A REGULÁLÓ PEPTIDEK SZEREPE AZ EXOKRIN PANCREAS MŰKÖDÉSÉBEN ÉS A GYOMOR MOTILITÁSÁBAN

A REGULÁLÓ PEPTIDEK SZEREPE AZ EXOKRIN PANCREAS MŰKÖDÉSÉBEN ÉS A GYOMOR MOTILITÁSÁBAN DOKTORI ÉRTEKEZÉS

DR. KISFALVI KRISZTINA Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar I.sz. Belgyógyászati Klinika

Témavezető: Dr. Varga Gábor Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet MTA Budapest, 2001

BEVEZETÉS A gastrointestinalis (GI) traktus fő feladata a táplálék megemésztése és felszívása. A gerincesek emésztőtraktusában igen kifinomult szabályozórendszer található, amely szabályozza az emésztőnedvek termelődését, a táplálék mozgatását a bélben, a központi idegrendszerrel való kapcsolatot és a gastrointestinalis szövetek növekedését és differenciálódását. Ezen események összehangolásában és ellenőrzésében központi szerepet játszanak a reguláló peptidek, amelyek szolubilis extracelluláris hírvivőként hatnak. A reguláló peptideket a gastrointestinalis mucosában levő speciális endokrin sejtek termelik, nagy részük azonban kimutatható a központi és a perifériás neuronokban is, ahol neuromodulátor szerepet fejthetnek ki. Munkám során néhány gastrointestinalis reguláló peptid, elsősorban a cholecystokinin (CCK) és a somatostatin hatásait vizsgáltam fiatal, elválasztás előtti életkorú és felnőtt patkány emésztőrendszerére, különös tekintettel az exokrin pancreas és a gyomormotilitás szabályozására. Kevés az irodalmi adat az újszülött és elválasztás előtti időszak gastrointestinalis működésének szabályozásáról. Ebben az életkorban adaptálódnak az emlősök az anyatej, majd az egyéb táplálék felvételéhez és emésztéséhez, így ebben az időszakban különösen fontos szerepet játszanak a szabályozó rendszerek és peptidek a szervezetben. Az egyedfejlődés során a patkány embrió hasnyálmirigyében nem észlelhető CCK-szerű immunreaktivitás, születés után és a szoptatás időszakában azonban a CCK magas koncentrációban van jelen a vérben, majd ismét csökken az elválasztás után. Az emelkedés időben egybeesik a pancreas gyors növekedésével, ami valószínűsíti a CCK szerepét a hasnyálmirigy fejlődésében. A CCK fontos szerepet játszik a gastrointestinalis motilitás szabályozásában is. Igen kis dózisú CCK hatékonyan befolyásolja a gyomor és bélrendszer motilitását in vivo és in vitro körülmények között is, ami azt jelzi, hogy ez a hormon egyik fiziológiás hatása. Tartós CCK kezelés növeli a pancreas súlyát és DNS tartalmát, azonban a gyomor növekedését befolyásoló hatásáról csak néhány ellentmondó adat található az irodalomban. Ismert, hogy a CCK hatását specifikus receptorok közvetítik, és a pancreas acinus sejteken és a GI simaizmokon jelen lévő receptorok a CCK-1 alosztályba tartoznak. A CCK-1 receptorok kétféle, magas és alacsony affinitási állapotban léteznek a szervezetben. A CCK ezen alacsony vagy magas affinitású helyekhez kötődve különböző intracelluláris folyamatok beindulásához vezet, ennek megfelelő következményes biológiai válaszokkal. A szintetikus CCK analóg

2

JMV-180 agonistaként hat a magas affinitású CCK-1 receptorokon és antagonista az alacsony affinitású receptorokon, így hasznos eszköz arra, hogy segítségével elkülönítsük a receptor kétféle állapotát. Egyes szekretagógok nagy dózisaival, így CCK-val, illetve a CCK analóg caeruleinnel akut interstitialis pancreatitis idézhető elő patkányban, ezen megfigyelés alapján vetették fel a CCK esetleges pathogenetikai szerepét a pancreas betegségeiben. A „hiperstimulációs” pancreatitis a kialakulásának pathomechanizmusa részleteiben még nem ismert. Az ilyen módon kiváltott akut pancreatitis korai szakában az acinussejtekben szekretoros és nagy autofág vakuolák fejlődnek ki, melyek a kondenzálódó vakuolák és zymogén granulumok fúziójának eredményeként emésztő és lizoszómális enzimeket tartalmaznak. Az eredetileg membránnal elválasztott enzimek egymással való kapcsolatba kerülése (kolokalizáció) lehetővé teszi, hogy a lizoszómális hidrolázok, mint pl. a katepszin-B katalizáló hatása következtében a zymogén szemcse inaktív tripszinogénje aktív tripszinné alakuljon, és ez az acinus sejt nekrózisát hozza létre. Mindezek alapján úgy tűnik, hogy a pancreas emésztőenzim raktárainak csökkentése protektív hatású akut pancreatitisben. A somatostatin gátolja a normál és stimulált pancreas enzimszekrécióját. Ennek alapján kézenfekvő lenne a somatostatin kezelés jó hatása akut pancreatitisben. Az irodalomban számos tanulmányt találunk ezzel kapcsolatban, azonban eredményeik ellentmondásosak

3

CÉLKITŰZÉSEK Kísérleteink során három területen vizsgáltuk a reguláló peptidek szerepét: I. A pancreas szekréció és növekedés szabályozása a születés utáni időszakban (elválasztás előtt) és felnőtt életkorban II. CCK-1 receptorok szerepe a gyomor motilitásában és szöveti növekedésében III. végül vizsgáltuk a tripszininhibitor camostate és a somatostatin előkezelés lehetséges preventív hatását kísérletes akut pancreatitisben.

