MAKAI SZABOLCS
A POLIMERKÉPZŐ GLUTENIN ALEGYSÉGFEHÉRJÉK SZABÁLYOZÁSI FOLYAMATAI BÚZÁBAN C. DOKTORI ÉRTEKEZÉSE
Témavezetők: Juhász Angéla PhD (tud. oszt. vez.) és Tamás László PhD (hab. egy. docens) Készült az ELTE Biológiai Doktori Iskola (vez.: Prof. Dr. Erdei Anna) Kísérletes Növénybiológiai Doktori Program (vez.: Prof. Dr. Szigeti Zoltán) keretében az MTA Agrártudományi Kutatóközpontjában 2015-ben.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Jelen doktori munka elkészítésében a legnagyobb köszönet két témavezetőmnek Juhász Angélának (MTA ATK) és Tamás Lászlónak (ELTE) jár. Köszönöm továbbá Balázs Ervin akadémikusnak, hogy folyamatosan támogatta a doktori munkám elkészítését. Kiváló segítségükért köszönettel tartozom közvetlen kollégáimnak a laboros munkák kivitelezésében. Éva Csaba, Szelényi Magdolna hozzájárulása a kutatómunkámhoz egyben volt nélkülözhetetlen, hatékony és eredményes. Köszönöm édesanyám, testvérem és kedves párom támogatását és bátorítását a munkám során. Őszinte hálám Haraszi Rékának a bensőséges és inspiráló beszélgetésekért. Az ELTE Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszékén dolgozó ’TLC’ munkacsoport és az MTA ATK Alkalmazott Genomika Osztály minden jelenlegi és volt munkatársának köszönöm a támogatását és a segítséget, amit nyújtottak. Köszönöm a nyitottságot és segítséget az MTA ATK Génmegőrzési és Organikus Nemesítési Osztály dolgozóinak. Kőszegi Bellának köszönöm a lelkiismeretes munkát, amivel gördülékennyé tette a munkahelyi munkát. A kutatómunkát az OTKA K100881 számú pályázat is támogatta.
TARTALOMJEGYZÉK Rövidítésjegyzék .......................................................................................................................... i Bevezető ..................................................................................................................................... 1 1
Irodalmi áttekintés ............................................................................................................. 2 1.1
A polimerizálódó sikér alegységfehérjék ..................................................................... 3
1.1.1
Nagy molekula tömegű glutenin alegységfehérjék .............................................. 4
1.1.2
Kis molekula tömegű glutenin alegységfehérjék ................................................. 7
1.2
A glutenin gének transzkripciójának szabályozása ...................................................... 8
1.2.1
Cisz szabályozó elemek a gluteninek promóterein .............................................. 8
1.2.2
Transzkripciós faktorok és kölcsönhatásaik ....................................................... 10
1.2.3
Genetikai szabályozó körök és vizsgálataik ........................................................ 15
1.2.4
Hormonális vonatkozások .................................................................................. 15
1.3
A búzaszem fejlődése ................................................................................................ 16
1.3.1
Korai szakasz ....................................................................................................... 16
1.3.2
Differenciálódás és növekedés ........................................................................... 17
1.3.3
Érési fázis ............................................................................................................ 19
1.3.4
Szintézist meghatározó tényezők ....................................................................... 19
1.4
A közönséges búza háziasítása és annak következményei........................................ 20
1.4.1
A háziasítás genetikája ....................................................................................... 20
1.4.2
A háziasítás hátránya.......................................................................................... 21
2
Célkitűzések ...................................................................................................................... 22
3
Anyag és módszer............................................................................................................. 24 3.1
Kutatás során fejlesztett számítástechnikai eszközök és módszerek ........................ 24
3.1.1
Nagy érzékenységű in silico expresszióméter .................................................... 24
3.1.2
Promóter „böngésző” ......................................................................................... 27
3.1.3
Modul detektív ................................................................................................... 27
3.1.4
Fókuszált ko-expressziós hálózatszerkesztés ..................................................... 28
3.2
3.2.1
Motívumok, promóterszakaszok és próbaszekvenciák ..................................... 30
3.2.2
Expressziós adatsorok ........................................................................................ 32
3.3
Filogenetikai és diverzitás elemzés............................................................................ 32
3.4
Klaszterelemzés ......................................................................................................... 33
3.5
Tranziens génexpresszió ............................................................................................ 33
3.5.1
Riportergénes konstrukciók elkészítése ............................................................. 33
3.5.2
Tranziens expresszió........................................................................................... 34
3.5.3
Biolisztikus transzformáció ................................................................................. 35
3.6 4
Adatok és adatbázisok ............................................................................................... 30
PBF promóter szekvenálása ....................................................................................... 35
Eredmények...................................................................................................................... 37 4.1
Szabályozó elemek és kölcsönhatásaik a nagy molekulatömegű glutenin
alegységfehérje gének promóterein .................................................................................... 37 4.1.1
A Glu-1 gének promóter szakaszainak motívum-kompozíciója ......................... 37
4.1.2
Cisz-szabályozó modulok azonosítása ................................................................ 41
4.1.3
A Glu-1 aktivitásának változása genotípusonként ............................................. 44
4.1.4
Környezeti tényezők hatása a Glu-1 gének aktivitására .................................... 47
4.1.5
A HMW-GS gének és kölcsönható transzkripciós faktoraik hálózatelemzése ... 49
4.1.6
Szövetspecifitás vizsgálata ................................................................................. 54
4.1.7
A PBF promóterek szekvenálása és elemzése .................................................... 56
4.2
Konzervált szabályozó elemek jellemzése és szerepe az LMW glutenin gének
expressziójában .................................................................................................................... 57 4.2.1
S-típusú LMW Glutenin gének............................................................................ 61
4.2.2
I-típusú LMW Glutenin gének ............................................................................ 61
4.2.3
M-típusú LMW Glutenin gének .......................................................................... 62
4.2.4
LMW glutenin gének expressziójának összehasonlítása N-terminális szerint ... 63
4.2.5
A LMW glutenin gének hálózati elemzése ......................................................... 65
4.3 5
Az eredmények értékelése ............................................................................................... 70 5.1
A nagy molekulatömegű glutenin Alegységfehérjék szabályozása ........................... 70
5.1.1
Eltérő szabályozás az x- és y-típusú HMW glutenin gének között ..................... 70
5.1.2
Génprogramok és szerepük ............................................................................... 71
5.1.3
Szövetspecifitás a la cisz..................................................................................... 72
5.1.4
A HMW glutenin gének szabályozásának modellje............................................ 74
5.2
6
A HMW-GS promóterek evolúciójának vizsgálata ..................................................... 67
A kis molekulatömegű gluteninek szabályozása ....................................................... 77
5.2.1
Az LMW glutenin cisz szabályozó elemeinek jellemzése ................................... 77
5.2.2
Konzervált cisz szabályozó régiók és génaktivitások összefüggései .................. 78
5.2.3
Az LMW glutenin gének transzkripciójának finomhangolása ............................ 79
5.3
Az LMW és HMW glutenin gének promótereinek összevetése ................................ 80
5.4
Növényszíntű összefüggések ..................................................................................... 80
5.5
Nemesítési vonatkozások .......................................................................................... 82
5.6
Konklúzió.................................................................................................................... 85
Összefoglalás .................................................................................................................... 87
Summary .................................................................................................................................. 88 Irodalomjegyzék ....................................................................................................................... 89
RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK ABA: abszcizinsav. ABRE: abszcizinsav reszponzív. bp: bázispár. bZIP: basic leucine zipper. CRM: cisz-szabályozó modulok. DOF: DNA-binding One Zinc Finger. EB: endospermium boksz. GA: gibberilinsav. GAMYB: gibberilin aktiválta MYB. HBP-1: hisztonhoz kötődő fehérje (histone binding protein). HMW-GS: nagy molekula tömegű glutenin alegységfehérjék. LD: linkage disequilibrium. LEB: hosszú (long) endospermium boksz. LMW-GS: kis molekulatömegű glutenin alegységfehérjék. nt: nukleotid. O2: Opaque 2. PBF: prolamin bokszhoz kötődő faktor (prolamin binding factor). P-boksz: prolamin boksz. SPA: tartalékfehérje aktivátor (storage protein activator). TF: transzkripciós faktor. TPM: transcript per million.
i
BEVEZETŐ A búza az egyik legfontosabb és legszélesebb körben elterjedt haszonnövény a világon. Egyaránt fontos szerepet tölt be az emberiség élelmezésében és az állatállomány takarmányozásban. A búza szemterméséből készült liszt az elmúlt közel 10 000 évben az emberi táplálkozás legjelentősebb kalória- és fehérjeforrása, a mezőgazdaság és ezáltal az emberiség kultúrfejlődésének meghatározó szereplője (Anonim, 2005). A liszt a búzaszem raktározó szövetének őrleménye, amely jelentős keményítő és fehérje tartalommal bír. A szem fehérje tartalmának jelentős hányadát kitevő tartalékfehérjéknek elsődleges szerepük van a dagasztás során keletkező sikérmátrix kialakulásában, így a lisztalapú tészta- és sütőipari termékek minőségében. Egy adott búzafajta sikérképző fehérjéit kódoló génjeinek allél szerkezete és a gének aktivitása nagymértékben befolyásolja a tészta erősségét és nyújthatóságát. Ám míg a sikérfehérjék tésztaminőségre gyakorolt hatása egy jól kutatott téma, tudásunk a mennyiséget befolyásoló genetikai és környezeti tényezőkről nem kielégítő. A tartalékfehérjék szabályozását az 1990-es évek és a 2000-es évek elején intenzíven kutatták. A téma úttörői kiváló eredményeket értek el egy-egy gén karakterizálásában, szabályozó elemeinek feltárásában. Ám az izolált eredmények szintézise további adatok, később módszerek hiányában elmaradt. Jelen tézisben bemutatott kutatás ezt az űrt hivatott részben betölteni. Felhasználva az egyes kutatócsoportok korábbi kísérletes eredményeit, az időközben felgyűlt vonatkozó adathalmazt (big data) illetve a bioinformatikai módszerek utóbbi időkben tapasztalható robbanásszerű proliferációját, kutatásunk célja ezen tartalékfehérjék egy fontos családjának, a polimerképző glutenin alegységfehérje gének transzkripció szintű szabályozásának jobb megértése. Mindezt olyan szempontok mentén, hogy eredményeink hatékonyan bővítsék a nemesítők eszköztárát. A martonvásári kutatóintézet egy kiváló eredményekkel bíró nemesítési intézet, ahol a tartalékfehérjék vizsgálatának hosszú hagyománya van. Az Alkalmazott Genomikai Osztályon működő kutatócsoportban évtizedes tapasztalatok gyűltek össze a tartalékfehérjék karakterizálásáról, a fehérjeláncok elemzéséről. Ehhez a tudáshalmazhoz illeszkedik szervesen jelen dolgozat témája: a gének nem kódoló részeinek, nevezetesen a szabályozásért felelős promóter szakaszoknak átfogó, összehasonlító vizsgálata és a szabályozási folyamataik alaposabb megismerése. 1
1 IRODALMI ÁTTEKINTÉS Nincs olyan hónap, amikor ne aratnának búzát a világ valamelyik szegletén, és nem volt olyan év az elmúlt 10 000 évben, amikor ne vetettek volna búzát valahol. Habár mennyiségi szempontokból
a
világtermelésben
a
kukoricával
és
a
rizzsel
vetekszik,
a
világkereskedelemben a búza a legjelentősebb, és a minőségi követelmények búza esetében a legkritikusabbak. A búza az egyik legszélesebb körben elterjedt élelmiszeripari és takarmány alapanyag. Ezt részben a különböző éghajlatokhoz és körülményekhez való jó alkalmazkodó képességének,
könnyű
tárolhatóságának,
tápanyagértékének
köszönheti,
és
nem
utolsósorban annak, hogy a búzaliszt a legkülönbözőbb élelmiszerek nélkülözhetetlen összetevője (Wrigley, 2009). Búzalisztből készítenek kelesztett, forma- és lepénykenyeret, finom pékárut, süteményeket, kekszféléket, gőzölt kenyeret, friss és száraztésztát, gyorsfagyasztott, pelyhesített, puffasztott és extrudált termékeket. Ezen termékek előállításához más és más minőségi paraméterekkel rendelkező búzafajtákra van szükség. Mindezen termékek ideális esetben a nekik megfelelő tulajdonságokkal bíró búzafajtából készülnek (Wrigley, 2009). A búzaliszt alapú tészta egyedi viszkoelasztikus tulajdonságokkal bír, amely különlegessé teszi a gabonafélék között. A kenyérbúza nemesítése közel egyidős a megjelenésével. Kezdetben csak egyszerű primitív eszközökkel válogatták a búzákat generációról generációra, ám tekintve a búza önbeporzó jellegét ez ritkán jelentett genetikai változást. A mesterséges keresztezés a XIX. században terjedt el a nemesítők körében. Napjainkra azonban a genetikai ismeretek és eszközök bővülésével a markeralapú nemesítés soha nem látott hatékonyságot ért el. Rezisztencia gének és egyéb, pl. a terméshozammal illetve a lisztminősséggel kapcsolatba hozható gének azonosítása lehetővé tette, hogy a nemesítők molekuláris markerek használatával célirányosan, közvetlenül genetikai alapokon szelektáljanak. A búza egyik legfontosabb tulajdonsága a szem fehérjetartalma. A terméshozam mellett ez a tulajdonság határozza meg a termény piaci értékét, így ennek minőségi és mennyiségi javítása kiemelt nemesítési cél. Általánosan elfogadott, hogy a fehérjetartalom rendkívüli módon függ a genetikai és környezeti hatásoktól. Ezt először Davis és munkatársai (1981) mutatták be. A búzaliszt fehérjetartalmának mennyiségi és minőségi jellemzését a szemben elsődleges kén és 2
nitrogén raktározási funkcióval rendelkező ún. tartalékfehérjék különböző összetevőinek sikeres frakcionálása tette lehetővé (Osborne, 1907). A legjelentősebb frakciójának az alkoholban csak kén-kén hidakat bontó redukáló szer jelenlétében oldható glutenin fehérjéket tartalmazó frakció bizonyult. A frakcióban található fehérjéket a Shewry és munkatársai alapján bevezetett, a fehérjék molekuláris sajátságait is figyelembe vevő nevezéktan szerint prolaminoknak nevezik (Shewry és mtsai., 1983). A fehérjék végfelhasználói szempontból releváns, pontos jellemzéséhez szükséges volt annak felismerése, hogy az oldhatatlan, polimerizálódó glutenin egységek mennyiségének a monomer gliadinokhoz viszonyított aránya pozitívan hat a kenyértérfogatra (Orth és Bushuk, 1972). A prolaminok jelentőségét tovább növeli, hogy a szemtermés teljes fehérje tartalmának közel 80%-át teszik ki (Seilmeier és mtsai., 1991). Ennek körülbelül 30%-a a monomer gliadinok és 70%-a a polimerizálódó gluteninek aránya (Wrigley, 2009).
1.1 A POLIMERIZÁLÓDÓ SIKÉR ALEGYSÉGFEHÉRJÉK A sikér polimerképző alegységfehérjéire, a nagy és kis molekulatömegű gluteninekre jellemző, hogy a konzervált N- és C-terminális régióik között hosszabb vagy rövidebb, prolinban és glutaminban gazdag, rövid ismétlő peptid szakaszokból felépülő repetitív régiók találhatóak. A konzervált végeiken található cisztein aminosavak által képesek polimerizálódni, és kialakítani a kenyérkészítés szempontjából elengedhetetlen polimert, a sikérmátrixot. Meglepő sajátosságuk, hogy a termesztett és vad fajok között egyaránt rendkívül nagy polimorfizmus fordul elő (Shewry és mtsai., 2009). A polimerképző sikér fehérjéket kódoló gének mindegyike multigén lókuszon található, amit feltehetőleg duplikációk illetve azok sorozata hozott létre. A gyakori és leginkább a molekulatömeget (és egyben a hosszt) érintő polimorfizmusok feltételezhetően az egymáshoz közel elhelyezkedő homológ gének és rajtuk előforduló repetitív szakaszok okozta egyenlőtlen kromoszómális átkereszteződések (crossing-over) által alakulhatott ki (Shewry és mtsai., 2009). A tény, hogy ez a fehérjék szerkezetét érintő sokszínűség fennmaradt önmagában azt jelzi, hogy gének nem voltak, illetve nincsenek kitéve szelekciós nyomásnak.
