitás nagy. Ezek után, ahogy a kromoszómák felállnak a metafázisos síkra, aktiválódhat a Cdc20 és ettõl a bifurkációs paraméter lecsökken, az ábrán balra mozdul el a rendszer, amíg el nem tûnik a felsõ ág (c pont), és visszajut az alacsony Clb aktivitáshoz tartozó állapotba. („Finis” átmenet). Mivel a Clb aktivitás a „Finis” során leesek, ezért a Cdc20 szintézise leáll és a Cdc20 gyorsan lebomlik. Ennek következtében a rendszer visszajutunk a kiindulási pontba (G1 pont). Fontos észrevenni, hogy mind a „Start”-ot (Cln2) mind a „Finis” (Cdc20) átmenetet elõmozdító molekulák negatív visszacsatolási mechanizmusokkal vannak szabályozva és ezek a mechanizmusok forgatják a szabályozási rendszert ezen a hiszterézis körön. 36

1. A Cln2 segíti a Clb-ek akkumulációját („Start” esemény), a megjelenõ Cdk/Clb aktivitás viszont meggátolja a Cln-ek szintézisét, ezért azok koncentrációja lesik. 2. Teljesen hasonlóan a Cdc20 elõsegíti a Clb-ek lebontását („Finis” esemény), de mivel szintézise Cdk1/Clb aktivitás függõ, ezért azok lebontását követõen a Cdc20 koncentrációja is leesik. Könnyû belátni, hogy ezekre a negatív visszacsatolásokra azért van szükség, mert az

Sic1

“Finis”

d

b

S/M

c

Clb5

Clb kinázok aktivitása

egyik átmenetet segítõ molekula gátlólag hat az azzal ellentétes másik átmenetnél.

“Start”

a

G1

A + [Cln2] B + [Cdc 20]

A/B

16. ábra: Hiszterézis a sarjadzó élesztõ sejtciklusában (vázlatosan). A Clb kinázok aktivitása a Cln2 és a Cdc20 aktivitások arányainak függvényében szimulációink szerint hiszterézist mutat. Ha Cln2 és Cdc20 sincs jelen, akkor a rendszer a két stabilis állapot bármelyikében lehet. (G1 és S/M pontok) Az átmeneteket e két állapot között a Cln2 és a Cdc20 váltakozó aktivitása hajtja. Mivel a sejtciklus szabályozás hiszterézis tulajdonságát kísérletesen még nem ismerték fel, ezért a modell alapján egy protokollt javasoltunk ennek kísérletes igazolására. A Sic1 fehérje a S. cerevisiae CKI-je, ami a Clb-ek aktivitását gátolja. (Schwob et al., 1994) Modellünkben ha az S/M fázisban megállított (mitózisban blokkolt) sejtekhez kívülrõl extra Sic1-et adunk, és ezzel lecsökkentjük a Clb aktivitást, akkor egy küszöb fölött a Sic1 mennyisége elég lesz ahhoz, hogy a sejtek visszajussanak a G1 állapotnak megfelelõ pontba. (Amon et al., 1994) Azért nem nevezném ezt „rendes” G1 fázisnak, mert ebben az esetben a mitózis és sejtosztódás befejezése nélkül jutunk vissza ebbe az állapotba. Ha ebbõl a G1-es állapotból indulunk, (például párosodási faktor adagolásával gátoljuk a Cln-ek szintézisét (Jeoung et al., 1998)) akkor pedig Clb5 küszöb fölötti adagolásával átjuthatunk az S/M állapotba korrekt „Start” nélkül. Ha a két külsõ beavatkozást váltogatjuk és a replikáció nincs gátolva, akkor az osztódás gátlása miatt a sejtekben a DNS állomány 37

megsokszorozódik. Erre az un. „endoreplikáció”-ra (Labib et al., 1995; Novák & Tyson, 1997) a sarjadzó élesztõ sejteket más módon nehezen lehetett rákényszeríteni.

Jóllehet a fentebb tárgyalt modellel kielégítõen le lehet írni a sarjadzó élesztõ vadtípusú sejtjeinek és legfontosabb sejtciklus mutánsainak viselkedését, a sejtciklus szabályozási hálózat azon része, amely a „Finis” átmenetet írja le nem eléggé kidolgozott. Éppen ezért célszerûnek tûnt a modell bõvítése újabb komponensekkel és szabályozási lépésekkel annak érdekében, hogy a sarjadzó élesztõ sejtciklusának egy sokkal tökéletesebb modelljét kapjuk meg.

38

3.3. A sarjadzó élesztõ modell továbbfejlesztése A korábban ismertetett modellben a Finis eseményt az APC/Cdc20 egyszerûen az APC/Hct1 közvetlen aktiválásával idézte elõ. Az APC/Hct1 egyértelmûen foszforilezés-defoszforilezés révén szabályozódik és az is bizonyított, hogy a gátló foszforilezést a Cdk/ciklin komplexek végzik (Zachariae et al., 1998). Ebbõl egyértelmûen következik, hogy a Hct1 aktiválását egy foszfatáz katalizálhatja. Az APC/Cdc20 pedig egy ubikvitinezõ rendszer, ami bizonyos fehérjéket (pl. szekurin) képes lebontás céljára megjelölni.

Mindezek alapján felvetõdik a kérdés, hogyan képes az APC/Cdc20 az APC/Hct1 aktiválására? Az egyik ubikvitinezõ rendszer aktiválása a másik által egyszerûen elképzelhetõ, ha az APC/Cdc20 aktivál egy foszfatázt, ami defoszforilezi a Hct1-t. Még konkrétabban ez úgy képzelhetõ el, ha az APC/Cdc20 ubikvitinezéssel lebontásra ítéli a foszfatáz egy inhibitorát. Könnyû észrevenni, hogy ez a séma nagyon hasonlít az APC/Cdc20 anafázisban betöltött szerepéhez, ahol a szekurin lebontása révén inaktív komplexbõl felszabadítja a szeparint (ld. 3. ábra).

A foszfatáz figyelembevételének azonban egy további elõnye is van. A Sic1 ubikvitinezése foszforilezés függõ, vagyis a foszforilezett forma gyorsan lebomlik a nem-foszforilezetthez képest. A Sic1 foszforilezését a Hct1-hez hasonlóan a Cdk/ciklin komplexek végzik (Verma et al., 1997) és ezt a folyamatot eddig irreverzibilis reakciónak tekintettük. Könnyen elképzelhetõ azonban, hogy ugyanaz a foszfatáz, ami a Hct1-et defoszforilezi ugyancsak képes a foszfát-csoportok eltávolítására a Sic1-rõl, ezzel megmentve azt a gyors ubikvitinezéstõl és lebontástól (Visintin et al., 1998).