MÓDSZEREK Kísérleteinkhez Wistar patkányokat használtunk. Az újszülött állatokon végzett vizsgálatoknál egy alomban 8 állat volt és minden kísérletnél olyan elrendezést alkalmaztunk, amely szerint az egy alomban lévő állatok különböző anyagokat kaptak, különböző kísérleti csoportokba kerültek, hogy az anyai hatást ki tudjuk küszöbölni. Számos kísérletünkben a CCK analóg caeruleint használtuk, hogy a CCK-szerű hatásokat létrehozzuk. A caerulein egy kétéltűből származó dekapeptid, mely olyan C terminális oktapeptid szekvenciával rendelkezik, ami csak 1 aminosavban tér el a CCK-tól. Ennek következménye, hogy ennek a két peptidnek azonos biológiai hatásspektruma van. Kísérleti szempontból a caeruelin azért előnyösebb, mert ellenállóbb az enzimatikus hasítással szemben, mint a CCK. Alkalmazott biokémiai módszerek Az eltávolított pancreas szövet fehérjetartalmát Lowry módszere szerint határoztuk meg, a kalibrációs görbéhez BSA-t használtunk. A szöveti DNS tartalmat perklórsavban történő extrakció után difenilamin reakcióval mértük Munro, Fleck és Burton módszerei szerint. A tripszin aktivitást Hummel spektrofotometriás módszerével. TAME (p-tosyl-arginin-metilészter) szubsztrát alkalmazásával, 247 nm-es hullámhosszon határoztuk meg. Az amiláz aktivitás értékelése Bernfeld szerint történt, oldható keményítőt alkalmazva szubsztrátként, maltóz standard görbe mellett.

4

In vivo vizsgálatok Pancreas szekréció és növekedés: A fiatal, elválasztás előtt lévő patkányok (patkányoknál az anyatejről való elválasztás a 20. napon történik, addig postnatalis periódusról beszélünk) pancreas enzimszekréciós vizsgálata in vivo a hagyományos módszerrel (pancreas vezeték kanülálás) nem lehetséges, mert a ductus Wirsungianus átmérője olyan kicsi, hogy technikailag lehetetlen kanült vezetni bele. Kutatócsoportunk a ’80-as évek végén kifejlesztett egy új módszert, az ún. „tubeless” technikát, amelynek segítségével a stimulált pancreas szekréció quantitatívan vizsgálható intakt szoptatott állatokban. A technika lényege, hogy a nem stimulált hasnyálmirigyben az enzimaktivitás változatlan, míg a stimulált mirigyben csökken, mivel az enzimek a bélbe szekretálódnak. A stimulált és a kontroll hasnyálmirigy enzimaktivitásának különbsége jól korrelál a szekréciós aktivitással. A „tubeless” technika segítségével vizsgáltuk a gastrointestinalis peptidek közül a CCK, secretin és bombesin hatását a pancreas szekrécióra a postnatalis periódusban. Meghatároztuk a kivett hasnyálmirigy fehérje és tripszintartalmát és a tripszin/fehérje hányados jelezte a pancreas enzimtartalom változását, kiürülését vagy felhalmozódását a mirigyben. Az uretánnal (1,2 g/kg ip) elaltattott állatokat juguláris kanüllel láttuk el, majd a májkapuban lekötöttük a közös epevezetéket és a pancreas vezeték duodenalis végébe polietilén kanült vezettünk és ezen keresztül gyűjtöttünk tiszta pancreasnedvet 30 perces frakciókban. Ismert koncentrációjú CCK-8-at vagy dexloxiglumidot adtunk iv., és mértük a gyűjtött pancreasnedv amiláztartalmát. Vizsgáltuk a pancreas növekedését is exogén és endogén CCK, somatostatin és alkohol hatására. A kezelést 7-10 napig folytattuk, majd az állatokat dekapitáltuk, a pancreast kivágtuk, óvatosan megtisztítottuk a zsírtól, mesentériumtól és nyirokcsomóktól, megmértük a súlyát, majd Tris pufferben homogenizáltuk. Meghatároztuk a pancreas tripszin- és amilázaktivitását, valamint fehérje és DNS tartalmát. Gyomorürülés és szöveti növekedés: Az állatokat gyomorkanüllel és vena jugularis kanüllel láttuk el. A műtét és a kísérletek megkezdése között legalább egy hét gyógyulási időszakot hagytunk. Az állatok egy része camostate-ot kapott intragastrikusan a kanülön keresztül, másik része különböző dózisú caeruleint iv. bolusban a tesztétel előtt. A tesztétel fenol-vöröst tartalmazó testmeleg fiziológiás sóoldat volt, melyből lassan 3 ml-t juttattunk a kanülön át az előgyomorba. Ezt követően a gyomorkanült lezártuk, majd 5 perc múlva újból kinyitottuk és összegyűjtöttük a gyomorban maradt tesztételt. Az így nyert folyadékot először lúgosítottuk, majd a benne levő fenol-vörös mennyiségét spektrofotométer segítségével (560 nm-en) megmértük. A beadott és a visszanyert fenol-vörös mennyiségének különbségéből következtettünk a gyomorürülés mértékére.