3
1.1.1 NAGY MOLEKULA TÖMEGŰ GLUTENIN ALEGYSÉGFEHÉRJÉK A sikérmátrix gerinchálózatát alkotó nagy molekulatömegű glutenin alegységfehérjék (HMWGS) a búza legfontosabb tartalékfehérjéi. A kódoló génjeik az egyes kromoszóma csoport Glu1A, B és D homeológ lókuszain találhatóak és nem tartalmaznak intront (1. ábra). Egy korai duplikációs esemény hatására a lókuszon két paralóg gén található, amelyeket x és y-típusnak neveznek (Kong és mtsai., 2004). Az x- és az y-típusú HMW-GS-k közötti távolság genomonként változik, 187 Kb az A, 168 Kb a B és 51 Kb a D genomban. Szekvencia elemzések során kimutatták, hogy a változást a lókuszon megtalálható retrotranszpozonok okozták (Gu és mtsai., 2004). Tekintve, hogy genomonként összesen két gén található, amelyek a búzaszem összfehérje tartalmához mérten rendkívül nagymennyiségű, ám eltérő tulajdonságú fehérjét eredményeznek, a fehérjék vizsgálata viszonylag egyszerű. Tanulmányozásukat tovább egyszerűsíti, hogy az 1A kromoszóma y-típusú génje (Glu-1Ay) a hexaploid búzában a legtöbb esetben inaktív. Aktív Glu-1Ay gént ezidáig csak vad fajokban (Jiang és mtsai., 2009) és egyetlen hexaploid búza fajtában azonosítottak (Margiotta és mtsai., 1996). Legtöbbször 3 és 5 közötti aktív HMW-GS gén figyelhető meg a hexaploid búzában. A HMW-GS gének inaktivitását különféle genetika átrendeződések okozzák: korai stop kodon a Glu-1Ax esetében, retrotranszpozon inszerció Glu-1Ay-nál, illetve csonkított kódoló régió a Glu-1Dx esetében (Anderson és mtsai., 2002; Shewry és mtsai., 2003a). Az érett HMW-GS fehérjék szerkezete egységes. Az N-terminálisuk egy erősen konzervált, rövid szakasz amelynek hossza típusonként eltér (x-típusnál 81-89, y-típusnál 104 aminosav). A C-terminális ennél is egységesebb, típustól függetlenül 42 aminosav hosszú. A kettő között húzódó hosszú, repetitív szakasz viszont allélenként nagyban eltér (272-872 aminosav) (Anderson és mtsai., 2002). Az N és a C-terminálisok ciszteint tartalmaznak, amelyek képesek a fehérjén belüli illetve a fehérjék közötti kénkötések létesítésére, és ily módon a polimerek kialakítására. A legtöbb esetben az y-típusú HMW-GS hét, és az x-típusú alegység négy ciszteint tartalmaz konzervált pozíciókban. További különbség a két típus között a repetitív szakaszok ismétlődő motívumaiban figyelhető meg. Az x-típusnál megfigyeltek egy hexapeptid, egy nonapeptid és egy tripeptid motívumot, míg az y esetén csak egy hexapeptid motívumról számoltak be (Shewry és mtsai., 2009). Az allélikus változatok leginkább a ismétlődő szakaszok hosszában nyilvánulnak meg, és mindig a teljes motívumot érintik. Habár 4
ezen szakaszok szekvenciája általánosan nem konzervált, bizonyos pozíciókban található aminosavak konzerváltsága kiemelkedően magas lehet. Ennek feltételezhetően a fehérje hatékony raktározása során van szerepe (Shewry és mtsai., 2003b). Valamilyen mértékű szekvencia-variancia ugyanakkor mindhárom régióban megfigyelhető. Ezek közül, a polimer képződésre és ezáltal a végfelhasználói minőségre való hatása miatt a ciszteinek számát érintő eltérések a legérdekesebbek. A jó minőséggel összekapcsolt Glu-1Dx5 allél egy extra ciszteint tartalmaz a repetitív szakasz elején (Anderson és Greene, 1989), míg a gyenge minőséggel összefüggésbe hozott Glu-1Bx20 allél esetén két cisztein hiányzik az Nterminális szakaszból (Shewry és mtsai., 2003a). A Glu-1Dx5 allélhoz hasonlóan egy extra ciszteint tartalmazó és a minőséget kedvezően befolyásoló Glu-1Ax2*b alegységet a Bánkúti 1201 búzafajtából azonosították (Juhasz és mtsai., 2001). Nagy molekulatömegű gluteninek a Triticeae nemzettség csoport minden ismert és vizsgált fajában megtalálhatóak, genetikai jellemzőik és molekuláris funkciójuk alapos összehasonlító vizsgálatoknak lettek kitéve (Ciaffi és mtsai., 1998; Dong és mtsai., 2013; Giles és Brown, 2006; Gu és mtsai., 2004; Jiang és mtsai., 2012; Rodríguez-Quijano és mtsai., 2001). A termesztett és vad búzafajok HMW-GS szekvenciái közel 70%-os egyezést mutattak (Shewry és mtsai., 2009). A HMW glutenineket kódoló Glu-1 lókuszról kimutatták, hogy erősen konzervált régió és meglehetősen alacsony rekombinációs potenciállal rendelkezik (Gu és mtsai., 2006). Annak ellenére, hogy búzaminőséget szignifikánsan befolyásoló hatása miatt különös érdeklődésre tart számot, ezidáig nem számoltak be egyetlen rekombinációról sem, ami az x- és y-típusú HMW glutenin alegységek között törést okozott volna (Shewry és mtsai., 2003c). A három Glu1 lókusz más-más szintű diverzitást mutat, amely arra utal, hogy a búza kialakulását megelőző evolúciós történetük eltért. Genetikai programjukat tekintve a HMW glutenin gének kizárólag az endospermiumban aktívak, és a teljes szemfehérje tartalom kb. 12%-áért felelősek (Halford és mtsai., 1992; Seilmeier és mtsai., 1991). Mindemellett a homeológ és paralóg gének expressziója nagymértékben eltér. Általánosan elmondható, hogy a Glu-1Bx gének a legaktívabbak, amelyeket a homeológ Glu-1Dx követ. Ezek paralógjainak (Glu-1By és Glu-1Dy) aktivitása alacsony (Dupont és mtsai., 2011; Hurkman és mtsai., 2013).
5
1. ábra HMW és LMW-GS gének kromoszómális elhelyezkedése és ismertebb alléljaik, illetve típusaik. A Glu-B7x génnek létezik egy túltermelő változata, amelyet Glu-1Bx7oe-ként jelölünk.
6
1.1.2 KIS MOLEKULA TÖMEGŰ GLUTENIN ALEGYSÉGFEHÉRJÉK Fehérje szinten a kis molekulatömegű alegységfehérjék (LMW-GS) megnevezés azon fehérjékre utal, amelyek részt vesznek a sikérmátrix kialakításában. Tipikus LMW-GS-eket egy 35-40 tagból álló géncsalád kódolja, amely az 1-es kromoszóma csoport Glu-3 multigén lókuszain találhatóak (Glu-3A, Glu-3B, Glu-3D) (1. ábra). A lókuszon az egyes gének 150 Kb távolságra helyezkednek el (Wicker és mtsai., 2003). Ellentétben a HMWGS fehérjékkel az egyes LMW-GS fehérjék minőséget befolyásoló szerepe nehezen tisztázható a nagyszámú gén jelenléte, illetve azok nagyfokú hasonlósága miatt. Azonban elmondható, hogy jelentőségük nagyobb a tészta nyújthatóság kialakításában, ugyanakkor az egyes genotípusokban egyidejűleg kifejeződő HMW és LMW glutenin alegységek kölcsönhatásának kiemelt szerepe van a tészta rugalmasságának kialakulásában (Békés és mtsai., 2006). Jelenlegi ismereteink szerint az összes LMW-GS gén intron nélküli, 900 és 1200 bp hosszúak és szerkezetük nagymértékben hasonlít. N terminálisuk egy rövid (13 aminosav) szakasz, amelyet egy glutaminban gazdag, repetitív szakasz követ (70-186 aminosav). A C-terminális a HMWGS-ekhez képest hosszabb (kb. 180 aminosav hosszúságú) és csaknem a fehérje felét teszi ki. Az LMW-GS fehérjék legtöbbször nyolc ciszteint tartalmaznak, amelyek részben inter-, részben pedig intramolekuláris kénkötések kialakításában vesznek részt. A repetitív szakasz néhány 5 vagy 9 aminosav hosszú oligopeptid motívumokból épül fel (Lafiandra és mtsai., 2004). Hasonlóan a HMW-GS fehérjékhez, a fehérje méretének változékonyságáért a repetitív szakaszok okozta egyenlőtlen crossing-over a felelős. Ugyanakkor LMW-GS fehérjékre jellemző az aminosav kicserélődés okozta variancia, ami lehetővé tette ezen géncsalád Nterminálisán alapuló csoportosítását. Ily módon LMW-GS fehérjéket az érett peptidlánc Nterminális szakaszának kezdő aminosavai alapján három csoportra osztották: izoleucin (LMW i-típus), szerin (LMW s-típus) illetve metionin (LMW m-típus) (Kasarda és mtsai., 1988; Lew és mtsai., 1992; Masci és mtsai., 1995). Az eddigi tapasztalatok alapján az i-típusú LMW glutenin gének csoportja kizárólag az A genomra jellemző, míg a s- és m-típusú gének mind a három lókuszon megtalálhatóak. Az LMW gluteninek további csoportosítását teszi lehetővé a peptidláncban található, és polimerizálódás szempontjából fontos ciszteinek számának és elhelyezkedésének figyelembe vétele (Ikeda és mtsai., 2002; Juhász és Gianibelli, 2004). Kis molekulatömegű glutenin alegységfehérjék nagy számát figyelték meg a búzafélékben (Ciaffi és mtsai., 1993; Gianibelli és mtsai., 2002; Lee és mtsai., 1999a; Rodríguez-Quijano és 7
mtsai., 1997). A genetikai variabilitás ezekben a fajokban szembetűnően nagy volt a hexaploid és tetraploid búzákban tapasztaltakhoz képest. Diploid búzákban nemcsak fajták között, hanem fajtán belül is jól kimutatható volt a LMW glutenin alegységek nagyobb genetikai változékonysága (Lee és mtsai., 1999a, 1999b). Különös, hogy a termesztésbe bevont diploid T. monococcum rendelkezett a legkisebb variabilitással, amit feltehetőleg a fentebb említett, a háziasítás során fellépő genetikai diverzitáscsökkenés okozott. Gélelektroforézises fehérje mintázatok alapján megállapított allélikus polimorfizmusuk szerint a diploid és hexaploid búzában tapasztalható diverzitás a vad fajok javára nagymértékben eltért (Gupta és Shepherd, 1990a, 1990b). Az eddig vizsgált LMW-GS szekvenciák több, mint 80%-os hasonlóságot mutatnak, ezért az allélok azonosítása komoly kihívások elé állítja a fehérjekémikust és a bioinformatikust egyaránt (Shewry és mtsai., 2009).
1.2 A GLUTENIN GÉNEK TRANSZKRIPCIÓJÁNAK SZABÁLYOZÁSA Tartalékfehérjék kizárólag a fejlődő szem raktározó szövetében, az endospermiumban termelődnek. Az élettanilag szigorúan szabályozott működésük elsősorban az átírás (transzkripció) szintjén történik (Bartels és Thompson, 1986; Sørensen és mtsai., 1989). Az expresszió függ a nitrogén, kén és cukor mennyiségétől (Duffus és Cochrane, 1992; Thomas és Flavell, 1990). Átírásukban nagy szerepet játszanak a cisz szabályozó elemekkel kölcsönható transzkripciós faktorok (TF) és az epigenetikai tényezők (Fauteux és Strömvik, 2009; Kawakatsu és Takaiwa, 2010a; Wen és mtsai., 2012). A prolaminok közül csak az LMW gluteninek és gliadinok esetében van szerepe az imprintingnek és a metilációnak, a HMW glutenin gének kevésbé vannak kitéve ezen epigenetikai hatásoknak (Radchuk és mtsai., 2005; Sørensen, 1992; Wen és mtsai., 2012). A szemfejlődés szabályozási kaszkádjának tetején (hasonlóan a más szabályozási folyamatokhoz) fitohormonok hangolják össze a gének működését (Agarwal és mtsai., 2011). A szabályozási kaszkád alacsonyabb fokai családonként szétválnak (DuPont és mtsai., 2006; Hurkman és mtsai., 2013). Jelen tézis az LMW és HMW glutenin gének szabályozásának ezen transzkripciós szabályozási szintjeit kívánja feltárni.
1.2.1 CISZ SZABÁLYOZÓ ELEMEK A GLUTENINEK PROMÓTEREIN Az egyszikűekre jellemző cisz szabályozó elemeket (vagy szekvencia-motívumok, kötőhelyek) és velük kölcsönható transzkripciós faktorokat már többen tanulmányozták, és számos
8
összefoglaló tanulmány született a témában (Fauteux és Strömvik, 2009; Kawakatsu és Takaiwa, 2010b; Shewry és mtsai., 2003b). A kenyérbúza vonatkozásában az első alapvető tanulmány az LMWG1D1 gén izolálása után vált sikeressé (Colot és mtsai., 1987). Ám az eddigi vizsgálatok egyéni gén szinten történtek és legtöbbször a promóter motívumok azonosításáig jutottak. Megállapították, hogy tartalékfehérjék szempontjából kiemelt jelentőségű az ún. „300”-as elem vagy más néven az endospermium boksz (EB), ami a promóter szakasz 300. bázispárjánál található a kódoló régiótól 5’ irányba haladva (továbbiakban -300 bp-nál) (Forde és mtsai., 1985; Hartings és mtsai., 1990; Kridl és mtsai., 1984). Az endospermium boksz megközelítőleg 30 nukleotid (nt) hosszú és az irodalom alapján jelentős szerepet játszik prolaminok szövetspecifikus expressziójában. Két TF kötőhelyet tartalmaz: egy prolamin bokszot (P-boksz) és egy GCN4 motívumot (Hammond-Kosack, 1993). A GCN4 motívum, amit az irodalomban az N-bokszként is említenek, eredetileg az élesztőgombában azonosított GCN4 motívumhoz való hasonlóságáról kapta a nevét (Müller és Knudsen, 1993). A perjefélékben (Poaceae) több motívumot azonosítottak, melyek a tartalékfehérjék szabályozásában töltenek be kiemelt szerepet (Fauteux és Strömvik, 2009). Ezek alapján a perjefélék családjába tartozó fajok prolamin génjeinek promótereiről általánosan elmondható, hogy legalább egy GCN4 motívumot, néhány P-bokszot, SKN1 és GCAA motívumokat tartalmaznak. Ezeken felül a MYB kötő AACA/TA, a bZIP kötő ACGT, a B3 (VP1) kötő RY motívum és a NF-YC kötő CCAAT motívumoknak tulajdonítanak jelentős szerepet a tartalékfehérjék expressziójának szabályozásában (Hammond-Kosack, 1993; Takaiwa és mtsai., 1996). A palindrom SKN1 motívum az ún. SPA (Storage Protein Activator) kötőhelye. A motívumot eredetileg Caenorhabditis elegans-ban azonosították, majd később különböző gabonafélék tartalékfehérjéinek promóter szakaszaiban is leírták (Fauteux és Strömvik, 2009; Gu és mtsai., 2010; Washida és mtsai., 1999). A búza SPA TF-a a kukorica Opaque 2 (O2) elnevezésű bZIP transzkripciós faktorával mutat homológiát. Az LMW-1D1 LMW glutenin gén promóterének különböző mutánsait vizsgálva Albani és munkatársai (1997) rávilágítottak az egyes motívumok lehetséges szerepére a szabályozásban. Szignifikáns uidA aktivitás volt tapasztalható dohány levélszöveteiben, amikor az EB csak Pbokszot tartalmazott. Amennyiben a teljes EB jelen volt a promóter fragmentumban, a vegetatív szövetek nem mutattak GUS aktivitást (Stoger és mtsai., 1999). Endospermiumban
9
a LMW-1D1 gén 938 bp hosszú promótere jelentősen intenzívebb aktivitást produkált, mint a rövidebb fragmentumok (Hammond-Kosack, 1993). Az LMW gluteninhez képest a HMW glutenin gének promóter szakaszai tartalmaznak néhány sajátos, kizárólag rájuk jellemző cisz szabályozó elemet (Anderson és mtsai., 1998; Fauteux és Strömvik, 2009; Forde és mtsai., 1985; Guillaumie és mtsai., 2004; Shewry és mtsai., 2003b). A HMW gluteninek promótereiből hiányzik a LMW gluteninek és rokon egyszikű növényekben általánosan megfigyelhető kételemű EB. Ugyanakkor beszámoltak két, teljesen egyedi és magas konzerváltságot mutató hosszú motívumról. Az egyik a CEREAL boksz, egy 30 bp hosszú motívum, amit a Glu-1B és -1A promóterek esetén írtak le először (Anderson és Greene, 1989). A másik az ún. HMW-Enhanszer motívum, amely 40 bp hosszú, és tartalmaz egy P-bokszhoz hasonló motívumot (Thomas és Flavell, 1990).
1.2.2 TRANSZKRIPCIÓS FAKTOROK ÉS KÖLCSÖNHATÁSAIK Jelenlegi ismereteink alapján három transzkripciós faktor család játszik kiemelkedő szerepet a gluteninek endospermium specifikus expressziójának kialakulásában: bZIP, DOF és MYB * (Albani és mtsai., 1997; Diaz és mtsai., 2005; Vicente-Carbajosa és mtsai., 1997). Ezeken kívül NAC, B3 (VP1) és az NF-YC családhoz tartozó transzkripciós faktorok esetében is egyre több jel mutat arra, hogy valamilyen fontos szerepet játszanak a tartalékfehérjék szabályozásában (Agarwal és mtsai., 2011; Verdier és Thompson, 2008). (Dong és mtsai., 2007). Az érintett TF családokat és ismert géneket az 1. táblázatban foglaltuk össze. A búza esetében egyetlen TF jelenléte sem kizárólag endospermium specifikus. A megfigyelt kölcsönhatások közül kiemelt jelentőséggel bír az egyszikűek endospermium szövetére jellemző bZIP és DOF TF-ok közötti kölcsönhatás (Agarwal és mtsai., 2011; Yamamoto és Onodera, 2006). Ezen kívül, árpában megfigyelték a GAMYB és DOF TF-ok közötti kölcsönhatást, amely képes volt aktiválni endospermium specifikus gének expresszióját (Diaz és mtsai., 2002). A bZIP családhoz tartozó TF-ok kötőhelyei viszonylag változékonyak. A kötőhely törzsét alkotó ACGT motívumon túl, a búzában a GCN4 (TGAGTCA) motívum is bZIP TF-okkal kerülnek kölcsönhatásba (Izawa és mtsai., 1993). A bZIP TF-ok működése nagyban függ a nitrogén ellátottságtól. Alacsony aminosav szint mellett ezen TF aktivitása növekszik, majd a szükséges
*
Neve a myeloblasztozisból ered. Elsőként, mint egy proto-onkogén fehérje lett izolálva. A MYB azóta egy önálló transzkripciós család neve.