Figyelembe kell azonban venni, hogy az APC/Cdc20 nemcsak az APC/Hct1 aktiválásán keresztül serkentheti a „Finis” esemény bekövetkezését. Amennyiben az APC/Cdc20 a Clb-eket is ubikvitinezi, és ezáltal serkenti azok lebontását, akkor ily módon is segítheti az APC/Hct1 aktiválódását és a Sic1 stabilizálódását. Azért is szükséges mindkét fehérje aktiválása, mert tudjuk, hogy bármelyikjük hiányában a másik egyedül is képes a CDK aktivitás eltüntetésére (ld. Zachariae & Nasmyth, 1999). 39

Fentiek alapján az APC/Cdc20 potenciális szerepeit a „Finis” eseményben a 17. ábra foglalja össze. Ezen elgondolásunkat a „Finis” eseményrõl elõször egy egyszerû sejtciklus modellben dolgoztuk ki (Novák et al., 1999), aminek ismertetésétõl e helyen eltekintek.

Az általunk feltételezett foszfatázt egyébként sarjadzó élesztõben idõközben azonosították is: ez nevezetesen a Cdc14 és ennek megfelelõen az ábrán már így jelöltük. Kísérletesen igazolták, hogy a Cdc14 defoszforilezi mind a Hct1 mind a Sic1 foszforilezett formáit és ezáltal aktiválja a Hct1-t és stabilizálja a Sic1-t (Visintin et al., 1998). Sõt a kísérletek azt is megállapították, hogy a Cdc14 foszfatáz defoszforilezi és ezáltal aktiválja a Sic1 transzkripciós faktorát, a Swi5-öt és ez a hatás ugyancsak a Sic1 szintjének növekedését eredményezi.

+ Hct1

Hc

t1

P

+

+

Cdk

Cdk

+

Inhibitor

Cdc14

Clb

Sic1

Inhibitor

Cdc14

Cdk

+

Cdc20

Sic1 Sic1

Sic1

Clb

P

Swi5

+

+

17. ábra: A Cdc20 lehetséges szerepei a „Finis” átmenetben. A Cdk/Clb komplexek a sejtciklus végén kétféleképpen is inaktiválódhatnak: a Sic1gyel komplexet képezve, vagy az APC/Hct1 által okozott Clb lebomlás miatt. Mind a Sic1-et, mind a Hct1-et a Cdc14 foszfatáz aktiválja, amit viszont egy inhibitor tart komplexben, egészen addig, míg a kromoszómák megfelelõen fel nem állnak a metafázisos síkra, amitõl a Cdc20 aktiválódik és lebontja az inhibitort. A Cdc20 a Clb-ek lebontásával közvetlenül is serkentheti a Finis átmenetet. Idõközben a fentebb említett foszfatáz inhibitorral kapcsolatban is születtek kísérletes eredmények (Shou et al., 1999; Visintin et al., 1999): azonosítottak egy Net1 fehérjét, ami a sejtmagvacskában gátolja a Cdc14 40

foszfatázt. Ugyancsak kísérletes

megállapítást nyert az a tény, hogy az APC/Cdc20 a Clb5 lebontása révén is serkenti a Finis átmenetet (Shirayama et al., 1999).

Mindezen kísérleti adatok eredményeként kirajzolódni látszott a „Finis” átmenet egy komplikált szabályozási képe (ld. Morgan, 1999; Zachariae & Nasmyth, 1999), amit a sarjadzó élesztõ 3.1. pontban ismertetett modelljébe illesztve kidolgoztuk a sarjadzó élesztõ sejtciklusának egy még részletesebb modelljét (18. ábra).

A Cdc14 foszfatáz szintje állandó a sejtciklus alatt, de feltételezzük, hogy a Cdc5 fehérje felelõs a sejtmagba történõ bejuttatásáért. A Cdc5 egy Polo-kináz (Shirayama et al., 1998), amely konstans sebességgel képzõdik és az APC/Hct1 hatására bomlik le (az ábrán ezt a hatást nem jelöltem) viszont aktiválódásához Clb2 aktivitásra van szüksége. A sejtmagba került Cdc14-et a Net1 inhibitor tartja inaktív komplexben (más komponensekkel összeállva alkotják a RENT komplexet). Mind a szabad inhibitor (Net1) mind annak foszfatázzal kapcsolt formájának (RENT) aktivitása foszforiláció/defoszforiláció útján szabályozott (Shou et al., 1999; Visintin et al., 1999) . A Cdc15 protein-kináz (Shirayama et al., 1996) foszforilezéssel inaktiválja, míg egy egyelõre ismeretlen foszfatáz (PPX) pedig aktiválja a Net1-et. A kromoszómák és a magorsófonalak kapcsolódását ellenõrzõ mechanizmusok a Cdc15 és a Cdc20 aktivitásán fejtik ki hatásukat. A magorsófonalakhoz nem tapadt kromoszómák a Bub2 fehérje aktiválásán keresztül inaktiválják a Cdc15-öt, a Mad2 aktiválásával pedig inaktívan tartják a Cdc20-at (Alexandru et al., 1999). Az APC/Cdc20 a PPX foszfatáz lebontásával segíti a Net1 inaktiválódását.

Az APC/Cdc20-nak azonban további szubsztrátjai is vannak. Az APC/Cdc20 1. a Pds1 (szekurin) lebontásával felszabadítja az inaktívan tartott Esp1-t (szeparin), ami az anafázis elindítását eredményezi (Ciosk et al., 1998); 2. a Clb5 lebontásával pedig megszünteti a Cdk1/Clb5 aktivitást, ami a Cdc14 foszfatáz ellen dolgozik a Sic1 és a Hct1 foszforilezése révén (Shirayama et al., 1999).

A 18. ábrán látható, hogy feltételezésünk szerint az Esp1 proteáz nemcsak a ragasztófehérjéket bontja le, hanem hozzájárul a PPX és a Pds1 lebontásához is (Cohen-Fix & Koshland, 1999). 41

Az új komponenseken kívül jelentõs változtatás még az elõzõ modellhez képest, hogy a kromoszómák és a magorsófonalak kapcsolódását ellenõrzõ mechanizmus nem ad jelet a normál sejtciklus folyamán, hanem csak akkor, ha valami gátolja a mitózist (Alexandru et al., 1999). Az APC/Cdc20 aktiválódása a Cdk1/Clb2 aktivitás függvénye és a normális ciklusban (kromoszómák kapcsolódása a magorsófonalakhoz rendben lejátszódik ez egy bizonyos idõkésleltetéssel (amit az intermedier enzim = IE okoz) a Clb2 aktivitás megjelenését követõen be is következik. Amennyiben a mikrotubulusok valamilyen hiba folytán nem képesek a kromoszómák széthúzására a mitózisban, akkor a Mad2 aktiválódása miatt a Cdc20 inaktív formában marad. Sic1