5

Az állatokat 7 napig kezeltük (caerulein, camostate, dexloxiglumid), majd a 8. napon leöltük őket (előtte 1 éjszakát éheztek) és a gyomrukat eltávolítottuk. A corpus részt elválasztottuk az antrumtól és az előgyomortól. A corpust és az antrumot homogenizáltuk, majd megmértük fehérje és DNS koncentrációjukat. In vitro vizsgálatok Pancreas szekréció: A frissen eltávolított pancreast apró szeletekre vágtuk (3-5 mg-os) és összesen kb. 150 mg-nyi szövetet 1 ml térfogatú szervkamrába helyeztünk, melyen folyamatosan módosított Krebs-Henseleit oldatot áramoltattunk át. Az ismert koncentrációjú CCK-8-at vagy dexloxiglumidot közvetlenül adtuk a szuperfúziós oldathoz. A 30 perces inkubálás után 3 perces frakciókban gyűjtöttük a szervkamrát elhagyó oldatot, amiből meghatároztuk az amilázkoncentrációt. Acinussejt izolálás: A pancreas acinusokat az irodalomban leírt és elfogadott metodika szerint preparáltuk. CCK-8-at és JMV-180-at (önmagában vagy kombinálva) ismert koncentrációban adtunk közvetlenül az inkubáló oldatba a második inkubáció előtt. Az inkubáció végén az acinusokat és a médiumot centrifugálással elválasztottuk és ezek amiláztartalmát meghatároztuk. A CCK-8 és a JMV-180 biológiai aktivitását az amiláz felszabadulás mennyiségével (30 perces periódus alatt, 37oC-on, keményítő szubsztrátot alkalmazva) határoztuk meg. Gyomor simaizom kontrakció: Simaizom csíkokat (2-3 mm széles, 8-10 mm hosszú) preparáltunk a corpusból, az antrumból és a pylorusból. A corpusból és az antrumból körkörös és hosszanti izomcsíkokat preparáltunk, míg a pylorusgyűrűből csak körkörös izmokat. A kipreparált darabokat szervfürdőbe helyeztük és rögzítettük a transzducerhez, amelynek segítségével az izom hosszúságában bekövetkező változásokat mértük. Különböző koncentrációjú CCK-8-t vagy JMV-180-t juttattunk közvetlenül a kamrában lévő oldatba és az így létrejött kontrakciókat izometriás körülmények között néztük potenciométerrel. A kísérleteket párhuzamosan végeztük: az egyik kamrában a vizsgált peptidet tartalmazó, míg a másik kamrában a peptidet nem tartalmazó oldat volt. Pancreatitis Szupramaximális dózisú caeruleinnel hoztunk létre pancreatitist Lampel leírása szerint. Az első kísérletben 400 mg/kg dózisú camostate-ot adtunk szondán keresztül az állatoknak az első caerulein injekció előtt majd öt órával az első caerulein injekció után az állatokat kivéreztettük, pancreasukat kivettük. A másik kísérletben a pancreatitis létrehozása előtt 12 órával 4 µg/kg dózisú octreotid

6

(Sandostatin) injekciót adtunk sc., majd ezt 12 óránként ismételtük, és az állatokat különböző időpontokban dekapitáltuk: 6, 24, 72, illetve 120 órával az első caerulein injekció után. A 6. és 24. órában az akut pancreatitisre kifejtett hatást, míg a 3. és 5. napon a pancreas regenerációra kifejtett hatást vizsgáltuk. A dekapitációt követően a pancreast eltávolítottuk, megmértük és analizáltuk a fehérje, DNS, tripszin és amiláz tartalmat, emellett meghatároztuk a plazma amilázszintet is. Statisztika Az eredményeket variancia analízissel, illetve szükség szerint többszörös összehasonlítás módszerrel értékeltük.

7

FŐBB ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK

·

·

·

·

·

·

· ·

8

Először mutattuk ki, hogy elválasztás előtti életkorban az endogén CCK-t felszabadító szintetikus tripszininhibitor, a camostate a bélbe juttatva stimulálja a pancreas tripszinszekrécióját. Ez a hatás atropinnal részben gátolható volt, ami arra utal, hogy az endogén CCK részben a vaguson keresztül fejti ki hatását. Igazoltuk, hogy a camostate emeli a plazma CCK szintet elválasztás előtti életkorban is, és kimutattuk, hogy ez a plazma hormonszint emelkedés időben jóval tovább tart, mint az exogén CCK beadása esetén (45 perccel a kezelés után is közel nyolcszor magasabb a plazma CCK szint camostate adása esetén, mint a kontrollban, míg a CCK beadása után ekkor már normális szintet mértünk). A secretin 10 napos állatokban hasonló hatást fejtett ki, mint felnőtt állatokban. Szignifikánsan csökkentette a hasnyálmirigy tripszintartalmát, azaz fokozta az enzimszekréciót és potenciálta a caerulein szekréciós hatását szoptatott állatokban. A bombesin újszülöttben szintén stimulálta az enzim kiürülését. Ezen adatok arra utalnak, hogy a CCK mellett a secretin és a bombesin is részt vesz patkányban a pancreas exokrin szekréció szabályozásában a postnatalis fejlődés során. Kísérleteinkben kimutattuk, hogy a camostate hypertrophiát hoz létre a postnatalis periódusban is és 10 napig tartó camostate kezelés elegendő a pancreas növekedés létrehozásához, további kezeléssel nem fokozódik a mirigy növekedése. Kísérleteink során az octreotid kezelés a postnatalis 1-11. nap között csökkentette a plazma növekedési hormon szintjét, a pancreas tripszintartalmát és koncentrációját, és gátolta a caerulein által indukált DNS és tripszintartalom emelkedést. Kimutattuk, hogy a postnatalis periódus második felében az alkohol kezelés nem befolyásolta sem a normális, sem a stimulált pancreas növekedését. Ennek magyarázata lehet, hogy a biológiai programozás a postnatalis időszakban olyan erős, hogy az exogén növekedést gátló hatásokat (pl alkohol) jelentősen vagy teljesen képes ellensúlyozni. Igazoltuk, hogy újszülöttekben a camostate exokrin pancreasra kifejtett hatása gátolható CCK-1 receptor antagonistával (lorglumid). Felnőtt állatokban jellemeztük egy új CCK-1 receptor antagonista, a dexloxiglumid hatását a pancreas szekrécióra és növekedésre. Eredményeink