10
szint mellett lebomlanak (Kornitzer és mtsai., 1994). A bZIP családhoz tartozó SPA TF-nak komoly szerepe van a glutenin alegységfehérjék expressziójának szabályozásában, habár hatását más TF-okkal komplexben fejti ki (Albani és mtsai., 1997; Conlan és mtsai., 1999). Különböző haplotípusaik kimutathatóan hatással vannak a szemkeménységre és a kenyértészta viszkoelasztikus tulajdonságaira (Ravel és mtsai., 2009). A prolamin bokszhoz kötődő transzkripciós faktor a DOF családhoz tartozó PBF (prolamin binding factor. Búza esetében a PBF az AAAG (P-boksz) motívumhoz kapcsolódva aktiválja vagy erősíti a tartalékfehérjék expresszióját (Conlan és mtsai., 1999). A DOF típusú TF-ok a DNSfehérje kölcsönhatáson túl, a fehérje-fehérje kölcsönhatásaik által is fontos szerepet játszanak a kombinatorikus szabályozásban (Yanagisawa, 2002). Transzkripciós elemzések szerint a PBF búzában több szövetben is jelen van (Dong és mtsai., 2007). A növényi MYB TF-ok az egyik legnagyobb transzkripciós faktor család. Az R2R3 altípusú MYB TF-okról kimutatták, hogy fontos szerepet töltenek be a virágzáshoz és szemfejlődéshez köthető szabályozásban (Du és mtsai., 2009). Az árpa GAMYB, a rizs OsMYB5 és a búza TaMYB TF-okat felismerő kötőhelyeknek a törzsét AACA/TA motívum alkotja (Chen és mtsai., 2005; Diaz és mtsai., 2002; Suzuki és mtsai., 1998). A TF-ok általában egymással kölcsönhatásban, fehérjekomplexeket kialakítva fejtik ki hatásukat. Az EB P-boksz és a GCN4 motívumaihoz kötődő DOF és bZIP típusú TF-okról bizonyították, hogy egymással kapcsolatba lépve, együtt fejtik ki endospermium specifikus transzkripciót irányító hatásukat (Albani és mtsai., 1997; Kawakatsu és Takaiwa, 2010a; Vicente-Carbajosa és mtsai., 1997). Megfigyelték, hogy tizenhárom nappal a virágzást követően a P-boksz motívumokhoz bekötődött a DOF típusú PBF TF, amikor még az EB másik, GCN4 kötőhelye betöltetlen volt. A 18. napon a bZIP TF elfoglalta kötőhelyét, az LMW glutenin gén expressziója jelentősen emelkedett (Hammond-Kosack, 1993). Ugyanakkor a bZIP TF-ok is komplexben működnek. A felismerő funkció kialakulásához legalább 2 vagy 3 alegység (homovagy heteromer) kölcsönhatása szükséges (Wu és mtsai., 2000). Az bZIP típusú O2 TF-ról bebizonyították, hogy a DNS-hez való kötődésének szükséges feltétele a homodimerek kialakulása (Kawakatsu és Takaiwa, 2010a). Mindezen hatásokat MYB TF-ok tovább finomították. MYB kötő motívumok jelenléte képes volt elnyomni a glutelin gének expresszióját rizsben (Suzuki és mtsai., 1998). Árpa esetében virágzást követően 10 nappal megjelennek MYB és DOF TF-ok, amely megerősítette azt a korábbi feltételezést, hogy a 11
GAMYB TF aktívan részt vesz az árpa Hor2 tartalékfehérjék expressziójának szabályozásában (Diaz és mtsai., 2002). Kawakatsu és munkatársai 2010-ben megjelent közleménye szemléletesen foglalja össze a tartalékfehérjék promótereiről felhalmozott ismereteket (Kawakatsu és Takaiwa, 2010a). A 2. ábra a cikkükből átvett grafikát mutatja be.
12
1. táblázat A növények szemfejlődésében résztvevő TF leírásai és ismert génjei (Agarwal és mtsai., 2011; Zhang és mtsai., 2011) TF család
Leírás
A szemfejlődést szabályozó gének
AP2
Növény specifikus, 70 aminosavból álló jellegzetes repetitív, DNS kötő doménnel rendelkező fehérje. Eredetileg a APETALA2 virágzást szabályozó fehérjében azonosították. Az etilén reszponzív AP2 fehérjék az EREBP néven ismertek.
ABA INSENSITIVE 4/ABI4 EREBP
B3
Növény specifikus TF család, amely egy 110 aminosav hosszú konzervált, DNS kötő szakasszal rendelkezik. Nevét onnan kapta, hogy a kukorica VIVAPOROUS1 (VP1) fehérjének az harmadik doménje. Az auxinra válaszoló faktorok (ARF) egyaránt működhetnek represszorként vagy aktivátorként.
ABA INSENSITIVE 3/ABI3, AUXIN RESPONSE FACTOR/ARF, FUSCA3/FUS3, LEAFY COTYLEDON2/LEC2, VIVIPAROUS1/VP1
bZIP
Jellemzően egy 16 aminosav hosszú régiót tartalmaz, amely funkciója szerint DNS kötő és nukleáris lokalizáló szignál (NLS). Ezen kívül tartalmaz több leucint, amely a homo- illetve hetero-dimerizációban segíti. A bZIP csak dimerben képes a DNS-hez kötődni.
ABA-RESPONSIVE ELEMENT BINDING FACTOR 4/ABF4, ABA-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN 3/AREB3, ABSCISIC ACID5/ABI5
CBF
NF-Y TF-ok minden eukariótában megtalálhatóak. Három alegységből felépül komplexben hat: NY-YA, NF-YB, NF-YC. Először az NF-YAB és C heterodimer alakul ki, ami az NF-YA-val kötődve képes a CCAAT motívumhoz kötődni. Az NF-Y fehérjék konzervált szakaszai nagyfokú hasonlóságot mutatnak a hiszton kötő motívumokkal. Nevezetesen a NF-YB a H2B-hez, illetve az NF-YC a H2A-hoz. Az irodalomban HAP (heme associated protein) és CBF (CCAAT binding factor) néven előfordul elő.
LEAFY COTYLEDON1/LEC1, LEC1LIKE/L1L
DOF
A DOF domén egy 50 aminosav hosszú régió, amely magában foglal egy C2C2 cinkfingert és egy DNS kötő régiót. DOF TF-ok szerepe széleskörű szabályozási folyamatokban ismertek: fejlődő szem, fényszabályozás, szénhidrogén anyagcsere, védekezés, csírázás auxin válasz a sztomatában, stb.
PBF
MYB
A MYB DNS kötő szakasza három hélix-turn-hélix szerkezeti elemből áll. Ezek mindegyike három szabályosan elrendezett triptofánt tartalmaz. A MYB szakaszok számának megfelelően különbséget teszünk MYB1R, R2R3 MYB és MYB3R között, ahol 1, 2 vagy 3 hélix található.
Gibberilin activated MYB/GAMYB Jasmonate activated MYB/JAMYB
NAC
Növény specifikus TF család, amely nevét a tagjairól kapta. NAM (no apical meristem), ATF, CUC (cupshaped cotyledon) -> NAC. A DNS kötő szakasza a NAC domén.
CUP SHAPED COTYLEDON1/CUC1, CUC2, CUC3 TaNAC1, TaNAC4
13
2. ábra Transz és cisz motívumok a tartalékfehérjék szabályozásában (Kawakatsu és Takaiwa, 2010a). Opaque2 (O2) bZIP transzkripciós faktor, a SPA a GCN4 típusú motívumhoz kötődnek. DOF TF, PBF felismeri a P-boksz motívumot. A MYB típusú GAMYB az AACA motívumhoz kötődik. B3 típusú TF-ok, mint a FUS3 a RY motívumokat ismeri fel a tartalékfehérjék promóterein. A TFok kölcsönhatásait lila vonalak jelölik.
14
1.2.3 GENETIKAI SZABÁLYOZÓ KÖRÖK ÉS VIZSGÁLATAIK A genetikai szabályozókörök (illetve hálózatok) definíció szerint azon kölcsönhatások összességét jelentik, ami a gének és termékeik (RNS-ek, fehérjék) között alakul ki és befolyásolják az RNS expressziójának intenzitását, továbbá fehérje hasítási variánsok kialakulását, valamint azok helyét és idejét (Davidson, 2006). Ezen szabályozó körök az egyik legfontosabb meghatározói a sejt életfolyamatainak és viselkedésének. Mivel a szabályozó körök működési logikája a DNS-ben kódolva van, ezért megfejtésük kizárólag bioinformatikai módszerekkel (elemzés és modellezés), illetve ahhoz kötődő nagyáteresztő képességű szekvenálási és expresszió mérési módszerekkel (microarray, RNS-szekvenálás, cDNS) lehetséges. Ennélfogva a szabályozási mechanizmusok kutatásában a számítástechnika és matematika nélkülözhetetlen (Bolouri, 2014). A szabályozási körök, vagy génprogramok vizsgálatának fontosságát növeli, hogy az elmúlt 40 évben az evolúció elsődleges forrásának a génexpressziót érintő mutációkat tartották (Wittkopp és Kalay, 2011). Az utóbbi évtizedben összegyűlt eredmények ezt a feltételezést megerősítették, illetve annyiban árnyalták, hogy az evolúciós változásokat elsősorban a cisz szabályozó elemek (motívumok, kötőhelyek) mutációi idézték elő (Wittkopp és Kalay, 2011). A szabályozó körök azonosítására a ko-expressziós hálózatok szerkesztése megfelelő eszköznek bizonyult az Arabidopsis szemfehérjéinek kutatása során (Peng és Weselake, 2011). Kimutatták, hogy a tartalékfehérjék promótereiben a bZIP és B3 TF által felismert kötőhelyek gyakrabban fordulnak elő, ezért azoknak szerepük lehet a szabályozásban. Rizs esetében már leírták, hogy (az endospermiumban expresszálódó) globulin típusú glutelin tartalékfehérjék transzkripciójában több szabályozókör is részt vesz (Qu és mtsai., 2008). Búza esetében szintén jelezték, hogy a homeológ Glu-1 géneket ugyanazok a szabályozókörök felügyelik (Wanous és mtsai., 2003).
1.2.4 HORMONÁLIS VONATKOZÁSOK A fejlődő szem egy több sejttípusból felépülő összetett szerv, ahol a sejttípusoknak külön fejlődési üteme és funkciója van. A szemfejlődés zavartalan menete összehangolt koordinációt igényel, amelyet a növény jelátvivő molekulák által valósít meg. Ezek a molekulák a fitohormonok, amelyek koncentrációja és eloszlása térben és időben folyamatosan változik a szem fejlődése során. A hormonok közül a szemfejlődésben az auxinnak van az egyik legkiemeltebb szerepe, mert a megtermékenyítéstől az érésig folyamatosan nagy 15
mennyiségben jelen van a szemben. Az auxin gradiense hatással van a sejtdifferenciálódásra, osztódásra és növekedésre (Locascio és mtsai., 2014). A citokininek a fejlődési szakasz első felében töltenek be fontos szerepet a raktározó sejtek osztódásának serkentésében (Gutiérrez és mtsai., 2005). Abszcizinsavról (ABA) és etilénről már rizs esetén bebizonyosodott, hogy kapcsolatba hozhatóak a szemtelítődés sebességével (Yang és mtsai., 2006). Az ABA mennyisége kétszer csúcsosodik ki a szemfejlődés során. Először az anyai szövetekből kapott szintnél jelentkezik egy maximum, amely az embriófejlődéshez szükséges, majd másodszor a szemtelítődés és a kiszáradás szakaszaiban, amely a tápanyag raktározásra van hatással. Később a gibberilinsavval (GA) közösen a nyugalmi helyzet beálltát szabályozza. A GA szerepe a csírázásban kiemelt, a tápanyag mobilizálását iniciálja és koordinálja (Locascio és mtsai., 2014). Rizs esetén, magas metil-jázmonát koncentráció csökkentette a hozam szintet (Kim és mtsai., 2009). Árpánál felfedeztek egy új kétkomponensű jelátviteli utat, amely az endospermium szállító sejtjeiben kölcsönhat az ABA-val és az etilénnel (Thiel és mtsai., 2012).
1.3 A BÚZASZEM FEJLŐDÉSE Az endospermium fejlődésének a fűfélékben több, jól jellemezhető szakasza van, melyek gyakran nagymértékben átfednek egymással. A fázisokat jellemzően sajátos transzkripciós programok kísérik. Wan és munkatársai behatóan tanulmányozták a transzkripció változását, ahol több, szövetre illetve fejlődési stádiumra jellemző transzkripciós mintázatot írtak le (Wan és mtsai., 2008). E programok megvalósulását a transzkripciós faktorok összetételének és aktivitásának változásai kísérik.
1.3.1 KORAI SZAKASZ A kettős megtermékenyítést követő intenzív sejtosztódás során a központi sejtből kialakul a több sejtmagot tartalmazó szincitium, míg a petesejtből kialakul a zigóta. A központi sejt osztódása ebben a fázisban jóval gyorsabb, mint a megtermékenyített petesejté. Ennek oka, hogy a központi sejtek osztódása során nem alakul ki sem sejtmembrán, sem sejtfal, aminek egyfajta evolúciós (Sabelli és Larkins, 2009) vagy inkább szelekciós előnyt tulajdonítanak. A sejtek számával nő a később kialakuló raktározó sejtek felvevő kapacitása, amely nem mellesleg egyenes arányban növeli a hozamot. A búza esetében közel 2000 sejtmagot 16
számoltak ebben a fázisban (Bennett és mtsai., 1975). Hozzávetőleg két nappal a megtermékenyülés után az osztódás lelassul, a sejtmagok az embriózsákhoz és a központi vakuólum
megnagyobbodása
következtében
a
primer
endospermium
sejtfalához
rendeződnek. Ezt követően indul be a szintén gyorsan lezajló sejtesedés, amely a perifériáktól befelé, a vakuólum irányába terjed. Ennek első fázisa a sugárirányú mikrotubuláris hálózat kialakulása, amelyet sejtfalképződés követ. A folyamat a virágzást követő 6. napra befejeződik.
1.3.2 DIFFERENCIÁLÓDÁS ÉS NÖVEKEDÉS A virágzást követő 7. naptól indul az endospermium, azaz a tartalékszövet differenciálódása. Ennek során 4 sejttípus keletkezik: szállító, keményítőszemcsés raktározó, aleuron és embrió kísérősejtek. A szállító sejtek alakulnak ki legkorábban a placenta körül. Legfontosabb szerepük a cukor és aminosavak szállítása az endospermium számára. Az aleuron réteg (a 7. nap után alakul ki) a szállító sejtektől függetlenül, a búza esetében egy sejtnyi vastag burokként fogja körül az endspermiumot. Egyedül a szállító sejtek csatlakozását hagyja szabadon. Az aleuron sejtek közvetlen szomszédságában található raktározó sejtek kisebbek és mitotikusan aktívabbak a többi raktározó sejtnél, ezért gyakran szubaleuronként szokták azokat nevezni. Az aleuron az egyetlen része az endospermiumnak, amely a teljes érés után élve marad, és később a csírázás beindításában jelentős szerepe van. A keményítőszemcsés raktárorzó sejtek kialakulása valamelyest összefonódik az aleuron kialakulásával, a kettő szétválása leginkább pozíció specifikus (Sabelli és Larkins, 2009). A raktározó szövet legfőbb tulajdonsága az amiloplasztiszban történő keményítőszintézis. Ez adja az endospermium jellegzetes textúráját és fehér színét. A keményítő felhalmozása már viszonylag korán a 7-8. napon elkezdődik és feltételezhetően a rendelkezésre álló cukor-gradiens szabályozza. A raktározó szövetben termelődnek a sikért alkotó glutenin és gliadin fehérjék. A gluteninek szintézise az endoplazmatikus retikulumban történik, ahonnan átkerülnek a lumenbe. Itt izomeráz enzimek (protein disulphide isomerase) közreműködésével kialakulnak a jellemző intra- és intermolekuláris kénhidak. Az így létrejött kisebb polimerek fehérjetestecskékbe kerülnek, amelyek az érés során egyesülhetnek, és fokozatosan kitöltik és átszövik a keményítőszemcsék közötti teret. Ettől eltérő módon zajlik a gliadinok felhalmozása, amelyek a Golgi készüléken keresztül a vakuólumokban rakódnak le (She és mtsai., 2011).