Sic1

+

Swi5

+

Clb2

nem felállt kromoszómák

P

Cdc14

+

Cdc15

Cdc14

plazmá ban

sejtmagban

Net1

Net1P

Cdc5

+ RENT

+ Hc

t1

Cdc20

Hct1

+

Bub2

PPX

t1 Hc

+

Esp1

+ Cdc20

+ Clb5

IE

IEP

Mad2

+

anafázis

Clb2

Esp1 Pds1

Esp1

+

+

apoCdc20

+ Pds1

Esp1

18.ábra: A „Finis” átmenetért felelõs szabályzórendszer részletes modellje. A Cdk1/Clb2 hatására beindul a Cdc20 szintézise, majd késleltetve (IE-n keresztül) aktiválódik is. Ez az aktív forma megindítja a Clb5, a PPX, és a Pds1 lebomlását, ez utóbbitól felszabadul az Esp1, ami elindítja az anafázist, valamint segít a Cdc20-nak a célfehérjék lebontásában. A Cdc20-szal párhuzamosan aktiválódik a Cdc5 is szintén a Cdk1/Clb2 hatására, ami elindítja a Cdc14 transzportját a sejtmagba, ahol a Cdc14 elõször a Net1-gyel komplexet (RENT) képez, amibõl kiszabadul, miután a PPX lebomlott, és a Cdc15 inaktiválta a Net1-et. A szabad Cdc14 aktiválja a Sic1 szintézist a Swi5 transzkripciós faktoron keresztül, valamint a Sic1 lebontását is gátolja. Ezen kívül pedig aktiválja a Hct1-et is. A Mad2 és a Bub2 érzékelik, ha valamilyen probléma történt a kromoszómákkal, és ilyenkor leállítják a sejtciklust. Ezt a rendszert a 13. ábrán látható hálózattal közös modellbe szerkesztve egy 26 differenciálegyenlettel leírható rendszert kapunk. (A differenciálegyenletek és egyéb egyenletek a 3. táblázatban, a használt konstansok pedig a 4. táblázatban találhatóak.)

42

A 19. ábrán a vad típusú sarjadzó élesztõ sejtciklusának szimulációját láthatjuk ezzel a részletes modellel. A G1 fázisban ahogy nõ a sejt és elér a mérete egy kritikus értéket, bekapcsol a Cln2 (nem szerepel az ábrán) és a Clb5 szintézise. Ezek a Cdk1-gyel kapcsolódva foszforilezik és ezzel inaktiválják a Sic1-et és a Hct1-et. Lehetõvé téve a Clb2 megjelenését. A Clb2 aktiválja a Cdc5-öt, ami elindítja a Cdc14 transzportját a magba. Valamint a Clb2 aktiválja a Cdc20-at, ami lebontja a Pds1-et, ezzel kiszabadul az Esp1, ami az anafázist indítja el. Ezután a Cdc20 lebontja a PPX-et és a Clb5-öt is, ami lehetõvé teszi a Cdc14 kiszabadulását a RENT komplexbõl és ez az aktív Cdc14 defoszforilezi és ezzel aktiválja a Sic1-et és a Hct1-et. Az aktív Sic1 és Hct1 megszünteti a Clb2 aktivitást, és a Clb aktivitás megszûnésétõl bekövetkezhet a sejtosztódás.

Ezzel a komplett modellel még több mutáns sejtciklusát le tudtuk írni, valamint nemcsak a „Start”, hanem a „Finis” átmenet szabályozóinak hiányát, illetve túltermelését tudjuk szimulálni. (Az összes szimulált mutáns listája a 2. táblázatban olvasható.) Ennek illusztrálására szolgáljon a következõ példa (20. ábra). A sarjadzó élesztõ cdc20ts mutánsa nem képes a mitózis anafázisának megkezdésére, mert a Pds1 fehérje inaktívan tartja az Esp1-et, amire szükség lenne a kromoszóma szegregációhoz. Jól mutatja ezt hogy, ha a cdc20ts mutánsban a Pds1 génjét funkcióképtelenné tesszük, akkor a sejtek végrehajtják az anafázist, mert az Esp1 aktiválódik. Azonban a sejtek ilyenkor sem képesek a mitózisból való kilépésre („Finis”), mert a Clb5 szintje magas, ami foszforilezéssel inaktívan tartja a Hct1-et és serkenti a Sic1 lebontását. Ha azonban a duplamutánsban a Clb5 génjét is funkcióképtelenné tesszük, akkor a sejtek ismét szaporodásképesek lesznek. Ha viszont a Cdc20 mellett csak a Clb5-öt tesszük inaktívvá, akkor a sejtek nem tudják elkezdeni az anafázist a Pds1 jelenléte miatt. Mivel az Esp1 így továbbra is a Pds1gyel komplexben marad, a PPX lebontása nem kezdõdik el (a Cdc20 mutációja miatt az Esp1 nélkül nem indulhat el a PPX lebontása), ezért a Cdc14 sem szabadul fel a RENT komplexbõl. Ha a Pds1-et is eltüntetjük a sejtekbõl, akkor az Esp1 már el tudja indítani az anafázist és a PPX lebontásával a Cdc14-et is felszabadítja a komplexbõl így életképesek lesznek a sejtek.

43

G1

2.0

S/M sejtméret

1.5

1.0

0.5 3

Sic1

Clb2

2

Cdc14 tot Pds1

1

Sic1

Clb5 1.5 0

Cdc5 Hc

t1

PPX

1.0

Esp1

Cdc14 szabad

0.5

Cdc20

0.0 0

50

100

150

Idõ (min)

19. ábra: A kiegészített modell szimulációja. (A 3. táblázat egyenleteit és a 4. táblázat konstansait felhasználva.) cdc20 ts

2.5

cdc20 ts pds1∆

2.5

Clb2

Clb2 2

2

1.5

1.5

t1 Hc

1

t1 Hc

Pds1

1

Clb5

0.5

Clb5

0.5

Cdc14

Cdc14

0

0 0

100

200

300

t (min)

0

100

ts

300

t (min)

300

t (min)

ts

cdc20 clb5∆

2.5

200

cdc20 pds1∆ clb5∆

2.5

Clb2 2

Clb2

2

1.5

1.5

t1 Hc

1

Pds1

t1 Hc

1

0.5

0.5

Cdc14

Cdc14

0

0 0

100

200

300

t (min)

0

100

200

20. ábra: A sarjadzó élesztõ Cdc20 fehérjéjének hiánya különbözõ más mutációkkal kombinálva. A cdc20ts mutáns a clb5∆, vagy a pds1∆ mutációkkal párban sem képes az osztódásra, viszont a tripla mutáns életképes. 44