·

·

·

·

alapján a dexloxiglumid egy szelektív és kompetitív CCK-1 receptor antagonista. Kimutattuk, hogy a CCK analóg caerulein mellett a camostate is dózisfüggő módon gátolta a folyékony tesztétel ürülését a gyomorból. Tartós CCK kezelés nem befolyásolta a gyomor súlyát és összetételét sem a corpusban, sem az antrumban, így a CCK hatása a pancreas és a gyomor szöveti növekedésére különböző. A JMV-180 segítségével kimutattuk, hogy a pylorusban, a corpus és az antrum simaizmaiban csak alacsony affinitású CCK-1 receptor van jelen, míg a pancreasban az alacsony és magas affinitású CCK-1 receptor található. Ennek alapján indirekt módon igazoltuk, hogy csak a magas affinitási állapotban lévő CCK-1 receptorok stimulációja vezet sejtproliferációhoz. Kimutattuk, hogy a pancreatitis kialakulását megelőzően (preventiven) orálisan adott camostate a hasnyálmirigy-gyulladás súlyosságát jelentősen mérsékelte a tripszinraktárak kiürítésével. Somatostatin kezelés – még ha a hasnyálmirigy gyulladás kialakulása előtt is adjuk – kísérleteinkben nem tudta kivédeni a kísérletesen létrehozott akut pancreaskárosodást. A peptid korai alkalmazása azonban csökkentette a károsodás mértékét, így a károsodás korai szakaszában kiegészítő kezelésként a somatostatin adása szóba jön. Tartós alkalmazás azonban nem javasolt, mert a somatostatin kezelés nem gyorsítja a mirigy regenerációját.

9

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Mindenekelőtt szeretnék hálás köszönetet mondani az első tanáromnak, Dr. Papp Miklós professzor úrnak, aki medikus koromban maga mellé vett és mindenben segített, támogatott. Egy széles látókörű, nyitott kutatót ismerhettem meg Benne, sugárzott belőle kutatás iránti őszinte odaadás és tisztelet. Köszönöm Neki, hogy megtisztelt bizalmával, hogy tanítványává fogadott, és hogy megtanulhattam Tőle a kutatói látásmódot, gondolkodást, mely nemcsak a PhD tanulmányaim során, de a klinikai munkámban is igen sokat segített és segít jelenleg is. Papp Tanár úr kritikája, segítő megjegyzései, lankadhatatlan figyelme, állandó bíztatása, barátsága munkám során mindvégig elkísért. Hasonlóképpen nagy hálával tartozom és igen köszönöm dr Varga Gábor professzor úr segítségét és támogatását, aki nélkül ez a dolgozat nem jöhetett volna létre. Papp Tanárúr nyugdíjba vonulása után Varga Tanár úr maga mellé vett és tovább tanított, megmutatta, hogy milyen ma egy nemzetközileg is elismert kutató élete és munkája. Varga tanár úr kitartása, munkabírása, a kutatás iránti szeretete és elhivatottsága mindig lenyűgözött. Köszönöm, hogy mindig kiállt mellettem, hogy mindvégig, sgített, tanított, és nemzetközi hírű kutatócsapatának tagjává fogadott. Hálás köszönettel tartozom Tulassay Zsolt professzor úrnak is, a Semmelweis Egyetem II. sz Belgyógyászati Klinika igazgatójának. Tulassay professzornak köszönhetem azt, hogy egyáltalán egy igazi kutatóhelyre juthattam, mert professzor úr medikus koromban vitt el oda, ahol ő is kísérletes kutatómunkája nagy részét végezte, a KOKI-ba Papp Miklós professzor úrhoz. Tulassay professzor kedvessége, dinamizmusa, racionalitása és a betegekkel való fantasztikus viszonya mindig magával ragadott, és példa értékű volt számomra. Köszönöm azt is, hogy Tulassay professzor PhD programjába kerülhettem, és állandó támogatását élvezhettem. Nagyon sokat köszönhetek a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Gastroenterológiai munkacsoportjának, ahol mindig fantasztikus légkör fogadott, és minden percre, amit velünk töltöttem nagy örömmel emlékezem. Mindig önzetlenül segítettek, támogattak. Külön köszönöm Barabás Lia, Harasztiné Jacsó Márta, Burghardt Beáta és Rácz Gábor, segítségét és barátságát, akikhez mindig fordulhattam bátorításért, segítségért, őszintén mellettem álltak jóban és rosszban egyaránt.