17
A negyedik sejttípusnak, az embrió kísérősejteknek a fejlődés első felében van jelentősége. Eleinte egy többrétegű burokként körbefogja azt, ám ahogy az embrió növekszik, fokozatosan visszahúzódik, majd felszívódik és az érés végére szinte teljesen eltűnik (Sabelli és Larkins, 2009). A virágzást követő 8. és 12. napok között az endospermiumban erős sejtosztódás tapasztalható, ami az aleuronban illetve az szubaleuronban akár a 20-25. napig is eltarthat. Ennek során a sejtek igyekeznek minél hatékonyabban kitölteni a rendelkezésre álló teret, a szemtermésben lévő üreget. Ezzel átfedésben kezdődik az endoreduplikáció, ahol a DNS végtelenített módban duplikálódik. A folyamatot nem kíséri kromatinkondenzáció, szegregáció, sem pedig citokinezis (Sabelli és Larkins, 2008). Funkciója nem tisztázott, lehetséges, hogy ez a transzkripció hatékonyságának növelését szolgálja, ám szintén elképzelhető, hogy egyfajta nukleotid (foszfor) felhalmozásról van szó, ami szintén a későbbi csírázást táplálja (Sabelli és Larkins, 2008). Az endoreduplikáció kukoricában jól megfigyelhető eltéréseket okoz, a legkisebb sejtmagú sejtek (3C, 6C) a szövet perifériáján találhatóak, a nagyobbak (90C) a középső régiókban (Kowles és Phillips, 1985).
3. ábra Affymetrix chippel mért transzkriptóm. A vonalak az egyes próbák időssoros változásait követi. A vonalak színe a 6 nappal virágzás után mért aktivitás szerint lett meghatározva. Az ábrán 14550 próba eredményét tüntették fel. A képet Wan és munkatársai (2008) közleményéből vettük át. A sejtosztódás fázisából a szemtelítődés (raktározás) fázisba való átmenetet a búzaszem transzkripciós programjának markáns változása kíséri (Wan és mtsai., 2008) (3. ábra). Feltételezések szerint az átprogramozódást a glikoziltranszferáz aktivitásának növekedése indukálja (Borisjuk és mtsai., 2004).
18
1.3.3 ÉRÉSI FÁZIS Hozzávetőleg a 28. napon a tartalékképzés (szén, nitrogén, kén, foszfor) aktivitása csökkenni kezd, majd a szem lassan száradásnak indul. Ebben a fázisban a programozott sejthalálnak van fontos szerepe. Ez kukorica esetén a középső raktározó sejtektől indul és tart az endospermium szélei felé, ám búza esetében térben nem koherens módon kezdődik. A növényi sejthalál folyamata sokban hasonlít az állatoknál megfigyelt apoptózishoz (DNS fragmentáció, kromatinkondenzáció, sejtmag-membrán felbomlása), ám a folyamat motorjaként ismert kaszpáz enzimek jelenlétére mindezidáig csak kevés bizonyíték áll rendelkezésre (Hatsugai és mtsai., 2004; Qiang és mtsai., 2012). A teljes érést és egyben kiszáradást a 42. napra éri el a búzaszem. Ekkorra az embrió és az aleuron nyugalmi állapotba kerül (dormancia).
1.3.4 SZINTÉZIST MEGHATÁROZÓ TÉNYEZŐK A gabonaféléknél a sejtméret, sejtdifferenciálódás, endoreduplikáció, a keményítő felhalmozódás és a keményítőszemcse mérete magas ATP szintet igényelnek. A szemfejlődés sejtnövekedési és raktározási fázisában a megnövekedett metabolikus aktivitást a rendelkezésre álló energia korlátozza. Ezt látszólag súlyosbítja a tény, hogy az endospermium erősen hipoxiás szövet. (Rolletschek és mtsai., 2005). A keményítő akkumulációját ily módon a szintézis kapacitása határozza meg, vagy másképpen kifejezve „nyelő” (sink) függő folyamat. Ezzel szemben a tartalékfehérjék felhalmozása forrás (source) függő folyamat (Dupont és Altenbach, 2003). Magasabb nitrogén forrás esetén növekszik a szem fehérje tartalma. A két metabolizmus nem független egymástól, így az endospermium csak addig képes az extra nitrogén felvételére, amíg az N/C arány egyensúlyban marad (Barneix, 2007; Weichert és mtsai., 2010). Korábban leírták, hogy a tartalékfehérjék szintézise a vegetatív szövetekből odaáramló és aminosav formájában (glutamin, alanin, szerin és glicin) kapott nitrogén, szulfát és más formákban kapott kén, illetve a toklászból érkező cukor mennyiségétől függ (Dupont, 2008). Ugyanakkor a N/C arány mennyiségi befolyása mellett a tartalékfehérjék minőségi összetételére az N/S arány van jól megfigyelhető hatással (DuPont és mtsai., 2006). A kénben gazdag LMW gluteninek és gliadinok transzkripciója a kén mennyiségétől függ, míg a kénben szegény HMW gluteninek és az omega gliadinok jobban követik a nitrogén szint változását (Dai és mtsai., 2015). Ebből fakadóan a talaj kéntartalma érezhetően befolyásolja a tartalékfehérjék kenyérkészítés miatt fontos minőségi összetételét. Kimutatták, hogy 19
kénszegény környezetben változatlan szemtömeg mellett megnövekedett a kénben szegény HMW glutenin és omega illetve az alfa/béta gliadinok aránya (Dai és mtsai., 2015). Mindez alátámasztja az ún. génegyensúly hipotézist, amely a makromolekuláris komplexek sztöchiometriai egyensúlyát kapcsolja össze a kódoló gének expressziójának összehangolt változásaival (Birchler és Veitia, 2012). Mindezen folyamatok összehangolására egy átfogó, növényi szintű koordináció jelenlétét feltételezik (Slimane és mtsai., 2013).
1.4 A KÖZÖNSÉGES BÚZA HÁZIASÍTÁSA ÉS ANNAK KÖVETKEZMÉNYEI A hexaploid búza kizárólag haszonnövény formában létezik (Matsuoka, 2011), amely egy tetraploid haszonnövény (Triticum dicoccum) és a vadon élő kecskebúza (Aegilops tauschii) kereszteződéséből keletkezett. Egy lehetséges elképzelés szerint Triticum urartu az A genom, Aegilops speltoides a B genom és Aegilops tauschii a D genom donorja (Dubcovsky és Dvorak, 2007). A jelenleg létező hexaploid búzafajták az őseikhez képest számos morfológiai és fiziológiai változásról tanúskodnak: magas hozam, szemmegtartás (a szem nem pereg ki), csökkent kémiai és morfológiai ellenálló-képesség, dormancia elvesztése, összehangolt csírázás és növekedés, szárszilárdság, amely lehetővé tette a sűrűbb vetést és aratást. Mindezen tulajdonságokat együttesen domesztikációs szindrómának nevezzük. A termesztés és folyamatos szelekció során ezeken felül további tulajdonságok alakultak ki: változó keményítő összetétel, éghajlati és égövi adaptáció valamint csökkent fehérje-szénhidrát arány (Dubcovsky és Dvorak, 2007; Harlan, 1992; Harlan és mtsai., 1973). Különös, hogy a haszonnövények közül csak a búza esetén beszélhetünk új fajról, minden más növény megtartotta szoros genetikai viszonyát a vad típusokkal (Harlan és mtsai., 1973).
1.4.1 A HÁZIASÍTÁS GENETIKÁJA Olsen és Wendel megállapítás szerint a legtöbb domesztikációs tulajdonság olyan génmutációk eredménye, mely vagy a promótert vagy a kódoló szakaszt érinti (Olsen és Wendel, 2013). Az egyik legismertebb példa a kukoricáé, ahol a bokrosodásért felelős tb1 (teosinte branched1) gén szinte egyedül felelős a kukorica háziasításáért. Kimutatták, hogy a vad és termesztett fajok között a legnagyobb diverzitás csökkenés a gén 5’ végi, nem kódoló szakaszán tapasztalható (Wang és mtsai., 1999). A kukoricán végzett tanulmányok tükrében 20
úgy tűnik, hogy a szelekció (avagy a nemesítés) kizárólag a tb1 promóter szakaszát érintette, és a szegregáció szempontjából szétválasztotta a kódoló és nem kódoló szakaszokat. Doebley és munkatársai tovább mentek és arról számoltak be, hogy a fejlődési és morfológiai változások mögött olyan gének mutációi állnak, amelyek a transzkripciós szabályozásban játszanak fontos szerepet (Doebley és mtsai., 2006). Egy ilyen jelentős példa a Q allél, amely durum búzánál tűnt fel először (Simons és mtsai., 2006). A gén egy AP2 típusú transzkripciós faktor (TF), aminek a Q nevű alléja pleiotróp hatást fejt ki a pelyvalevelek alakjára és textúrájára, valamint a kalász alakjára; a mutáció hatására létrejött növény kalásza hasábos alakú, a kalászkákban több virág található, ami termésnövekedést okoz (Charmet, 2011).
1.4.2 A HÁZIASÍTÁS HÁTRÁNYA A háziasítás legsúlyosabb következménye, hogy a növények genetikai diverzitását csökkentette. Az irodalom ezt a nemesítés genetikai szűk keresztmetszetének (genetic bottleneck) nevezi, hisz a jelenség nagymértékben csökkenti a nemesítők mozgásterét. A HMW gluteninek közül a Glu-1D esetén külön is kimutatták, hogy jelentősen csökkent a genetikai diverzitása a vad rokonok ortológjaihoz képest (Dong és mtsai., 2013; Giles és Brown, 2006). Közép és Dél-Ázsiában a HMW glutenin diverzitása valamivel magasabb a többi területekhez képest. Ez arra enged következtetni, hogy a közönséges búza kialakulásáért felelős hexaploidizáció egyik centruma ezeken a területeken lehetett (Terasawa és mtsai., 2010). Jelenleg az egyetlen megoldás a genetikai sokszínűség javítására a búza visszakeresztezése a hatalmas genetikai diverzitást felhalmozó vad rokonfajokkal (Charmet, 2011).
21
2 CÉLKITŰZÉSEK A tartalékfehérjék képződése mind térben (endospermium), mind időben (virágzás után 5-42 nap) szigorúan szabályozott folyamat. Noha a nagy és kis molekulatömegű gluteninek minőségi tulajdonságokkal való összefüggése egy igen részletesen tanulmányozott kutatási terület, jelenleg kevés ismeret áll rendelkezésünkre a glutenin gének expressziójának folyamatáról, azaz hogy mi indítja el expressziójukat, mi okozza a termelődésük leállását és mi biztosítja a szövetspecifikus termelődést. Nem tisztázott a gének promótereiben található különböző cisz szabályozó elemek szerepe, illetve nem ismert az ezekhez kapcsolódó transzkripciós faktorok pontos funkciója. Eddig megjelent eredmények alapján a kénben gazdag kis molekulatömegű glutenin és a gliadin gének cisz-szabályozás mellett epigenetikailag is szabályozottak, míg a nagy molekulatömegű glutenin alegység gének esetében a metiláció nem játszik szerepet a szabályozásban. Az egyes kutatócsoportok többnyire csak egy-egy gén alapvető szabályozását vizsgálták, ám a szabályozás jobb megértése megkívánja a teljes géncsalád promóter szekvenciájának jellemzését, és az expressziós profiljukkal való összevetését. A HMW és LMW glutenin gének fontos szerepet töltenek be a fehérje tartalom kialakulásában, a különböző sütőipari minőségi tulajdonságok kialakításában, így szerepük a nemesítési programokban vitathatatlan. A modern nemesítés a genetikai és legújabban a genomikai eredmények felhasználásával, az ott felhalmozott ismeretek mentén határozzák meg céljaikat. Habár a prolaminok minősége (egész pontosan kedvező allélikus összetétele) már egy régi nemesítési cél, e fehérjék mennyiségét befolyásoló tényezők még nem ismertek, márpedig az ezekre irányuló célirányos szelekció nagyban segítené a nemesítők munkáját (Petolino és Davies, 2013). A fehérjehozam nagyban függ a környezeti illetve genetikai hatásoktól, ám ennek mértéke genotípusonként változhat. A környezeti hatások befolyása a tartalékfehérje génekkel kölcsönható transzkripciós faktoroktól függ, ami által a környezeti befolyásoltság mértéke feltételezhetően maga is genetika függő. Mindezt felismerve, hisszük, hogy ha a polimerképző sikérfehérjék szabályozását alaposan megismerjük, hosszútávon képesek leszünk a környezeti függését enyhíteni és a hozamot stabilizálni (avagy a potenciális és a várható hozamot közelíteni).
22
A kutatómunka során célunk volt a fehérjemennyiség és ezáltal sikér polimer kialakulásában kiemelt szerepet játszó HMW és LMW glutenin génekhez tartozó promóter szekvenciák cisz regulációs elemeinek összehasonlítása, jellemzése, az adatbankokban található expressziós adatainak in silico feldolgozása, kölcsönható transzkripciós faktorok azonosítása és a szabályozási folyamatokra egy-egy lehetséges „mechanikai” modell kidolgozása - követve Werner és munkatársai gondolatmenetét (Werner és mtsai., 2003). A fentiek értelmében a kutatómunkám során az alábbi feladatokat határoztuk meg: 1. A HMW glutenin gének promótereinek funkcionális elemzése, változásainak összevetése saját és kölcsönható transzkripciós faktorok génaktivitási adataival, majd egy szabályozási modell leírása, illetve javaslattevés esetleges nemesítés célgénekre. 2. A HMW glutenin gének promótereinek filogenetikai vizsgálata. A x- és az y-típusú gének duplikációt követő szétválásának lehetséges funkcionális következményeinek leírása.
Iránymutatás
a
tartalékfehérjék
szempontjából
megfontolandó
visszakeresztezési alanyok kiválasztására. 3. LMW glutenin gének promótereinek funkcionális elemzése, összevetése a génaktivitási adatokkal és a feltételezhető átírási mechanizmus feltárása. 4. A HMW-GS szövetspecifitását okozó folyamatok kísérletes vizsgálata a felállított modell alapján.
23
3 ANYAG ÉS MÓDSZER
3.1 KUTATÁS
SORÁN
FEJLESZTETT
SZÁMÍTÁSTECHNIKAI
ESZKÖZÖK
ÉS
MÓDSZEREK A vizsgálatunk tárgyát képző LMW- illetve HMW-GS gének alléljai nagyfokú szekvencia hasonlóságot mutatnak. Expresszió szintjük mérése microarray módszerekkel lehetetlen a kereszt-hibridizáció magas mértéke miatt. Hasonló problémák jellemzik a transzkripciós faktorok expressziójának mérését. Ugyanazon családhoz tartozó TF-ok közötti különbség a hibridizációs
technológiák
alkalmazhatósága
szemszögéből
legtöbbször
minimális.
Ugyanakkor a promóterek és TF-ok funkcionális jellemzéséhez elengedhetetlen az expressziós szintek pontos mérése az allélok szintjén. A kutatómunka legelső lépése tehát egy igen nagy érzékenységű, ám egyszerű expresszióméter (vagy transzkriptométer) fejlesztése volt (Makai és mtsai., 2011). Ezzel majdnem párhuzamosan készült el a promóter szekvenciák grafikai megjelenítését szolgáló promóter „böngésző” alkalmazás, amely az adatok egyedi vizualizációjával segítette a munkánkat (Makai és mtsai., 2012). A promóterek moduljainak felderítésére íródott a Modul Detektív perlszkript csomag, ami a motívumok és motívumcsoportok jelentőségét mérte. Ahogy nőtt a bevont adatok száma a kutatásba, úgy vált egyre szükségesebbé az eredmények intuitívabb, emberileg jobban értelmezhető feldolgozásának módja. Ezért kidolgoztunk egy új ko-expressziós hálózatszerkesztési eljárást, amely a gráfelmélet bevonásával segítette a genetikai alhálózatok detektálását.
3.1.1 NAGY ÉRZÉKENYSÉGŰ IN SILICO EXPRESSZIÓMÉTER Az expresszió kvantifikálásra cDNS könyvtárakat használtunk (lásd 3.2. fejezet). A nagy arányú szekvencia hasonlóság miatt ugyanakkor nem klaszterezhettük a cDNS-eket a művelet viszonylag magas hibarátája miatt (Wang és mtsai., 2004). Helyette egy új eljárást fejlesztettünk, aminek a folyamatábráját a 4. ábra mutatja be. A próbaszekvenciákat a cDNS könyvtárból képzett BLAST (Altschul és mtsai., 1997) adatbázisokon az alábbi szigorú feltételek mellett futtattuk. A blastn-nél használt kapcsolók a gluteninek esetén a következők voltak: -word_size: 128, -ungapped, -mismatch_penalty: -30. A TF esetén a blastn parancsot ’megablast’ módban futtattuk. A próbaszekvenciák az LMW és 24
HMW glutenin valamint a vizsgálatba bevont TF-ok összes alléljának kódoló szekvenciái voltak. Tekintve, hogy a in silico kísérletek próbaszekvenciái (LMW-GS, HMW-GS, TF) nem egyforma mértékben hasonlóak az expresszióméternél ezt követően más-más szűrési feltételeket alkalmaztunk. Ez azt jelenti, hogy az LMW gluteninek esetén 100%-os, a HMW gluteninek esetén 90%-os találatokkal dolgoztunk tovább. A TF-nál nem volt szükség szűrésre ezen a ponton. Tekintve, hogy a nagyfokú hasonlóság miatt több próbaszekvencia is eredményezhette ugyanazt a cDNS találatot, a találatokat összehasonlítottuk, osztályoztuk és egyenként elbíráltuk. Egy adatsor egyetlen cDNS-e értelemszerűen csak egy allél valós transzkriptje lehet. Az algoritmus a találatot azon próbaszekvenciának ítélte, ahol a legnagyobb volt az osztályzata. Ha az adott cDNS találat több egymástól eltérő próbaszekvenciánál is ugyanazon pontszámmal rendelkezett, akkor azt az egyértelmű géntípus azonosíthatóságának hiányában az értékelésből kizártuk. Az expressziós adatokat a megmaradt cDNS találatok alapján TPMben
(transcript
per
million)
kifejezve
számítottuk.