2. táblázat: A vizsgált mutánsok vad típus cdc20ts cdc20ts pds1∆ ∆ ts cdc20 clb5∆ ∆ ts cdc20 clb5∆ pds1∆ cdc20ts ESP1op cdc5 ts cdc5 ts SIC1op cdc5 ts CDC14op cdc5 ts CDC15 op cdc15ts cdc15ts CDC5op cdc15ts CDC14op cdc15ts net1ts cdc15ts SIC1op cdc14ts cdc14ts SIC1op CDC14 op CDC14 op sic1∆ ∆ op CDC5 CDC5db∆op CDC5db∆op + nokodazol CDC5db∆op clb5∆ net1ts net1 op pds1∆ PDS1db∆ PDS1db∆ ∆ op esp1ts esp1ts sic1∆ esp1ts hct1∆ esp1∆ sic1∆ hct1∆ sic1∆ ∆ hct1∆ ∆ clb5∆ cln2∆

cln3∆ cln2∆ ∆ cln3∆ ∆ nokodazol mad2∆ + nokodazol bub2∆ + nokodazol pds1∆ + nokodazol pds1∆ bub2∆ + nokodazol mad2∆ bub2∆ + nokodazol SIC1’P-hely∆ ∆ HCT1’P-hely∆ ∆ op SIC1 ppx∆ ppx∆ + nokodazol ppx∆ mad2∆ + nokodazol ppx∆ CDC5op PPXop net1ts IE ’P állandó IE ’P-hely∆ IE ’P állandó + nokodazol IE ’P-hely∆ + nokodazol Jelölések: ∆: az adott gén hiányzik a sejt DNS állományából ts: hõmérsékletérzékeny mutáció a génben op: az adott géntermék mennyisége megnövelve db∆: a fehérje lebontásáért felelõs génszakasz eltávolítva ’P: a fehérje szabályozásában szereplõ foszforilációs hely nokodazol: a sejteket mitózisos orsó kialakulást gátló szerrel kezelik a mutáció életképtelen sejtekhez vezet eddig kísérletesen nem vizsgált mutációk

45

3. táblázat: A komplett modell egyenletei10 A Cdk/ciklin komplexek egyenletei: d [Cln2] = (k s , n 2 '+ k s , n2 ⋅ [SBF]) ⋅ mass − k d,n2 ⋅ [Cln2] dt d [Clb5T] = ( ks , b 5 '+ ks , b 5 ⋅ [SBF]).mass − kd 5 ⋅ [Clb5T] dt k d 5 = k d ,b 5 ''' +[Esp1] ⋅ ( k d ,b 5 ''+ k d ,b 5 '[Cdc20A])+ ⋅ k d ,b 5 ⋅[Cdc20A] d [Clb2T] = (k s , b 2 '+ k s , b 2 ⋅ [Mcm1]) ⋅ mass − k d 2 ⋅ [C lb2T] dt k d 2 = V2 '⋅ (1 − [Cdh1]) + V 2 ⋅ [Cdh1] + V2,20 ⋅ [Cdc20A] [Cln3] = k cln3 ⋅ mass [Clb2] = [Clb2T]-[C2] [Clb5] = [Clb5T]-[C5] [Sic1] = [Sic1T]-[C2]-[C5]-[Sic1P]

A ciklin lebontásért felelõs enzimek egyenletei: ⋅ [IEP] d[IEP] Va ,iep ⋅ (1 − [IEP]) kiiep = − , dt J a , iep + 1 − [IEP] J iiep + [IEP] , Va , iep = k aiep ⋅ [Clb2] , d[Cdc20T] = kas ,20 '+ kas ,20 ⋅ [Clb2] − kad ,20 ⋅ [Cdc20T] dt d[Cdc20A] = kaa ⋅ [IEP] ⋅ ([Cdc20T] −[Cdc20A]) −( kai + kad ,20 ) ⋅[Cdc20A] dt ⋅ [Cdh1] d[Cd h1] Va c, d h 1 ⋅ (1 − [Cdh1]) Vicdh = − , 1 dt J a ,c d h1 + 1 − [Cdh1] J icdh , 1 + [Cdh1] Va ,c d h1 = kapcrv + kapcr ⋅ [Cdc14] Vi ,c d h1 = kapc '+ kapc ⋅ (Ε c ln3 + Ε cl n 2 .[Cln2] + Εclb 2 .[Clb2] + Ε clb 5 .[Clb5])

10

A táblázatban Hct1 helyett a mostanában jobban elfogadott Cdh1 elnevezést használom. 46

A Cdk inhibitor (Sic1) szintjét befolyásoló komponensek egyenletei: d[Sic1T] = ( ks ,s i c '+ ks ,s i c ⋅ [Swi5]) − kd , sic ⋅[Sic1p] dt d[Sic1p] = Εk 4 ([Sic1T] −[Sic1p]) − ( k p p,s i c ⋅ [Cdc14] + kd ,sic ).[Sic1p] dt d[C2] = − kir 2 ⋅[C2] + ki ⋅ [Clb2]⋅ [Sic1] − ( k d 2 + Ε k 4 ).[C2] dt d[C5] = −k ir 5 ⋅[C5] + ki ⋅ [Clb5].[Sic1] − ( kd 5 + Ε k 4 ).[C5] dt Εcdksic , Ε k 4 = k4 '+ k4 ⋅ k m 2 + [Sic1T] Εc d k,s i c = Ε c3 ⋅ (Εc ln3 + 0.1 ⋅[X] ⋅ [mass]) + Εc 2 ⋅ [Cln2] + Εc 5 ⋅ [Clb5] + Εcb 2 ⋅ [Clb2] Εc ln3 =

max c ln3 ⋅ [Cln3] [Cln3] + k f , s3

d[Swi5T] = k s ,s w i 5 '+ k s ,s w i 5 ⋅[Mcm1] − kd , swi 5 ⋅ [Swi5T] dt d[Swi5] = k a ,s w i 5 ⋅ ([Swi5T] − [Swi5]) ⋅[Cdc14] − k i ,s w i 5 ⋅ [Clb2] ⋅[Swi5] − k d , swi5 ⋅ [Swi5] dt

A növekedés, DNS replikáció, sarjképzõdés, magorsóképzõdés egyenletei: d mass = µ.mass dt d[ORI] = ks ,o r i ⋅ (E orib, 5 [Clb5] + Εo r i, b 2 ⋅[Clb2]) − kd , ori ⋅[ORI] dt d[BUD] = ks b, u d ⋅ ([Cln2] + Ε c l n 3 +E b u d,b 5 [Clb5]) − k dbud ⋅ [BUD] , dt d[SPN] [Clb2] = k s ,s p n ⋅ −k ⋅ [SPN] dt J spn + [Clb2] d , spn