10

Köszönöm Dr. de Chatel Rudolf professzor úrnak, Semmelweis Egyetem I.sz. Belgyógyászati Klinika igazgatójának, hogy egy ilyen híres és jónevű klinikán tanulhattam és tanulhatom a belgyógyászat alapjait. Köszönöm professzor úrnak, hogy a klinikai orvosi munka, a betegellátás megismeréséhez és tanulásához minden segítséget megadott, és kutatómunkámban is mindvégig töretlenül támogatott. Nagyon köszönöm dr. Papp János professzor úrnak, hogy a klinikán mindvégig mellette dolgozhattam, és Tőle tanulhattam a gastroenterológia és endoscopia művészetét. Professzor úr igen nagy tudása és fantasztikus ügyessége mindig lenyűgözött, és igen nagy megtiszteltetés számomra, hogy munkacsoportjába kerülhettem. Szeretnék köszönetet mondani minden kollégámnak, akikkel az eltelt évek alatt együtt dolgozhattam. Igen nagy öröm és megtiszteltetés számomra, hogy világhírű professzoroktól és szakemberektől tanulhattam és leshettem el a belgyógyászat és a betegellátás alapjait a mindennapi munka során. Köszönöm Nekik mindig előremutató és segítő kritikáikat, türelmüket, segítségüket és barátságukat. Külön köszönöm az endoscopos labor munkatársainak a sok szakmai és emberi segítséget, és hogy a labor mindig egy kis sziget, egy meleg kis zug volt, ahova a sok munka mellett is mindig jó volt bemenni és örömöt, bánatot megosztani egymás között. Köszönöm továbbá minden gyakornoktársamnak, hogy együtt dolgozhattam velük, köszönöm a türelmüket és segítségüket, és hogy mindenkitől tanulhattam, szerezhettem fontos és hasznos ismereteket. Őszintén köszönöm Dr. Vizi E. Szilveszter Professzor Úrnak, a KOKI igazgatójának, hogy nemzetközileg igen elismert színvonalú kutatóintézetébe befogadott és az ott dolgozó munkatársakkal azonos lehetőségeket biztosított számomra külsős kutatóként is.

11

És végül, de egyáltalán nem utolsó sorban szeretnék köszönetet mondani családomnak. Drága Szüleimnek és Testvéremnek, akik biztos, meleg családi hátteret jelentenek számomra. Köszönöm Drága Anyukámnak, hogy mindig mellettem áll, fantasztikus tanácsaival átsegít minden bajon és gondon. Kedvessége, csodálatos természete és lénye igazi, utol nem érhető példakép számomra. Köszönöm Drága Apukámnak, aki miatt orvos lettem, és aki mindig segített, tanított, akihez bátran fordulhattam minden emberi és szakmai gondommal, és akinek szorgalma és szerénysége számomra örökre követendő példa marad. Köszönöm Drága Testvéremnek, hogy mindig összetartó, egymást utolsó csepp vérünkig segítő család lehetünk. Még egyszer köszönöm a szeretetet amit Tőletek kapok, és azt, hogy egy ilyen csodálatos családban élhetek.

12

INTRODUCTION The most important role of the gastrointestinal (GI) tract is the digestion and the absorption of the food. There is a sophisticated regulatory system in the GI tract of the vertebrates regulating the production of digestive enzymes, the motility, the connection with the central nervous system and the proliferation and differentiation of gastrointestinal tissues. The regulatory peptides have an important role in the coordination and controlling of these events and act as soluble extracellular messengers. These peptides are produced by special endocrin cells in the intestinal mucosa and can be found in the central and periferial nerves where they act as neuromodulators. I investigated the effects of some gastrointestinal peptides (cholecystokinin /CCK/ and somatostatin) on the GI tract, especially on the regulation of exocrine pancreas and motility of stomach in suckling and adult rats. There are only a few data available on the regulation of the GI tract in the newborns and before weaning. In this period of life mammals adapt to the food intake and digestion, and therefore, the effects of the regulatory peptides are very important at this time. In the ontogenesis there is no CCK-like immunoreactivity in the pancreas of the rat embryo but after birth the serum level of the CCK is highly elevated and decreased after weaning. The elevation of the serum level is parallel with the rapid growth of the exocrin pancreas suggesting that CCK plays a regulatory role in the development of the gland. CCK is also one of the most important hormones involved in the regulation of gastrointestinal motility. The fact that minute amounts of CCK are sufficient to affect GI motility under different in vivo and in vitro conditions would indicate that this action on the gut is one of the physiological actions of the peptide. Chronic administration of CCK produced pancreatic hypertrophy and hyperplasia, however, there are only a few contradictory data available on the peptide effect on gastric growth. Specific receptors mediate the biological actions of CCK on exocine pancreas and GI smooth muscle and they belong to the CCK-1 subtypes. The CCK-1 receptors exist in two (i.e. high and low) affinity states, and CCK occupancy of high and low affinity sites is thought to be related to the initiation of different intracellular events and consequent biological responses. Being an agonist at high affinity CCK-1 receptors and an antagonist towards the low affinity ones, the synthetic JMV-180 represents a useful tool to functionally distinguish between the two receptor states. Treatment of rats with high concentration of secretagogues, such as CCK or the CCK analogue caerulein generates interstitial pancreatitis suggesting the

13

pathogenetic role of these peptides in the diseases of the pancreas. Although the exact pathophysiology of this „hyperstimulated” pancreatitis is not well established, it is demonstrated that in this type of pancreatitis digestive and lysosomal enzimes are packaged in large intracellular secretory and autophag vacuoles. Breakdown of the vacuole membranes results in the colocalization of the enzymes, and by the catalization of the lysosomal enzymes (i.e. cathepsin B) the inactive trypsinogen is activated into trypsin. The activation of the trypsin induces the necrosis of the acinar cell. Accordingly, the depletion of the pancreatic trypsin content seems to have a beneficial effect on the onset of the „hyperstimulated” pancreatitis. Somatostatin inhibits the normal and stimulated enzyme secretion of the exocrine pancreas. On the basis of this inhibitory effect, treatment with somatostatin should be favourable in acute pancreatitis. However, literature data regarding the efficacy of somatostatin treatment in acute pancreatitis are controversial.