A
különböző
adatbázisok
összehasonlíthatósága végett, a TPM értékeket standardizáltuk (zéró átlagra és egységnyi szórásra). Az így kapott érték egy dimenzió nélküli érték, ezért az expressziókat bemutató diagramokon nem feliratoztuk az y-tengelyt. Az alkalmazás nem csak egyéni próbaszekvenciák expresszióját képes számítani, hanem csoportonként is (mint például TF családok, LMW-GS N-terminális szerinti csoportok). Ebben az esetben az osztályozás csoportonként történt, és a cDNS-t csak akkor zártuk ki az értékelésből, ha eltérő csoporthoz tartozó próbaszekvenciáknál voltak azonosak a pontszámaik.
25
4. ábra A kutatás során használt cDNS alapú transzkriptométer folyamatábrája. Részletek a szövegben. 26
3.1.2 PROMÓTER „BÖNGÉSZŐ” A Promóter „böngésző” alkalmazás egy egyszerű vizualizációs alkalmazás, amely FLEX-ban íródott és Windows rendszereken fut. Ismert motívumokat, kötőhelyeket jelenít meg a promóter szekvenciákon, számítja azok lokális feldúsulását (p-érték). A szoftver segít a szekvenciák motívumhoz kötött, félig automatikus illesztésében, ami a bioinformatikában jelenleg nem megoldott probléma. A tézisben az összes promóter mintázatot bemutató ábra ezzel a szoftverrel készült. Hasznos funkciója, hogy ún. kondenzált nézettel képes csupán a motívumok sorrendjét ábrázolni, segítve a „mintázat” polimorfizmusok áttekintését. A PLACE (Higo és mtsai., 1999) és PlantCARE (Lescot és mtsai., 2002) adatbázis motívumain túl egyedi motívumok megjelenítésére is képes.
3.1.3 MODUL DETEKTÍV A promótereken található konzervált motívum csoportok detektálása egy tisztán statisztikai feladat. Azt számítjuk, hogy egy adott sokaságban (ami esetünkben a hexaploid búza genom összes 1000 bp hosszúságú promóter szekvenciája) a próbaszekvenciák (esetünkben a HMW glutenin gének promóterei) mennyire felülreprezentáltak bizonyos motívum csoportok meglétében, illetve a kötőhely eloszlásuk mennyire egyedi. A megvalósított algoritmus kisebb módosításokkal követte a CREME (Cis-REgulatory Module Explorer) esetében leírt gondolatmenetet (Sharan és mtsai., 2003). A motívumok helyét RegEx alapú kereséssel határoztuk meg. A súlyozott mátrixok használata annyiban korlátozott, hogy nem engedi változó hosszúságú motívumok azonosítását. A motívumcsoportosulások megengedett hossza 200 bp, és a kötőhelyek egymástól való legnagyobb
távolságát
40
bp-ban
korlátoztuk.
A
később
részletezett
fókuszált
hálózatszerkesztéshez motívumduplexet is azonosítottunk, ahol a maximális távolság 150 bp volt. A kötőhely eloszlást a háttér sokaság és a próbák esetén is szakaszonként, léptetéses (sliding window) módszerrel számítottuk (szakaszméret: 100 bp, léptetés: 25 bp). A motívumok pozíciójának és a motívumcsoportok előfordulásának szignifikancia számításához a hipergeometrikus eloszlást használtunk. A moduldetektív Perl programozási nyelven íródott.
27
3.1.4 FÓKUSZÁLT KO-EXPRESSZIÓS HÁLÓZATSZERKESZTÉS A ko-expresszió hálózat szerkesztéséhez a normalizált expresszió értékek adatsoronkénti Pearson korrelációs koefficiensét (PCC) használtuk. A hálózat megjelenítése és elemzése a Gephi nevű programmal történt (Bastian és mtsai., 2009). A hálózat a PCC > 0,9 szűrése esetén is rendkívül kusza volt, és az általunk keresett génhálózatok vizuális megjelenítése a hálózat összetettsége miatt lehetetlen volt (5. ábra). Az „éleslátás” végett szükséges volt tehát a hálózatot a HMW glutenin gének génprogramjaira „fókuszálni”. Az előző fejezetben leírt modul detektív segítségével kiszámoltuk, hogy a HMW glutenin gének promóterein mennyire szignifikáns két TF kötőhely (duplex) együttállása. Tekintve, hogy a konzervált együttállás nagy eséllyel kölcsönhatást is feltételez, ezen p értékeket használtuk fel, hogy a hálózat hasonló két TF-a közötti éleinek súlyát (PCC) módosítsuk az alábbi képlet szerint: 𝐹𝑁𝑖𝑎𝑏 = 𝑙𝑜𝑔10 (
𝑃𝐶𝐶𝑖 ) 𝑝𝑎𝑏
Ahol az FN a fókuszált hálózat súlya; az ab az i-dik él egyik (a) és másik (b) csomópontjának TFa; a PCC a Pearson-féle korrelációs koefficiens és p az adott két TF kötő motívum együttállásának a p értéke (szignifikanciája). A fókuszálást aztán egy FN > 0 szűréssel értük el. Ez az eljárás lényegében kiemelte a meglévő erős ko-expressziót azok között a TF-ok között, amelyek kötőhelyei a HMW glutenin gének promóterein szignifikáns duplexet képeztek. Az alhálózatokat a Blondel és munkatársai által közölt algoritmussal határoztuk meg (Blondel és mtsai., 2008). A csomópontok jelentőségét az ún. „közöttiség” (betweenness centrality) értékkel fejeztük ki. Ez az érték méri, hogy a hány „legrövidebb útvonal” halad át az adott csomóponton. A legrövidebb útvonal a csomópontok között bejárható utak legrövidebbike. A közöttiség számításához a Brandes által közölt algoritmust használtuk (Brandes, 2001).
28
5. ábra Fókuszálatlan, teljes TF és HMW glutenin ko-expressziós hálózat.
29
3.2 ADATOK ÉS ADATBÁZISOK 3.2.1 MOTÍVUMOK, PROMÓTERSZAKASZOK ÉS PRÓBASZEKVENCIÁK A HMW glutenin gének expressziójának mérésénél a genotípusok saját alléljait használtuk próbaszekvenciának. Az allélösszetételeket a 3. táblázat részletezi. Ily módon a próbák azonosítói (accession szám) a következők voltak: Glu-1Ax2* - M22208 (Glenlea és DuPont adatsorokon); Glu-1Bx7 - DQ119142 (Glenlea) és BK006773 (Chinese Spring és DuPont adatsorokon); Glu-1By8 - JF736014 (Chinese Spring és Glenlea adatsorokon); Glu-1By9 X61026 (DuPont adatoknál); Glu-1Dx2 - BK006460 (Chinese Spring adatokon); Glu-1Dx5 – BK006458 (Glenlea és DuPont adatsorokon); Glu-1Dy10 – X12929 (Glenlea és DuPont adatsorokon); Glu-1Dy12 – BK006459 (Chinese Spring adatokon). A Glenlea-ben két kópia található a Glu-1Bx7 génből, melyek szekvenciái megegyeznek. A LMW-GS esetében az összes kódoló szekvenciát felhasználtuk, mint próbaszekvenciát. Az expresszióméter futtatásánál a próbaszekvenciákat csoportosítottuk az általunk bevezetett Nterminálisuk szerint. A transzkripciós faktorok expresszió méréséhez a PlantTFDB-n (Zhang és mtsai., 2011) megtalálható szekvenciákat használtuk. Összesen 1940 szekvenciát használtunk próba szekvenciaként, amelyek az összes ismert és eleddig azonosított TF családot reprezentálták. A dolgozatban használt TF kötőhely motívumok a vonatkozó irodalom alapján (2. táblázat), illetve nyilvános adatbázisokból (PLACE, PlantCARE) gyűjtöttük össze (Higo és mtsai., 1999; Lescot és mtsai., 2002).
30
2. táblázat A tartalékfehérje promótereken azonosított kötőhelyek (motívumok), kölcsönható TF típusok és irodalmi forrásaik. Elnevezés
CCAAT boksz GCN4 motívum GCN4 motívum GCN4 motívum AACA/TA motívum AACA/TA motívum MYB1AT törzsmotívum P-boksz P-boksz P-boksz P-boksz P-boksz P-boksz P-boksz RY törzsmotívum SKN1 motívum SPA bZIP
DNS kötő motívum
CCAAT GTGAGTCAT ATGAGTCAT GTGTGACAT TAACAA AACAAA AAACCA TGTAAAGT TGCAAAG TGTAAAG TGCAAAC TGCAAAAG TGGAAAG TGTAAAAGT CATGCA GTCAT GATGACGTGTC
Kötődő transzkripciós faktor CBF O2 bZIP O2 bZIP O2 bZIP R2R3 MYB R2R3 MYB R2R3 MYB PBF PBF PBF PBF PBF PBF PBF ABI3/VP1 bZIP O2 bZIP
31
Forrás
(Albani és Robert, 1995) (Albani és mtsai., 1997) (Müller és Knudsen, 1993) (Albani és mtsai., 1997) (Diaz és mtsai., 2002) (Diaz és mtsai., 2002) (Abe és mtsai., 1997) (Kreis és mtsai., 1985) (Sugiyama és mtsai., 1985) (Colot és mtsai., 1987) (Norre és mtsai., 2002) (Norre és mtsai., 2002) US Patent 20090064374 (Shirsat és mtsai., 1989) (Suzuki és mtsai., 1997) (Blackwell és mtsai., 1994) (Mena és mtsai., 1998)
3.2.2 EXPRESSZIÓS ADATSOROK Az expresszió szintek méréséhez összesen 31 adatkönyvtárat használtunk. Ebből 11 cDNS és 19 microarray adatsor volt. A microarray adatok (TA3, TA23, TA38) egy növényi expressziós adatbázisból, a PlexDB-ről töltöttük le (Dash és mtsai., 2012). A felhasznált cDNS könyvtárakat a 3. táblázatban foglaltuk össze. 3. táblázat Az expresszió méréshez használt fejlődő hexaploid búzaszem cDNS könyvtárak genotípusonként. A genotípusok HMW glutenin alegység összetételét külön feltüntettük. A DuPont könyvtár genotípusa ismeretlen. Allél kompozícióját a legjobb BLAST eredmények alapján határoztuk meg. Adatsor neve
Genotípus
Chinese Spring
HMW glutenin allél összetétele Ax
Ay
Bx
By
Dx
Dy
Chinese Spring
null
null
7
8
2
12
Adatsor alkönyvtárai a virágzást követő napok száma szerint 5,10,20,30
Összes cDNS száma
Forrás
10729, 11282, 11308, 12573
NCBI dbEST IDs: 19555, 10469, 19547, 10479 TaGI: #A9H, #A9I, #A9J TaGI: #BSD, #BSE, #BSF, #BSG, #BSH
Glenlea
Glenlea
2*
null
7oe
8
5
10
5,15,25
5805, 5368, 5094
DuPont
Nem ismert
2*
null
7
9
5
10
3,7,14,21,30
4689, 4887, 4967, 958, 840
A környezeti hatások elemzéséhez Hurkman és munkatársai (2013) által közzétett tömegspektrometriás fehérje azonosítással összekötött kétdimenziós gélelektroforézis adatok felhasználásával végeztük. Az adatsor a teljes prolamin családot lefedte, amiből mi csal a HMW glutenin alegységfehérjéket használtuk. Az egyes fehérjék adatait kigyűjtöttük, a biológiai ismétlések értékeit átlagoltuk, génenként összesítettük, majd normalizáltuk.
3.3 FILOGENETIKAI ÉS DIVERZITÁS ELEMZÉS Az evolúciós fa megszerkesztéséhez a Neighbor-joining módszert alkalmaztuk a MEGA6 szoftver felhasználásával (Tamura és mtsai., 2013). Az elemzés 139 HMW glutenin gén 32
promóter szekvenciát tartalmazott. A szekvenciák genomonkénti csoportjainak átlagos diverzitását szintén a MEGA6 programmal számoltuk a Maximum Composite Likelihood modell alkalmazásával.
3.4 KLASZTERELEMZÉS A kutatás során alkalmazott hierarchikus klaszterelemzéseket a Cluster3 programmal végeztük (de Hoon és mtsai., 2004).
3.5 TRANZIENS GÉNEXPRESSZIÓ 3.5.1 RIPORTERGÉNES KONSTRUKCIÓK ELKÉSZÍTÉSE Glu-1Bx7 HMW glutenin génnel rendelkező búza genotípus promóterének szövetspecifitását és aktivitását vad és különböző mutáns Glu-1Bx7 promóterrel meghajtott GUS riportergénes rendszerben vizsgáltuk tranziens expresszió segítségével. Célunk a -288 és -177 közötti szakaszon található ABRE|CBF motívum-csoportosulás funkcionális elemzése volt úgy, hogy a vad típuson felül a tervezett promóter mutánsok egyike esetében egyszerűen kiütöttük ezt a régiót (deléciós mutáns, bxDEL), a másik esetben viszont a régiót egy azonos hosszúságú (103 bp) indifferens DNS-szakaszra cseréltük ki (szubsztitúciós mutáns, bxRPLC). Utóbbi szakaszt a start kódtól 5’ irányból 16000 bp-ral vettük, mely az ellenőrzés alapján nem tartalmazott
6. ábra A tranziens génexpressziónál használt mutáns promóterek. A bxRPLC::GUS konstrukciónál a szürkével jelölt 103 bp hosszú szakaszt kicseréltük egy semleges, kötőhelyet nem tartalmazó szekvenciára. A bxDEL::GUS esetében ugyanezen szakaszt eltávolítottuk (deléció) a promóterből. A mutáns szakasz magába foglalta a ABRE|CBF csoportot, a HMW Enhanszer teljes hosszát. Pontos motívum mintázatát a 7. ábra és 10. ábra részletezi. 33
transzkripciós faktor kötőhelyet. A konstrukciók elkészítéséhez a start kodontól 5’ irányban álló 1000 bázist használtuk (6. ábra). A promótereket az Integrated DNA Technologies céggel szintetizáltattuk. A konstrukciók 5’ végére minden esetben HinDIII, míg a 3’ végre NcoI hasítási helyet terveztünk. A promótereket pIDTSmart(Amp) plazmidba klónozva szállították. A plazmid E. coli TOP10-es kompetens sejtekbe transzformáltuk, majd önálló kolóniákat folyadék-kultúrába oltottuk le. Felneveltük, majd plazmidot izoláltunk. A továbbiakban a vizsgált promótereket HinDIII-NcoI kettős emésztéssel kihasítottuk és külön-külön pCambia1391z (www.cambia.org) promóter-tesztelő vektorokba vittünk át (szubklónoztuk). A restrikciós klónozás során standard molekuláris biológiai módszereket alkalmaztunk és a Thermo Scientific cég által gyártott restrikciós endonukleázokat, T4 ligázt, illetve plazmidkinyerő-kiteket használtunk. A pCambia1391z vektor eredetileg promóter nélküli uidA gén::nos terminátor konstrukciót tartalmaz. Az uidA gén elé, HinDIII-NcoI hasítási helyek közé klónoztuk a vizsgálni kívánt promótereket. Kontrollkísérletekben egyrészt üres, promóter nélküli uidA gént tartalmazó pCambia1391z vektorral transzformáltunk (negatív kontroll), másrészt pKPK1 vektorral (Mészáros és mtsai., 2015), mely konstitutív kukorica ubiquitin promóterrel meghajtott uidA gént tartalmaz (pozitív kontroll).
3.5.2 TRANZIENS EXPRESSZIÓ A növényi anyagként szolgáló Chinese Spring (Triticum aestivum) genotípust Conviron fitotron kamrákban a már korábban kidolgozott, tavaszi T1 program szerint neveltük (Tischner és Koszegi, 1997). Levelek transzformációjához két-három hetes magoncok (2-3 leveles állapot) második leveléből 2-4 cm darabokat vágtunk ki és szilárd médiumra (Marzin és mtsai., 2008) helyeztük. A táptalaj 0,5% (w/v) agart, 1,65 g/l NH4NO3-ot, 0,4 M mannitolt (ozmotikumként) és 10 µM tidiazuron-t (öregedésgátló hormon) tartalmazott. A táptalajra helyezés után egy órával a leveleket transzformáltuk (ld. lentebb). Ezt követően 24 órán át ugyanazon a táptalajon, klimatizált 23°C-os helyiségben, természetes, szórt fényben (30 μmol/m2•s) tároltuk a transzformált mintát. A búza endospermiumokat 3 héttel virágzás után , steril körülmények között izoláltuk, majd endospermium-transzformáló (Ravel és mtsai., 2014) táptalajra (MS táptalaj, 100 g/l maltózzal) helyeztük. Három óra pihentetés után került sor belövésre (ld. lentebb). Transzformáció után az endospermiumokat 1 g/l kazein hidrolizátumot tartalmazó MS34
táptalajra helyeztük és 2 napig, sötétben, 23°C-on hagytuk tranziens módon expresszálni. A tranziens expresszió után a különböző növényi szöveteket GUS-festőoldatba tettük, és egy éjszakán át 37°C-on inkubáltuk. Festődés után az endospermiumokat 70%-os etanolba helyeztük. Leica sztereomikroszkóp alatt megszámoltuk a GUS-pozitív foltokat. Levelek esetében előbb 20, 50, 70, illetve 100%- etanol-tartalmú sorozatot alkalmazva eltávolítottuk a fotoszintetikus pigmenteket. A vizsgálatokat öt független ismétlésben végeztünk. A kapott adatokon párosítatlan T-próbát vagy varianciaanalízist, majd azt követően Tukey-féle poszttesztet végeztünk.