47

A foszfatáz (Cdc14) és szabályzóinak az egyenletei: d [Cdc14] = −ka s,c14,net ⋅ [Net1]⋅ [Cdc14]+ kd i,c 14,net ⋅ ([Net1T] − [Net1] − [PF]) dt + krel ⋅ ([Cdc14T] − [Cdc14] − [Net1T] + [Net1] + [PF]) − kd , c14 ⋅ [Cdc14]-kasnetp ⋅ [Net1p]⋅ [Cdc14] , d [Cdc14T] = ks ,c14 ''+ ks ,c14 '⋅ ([Cdc5T]-[Cdc5])+ks ,c14 ⋅ [Cdc5]-kd ,c14 ⋅[Cdc14T] dt d [Net1] = −ka s, c14, net ⋅[Net1] ⋅[Cdc14] + kd i,c14,net ⋅ ([Net1T] − [Net1] − [PF]) dt (k ⋅ [PPX] + kac2 ⋅ [Cdc14]) ⋅ ([Net1T] − [Net1] − [Cdc14T] + [Cdc14]) kin ⋅ [Cdc15] ⋅[Net1] + ac1 − Jac + [PF] Jin + [Net1T] − [PF] d [PF] (k ⋅ [PPX] + kac2 ⋅ [Cdc14]) ⋅[PF] kin ⋅ [Cdc15].([Net1T] − [PF]) = − ac1 + dt J ac + [PF] J in + [Net1T] − [PF] d [Cdc5T] = ks ,c 5 '+ ks ,c 5 ⋅[Mcm1] − ( kd ,c 5 '+ kd , c5 ⋅ [Cdh1) ⋅[Cdc5T]) dt d [Cdc5] ka ,c d 5 ⋅[Clb2] ⋅ ([Cdc5T] − [Cdc5]) ki ,c d 5 ⋅[Cdc5] = − dt J a ,c d 5 + [Cdc5T] − [Cdc5] J i,c d 5 + [Cdc5] − (kd , c5 '+ kd , c5 ⋅ [Cdh1]) ⋅ [Cdc5] d [Pds1] = ks , pds ⋅ ([SBF]+ [Mcm1]) − kd , pds .[Pds1] − kic1 ⋅ [Pds1]⋅ [Esp1]+k irc1 ⋅ [C1] dt kd , pds = kd 1, pds +[Esp1] ⋅ ( kd 2, pds + kd 3, pds ⋅[Cdc20A]) + kd 4, pds ⋅[Cdc20A] d [PPX] = ks , ppx − kd , ppx ⋅ [PPX] dt kd , ppx = kd 1, ppx +[Esp1] ⋅ (kd 2, ppx + kd 3, ppx ⋅[Cdc20A])+k d 4,ppx ⋅[Cdc20A] d [C1] = kic1 ⋅[Pds1] ⋅[Esp1]-kirc1 ⋅ [C1]-kd p, d s ⋅ [C1] dt

[Net1p] = [Net1T]-[Net1]-[Cdc14T]+[Cdc14] [RENT] = [Cdc14T]-[Cdc14]-[PF]+[Net1p] [RENTp] = [PF]-[Net1p] [Esp1] = [Esp1T]-[C1]

48

Az transzkripciós faktorok egyenletei:

SBF = G(Va,sbf , Vi,sbf , Ja,sbf , Ji,sbf ) Va,sbf = Esbf,n2 * [Cln2]+Esbf,n3 * (Εcln3 +X * mass)+Esbf,b5 * [Clb5] Vi,sbf = vs2v+vs2 [Clb2]

Mcm1 = G([Clb2], kmcmr , Ja,mcm , Ji,mcm) Ahol G(a, b, c, d) =

2∗a ∗ d + (b - a + b ∗ c + a ∗ d) 2 − 4 ∗ (b − a) ∗ a ∗ d b − a + b ∗c + a ∗d

a Goldbeter egyenlet (Goldbeter & Koshland, 1981).

49

4. táblázat: A kiegészített modell kinetikai konstansai. Sebességi állandók (min-1): ks,n2 ’ = 0

ks,n2 = 0.05

kd,n2 = 0.2

ks,b5 ’ = 0.0001

ks,b5 = 0.015

kd,b5 ’’’ = 0.005

kd,b5 ’’ = 0.001

kd,b5 ’ = 0.5

kd,b5 = 0.2

ks,b2 ’ = 0.0006

ks,b2 = 0.05

V2 ’ = 0.01

V2,20 = 0.1

kcln3 = 0.0033

ka,iep = 0.1

ki,iep = 0.15

kas,20 ’ = 0.006

kas,20 = 0.6

kaa = 0.1

kai = 0.1

kapcrv = 0.04

kapcr = 0.8

kapc’ = 0

kapc = 0.4

ks,sic’ = 0.04

ks,sic = 0.2

kd,sic = 1

kd,sic,c14 = 4

kir2 = 0.05

kir5 = 0.05

ki = 50

k4 ’ = 0.01

k4 = 0.04

ks,swi5’ = 0.005

ks,swi5 = 0.1

ka,swi5 = 2

ki,swi5 = 0.05

ks,ori = 2

ks,bud = 0.38

V2 = 1

kad,20 = 0.3

kd,swi5 = 0.1 ks,spn = 0.08

kd,ori = kd,bud = kd,spn = 0.06

µ = 0.005776

kas,c14,net = 500

kdi,c14,net = 1

krel = 0.5

kas,netp = 1

ks,c14 ’’ = 0

ks,c14 ’ = 0.05

ks,c14 = 0.5

kd,c14 = 0.4

kac1 = 10

kac2 = 0

kin = 1

ks,c5’ = 0.0025

ks,c5 = 0.05

kd,c5’ = 0.025

kd,c5 = 0.2

ka,cd5 = 0.15

ki,cd5 = 0.15

ks,pds = 0.1

ks,pds’ = 0

kd1,pds = 0.05

kd2,pds = 0.05

kd3,pds = 1

kd4,pds = 1

kd1,ppx = 0.1

kd2,ppx = 0.05

kd3,ppx = 10

kd4,ppx = 0.02

kic1 = 50

kirc1 = 1

kmcmr = 0.15

Vs2v = 0.6

ks,ppx = 0.1

Vs2 = 6

50

Karakterisztikus koncentrációk:

maxcln3 = 0.02

[Net1T] = 3

[Esp1T] = 1

Ja,iep = Ji,iep = 0.01

Ja,cdh1 = Ji,cdh1 = 0.01

Jspn = 0.2 Jac = Jin = 0.05 Ja,cd5 = Ji,cd5 = 0.01 Ja,sbf = Ji,sbf = 0.01

Ja,mcm = Ji,mcm = 1

Kináz hatásfokok: Εc3 = 150

Εc2 =15

Εc5 = 30

Εcln2 = 1

Εclb5 = 3

Εclb2 = 0.2

Εori,b5 = 0.9

Eori,b2 =0.4

Ebud,b5 = 1

Esbf,n3 =75

Esbf,b5 = 3

Εsbf,n2 = 3

Egyéb dimenziómentes állandók:

km2 = 0.05 kfs3 = 0.02 X = 0.0027 Cdc15 = 10

51

Εcb2 = 1

4. Összefoglalás Értekezésemben az eukarióta sejtciklus reakciókinetikai modellezésével foglalkoztam. Modelleket dolgoztam ki a mai eukariótákban ismert sejtciklus szabályzó rendszer alapjaira és azt továbbfejlesztve a ma élõ sarjadzó élesztõ sejtciklusának molekuláris szabályozására. Eredményeim a következõk: 1. A kromoszóma replikáció (másolás) és szegregáció (szétválasztás) váltakozását leíró mechanizmusból kiindulva megmutattuk, hogy az eukarióta sejtek sejtciklusa két egymással versengõ állapot: - a kis CDK aktivitású G1 fázis és - a nagy CDK aktivitású S/M fázis váltakozásaként értelmezhetõ. Elképzelésünkben ezek az állapotok stabilis, állandósult állapotokként jelennek meg, amelyek között az átmenetek csak bizonyos feltételek teljesülése esetén következnek be. A G1 fázisból az S/M fázisba történõ átmenet („Start”) során a sejt tömegének (méretének), míg az ellentétes irányú átmenet során („Finis”) a kromoszómák állapotának ellenõrzése történik meg. Ezek az ellenõrzési mechanizmusok biztosítják a sejtciklus szabályozottságát.

2. Megalkottuk azt a minimális szabályozó rendszert (vázmechanizmust), amellyel egyszerûen leírható a fenti két sejtciklus állapot kialakulása és váltakozása. Véleményünk szerint a két állapotot a CDK és az APC versengése hozza létre úgy, hogy - az APC (Anafázis Serkentõ Faktor) a ciklin lebontása révén megszünteti a CDK aktivitását, - a CDK az APC ciklin felismerõ alegységének foszforilezésén keresztül inaktiválja az APC-t. A CDK és APC antagonizmusa tehát egy pozitív visszacsatolást eredményez a vázmechanizmusban, mely a sejtciklus alapszabályozója.

3. Igazoltuk, hogy a sejttömeg és az APC-t aktiváló enzim (aktivátor, vagy ACT) koncentrációja olyan bifurkációs paramétereknek tekinthetõk, amelyek a vázmechanizmust (CDK–APC szabályozó ) az egyik állapotából a másikba

52

billentik. A sejttömeg növekedésének eredményeként bizonyos kritikus sejttömeg felett a G1 állapot megszûnik és a sejt az S/M állapotba kerül, majd az APC-t aktiváló enzim (ACT) aktiválódása ismét a G1 állapotba billenti a rendszert.

4. Megállapítottuk, hogy bizonyos paraméter értékeknél a két állandósult állapot bármelyike elõfordulhat, azaz a szabályozó rendszer bistabilis. Az alternatív állandósult állapotok következtében ún. hiszterézis is kialakulhat. Elképzelésünk szerint az eukarióta sejtek életciklusuk során egy hiszterézis hurkon haladnak körbe, s így sejtciklusa tulajdonképpen az alternatív állandósult állapotok közti átmenetek (bifurkációk) sorozataként fogható fel. Amikor a sejt átjut egy ellenõrzési ponton és új állandósult állapotba (más sejtciklus fázisba) kerül, akkor onnan csak a rendszer változóinak (a sejtméret és az aktivátor koncentrációja) jelentõs változása után juthat vissza az eredeti állapotba.

5. Megmutattuk, hogy a hiszterézis hurok körüli forgatását egy

negatív

visszacsatolási kör idézi elõ. A nagy CDK-aktivitású S/M állapotban az APC-t aktiváló molekulák (ACT) felhalmozódnak és aktiválják az APC-t, amely viszont lebontja a CDK ciklin alegységeit. A negatív visszacsatolás úgy valósulhat meg, hogy az ACT bomlása APC-függõ vagy szintézise CDK-függõ.

6. Igazoltuk, hogy a CDK sztöchiometrikus inhibitorának (CKI) hozzáadása a szabályozási rendszerhez egy újabb antagonizmus megjelenését idézi elõ. A CKI ugyanis komplexképzés révén gátolja a CDK aktivitását, míg a CDK foszforilezéssel serkenti a CKI gyors lebontását (ubikvitinezés). A mai eukarióták sejtciklusának szabályozásában a CDK mind az APC-vel, mind a CKI-vel antagonisztikus,

versengõ

kölcsönhatásban

áll.

Mivel

a

sejtciklus

két

alapállapotának létrehozásához elegendõ egyetlen antagonizmus is, ezért életképesek a mai eukarióta sejtek azon mutánsai, amelyekbõl vagy a CKI (a sarjadzó élesztõben Sic1) vagy az APC ciklint felismerõ fehérjéje (Hct1) hiányzik.

7. Bizonyítottuk, hogy amennyiben a CDK mind az APC-vel mind a CKI-vel antagonisztikus kölcsönhatásban áll, akkor a „Start” átmenethez ún. starter kinázokra van szükség. A sarjadzó élesztõben a starter kinázok szerepét a Cdk1 különbözõ Cln típusú ciklinekkel alkotott komplexei töltik be. Ezek reakcióival 53

kiegészített részletes modellt dolgoztunk ki a Saccharomyces cerevisiae sejtciklusára. A sarjadzó élesztõ sejtciklusát szabályozó különbözõ ciklineket és azok transzkripciós faktorait beépítve a modellbe, a vad típusú sejtek mellett több mint

ötven

mutáns

fiziológiai

tulajdonságait

modelleztük

numerikus

szimulációval. Az eredmények a részletes mechanizmus helyességét igazolták. A modell alapján megjósoltuk eddig még kísérletesen nem vizsgált mutánsok feltételezett viselkedését is.

8. A sejtciklus minimális szabályozó modelljébe beépítve a Cdk-alegység foszforilációs szabályzását is, részletes modelleket dolgoztunk ki a hasadó élesztõ (Schizosaccharomyces

pombe)

sejtciklusát

szabályozó

molekuláris

mechanizmusra.

9. Egyszerû modellt dolgoztunk ki a sejtciklus másik átmenetének („Finis”) értelmezésére. Ennek lényege az, hogy a sejtciklus végén egy foszfatáz az APC aktiválásával és a CKI defoszforilezéses stabilizálásával a CDK-aktivitás megszûnését idézi elõ.

10. Figyelembe véve a sejtciklus „Finis” átmenetével kapcsolatos legújabb molekuláris

biológiai

ismereteket,

továbbfejlesztettük

a

sarjadzó

élesztõ

sejtciklusára korábban kidolgozott modellünket. Egy olyan részletes modellt készítettünk, amely leírja a sarjadzó élesztõ legtöbb létezõ sejtciklus-mutánsát, továbbá ma még nem ismert változatok viselkedését is megjósolja.