14

AIMS OF THE STUDY

We investigated the effects of some regulatory peptides, cholecystokinin (CCK) and somatostatin on the GI tract in newborn rats and before weaning. We were mainly interested in: I. effects of these peptides on the secretion and growth of the exocrine pancreas in suckling and adult rats II.

effects of CCK-1 receptor stimulation on the motility and growth of gastric smooth muscle

III.

In addition, we investigated the therapeutic preventive effects of these peptides on acute experimental pancreatitis.

METHODS In all experiments Wistar rats were used. In the experiments performed on newborn rats one dam nurished 8 pups. As a rule, four such litters were used in littermate pairs: pups of each litter were distributed in pairs to all experimental groups to avoid the effect of the dam. In some experiments we administered the CCK analogue caerulein instead of CCK. Caerulein is extracted from frog skin and its aminoacid sequence only differs from that of CCK in a single residue at the C-terminal octapeptide. The consequence of this difference is that although the biological action of the two peptides are the same, caerulein is more resistant to proteolysis. Assays The protein content of the pancreas was determined by the method of Lowry using bovine serum albumin as standard. Pancreatic DNA content was measured by using diphenylamine after extraction the DNA by perchloracid. The method was introduced by Munro, Fleck and Burton. Trypsin activity was measured by spectrophotometric method of Hummel, trypsinogen was activated by enterokinase. Amylase activity was measured according to the method of Bernfeld using blue starch as standard control.

15

In vivo experiments Enzyme secretion and growth of the pancreas: in suckling rats, before weaning the cannulation of the pancreatic duct often leads to fatal complications. In our laboratory there was a new methodology elaborated so called „tubeless method”. The essence of the method is that the enzyme activity in the non-stimulated pancreas is unchanged while in the stimulated pancreas it is reduced due to the secretion into the duodenum. So the difference between the enzyme activity in the stimulated and non-stimulated pancreas corresponds to the secretion. We investigated the effects of some gastrointestinal peptides such as secretin and bombesin on the secretion of the exocrine pancreas by this method in rats before weaning. We removed the pancreas and measured the protein and trypsin content. The decrease of the trypsin/protein ratio was shown to be due to enzyme depletion, the increase of this ratio is an indicator of enzyme accumulation in the gland. After urethane (1.2 g/kg ip) anesthesia the common bile duct at the hepatic hilum was ligated and a polyethylene cannula was introduced into the duodenal part of the duct for collecting pure pancreatic juice for 30-min periods. The rats were given different doses of CCK-8 and/or dexloxiglumide intravenously and we measured the amylase concentration of the collected juice. We investigated the trophic action of exogenous and endogenous CCK, somatostatin and ethanol on the pancreas. The animals were treated with the above mentioned peptides and ethanol for 7 or 10 days. At the end of the treatments the rats were decapitated, the pancreata were removed, carefully trimmed free of fat, mesentery and lymph nodes, weighed, and homogenized in Tris buffer. Protein and DNA concentration as well as trypsin and amylase activities were then measured in the pancreatic tissue. Gastric emptying and growth: Under pentobarbitone anesthesia a Gregory-type gastric cannula was implantated in the forestomach of the rats. Experiments were started after at least 1 week to allow for recovery. Some of the animals were given camostate directly intragastrically, others were treated with different doses of caerulein bolus intravenously. 3 ml of the testmeal (saline with phenol-red (37oC)) was administered slowly directly to the stomach through the cannula. The cannula was closed for 5 minutes, than we collected the rest of the testmeal from the stomach. Phenol-red content of the collected juice was determined by spectrophotometry (560 nm) after alkalinization. The difference of the content of the phenol red in the administered and the collected juice corresponded with the gastric emptying. Rats were treated with caerulein, camostate and dexloxiglumide for 7 days. After overnight fasting, on the eighth day the animals were killed, the stomach was

16

removed, opened along the greater curvature and gently rinsed with water. The oxyntic gland area was carefully separated from the pyloric gland (antrum) and forestomach. The oxyntic gland area and the antrum were homogenized and the protein and DNA concentrations were measured in the gastric tissues. In vitro experiments Secretion of the pancreas: The pancreas was quickly removed then cut into small segments (3-5 mg) and a total weight of about 150 mg was placed in a tissue flow chamber of 1 ml capacity and superfused at a constant rate with a modified Krebs-Henseleit solution. CCK-8 and dexloxiglumide were added directly to the superfusion solution at known concentrations. The tissue was incubated for 30 minutes, then fractions were collected at 3-min intervals and the amylase concentrations in the effluents were measured. Preparation of isolated pancreatic acini: Isolated pancreatic acini were prepared by a method previously described and validated. CCK-8 and JMV-180 (alone or in combination) were added directly to the incubation vials in known concentrations immediately before the second incubation. At the end of the incubation, acini and media were separated by centrifugation and their amylase contents were measured. The biological activity of CCK-8 and JMV-180 was determined by the release of amylase in 30-min periods. Contractions of gastric smooth muscles: Muscle strips (2-3 mm in width and 8-10 mm in length) were prepared from the corpus, the antrum and the pylorus. Both circular and longitudinal muscles were prepared from the corpus and antrum whereas only circular strips were obtained from the pylorus ring. The strips were suspended in a 10 ml organ bath and connected via surgical silk to a forcetransducer for monitoring changes in muscle length. Strips were then exposed to different concentrations of CCK-8 and JMV-180, alone or in combination, until the tension reached a plateau. Values were expressed as percent of the contractile effect of 10-5M acetylcholine on the same muscle preparation. Pancreatitis The acute injury of the pancreas was induced by repeated subcutaneous injections of supramaximal doses of caerulein given at hourly intervals, according to Lampel. In the first experiment camostate (400 mg/kg) was given by gavage once at 1 hour before the first caerulein injection. Five hours after the first caerulein injection the rats were exsanguinated and their pancreata removed. In the other experiment octreotide was injected into the rats at a dose of 4 mg/kg sc. The first dose was administered 12 hrs before the first caerulein injection with repeated injections every 12 hours, until the rats were sacrificed. The animals were decapitated at different intervals: at 6 and 24 hours following the first caerulein