3.5.3 BIOLISZTIKUS TRANSZFORMÁCIÓ A belövéshez a Bio-Rad PDS-1000/He típusú génpuskáját használtuk, a gyártó ajánlásai szerint. A lövéshez 1 µm átmérőjű aranyszemcséket, 27 Hgmm vákuumot és 1100 psi (7,6 MPa) héliumnyomást használtunk. Az aranyszemcséket a gyártó által ajánlott módszer szerint előkészítettük. Az előkészítés során 3 mg aranyat 70%-os etanollal, majd steril MQ vízzel mostuk, végül 50 %-os glicerinben, 50 µl-es adagokban tároltuk 4°C-on. Egy 50 µl-es adag hozzávetőleg 3 lövésre volt elegendő. A DNS bevonat elkészítéséhez 1,5 µl 1 µg/µl-es plazmidot adtunk az 50 µl arany szuszpenzióhoz. Ezt követően 50 µl 3 M-os CaCl2-ot, illetve 20 µl 0,1 M-os spermidint pipettáztunk a cső falára, egymástól távol. A cseppeket aztán gyors mozdulattal, egyszerre ráztuk le az aranyhoz, amit aztán 2-3 percig rázattunk. Az aranyat 1 perc 10000 g centrifugálással ülepítettük, és a felülúszót kidobtuk. Ezt követően az aranyszemcséket egyszer, 190 µl abszolút etanollal mostuk, majd 18 µl abszolút etanolban reszuszpendáltuk. Egy ilyen szuszpenzióból lövésenként 5 µl-t használtunk fel. Az aranyszuszpenziót a transzformálásig jégen tartottuk.
3.6 PBF PROMÓTER SZEKVENÁLÁSA PBF TF promóter szekvenciájának azonosításához és szekvenálásához genomi DNS-t izoláltunk Glenlea és Chinese Spring búzafajtákból. A Chinese Spring genom segítségével tervezett promóter specifikus PCR primerekkel 3000 bp hosszú promóterrégiókat amplifikáltunk, amiket vektorba klónoztunk. A PCR-reakciók specifitását „nested” PCR alkalmazásával növeltük. A forward primer CCCATGGATCAATAGTAGTCAAC, a külső reverse primer pedig GATGCACGCCTCCTGATAC, a belső pedig CCTATTCCATTTCCACCAACC volt.
35
A reakció elegy összetétele 50 μl-re a következő volt: 200 ng növényi genomi DNS minta; 0,51 µM primer; 0,4 mM dNTP; 1/5 térfogat 5×tömény Thermo Scientific Phusion Green HighFidelity DNA Polymerase puffer; 2 egységnyi DNS polimeráz enzim (Thermo Scientific Phusion Green High-Fidelity). A termékeket oszlopon tisztítottuk, majd vektorba klónoztuk (Thermo Scientific Clonejet PCR Cloning kit). A klónozás a 3.5.1. fejezetben leírtak szerint végeztük. Ezt követően a Thermo Scientific cég által gyártott kittel kinyertük a plazmidokat, amiket a nested PCR belső primerpárjával amplifikáltunk. A pJET1.2/blunt vektorba klónozott PCR-termékek méretét BglII restrikciós endonukleázos emésztéssel ellenőriztük. A vektort úgy alakították ki, hogy a klónozó hely mindkét oldalán található ilyen hasítóhely, így a klónozott fragment kihasítható és mérete agaróz gélen láthatóvá tehető. Megfelelő méretű, vektorba klónozott PCR-termékek szekvenálásához M13-as vagy pedig a PCR-hez eredetileg használt primert használtuk. Egyes esetekben egyből a PCR-terméket szekvenáltuk. A szekvenálást külső szolgáltató végezte.
36
4 EREDMÉNYEK
4.1 SZABÁLYOZÓ ELEMEK ÉS KÖLCSÖNHATÁSAIK A NAGY MOLEKULATÖMEGŰ GLUTENIN ALEGYSÉGFEHÉRJE GÉNEK PROMÓTEREIN A Glu-1 gének fő transzkripciós szabályozói a promótereikhez kötődő transzkripciós faktorok (TF), a metiláció nem vagy elhanyagolható mértékben játszik szerepet. A rajtuk lévő TF kötőhelyek azonosítása és jellemzése ezért elengedhetetlen a HMW glutenin alegységfehérje (HMW-GS) gének viselkedésének megértése céljából. Tekintve, hogy a hat HMW-GS gén allélösszetétele egy adott genotípusban változatlan, az allélokra vonatkozó jellemzők egyben az adott genotípust is jellemzik. Ily módon közvetlen hatással van az adott genotípus szem fehérje összetételére, és ezáltal az abból készült tészta minőségére. A HMW glutenin gének promótereinek elemzéséhez 156 szekvenciát gyűjtöttünk. Ebből 140 promóter szekvencia volt 250 bp-nál, 122 szekvencia 500 bp-nál és 27 szekvencia 700 bp-nál hosszabb. Nyolcvanhét szekvencia tartozott a x-típusú és 69 az y-típusú HMW glutenin génekhez. A szekvenciák egyformán képviselték mindhárom lókuszt: 60 szekvencia az A, 67 a B és 29 a D genomról származott. A promóterek jellemzéséhez a 700 bp-nál hosszabb szekvenciákat használtuk.
4.1.1 A GLU-1 GÉNEK PROMÓTER SZAKASZAINAK MOTÍVUM-KOMPOZÍCIÓJA A HMW glutenin gének motívum összetétele alapján általánosságban elmondható, hogy mind a közeli (-300 bp-ig) és mind a távoli (-700 bp-on túli) régiókban a promótereik nagyobb hasonlóságot mutatnak a homeológ párjaikkal, mint az azonos lókuszon található paralógjaikkal (7. ábra és 8. ábra). A legnagyobb hasonlóságot a Glu-1Ax/Dx illetve a Glu1Dy/By párok között tapasztaltuk, míg a Glu-1Bx gén promóter profilja jellegzetes eltéréseket mutat a többi vizsgált szekvenciától. A legszembetűnőbb eltérés a start kodontól visszaszámolt -277 bázispárnál (bp) található ABRE motívum (ABRE@277poz † ) és a MYB@400-500poz motívum között található. Ezek
†
A tömörség kedvéért a továbbiakban a kötőhely motívumokat a következő formula szerint jelöljük: KÖTŐHELY@XXXpoz vagy KÖTŐHELY@XXXneg, ahol a KÖTŐHELY a motívum nevét, az XXX a startkodontól visszafelé számolt helyét és a ’poz’ vagy ’neg’ a szálirányt jelölik értelemszerűen.
37
pontos pozíciói az allélok között tapasztalható inszerciók és deléciók miatt némileg eltértek. A Glu-1Bx gének esetében (Glu-Bx13 kivételével) történt egy 55 bp hosszú inszerció, amely a CEREAL-boksz megduplázódását illetve a PBF@418poz kihasadását eredményezte. A Glu-1Ay gének esetében történt egy 131 bp hosszú deléció, amely során elveszett a CEREAL-boksz és a PBF@300poz. Hétszáz bázispár távolságra a kötőhelyek gyakorisága és a pozíciót illető konzerváltsága csökken, de a motívum összetétel ezekben a régiókban is megőrizte jellegzetességeit. A kötőhelyek eloszlás-elemzése alapján öt jól elkülönülő promóter régiót azonosítottunk (9. ábra). A start kodonhoz közeli szakaszon (>150 bp) túlnyomóan a TBF, CBF (NF-YA) motívumokat találtuk felülreprezentáltnak. Ennél távolabb az ABRE és CBF motívumok előfordulása jelentős. MYB és VP1 kötőhelyek a -400 és -500 bp közötti szakaszon felülreprezentáltak, amit -500 és -700 között egy bZIP típusú TF-okat kötő (röviden bZIP kötő) helyekben feldúsult régió követ. Ugyanitt található a bZIP kötő SPA motívum is. Tovább távolodva, -700 és -850 bp közötti szakaszon, az ABI3/VP1 és NAC kötőhelyek mutatnak átlagnál gyakoribb előfordulást.
38
7. ábra A Glu-1x gének promóter TF kötőhely kompozíciója. A promóterek lókuszonként csoportosítottuk (B,A,D). A felső vonalzó a startkodontól való távolságot jelöli.
8. ábra A Glu-1y gének promóter TF kötőhely kompozíciója. A promóterek lókuszonként csoportosítottuk (B,A,D). A felső vonalzó a startkodontól való távolságot jelöli. A jelmagyarázat az előző ábráéval (7. ábra) azonos.
39
9. ábra A promóter szekvenciák kötőhely eloszlásának felületdiagramja az x-típusú (A) és ytípusa (B) HMW-GS gének esetén. A moduláris szerkezet sematikáját a C ábra mutatja. A diagram bal oldalán jelöljük a kötőhelyeket TF családonként. A diagram egy domborzati térképhez hasonlatos, ahol a „magasság” arányban van az adott TF kötőhely szignifikanciájával az x tengelyen jelölt pozícióban. A diagram jól jellemezhető csoportokat mutat, amit a motívum elemzéssel kiegészítve azonosítottuk a promóter moduláris szerkezetét.
40
4.1.2 CISZ-SZABÁLYOZÓ MODULOK AZONOSÍTÁSA A kötőhelyek meghatározása szükséges, de nem elégséges feltétele a HMW glutenin gének szabályozó mechanizmusainak megértéséhez. Egyetlen motívum eloszlása, lokális vagy globális (azaz a teljes genomhoz viszonyított) relatív gyakorisága (felül-reprezentáltsága) mellett szükséges több kötőhely együttállásának, motívum-klasztereknek a relatív gyakoriságát is vizsgálni. Habár az együttállások a motívum eloszlás diagramon is kirajzolódnak, egy motívumklaszter elemzés segítségével egyértelműen eldönthető, hogy mennyire jellemző egy-egy együttállás a HMW glutenin génekre a búza genomon belül. A vizsgált Glu-1 gének 1600 bp hosszú promóter régiójában három olyan szakaszt azonosítottunk (CRM3, CRM5 és CRM6), amelyek túlnyomóan egyetlen transzkripciós faktor családra jellemző kötőhelyben dúsultak. További négy régióban a motívum összetétel volt kiemelkedően konzervált (bazális promóter, CRM1, CRM2 és CRM4) (10. ábra). A 280 bp hosszú bazális promóter tartalmazza a TATA@92poz és a CBF@37poz motívumokat, amelyeket az x-típusú HMW glutenin gének esetén még kiegészülnek a MYB@143poz és MYB174-177neg motívumokkal. Érdekes, hogy az itt megtalálható MYB kötőhelyek száma követi a CRM4-ben található MYB kötőhelyek számát. A bazális régiót követően húzódik a CRM1-es modul, ahol megtalálható az x-típusú HMW glutenin gének egyik legjellemzőbb motívuma, a CEREAL-boksz. Szintén itt található a nagyfokú konzerváltságot mutató HMW-enhanszer motívum. A szakasz ugyancsak tartalmaz egy PBF-ben relativan gazdag régiót, amely a vizsgált géntől függően egy vagy kettő PBF kötőhelyet tartalmaz. Ugyancsak ebben a szakaszban azonosítottunk egy 100%-osan konzervált ABRE@277poz kötőhelyet 40 bp távolságra egy CBF kötőhelytől. Erre a csoportosulásra a későbbiekben mint az ABRE|CBF motívumcsoport hívatkozunk. A CRM1 modult a Glu-1Ay génnél nem sikerült azonosítani.
41
42
A modulok jellemzése a szürke dobozokban található. A feltételezett kölcsönható MYB TF kötőhely párokat karikával jelöltük. A MYB-MYB távolság és a PBF-bZIP távolság felezőpontja egymáshoz közel, egy CEREAL boksz területére esik.
10. ábra Azonosított cisz szabályozó modulok.
Az ABRE|CBF motívumcsoport mellett találhatóak a CRM2 modul kötőhelyei, melyek a vizsgált szekvenciákban teljes mértékben megegyeztek egymással. A CRM2 modul tartalmaz egy MYB és egy VP1 kötőhelyet a pozitív szálon és egy bZIP kötőhelyet a negatív szálon. A kötőhelyek iránya, és egymásközti távolsága nagymértékben konzervált. A modul feltételzhetően lényeges szerepét jelzi, hogy ez a klaszter viszonylag tömör, összesen 45-50 bp hosszúságú. A -750 és -610 bp közötti, CRM3-mal jelölt szakaszon jellemzően bZIP típusú TF kötőhelyek találhatók. Géntől függően 3-6 bZIP kötőhelyet tartalmaz. Glu-1Ay-nál volt a legmagasabb a bZIP kötőhelyek száma: összesen öt bZIP kötőhelyet (SKN1 és GCN4)azonosítottunk a CRM3ban. Ugyancsak itt található a bZIP kötő SPA motívum is, amelyik mindegyik gén promóterén megtalálható. Pontos elhelyezkedése a promóteren az ezt megelőzően előforduló inszerciók és deléciók szerint változik. A CRM4 régió a bazális promóterhez hasonlóan az x- és y-típusú HMW glutenin gének esetében egymástól eltérő. Az y-típusú géneknél konzervált poziciójú NAC kötőhelyek fordultak elő nagyobb számban, az x-typusú géneknél viszont jellemzően MYB kötőhelyeket találtunk. Ez utóbbi esetében egy nagyon érdekes együttállást azonosítottunk, mert a CRM4 és a bazális szakasz MYB kötőhelyeinek száma és elhelyezkedése a kettős szálú DNS-en korrelál, szálspecifussága pedig ellentétes. Ezek a motívumok távoli, invertált párokat formálnak, azaz egy MYB a pozítív szálon együtt ’konzerválódott’ egy távoli MYB kötőhellyel a negatív szálon (10. ábra). A Glu-1Bx gének esetén ez a MYB@825poz-MYB@172neg pár. A Glu1Ax gén esetén két párt azonosítottunk: MYB@768poz-MYB@174neg és MYB@692negMYB@143poz. Hasonlóan, a Glu-1Dx-nél is két ilyen pár található: MYB@764pozMYB@173neg and MYB@737neg-MYB@142poz. További érdekessége az x-típusú promótereknek, hogy ezen párok távolságainak felénél található az ugyancsak x-típusra jellemző CEREAL-boksz. A CRM4 távolabbi régióiban RY elemek találhatóak mind két típusú HMW glutenin gén promóterén. A CRM5 a HMW-GS promóter szekvenciák -1330 és -1230 bp közötti szakaszán található, melynek jellemzője, hogy VP1 kötőhelyben gazdag. A CRM6 jelű modul a -1650 és 1340 bp közötti szakaszon található, és egy MYB kötőhelyben feldúsult régiót jelöl. Glu-1Bx gén esetén ez hiányzik (vagy távolabbi, nem vizsgált régióba tolódott).
43
4.1.3 A GLU-1 AKTIVITÁSÁNAK VÁLTOZÁSA GENOTÍPUSONKÉNT A transzkriptométer alkalmas a genotípusok között megfigyelhető expressziós szintek cDNS könyvtár alapú jellemzésére. A számítások során, a nagyfokú szekvencia azonosság ellenére, a gének expressziójában, illetve annak dinamikájában jellemző különbségek voltak tapasztalhatóak (11. ábra és 12. ábra). A Chinese Spring aktív, x-típusú alléljainak (Glu-1Bx7 és Glu-1Dx2) expressziói 10 nappal a virágzást követően érték el a maximumot, és ezután csökkenő tendenciát mutattak. Érdekes, hogy 30 nappal a virágzás után ez a folyamat megfordult, és erősödő aktivitást tapasztaltunk. A két y-típusú gén expressziója kevésbé volt szinkronban. A Glu-1Dy12 allél transzkripciója ugyan 10 nappal a virágzást követően csúcsosodott, de ezt követően egy állandó csökkenést tapasztaltunk az x-típusú génekre jellemző fordulópont nélkül. A Glu-1By8 allél aktivitása folyamatos, ámbár nagyon alacsony aktivitást mutatott a többi génhez képest.
44
11. ábra A HMW glutenin gének expressziós görbéi lókuszok szerint szétválogatva. A Glu-1Ay lókusz nincs feltüntetve, mert az összes vizsgált genotípusoknál inaktív volt. Az x-típusú gének között a túltermelő Glu-Bx7 GL és DP transzkripciós aktivitása a legerősebb, amit a Glu-Dx2 követ. Az y-típusú géneknél a Glu-1D lókusz génjeinek aktivitása a legerősebb, míg a Glu-1B géneké jellemzően alacsonyak. Az y tengely dimenzió nélküli, mert az adatokat a jobb összehasonlíthatóság végett zéró átlagra és egységnyi devianciára standardizáltuk. Az x tengely a mag fejlődési idejét mutatja a virágzást követő 5. naptól a 30. napig.