54

5. Irodalomjegyzék Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. & Watson, J. D. (1994). Molecular Biology of the Cell (Third ed.). New York: Garland Publishing. Alexandru, G., Zachariae, W., Schleiffer, A. & Nasmyth, K. (1999). Sister chromatid separation and chromosome re-duplication are regulated by different mechanisms in response to spindle damage. EMBO J. 18, 2707-2721. Amon, A., Irniger, S. & Nasmyth, K. (1994). Closing the cell cycle circle in yeast: G2 cyclin proteolysis initiated at mitosis persists until the activation of G1 cyclins in the next cycle. Cell 77, 1037-1050. Blow, J. J. (1993). Preventing re-replication of DNA in a single cell cycle: evidence for a replication licensing factor. J. Cell Biol. 122, 993-1002. Chen, C., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Novák, B. & Tyson, J. (2000). Kinetic analysis of a molecular model of the budding yeast cell cycle. Mol. Biol. Cell. 11, 369-391. Ciosk, R., Zachariae, W., Michaelis, C., Shevchenko, A., Mann, M. & Nasmyth, K. (1998). An ESP1/PDS1 complex regulates loss of sister chromatid cohesion at the metaphase to anaphase transition in yeast. Cell 93, 1067-1076. Cohen-Fix, O. & Koshland, D. (1999). Pds1p of budding yeast has dual roles: inhibition of anaphase initiation and regulation of mitotic exit. Genes Dev. 13, 19501959. Dirick, L., Bohm, T. & Nasmyth, K. (1995). Roles and regulation of Cln-Cdc28 kinases at the start of the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 14, 48034813. Donachie, W. D. (1968). Relationship between cell size and time of initiation of DNA replication. Nature 219, 1077-1079. Edelstein-Keshet, L. (1987). Mathematical Models in Biology. New York: McGrawhill, Inc. Farkas, H., Györgyi, L., Póta, G. & Tóth, J. (1992). Az egzotikus kinetikai rendszerek matematikájának alapjai. In Nemlineáris dinamika és egzotikus kinetikai jelenségek kémiai rendszerekben (Bazsa, Gy., Ed.), 13-116. Egyetemi jegyzet. Futcher, B. (1996). Cyclins and the wiring of the yeast cell cycle. Yeast 12, 16351646. Goffeau, A., Barrell, B. G., Bussey, H., Davis, R. W., Dujon, B., Feldmann, H., Galibert, F., Hoheisel, J. D., Jacq, C., Johnston, M., Louis, E. J., Mewes, H. W., Murakami, Y., Philippsen, P., Tettelin, H. & Oliver, S. G. (1996). Life with 6000 genes. Science 274, 563-567.

55

Goldbeter, A. & Koshland, D. E., Jr. (1981). An amplified sensitivity arising from covalent modification in biological systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 68406844. Gould, K. L. & Nurse, P. (1989). Tyrosine phosphorylation of the fission yeast cdc2+ protein kinase regulates entry into mitosis. Nature 342, 39-45. Hartwell, L. H. and Unger, M. W. (1977). Unequal division in Saccharomyces cerevisiae and its implications for the control of cell division. J. Cell Biol. 75, 422435. Hwang, L., Lau, L., Smith, D., Mistrot, C., Hardwick, K., Hwang, E., Amon, A. & Murray, A. (1998). Budding yeast Cdc20: A target of the spindle checkpoint. Science 279, 1041-1044. Irniger, S., Piatti, S., Michaelis, C. & Nasmyth, K. (1995). Genes involved in sister chromatid separation are needed for B-type cyclin proteolysis in budding yeast. Cell 81, 269-278. Jeoung, D. I., Oehlen, L. J. & Cross, F. R. (1998). Cln3-associated kinase activity in Saccharomyces cerevisiae is regulated by the mating factor pathway. Mol. Cell. Biol. 18, 433-441. Johnston, G. C., Pringle, J. R. & Hartwell, L. H. (1977). Coordination of growth with cell division in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Exp. Cell Res. 105, 79-98. Kramer, E. R., Gieffers, C., Hölzl, G., Hengstschläger, M. & Peters, J. M. (1998). Activation of the human anaphase-promoting complex by proteins of the CDC20/Fizzy family. Curr. Biol. 8, 1207-1210. Labib, K., Moreno, S. & Nurse, P. (1995). Interaction of cdc2 and rum1 regulates Start and S-phase in fission yeast. J. Cell Sci. 108, 3285-3294. Lord, P. G. & Wheals, A. E. (1980). Asymmetrical division of Saccharomyces cerevisiae. J. Bact. 142, 808-818. Martin-Castellanos, C., Blanco, M. A., de Prada, J. M. & Moreno, S. (2000). The puc1 cyclin regulates the G1 phase of the fision yeast cell cycle in response to cell size. Mol. Biol. Cell 11, 543-554. Moreno, S. & Nurse, P. (1994). Regulation of progression through the G1 phase of the cell cycle by the rum1+ gene. Nature 367, 236-242. Morgan, D. (1999). Regulation of the APC and the exit from mitosis. Nature Cell Biol. 1, E47-E53. Murray, A. & Hunt, T. (1993). The Cell Cycle. An introduction. New York: W.H.Freeman & Co. Nasmyth, K. (1995). Evolution of the cell cycle. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 349, 271-281.

56

Nasmyth, K. (1996). At the heart of the budding yeast cell cycle. Trends. Genet. 12, 405-412. Noszticzius, Z. & Wittmann, M. (1992). Nemlineáris jelenségek kísérletes vizsgálata. In Nemlineáris dinamika és egzotikus kinetikai jelenségek kémiai rendszerekben (Bazsa, Gy., Ed.), 261-276. Egyetemi jegyzet. Novák, B., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Chen, K. & Tyson, J. (1998a). Mathematical model of the fission yeast cell cycle with checkpoint controls at the G1/S, G2/M and metaphase/anaphase transitions. Biophys. Chem. 72, 185-200. Novák, B., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Nasmyth, K. & Tyson, J. (1998b). Model scenarios for the evolution of the eukaryotic cell cycle. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 353, 2063-2076. Novák, B., Tóth, A., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Tyson, J. & Nasmyth, K. (1999). Finishing the cell cycle. J. Theor. Biol. 199, 223-233. Novák, B. & Tyson, J. (1993). Modeling the cell division cycle: M-phase trigger, oscillations, and size control. J. Theor. Biol. 165, 101-134. Novák, B. & Tyson, J. (1997). Modeling the control of DNA replication in fission yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 9147-9152. Nyeste, L., Sevella, B., Kirchknopf L. & Holló J. (1978). Baktérium fermentációk matematikai modellezése. In A korszerû fermentációs kutatás néhány problémája. A kémia újabb eredményei. 39. kötet Richardson, H. E., Wittenberg, C., Cross, F. & Reed, S. I. (1989). An essential G1 function for cyclin-like proteins in yeast. Cell 59, 1127-1133. Schwab, M., Lutum, A. S. & Seufert, W. (1997). Yeast Hct1 is a regulator of Clb2 cyclin proteolysis. Cell 90, 683-693. Schwob, E., Bohm, T., Mendenhall, M. & Nasmyth, K. (1994). The B-type cyclin kinase inhibitor p40SIC1 controls the G1 to S transition in S. cerevisiae. Cell 79, 233-244. Schwob, E. & Nasmyth, K. (1993). CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 7, 1160-1175. Sherr, C. J. (1996). Cancer cell cycles. Science 274, 1672-1677. Shirayama, M., Matsui, Y. & Toh-e, A. (1996). Dominant mutant alleles of yeast protein kinase gene CDC15 suppress the lte1 defect in termination of M phase and genetically interact with CDC14. Mol. Gen. Gen. 251, 176-185. Shirayama, M., Tóth, A., Gálová, M. & Nasmyth, K. (1999). APC-Cdc20 promotes exit from mitosis by destroying the anaphase inhibitor Pds1 and cyclin Clb5. Nature 402, 203-206.