17

injection inducing the acute injury of the pancreas, and after 72 hours (Day 3) and 120 hours (Day 5) to study pancreatic regeneration. Removed pancreata were weighed and analyzed for protein, DNA, trypsin and amylase content, and the plasma amylase levels were determined as well. Evaluation of data Mathemathical statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA) and Dunn’s multiple range test.

NEW RESULTS

·

·

·

·

·

18

It was first demonstrated that the synthetic trypsin inhibitor camostate (which releases endogenous CCK) stimulates the pancreatic trypsin secretion even in developing rats, before weaning. The stimulating effect of camostate was partially inhibited by atropine suggesting that the endogenous CCK affects on the exocrine pancreas through vagal nerves also. We demonstrated that camostate increases plasma CCK in suckling rats and this elevation induced by camostate is longer in time than that due to exogenous CCK-8 (after 45 min the increase due to camostate was 8-fold higher than in control saline group meanwhile in the CCK treated group at the end of the 45-min test period the plasma CCK concentration turned back to the normal level.) In 10-days old rats the secretin acts on the pancreas secretion similar than in adult animals: the peptide significantly reduced the trypsin content of the pancreas by stimulating the enzyme secretion and potentiates the effect of caerulein. Bombesin also stimulated the enzyme output in newborns. These data suggest that beside CCK the secretin and bombesin also plays a role in the regulation of the exocrine secretion in the postnatal life. In our experiments we demonstrated that the serin protease inhibitor camostate promotes pancreatic growth in rats before weaning. It induces hyperplasia and hyperthrophy of the pancreas in the postnatal life and treatment for 10 days is enough for the effect, longer treatment has no more advantage. In the postnatal life the octreotide given alone decreased the plasma growth hormone level and basal pancreatic trypsin content and concentration, and

·

· ·

·

·

·

·

given in combination with caerulein, it diminished the caerulein-induced increase in DNA and trypsin content. We demonstrated that before weaning the ethanol affected neither the stimulated nor the non-stimulated growth of the pancreas. The explanation of this inefficiency may be due to the biological programming which compensates the influences acting against the development. We demonstrated that the CCK-1 receptor antagonist loxiglumide is able to antagonize the effects of camostate on the exocrine pancreas. In adult rats we characterized the effects of dexloxiglumide, a new CCK-1 receptor antagonist on the exocrine pancreas. Dexloxiglumide proved to be a selective and potent and competitive antagonist on CCK-1 receptors, therefore represents a useful tool to investigate CCK-receptor interactions in peripheral organs. Results of our investigations show that like CCK, the camostate also delays dose-dependently the gastric emptying. Chronic administration of CCK did not affect gastric weight and composition in both the oxyntic gland area and antrum, suggesting that the effects of the peptide on gastric and pancreatic growth are different. By the use of a special synthetic CCK analogue, JMV-180 we provided clear evidence that on pancreatic acinar cells the CCK-1 receptors are present in two different affinity states (high and low affinity), however, on gastric smooth muscle cells only low affinity receptors are present. In these experiments we indirectly confirmed that only the occupation of the high affinity receptors resulted in proliferation of the tissue. We demonstrated the preventive oral application of camostate had beneficial effects on caerulein-induced acute pancreatitis diminishing the trypsin content of the acinar cells. Somatostatin treatment – even if given before inducing experimental pancreatitis– can not prevent the onset of the experimentally induced acute injury of the pancreas. The early use of the peptide however has beneficial effect on the injury so the early use may be acceptable as a complimentary treatment at the beginning stage of the injury. The long term use, however, cannot be recommended because it does not speed up the restitution after the injury of the gland.

19

SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

Az értekezéshez közvetlenül kapcsolódó saját publikációk absztraktok nélkül Közlemények 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