45
Glenlea genotípus esetében a D lókusz génjei (Glu-1Dx5 GL és Glu-1Dy10 GL) között markánsabb volt a hasonlóság, mint a Chinese Spring esetében. Az aktivitások normalizálása után, a Glenlea túltermelő Glu-1Bx7oe allélja 1,4-szer mutatott nagyobb aktivitást, mint a Chinese Spring, nem túltermelő Glu-1Bx7 allélja (12. ábra). Hasonlóan, amikor a mindkét genotípusban előforduló és hasonló dinamikát mutató Glu-1By8 allélra normalizáltuk az adatokat, a Glenlea Glu-Dy10 allélja aktívabbnak bizonyult a Chinese Spring Glu-1Dy12 alléljánál. A Glenlea esetében az y-típusú HMW glutenin gének mindig alacsonyabb transzkripciós aktivitást mutattak az x-típusúaknál. A normalizálások alapján a Glu-1Ax2* allél transzkripciós szintje közel kétszerese volt a Glu-1By8-nak. A DuPont cDNS könyvtár alapján mért allél aktivitások, hasonlóak voltak a Glenlea genotípusban mértekhez, mely részben az allélok azonosságával magyarázható. Ebből következően, a vártnak megfelelően az egyetlen eltérést a Glu-1By génnél tapasztaltuk, ahol a DuPont Glu-1By9 allélja erősebb aktivitást mutatott, mint a Glenlea Glu-1By8 allélja. Az adatokat ebben az összehasonlításban a közös Glu-1Ax2* allélra normalizáltuk, ami alapján megállapítható volt, hogy a két genotípus többi génje (Dx, Bx, Dy) azonos transzkripciós aktivitású. Általánosan elmondható, hogy mindegyik genotípusban az x-típusú gének aktívabbak. Ez a tény még jobban kiemeli a két HMW-GS típus promóter profiljában leírt markáns különbségeket, és arra enged következtetni, hogy a géncsoportok szabályozó mechanizmusai eltérnek. A normalizált értékek alapján ugyanakkor különbségek figyelhetők meg ugyanazon gén eltérő alléljai között. Ha figyelembe vesszük, hogy az allélok promóterei között nem tapasztaltunk változást a motívummintázatában, ez mindenképpen figyelemre méltó eredmény.
46
12. ábra A HMW glutenin gének allélonkénti expresszió elemzése (A,B) és környezeti hatástól való függése (C). A közös allélra való standardizálással módunkban állt összevetni különböző genotípusok alléljainak expresszió-erősségét. A Chinese Spring és a Glenlea közös Glu-1By8 allélja alapján standardizált adatokat az A panel mutatja. A Glenlea és a DuPont genotípusok közös Glu1Ax2* alléljára normalizált adatokat a B panelen tüntettük fel. A környezeti hatásokat a C panel szemlélteti.
4.1.4 KÖRNYEZETI TÉNYEZŐK HATÁSA A GLU-1 GÉNEK AKTIVITÁSÁRA A környezeti hatásokra adott válaszok eltérései újabb bizonyítékul szolgálhatnak a géntípusonként eltérő szabályozás meglétére. Az elemzést tömeg-spektrometriás fehérje azonosítással összekötött kétdimenziós gélelektroforézis adatok alapján végeztük, amit 47
Hurkman és munkatársai (2013) tettek közre. A közölt tanulmányban a fejlődő búzaszem fehérje összetételének változását négyféle kezelés során vizsgálták a fejlődés több időpontjában. A következő kezelést alkalmazták: extra nitrogén (N), magas hőmérséklet (T), N+T és kontroll (K). Az minták időpontjai N és K esetén: 8, 13, 18, 23, 28, 33, 37 nappal a virágzást követően. N+T és T kezelésekkor: 6, 8, 13, 18, 21 nappal a virágzás után. Hurkman és munkatársai a HMW-GS, LMW-GS és gliadinok egymáshoz képesti változásait figyelték, ám adataik lehetővé tették a HMW glutenin alegységek egyedi szinten való feldolgozását (12. ábra). A megemelkedett hőmérséklet esetén a HMW glutenin alegységek expresszió szintjei egységesen változtak és a fehérjék termelődése már 6 nappal a virágzást követően kimutatható volt. Ugyanakkor megemelt nitrogén ellátottság esetében a változásra adott reakciók génenként változtak. Egy időleges megtorpanást tapasztaltunk a Glu-1Bx7 és Glu1Dx5 allélok aktivitásának növekedése esetében a virágzást követő 10. és 20. nap között, míg a Glu-1By9 és Glu-1Dy10 alléloknál ilyen hatás nem volt megfigyelhető. Az előző alfejezetben leírt, az x-típusú génekre jellemző transzkripciós fordulópont is ezen időszakban tapasztalható. Ez y-típusú gének, N kezelés mellett csupán 20 nappal a virágzást követően mutattak növekedést a kontrollhoz képest. A Glu-1Ax2* allél aktivitása összességében emelkedett, ám ez esetben is megfigyelhető volt a növekedés időleges megtorpanása. Meglepő, hogy Glu1Bx7 allél nem tudta tovább növelni az aktivitását, amikor a magas hőmérsékleten túl extra nitrogént is kapott (N+T). Ez jelentős különbség a többi génhez képest, ahol a magas hőmérséklet okozta hatást tovább fokozta a hozzáadott nitrogén. A normalizált aktivitás adatokat ezért hierarchikus klaszterezéssel csoportosítottuk. Ez alapján azt kaptuk, hogy Glu1Bx7 és Glu-1Dx5 között szorosabb kapcsolat mérhető, mint a Glu-1Dy10 és Glu-1By9 között (12. ábra).
48
4.1.5 A HMW-GS GÉNEK ÉS KÖLCSÖNHATÓ TRANSZKRIPCIÓS FAKTORAIK HÁLÓZATELEMZÉSE A HMW glutenin gének endspermium szabályozását nagymértékben a promóter régióval kölcsönható transzkripciós faktorok biztosítják. Ennek vizsgálatához elengedhetetlen a promóterekkel kölcsönható transzkripciós faktorok bevonása az expressziós vizsgálatokba. Az elemzés megbízhatóságának növelése érdekében, az expressziós számításokat microarray adatok bevonásával bővítettük. A vizsgálatba több, mint 1000 ismert búza TF-t vontunk be. A kapott expressziós adatokat összevontuk egy ko-expressziós hálózatban. Tekintve, hogy nem minden ko-expressziós esemény (amit a hálózatban élek ábrázolnak) jelent feltétlenül kölcsönhatást, a hálózatot azon eseményekre kellett fókuszálni, amelyek a meglévő tudásunk alapján a legvalószínűbbek. Abból az alapvetésből kiindulva, hogy az egymáshoz közel elhelyezkedő kötőhelyekhez csatlakozó TF-ok nagy valószínűséggel kölcsönhatásban vannak egymással, a 4.1.2 fejezetben azonosított kettős TF kötőhely együttállásait használtuk fel a hálózat „fókuszálására”. A kettős együttállások szignifikancia értékével módosított ko-expressziós események (élek) súlyával felrajzolt hálózat megadta azokat a lehetséges kölcsönhatásokat, amelyeket egymástól függetlenül két számítás is alátámaszt. Az így kapott hálózat alaphelyzetben kiszűrte azokat a transzkripciós faktorokat, amelynek kötőhelye nem fordul elő a HMW glutenin gének promóterein (13. ábra).
49
13. ábra A HMW glutenin gének és az endospermiumban átíródó transzkripciós faktorok fókuszált ko-expressziós hálózata. Az azonosított alhálózatok kis szabályozóköröket reprezentálnak, amelyek feltehetőleg saját, részben elkülönülő génprogramokat követnek. A HMW gluteninek két típusa jól láthatóan külön alhálózatba rendeződik (Glu1x és Glu1y). A zölddel jelölt TF-ok túlnyomórészt korán átíródnak, ám egy részük folyamatosan aktív az érési fázisig. A pirossal jelölt TF-ok jellemzően későn mutattak intenzitást. A kékkel ábrázolt „Vezérlő” program genotípusonként eltérő időzítéssel jelent meg. Ebben a szabályozókörben találhatók a PBF, SPA TF-ok. A világoskék ABI3-hoz kapcsolt alhálózat jellegzetessége, hogy összetétele megegyezik a CRM2 promóter régió motívum mintázatával. A címkék mérete „közöttiség” értékkel egyenes arányos. 50
A hálózat modularitása alapján 6 alhálózatot azonosítottunk. Eszerint az x- és y-típusú HMW glutenin géneknek saját génprogramjuk volt (Glu1x és Glu1y), amelyek jól elkülönültek egymástól. További azonosított kis szabályozókörök (génprogram, alhálózat – ezeket egymással felváltva használjuk): „Korai”, ABI3, „Vezérlő” és ABA/L1L. A legtöbb génprogram időzítése közel azonos volt minden vizsgált genotípusnál, a „Vezérlő” génprogramé ellenben változó volt. A génprogramok TF típusonkénti összetételét a 14. ábra mutatja. A tartalékfehérjék szabályozásában betöltött szerepük miatt a SPA és PBF TF-okat külön tüntettük fel. Érdekes, hogy az ABI3-hoz kapcsolt génprogram összetétele megegyezik a CRM2 promóter régió kötőhely összetételével (bZIP, MYB, VP1/ABI3). A két HMW glutenin típus saját alhálózata a hálózatban szépen elvált, ugyanakkor TF összetételeiket csak néhány eltérés jellemezte. NAC típusú TF csak a Glu1y programban fordult elő. JaMYB típusú TF-ok aktivitása (Tae044348, Tae040197) a Glu-1x génekkel mutatott nagyfokú korrelációt, míg a Glu-1y-hez kapcsolt program a TaMYB1 nevezetű MYB (Tae025436) TF-ral. A legnépesebb alhálózat a „Vezérlő” génprogram. Neve a szerepét hangsúlyozza, mert többek között olyan kiemelkedő jelentőségű transzkripciós faktorok találhatók ebben a csoportban, mint az SPA bZIP, a prolamin boksz kötő faktor PBF, illetve a LEC transzkripciós faktorok. A csoport fontosságát az is jelzi, hogy ez az egyetlen génmodul, amely a genotípusok között eltérő időben mutat aktivitást. Chinese Spring esetében a csoport génjei 20 nappal a virágzást követően, míg a Glenlea-ben már 5 nappal a virágzást követően a legaktívabbak (15. ábra). Az eltérés egyik lehetséges okát, a PBF gén promóterében meglévő eltérést (a későbbiekben) kísérletesen megvizsgáltuk (Lásd 4.1.7. fejezet). Az egyszerűen csak „Korai”-nak nevezett génprogramhoz tartozó gének közös jellemzője, hogy mindegyik vizsgált genotípusnál korai aktivitás mutattak. Érdekes, hogy a Glenlea esetében (a Chinese Springgel ellentétben) a „Korai” génprogram nem különül el a „Vezérlő” génprogramtól, amely szintén korán aktiválódott (15. ábra). Túlnyomóan a bZIP családhoz tartozó HBP-1 (histone binding protein) és VP1 típusú TF-ok tartoznak ehhez az alhálózathoz. Az ABI3 nevű szabályozókör egy kis alhálózat, de a benne található ABI3 TF (Tae058138) miatt igen jelentős. Összetétele megegyezik a HMW-GS gének promóterének CRM2 régiójában található kötőhelyek TF specifitásával. Az alhálózat központi csomópontja egy HBP-1 TF. A 51
többi génprogrammal a hálózat topológiája alapján leginkább az ABI3 nevű TF-on keresztül áll kapcsolatban. Ezt jelzi magas „köztesség” értéke is, ami egyenlő az adott csomóponton áthaladó legrövidebb utak számával a hálózat összes többi csomópontja között. Az ABA/L1L (Lec1-like) program alacsony számú, de sajátos TF-okat tartalmaz. Az összes génprogram közül az abszcizinsav kapcsolt bZIP TF-ok (ABRE) itt fordultak elő a legnagyobb számban. Többnyire későn, 20 nappal a virágzást követően mutattak aktivitást.
14. ábra Az azonosított génprogramok, vagy kis szabályozó körök TF típusonkénti összetétele. A PBF és SPA transzkripciós faktorokat eltérő színekkel ábrázoltuk. Az x tengely mentén a génprogramok egy feltételezett időbeni sorrendet követnek. Az ABI3 minden genotípusban korán, az ABA/L1L génprogramok pedig későn (a HMW glutenin programok után) jelentek meg. Az Vezérlő program időzítése eltért a vizsgált genotípusok között. (Ezt ezen az ábrán nem tudtuk jelölni.)
52
15. ábra A Chinese Spring és Glenlea genotípusokban mért expressziós értékek klaszterezése. A transzkripciós faktorokat a PlantTFDB azonosítójukkal és a génprogramjuk nevével jelöltük. A „Vezérlő” program a Chinese Spring genotípusban később válik aktívvá. Kékkel kiemeltük a „Vezérlő” program meghatározó génjét, a SPA (Tae003778) és három homeológ PBF TF-t (Tae021210, Tae46928, Tae51344), amelyek időzítése nagyban eltér a két genotípusban. A függőleges oszlopok a virágzás utáni napok számát jelölik. Ott kékkel a SPA és PBF megjelenésének idejét jelöltük.
53
4.1.6 SZÖVETSPECIFITÁS VIZSGÁLATA A fent bemutatott eredmények alapján kísérletesen megvizsgáltuk a HMW-GS gének szövetspecifitásának transzkripciós szabályozását. Eddigi eredményeink alapján A CRM1 szakasz
ABRE|CBF
motívumcsoportja
feltételezhetően
fontos
szerepet
játszik
a
szövetspecifikus expresszió kialakulásában. Ennek igazolására tranziens génexpressziós kísérleteket végeztünk a CRM1 promóter szakasz vad típusú és mutáns változataival. A kísérlet azon előfeltételezésre épült, hogy a szövetspecifitás negatív módon valósul meg, azaz a nem célzott szövetekben a HMW glutenin gének expressziója gátolt. A hipotézis tesztelésére a Glu1Bx7 gén alapján két mutáns és egy vadtípusú promóter konstrukciót készítettünk, amelyeket levélben és endospermiumban vizsgáltunk (6. ábra). Egyrészről kivágtuk az ABRE|CBF motívumot (bxDEL::GUS), másrészről a szóban forgó szakaszt kicseréltük egy semleges (kötőhelyet nem tartalmazó) szekvenciára (bxRPLC::GUS). Ez utóbbi eltüntette az ABRE|CBF motívum együttest, de a vizsgált 1000 bp hosszú promóter szakaszon belül érintetlenül hagyta az összes többi motívum egymáshoz viszonyított elhelyezkedését. Ezekkel a módosításokkal párhuzamosan vizsgáltuk az ABRE|CBF jelenlétének, illetve a tőle előrébb és hátrébb elhelyezkedő motívumok távolságának hatását. Negatív kontrollnak promóter nélküli pCam1391z konstrukciót használtunk. Ötszörös ismétlés mellett levélben a negatív kontrollhoz képest szignifikáns különbséget mutatott a bxWT::GUS és bxRPLC::GUS konstrukciók aktivitása, míg a bxDEL::GUS aktivitásánál nem volt megfigyelhető jelentős eltérés (16. ábra). A bxRPLC promóter levélben szignifikánsan erősebbnek bizonyult a vadtípushoz (bxWT) és a bxDEL promóterhez képest. Ugyanakkor mind a három konstrukciónál az aktivitás alacsony volt a konstitutív promóterhez (pozitív kontroll) képest. Az endospermiumban mért tranziens expresszió aktivitásának eredménye a fenti eredményektől eltért. A legkiemelkedőbb aktivitás a vad típusú promótert jellemezte, míg mindkét mutáns csökkentett aktivitást mutatott. A bxDEL mutáns a levélben tapasztaltakhoz hasonlóan itt is a legalacsonyabb értéket mutatta. Az endospermiumban az aktivitás minden vizsgált konstrukció esetében magasabb volt, mint a levélben.
54
120 100 80 60 40 20 0 bxWT::GUS
bxRPLC::GUS Levél
bxDEL::GUS
pCam1391z
Endospermium
16. ábra Tranziens génexpressziós vizsgálat összefoglaló diagramja. Az y-tengely a megfigyelt pöttyök átlagos számát jelöli szövetenként és konstrukciónként.
55
4.1.7 A PBF PROMÓTEREK SZEKVENÁLÁSA ÉS ELEMZÉSE A változó dinamikájú „Vezérlő” program egyik meghatározó transzkripciós faktora, a Protein Binding Faktor nevű (PBF). Ez a mellett, hogy az endospermium egy meghatározó szabályozó faktora, egyénileg is eltérő dinamikát mutatott a genotípusok között. Feltételezzük, hogy a transzkripció időzítési különbségének oka a két genotípus PBF génjét szabályozó promóter szakasz eltérései okozzák. Meglévő eszköztárunkba jól illeszkedett a PBF gén promóterének jellemzése, ezért a két genotípus 1000 nukleotid hosszú promóter szakaszaira specifikus primereket terveztünk, a kapott terméket klónoztuk és szekvenáltuk (17. ábra). A kapott PBF promóter szekvenciákat illesztettük és a PlantCare/PLACE motívumait felhasználva ábrázoltuk a promóter motívumokat. A három homeológ genomon található PBF promóterek motívum mintázata alapján jelentős eltéréseket találtunk az A és a B genom PBF génjei között, és szinte teljes azonosságot a D genom esetén.