57

Shirayama, M., Zachariae, W., Ciosk, R. & Nasmyth, K. (1998). The Polo-like kinase Cdc5p and the WD-repeat protein Cdc20p/fizzy are regulators and substrates of the anaphase promoting complex in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 17, 13361349. Shou, W., Seol, J. H., Shevchenko, A., Baskerville, C., Moazed, D., Chen, Z. W., Jang, J., Charbonneau, H. & Deshaies, R. J. (1999). Exit from mitosis is triggered by Tem1-dependent release of the protein phosphatase Cdc14 from nucleolar RENT complex. Cell 97, 233-244. Surana, U., Amon, A., Dowzer, C., McGrew, J., Byers, B. & Nasmyth, K. (1993). Destruction of the CDC28/CLB mitotic kinase is not required for the metaphase to anaphase transition in budding yeast. EMBO J. 12, 1969-1978. Surana, U., Robitsch, H., Price, C., Schuster, T., Fitch, I., Futcher, A. B. & Nasmyth, K. (1991). The role of CDC28 and cyclins during mitosis in the budding yeast S. cerevisiae. Cell 65, 145-161. Sveiczer, Á., Novák, B. & Mitchison, J. M. (1996). The size control of fission yeast revisited. J. Cell Sci. 109, 2947-2957. Sveiczer, Á., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, A., Tyson, J. & Novák, B. (2000). Modeling the fission yeast cell cycle: quantized cycle times in wee1- cdc25∆ mutant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 7865-7870 Tyson, J. J. (1991). Modeling the cell division cycle: cdc2 and cyclin interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7328-7332. Tyson, J. J., Novák, B., Odell, G. M., Chen, K. & Thron, C. D. (1996). Chemical kinetic theory as a tool for understanding the regulation of M-phase promoting factor in the cell cycle. TIBS 21, 89-96. Verma, R., Annan, R., Huddleston, M., Carr, S., Reynard, G. & Deshaies, R. (1997). Phosphorylation of Sic1p by G1 Cdk required for its degradation and entry into S phase. Science 278, 455-460. Visintin, R., Craig, K., Hwang, E. S., Prinz, S., Tyers, M. & Amon, A. (1998). The phosphatase Cdc14 triggers mitotic exit by reversal of Cdk-dependent phosphorylation. Mol. Cell 2, 709-718. Visintin, R., Hwang, E. S. & Amon, A. (1999). Cfi1 prevents premature exit from mitosis by anchoring Cdc14 phosphatase in the nucleolus. Nature 398, 818-23. Zachariae, W. & Nasmyth, K. (1999). Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex. Genes Dev. 13, 2039-2058. Zachariae, W., Schwab, M., Nasmyth, K. & Seufert, W. (1998). Control of cyclin ubiquitination by CDK-regulated binding of Hct1 to the anaphase promoting complex. Science 282, 1721-1724.

58

6. Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani:

Témavezetõmnek, Dr. Novák Bélának, aki lehetõséget adott arra, hogy már hallgató koromban csatlakozzam kutatócsoportjához, és azóta munkámhoz a lehetõ legnagyobb támogatást nyújtotta. Felkeltette érdeklõdésemet a sejtciklus kutatás iránt és lehetõvé tette, hogy számos konferencián és tanulmányúton tanuljak még többet e témáról.

Dr. John J. Tysonnak (Virginia Polytechnic Institute and State University, USA) aki lehetõvé tette amerikai tartózkodásaimat, melyek során a legnagyobb szeretettel, saját diákjaként fogadott és mindenben segítette munkámat.

Gyõrffy Bélának, akivel már hallgató korunk óta együtt dolgozunk, külföldön és idehaza egyaránt. Minden problémával közösen néztünk szembe, és megoldásukon is együtt dolgoztunk.

Dr. Kathy Chennek, Laurence Calzone nak (Virginia Polytechnic Institute and State University, USA) és Dr. Sveiczer Ákosnak akikkel mind Amerikában, mind idehaza öröm volt együtt dolgozni, és sokban segítették munkámat.

Dr. Kim Nasmythnek és Tóth Attilának (Institute of Molecular Pathology, Ausztria), akik számos, a sarjadzó élesztõ sejtciklusára vonatkozó kísérleti eredményt osztottak meg velünk, valamint inspiráló beszélgetéseink eredményeként közös publikációink is készültek.

Szüleimnek, hogy lehetõvé tették, egyetemi és posztgraduális tanulmányaimat.

A Varga József alapítvány nak anyagi támogatásáért.

59

7. Mellékletek (az értekezés témakörében megjelent publikációk különlenyomatai) 1.sz. melléklet: Novák, B., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Nasmyth, K. & Tyson, J.J. (1998) Model scenarios for the evolution of the eukaryotic cell cycle Phil. Trans. R. Soc. Lond. B., 353, 2063-2076

2. melléklet: Chen, C.K., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Val, J., Novák, B. & Tyson, J.J. (2000) Kinetic analysis of a molecular model of the budding yeast cell cycle. Mol. Biol. Cell. 11, 369–391

3. melléklet: Novák, B., Tóth, A., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Tyson, J.J. & Nasmyth, K. (1999) Finishing the cell cycle J. Theor. Biol. 199, 223-233

4. melléklet: Novák, B., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Chen, K. & Tyson, J.J. (1998) Mathematical model of the fission yeast cell cycle with checkpoint controls at the G1/S, G2/M and metaphase/anaphase transitions Biophys. Chem. 72, 185-200

5. melléklet: Sveiczer, Á., Csikász-Nagy, A., Gyõrffy, B., Tyson, J.J. & Novák, B. (2000) Modeling the fission yeast cell cycle: quantized cycle times in wee1- cdc25∆ mutant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 7865-7870

60

A sarjadzó élesztõ sejtciklusának matematikai modellezése

Recommend Documents