20

Kisfalvi K., Varga G., Papp M. Influence of gastrointestinal (GI) hormones and suckling in the developing rat. Journal of Developmental Physiology 1993, 19:149-155 IF: 0,928 Kisfalvi, K., Hajnal F., Friess H., Büchler M., Varga G, Papp M. Alcohol does not affect the trophic pancreatic effect of CCK and its plasma level in young rats. Pancreas 1994, 9:399-401 IF: 1,662 Kisfalvi K., Friess, H., Büchler M., Gorácz Gy., Papp M. Beneficial effects of preventive oral administration of camostate on caerulein-induced pancreatitis in rats. Dig. Dis. Sci. 1995, 40:546-547 IF: 1,739 Kisfalvi K, Friess H, Büchler M, Tulassay Z, Varga G, Papp M. Agedependent influence of octreotide on stimulated pancreatic growth in the postnatal period of rats. Eur J Gastroenterol Hepatol 1996, 8: 69-74. IF: 1,589 Kisfalvi K, Burghardt B, Varga G, Papp M. A hasnyálmirigyszövet védelmét befolyásoló tényezôk kritikai értékelése. Orv. Hetil 1996, 137: 787-791. Tulassay Z, Kisfalvi K, Papp M. The effect of the long-acting somatostatin analogue octreotide on caerulein-induced pancreatic injuries in rats. Z. Gastroenterol 1995 33: 99-102 IF: 0,680 Varga G, Kisfalvi K, D'Amato M, Scarpignato C. Effect of a new CCKAreceptor antagonist, dexloxiglumide, on the exocrine pancreas in rats. J Physiol (Paris) 1997, 91: 257-64. IF: 0,707 Varga G, Kisfalvi K, Pelosini I, D’Amato M, Scarpignato C. Different actions of CCK on pancreatic and gastric growth in the rat: effect of CCK-A receptor blockade. Br J Pharmacol 1998, 124: 435-440 IF: 3,704 Burghardt B, Kisfalvi K, Varga G, Papp M. Agonists and antagonists of regulatory peptides as tools to study regulation of pancreatic exocrine secretion, cell proliferation and gene expression. Scand J Gastroenterol 1998, Suppl 228: 11-20 IF: 2,360

10.

11.

Kisfalvi K, Papp M, Varga G. Effect of cholecystokinin and synthetic trypsin inhibitor camostate on pancreatic and gastric function in rats. Magyar Belorvosi Archivum 2000, 53: 227-232. Kisfalvi K, Rácz G, Zsirka-Klein A, Pelosini E, Scarpignato C, Varga G. Different activity states of CCK1 receptors on pancreatic acini and gastric smooth muscle in the rat. J Physiol (Paris) 2001, 95: 391-398 IF:1,339

Könyvrészlet 1. Papp M, Burghardt B, Kisfalvi K, Varga G. Critical evaluation of acinar, ductal vascular and intestinal intraluminal functions inlfuencing pancreatic cytoprotection. In: Biochemical pharmacology as an approach to gastrointestinal disorders, Ganigella TS ed, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, pp. 73-82, 1997.

Az értekezéshez közvetlenül nem kapcsolódó saját publikációk absztraktok nélkül 1.

Kordás K, Burghardt B, Kisfalvi K, Bardocz S, Pusztai A, Varga G. Diverse effects of phytohaemagglutinin on gastrointestinal secretions in rats. Journal of Physiology (Paris) 1998, 94: 31-36. IF: 1,339

Az értekezéshez közvetlenül kapcsolódó idézhető absztraktok közül néhány: 1.

2.

3.

Varga G, Kisfalvi K, Scarpignato C. CR-2194 and CR-2017: new tools to differentiate between CCK-A and CCK-B/gastrin receptors in vivo. Gut 1993, 34:(S3) S21 (IF: 5,111) Varga G, Kisfalvi K, Scarpignato C. A new CCK/gastrin receptor antagonist CR-2194 and CR-2017 differentiate between pancreatic and gastric receptor subtypes in vivo. Digestion 1993, 54: 313. (IF: 1,254) Varga G, Kisfalvi K, Scarpignato C. Inhibition of CCK-induced pancreatic enzyme secretion and growth by dexloxiglumide, a new CCK-A receptor antagonist. 4th Congress of the Internal Brain-Gut Society, Pécs. Dig Dis Sci 1996. (IF: 1,972)

21

4.

Kordás K, Burghard B, Kisfalvi K, Bardocz S, Pusztai A, Varga G. Diverse effects of phytohaemagglutinin on gastrointestinal secretions in rats. Dig Dis Sci, 43: 2345, 1998 (IF: 1,972) 5. Kisfalvi K, Scarpignato C, Varga G. Different affinity states of CCK-A receptors on pancreatic acini and pyloric muscle in the rat. Z Gastroenterol (IF: 0,890) 36:429 1998. 6. Kisfalvi K, Scarpignato C, Varga G. Difference of affinity states of CCKAreceptors on pancreatic acin in and gastric smooth muscle in rats. Annual Meeting of the Amer. Gastroenterol. Assoc., Orlando, May 1999, Gastroenterology 116: A617, 1999 (IF:10,33) 7. Kisfalvi K, Rácz G, Scarpignato C, Varga G. Affinity states of CCK-A receptors on gastric and intestinal smooth muscle in rats. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 41. Nagygyűlése, Balatonaliga 1999. Junius 8-12, Z Gastroenterol 37: 427, 1999 (IF: 0,890) 8. Kisfalvi K, Rácz G, Scarpignato C, Varga G. Different affinity states of CCKA-receptors on pancreatic acini and gastric smooth muscle in rats. 31st European Pancreatic Club Meeting, Lüneburg, July 28-31, 1999, Digestion 60: 384, 1999 (IF: 1,254) 9. Kisfalvi K, Scarpignato C, Varga G. Different affinity states of CCK-A receptors on pancreatic acini and pyloric muscle in the rat. Z Gastroenterol 36:429 1998. (IF: 0,890) 10. Varga G., Kisfalvi K., Rácz G., Scarpignato C. Relationship between the affinity states of CCKA-receptors and the trophic effects of CCK on pancreas and stomach in rats. 7th United European Gastroenterology Week, (IF: 5,111) Roma, November 13-17, 1999, Gut

22