17. ábra A Glenlea (G) és Chinese Spring (ChS) genotípusok PBF TF génjének promóter mintázata, lókuszonként (5A, 5B, 5D) válogatva. Az A és B lókuszokon karakteres eltérések találhatóak a genotípusok promótereiben. Az eltérés önmagában elégséges magyarázat lehet a korábban bemutatott expressziós különbségekkel (15. ábra). A D lókuszon azonban azonosságot tapasztaltunk. Az átláthatóság kedvéért az ábrán csak azok a kötőhelyek szerepelnek, melyek számban jelentősen eltérnek a két vizsgált genotípus között. A PlantCare-en elérhető összes kötőhelyet (>400) vizsgáltuk.
56
4.2 KONZERVÁLT SZABÁLYOZÓ ELEMEK JELLEMZÉSE ÉS SZEREPE AZ LMW GLUTENIN GÉNEK EXPRESSZIÓJÁBAN Az elérhető, nyilvános adatbázisokban 360 kis molekula tömegű glutenin alegységfehérje gént azonosítottunk szekvencia szinten. Összesen 170 LMW glutenin alegységfehérjét kódoló szekvencia esetén találtunk legalább 30 bp, legfeljebb 2008 bp hosszúságú promóter szakaszt. Tekintve, hogy az LMW-GS gének kevésbé jól karakterizáltak ortológia és homológia szerint, a gének tanulmányozása összetettebb feladat a HMW-GS génekhez képest. Nem ismert a GLU3A, B, D multigén lókuszok szerkezete, a géneket nem tudtuk lókuszonként csoportosítani (mint ahogy megtehettük x- és y-típusok szerint a HMW-GS esetén). Ezért szükségesnek éreztük az LMW-GS gének csoportosításának további finomítását az N- illetve a C-terminusban általunk azonosított rövid, karakterisztikus polipeptid motívumok alapján (4. táblázat). Az LMW glutenin gének promótereit típusonként csoportosítottuk és ily módon jellemeztük (18. ábra). Az azonosított polimorfizmusokat, beleértve az LMW glutenin génekre jellemző hosszú endospermium boksz (long endosperm box; LEB) meglétét illetve hiányát LMW glutenin géntípusonként az 5. táblázatban mutatjuk be. A különböző csoportba tartozó LMW glutenin géntípusok promóter profiljainak jellemzése és hatásuk az expresszió szintjére következő alfejezetekben kerül bemutatásra. A motívumok eloszlása alapján, a HMW-GS-ekhez hasonlóan, a LMW-GS promótereken is azonosítottunk konzervált régiókat (18. ábra). Két rövid, bazális promóter szakasz (B1 és B2), illetve az EB és LEB régióit valamint távolabbi cisz szabályozó modulokat, azaz CRM-t azonosítottunk. A B1-es szakasz a -50 bp-ig tart és polimorfikus, míg a B2 51 és 120 bp között húzódik, és a vizsgált géneknél magas konzerváltságot mutatott. A B1-ben változó gyakorisággal és kombinációban MYB, bZIP és CBF kötőhelyek fordulnak elő. A B2-es szakasz egy TATA bokszból és egy P bokszból áll. A gének közötti eltéréseket az alábbiakban géntípusok szerint részletezzük.
57
4. táblázat Az LMW glutenin gének csoportosítása a különböző módszerek alapján. LMW
N-terminus
LMW főtípus
Ikeda-féle
Lókusz
glutenin
(Ikeda
és
gén típus
mtsai., 2002)
Referencia accession
IQA
ISQQQQAPPFS
LMW-i
VI/11
Glu-A3
X07747
IPP
ISQQQQPPPFS
LMW-i
VI/11
Glu-A3
FJ447464
IQP
ISQQQQQPPFS
LMW-i
VI/12
Glu-A3
FJ876821
IEN
IENSHIPGLEK
LMW-s
II/4
Glu-B3/Glu-D3
AY542898
MEN
MENSHIPGLEK
LMW-s
-
Glu-B3 ?
AY608420
MSP1
MENSHIPGLER
LMW-s
II/3
Glu-B3
FJ447463
MSP2
MENSHIPGLER
EU369715
MSP3
MENSHIPGLER
EU369722
MSG1
METSHIPGLEK
MSG2
METSHIPGLEK
MSH
METSHIPSLEK
LMW-m
I/2
Glu-B3/Glu-D3
EU189089
MRC1
METRCIPGLER
LMW-m
V/10
Glu-D3
EU189094
MRC2
METRCIPGLER
MDS1
MDTSYIPGLER
MDS2
MDTSCIPGLER
MSC1
METSCIPGLER
MSC2
METSCIPGLER
MSS1
METSCISGLER
MSS2
METSCISGLER
MSV
METSRVPGLEK
LMW-m
I/1
Glu-D3
EU189096 EU369734
FJ615311 LMW-m
IV/6
Glu-A3
FJ549936 FJ549935
LMW-m
IV/8
Glu-A3/Glu-D3
IV/9 LMW-m
IV/7
EU189091 AY994358
Glu-D3
AY831795 DQ457416
LMW-m
III/5
58
Glu-D3
EU189098
5. táblázat LMW glutenin géntípusonként megfigyelt polimorfizmusok a promóterek endospermium bokszában (EB).
LMW glutenin típus
LEB
LEB összetétel
Extra EB jellegű motívumok
-300-as motívum (EB1)
EB2
IQA
-
P-boksz |GCN4
P-boksz
nincs adat
IPP
-
P-boksz |GCN4
P-boksz
P-boksz | GCN4
IQP
-
P-boksz |GCN4
P-boksz
nincs adat
IEN
+
P-boksz |GCN4
P-boksz |GCN4
-
MEN
+
P-boksz |GCN4
P-boksz |GCN4
-
MSP1
-
P-boksz 1|SKN1
P-boksz |GCN4
P-boksz |GCN4 2-SKN1
MSP2
nincs adat
nincs adat
nincs adat
MSP3
nincs adat
nincs adat
nincs adat
P-boksz |SKN1
P-boksz
P-boksz|GCN4 3
MSG1
-
MSG2
nincs adat
MSH
-
P-boksz |SKN1
P-boksz
MRC1
+
P-boksz |GCN4
P-boksz |GCN4
MRC2
+
P-boksz |GCN4
P-boksz |GCN4
MDS1
nincs adat
nincs adat
nincs adat
nincs adat
MDS2
nincs adat
nincs adat
nincs adat
nincs adat
MSC1
-
P-boksz |SKN1
-
nincs adat
MSC2
nincs adat
nincs adat
nincs adat
nincs adat
MSS1
nincs adat
nincs adat
nincs adat
nincs adat
MSS2
-
P-boksz |SKN1
P-boksz |GCN4
nincs adat
MSV
-
P-boksz
P-boksz
P-boksz |GCN4
P-boksz|SKN1
59
P-boksz |SKN1, P-boksz |GCN4SKN1
18. ábra Az LMW géntípusok promóter szakaszai. Az A panel a motívum eloszlást ábrázolja felületdiagramon. Az x-tengely a transzkripciós kezdőponttól visszafele haladva mutatja a távolságot. A B panel az LMW glutenin géntípusok kiválasztott, reprezentatív szekvenciáinak promóter mintázatát mutatja a start kodontól visszafelé számított első ezer nukleotidig. Az egyes típusokat a hozzájuk tartozó génbanki azonosítókkal a jobb oldalon tüntettük fel. Az azonosított B1, B2, EB és LEB régióit külön tüntettük fel.
60
4.2.1 S-TÍPUSÚ LMW GLUTENIN GÉNEK Az érett fehérje szekvencia alapján szerinnel kezdődő LMW glutenin alegységfehérjéket aminosav szekvenciájuk alapján három alcsoportba lehet sorolni: MSP, IEN és MEN. Az MSP típusú fehérjéket kizárólag a Glu-3B lókusz kódolja és további három alkategóriába sorolhatóak. Ezek a továbbiakban MSP1, MSP2 és MSP3 jelöléssel fognak szerepelni. A legfőbb különbség az MSP alkategóriába tartozó promóterek között a CBF@11poz motívum hiánya az MSP1 és MSP2 esetén. Az MSP1 B1-es régiója ezenkívül tartalmaz egy bZIP kötőhelyet. Továbbá, az MSP1 típusú promóterek tartalmaznak még extra bZIP motívumokat -560 bp-nál, a LEB régió után, amelyet egy MYB kötő motívum kísér -441 bp-nál. Jellemző még az MSP alcsoportra, hogy 2 MYB kötőhely található a távoli promóter régióikban (-1788 és -1794 bp). Hasonlóan az i-típusú promóterekhez az MSP1 típusú gének hordoznak egy SPA kötőhelyet 640 bp-nál. Mindegyik MSP promóter tartalmazza a konzervált MYB@34poz kötőhelyet a B1es régióban. Fontos különbség, hogy az MSP típusú gének nem hordozzák a teljes LEB motívumot -300 bp-nál, ez jellemzően MEN és IEN típusú géneknél fordul elő. Az IEN és MEN alcsoportba tartozó s-típusú LMW gluteninek, mindkét csoport génjei a Glu-3D lókuszon kódoltak, ám a kódoló szekvenciáikban található eltérések előforduló különbségek miatt szükséges volt megkülönböztetni őket. A CBF@11poz hiányzik a promótereikől a B1 régióban. Az IEN típusú gének hasonlóságot mutatnak az MSP génekkel, ugyanis mindkettőben előfordul a SPA kötőhely. Ám ezek további P-bokszot tartalmaznak -406 bp-nál. GCN4 és SKN1 kettős kötőhelyet azonosítottunk -557 bp-nál, illetve egy extra GCN4 kötőhelyet -735 bp-nál mindkét alcsoportban.
4.2.2 I-TÍPUSÚ LMW GLUTENIN GÉNEK Az i-típusú LMW glutenin gének kizárólag a Glu-3A lókuszon fordulnak elő. Promótereik nem tartalmazzák a LEB motívumot, helyette egy extra EB motívum található -550 bp-nál. SPA kötőhely itt is -650 bp környékén konzerválódott. MYB típusú kötőhely (MYB1AT) nem található az i-típusú LMW fehérjék többségén. B1-es régiójuk tehát nem tartalmazza a MYB@34poz motívumot. Egyedül egy ISQQQQQQ(Q)PF aminosav szekvenciával kezdődő fehérje nukleotid szekvenciájában sikerült csak azonosítani, de ez a gén egy korai stop kodon miatt nem expresszál.
61
4.2.3 M-TÍPUSÚ LMW GLUTENIN GÉNEK Az LMW glutenin m-típusú alegységei a legszínesebb csoport, melyek szekvenciájuk alapján 7 alcsoportba sorolhatóak (4. táblázat). MSD1 alcsoport egy tipikusan inaktív, pszeudogén csoport, mely tartalmaz egy korai stop kodont. Sajnos nem minden génhez volt elérhető 150 bp-nál hosszabb szabályozó régió, de így is elmondható, hogy a m-típusú gének mindegyikénél konzerválódott a B2 régió TATA-boksz és PBF motívuma, valamint a B1 régió CBF és a MYB motívumcsoport. Az LEB modul nem jellemző az m-típusú gének promótereire, egyedül az MRC1 és 2 alcsoportokban fordultak elő (5. táblázat). A METRCIPGLER típusú gének a leggyakrabban előforduló m-típusú LMW glutenin alegységek, melyek két alcsoportba sorolhatóak: MRC1 és MRC2. A LEB modult követően promótereik tartalmaznak egy további teljes EB-t -582 bp-nál. További PBF kötőhelyek találhatóak -416 és -182 bp-nál, melyeket a szokásostól eltérően nem kísér bZIP kötő GCN4 motívum, de környezetükben megtalálhatóak az ugyancsak bZIP kötő SKN1 motívumok. A MRC1 és MRC2 alcsoportok B1 régiói nem tartalmazzák a MYB@34poz motívumokat. Ugyanakkor a B2 és EB közötti szakaszon megtalálható egy MYB kötőhely. A vizsgált LMW-GS promóterek között egyedülállóan ezekben az alcsoportokban találtunk NAC kötőhelyet, a negatív szálon (-424 bpnál), nem messze a LEB második EB motívumcsoportjánál. Az MSV alcsoporthoz tartozó gének promóterei merőben eltérő szerkezetűek a fentebb leírtaktól. Ezek EB régiójában nem található meg a teljes -300 elem, ugyanakkor -556 bp-nál található egy SPA kötőhely. Hasonlóan a többi m-típusú LMW-GS gén promóteréhez a B2-es régió tartalmazza a PBF@113poz és TBF@80pos. Szintén megtalálható a B1 régió MYB@34poz és CBF@11poz kötőhelye (MYB|CBF). -651 bp környékén egy RY kötő motívum jellemző ebben az alcsoportban. Az MSH típusú LMW glutenin alegységeknek két formáját lehet megkülönböztetni, amelyek több motívum előfordulásában is hasonlatosak. Ezen promóterek tartalmaznak egy MYB@359poz kötőhelyet 30 bp távolságra a csonka LEB-től. További konzervált PBF motívumot azonosítottunk a -112 és-387. B1 régiója teljes, tartalmazza a MYB|CBF motívumcsoportot. METSHIPGLEK típusú szekvenciák két alcsoportra oszthatóak: MSG1 és MSG2. Az utóbbihoz tartozó gének pszeudogének. MSG2 promóterek hordoznak egy extra MYB kötőhelyet a 62
konzervált -34 bp-nál elhelyezkedő közelében. MSG1 gének csupán egy hiányos LEB régió tartalmaznak. Egy ötödik PBF kötőhely található 32 távolságra a TATA boksztól (PBF@112poz). Azon LMW glutenin gének, melyek kódoló kezdőszekvenciája METSCISGLER szintén két alcsoportba sorolhatóak: MSS1 és MSS2. Az MSS1-hez nem állt rendelkezésre promóter szekvencia. MSS2-re jellemző a csonka LEB, és hasonlóan a többi m-típusú LMW glutenin promóterekhez -113 bp-nál található egy PBF kötőhely. TATA bokszuk szintén duplikálódott, és B1 promóter szakasza tartalmazza a konzerválódott MYB|CBF csoportot, ami közé beékelődött egy bZIP@27poz motívum. METSCIPGLER típusú LMW glutenin gének további alcsoportokra oszthatóak, ám ezek közül a MSC1 típusú gének jelenléte jellemzőbb a kenyérbúzára. Ezek többnyire nem tartalmaznak LEB-t, és a -300 –as elemük csonka, csupán egy PBF@137poz, bZIP@280poz és mindkét szálon RY elemet 139 bp-nál.
4.2.4 LMW GLUTENIN GÉNEK EXPRESSZIÓJÁNAK ÖSSZEHASONLÍTÁSA N-TERMINÁLIS SZERINT A virágzást követő 5-30 napos időpontokban három genotípus LMW glutenin expressziós profilját vizsgáltuk. A számított expressziós adatok jó összefüggést mutattak az LMW glutenin gének promóter mintázatával. Habár az MSS1 és MEN géntípusok a számításokban alulreprezentáltak voltak, az MRC és MSV gének esetén statisztikailag szignifikáns (p<0.05) különbségeket mértünk a Glenlea és Chinese Spring genotípusok között (19. ábra). A cDNS alapú számításaink szerint az LMW glutenin gének alapvetően két gén expressziós mintázatot követnek a szemfejlődés során. Az egyik mintázat többnyire az i-típusú és a legtöbb s-típusú génre jellemző és folyamatos növekedést mutat. Ezzel szemben a másik mintázat túlnyomó részben m-típusú (legjellemzőbben azon m-típusú LMW gluteninek, amelyik N terminális szekvenciája az 5. pozícióban cisztein aminosavat tartalmaz) gének esetében figyelhető meg. Ezek mRNS koncentrációja a virágzást követő 25. napnál maximumot mutat az endospermium szövetben. Szignifikáns eltéréseket mutattak az allélikus hatások, amit jól demonstrál az MRC gének expressziós mintázatának különbsége Glenlea és Chinese Spring búzafajták között. Glenlea esetében az MRC2 LMW glutenin gének transzkripciós aktivitása nagyon magas. A maximumot a 21. napnál érték el. Ezzel szemben a Chinese Spring fajtában az MRC1 allél volt jelen nagy
63
mennyiségben, ugyanakkor az MRC2 expressziója csupán a hibahatáron belüli mennyiségben volt csak kimutatható.
19. ábra LMW glutenin géntípusok expressziós mintázatainak összehasonlítása. A három vizsgált cDNS adatkönyvtárban vizsgáltuk a LMW glutenin géncsoportok expressziós dinamikáját. Genotípusonként (Chinese Spring, Glenlea, DuPont) két diagram a két típusú dinamikát mutatja. Az első mindig a csúcsosodó jellegű dinamikát kirajzoló, a második az ettől eltérő karakterisztikájú géntípusokat foglalja egybe. A vízszintes tengely a virágzást követő napok számát jelöli. A függőleges tengely egy dimenziómentes, a génaktivitással arányos értéket jelöl (lásd a 3.1.1. fejezetet). 64
4.2.5 A LMW GLUTENIN GÉNEK HÁLÓZATI ELEMZÉSE A HMW-GS géneknél kapott fókuszált hálózatot kiegészítettük a LMW-GS génekkel. Összesen 23 gént használtunk fel, amelyek mindhárom lókuszt képviselték. A hálózatban, hasonlóan a HMW-GS-hez, a Blondel és munkatársai (2008) által közölt algoritmus szerint alhálózatokat azonosítottunk (20. ábra). Az új gének jelentősen átrajzolták a hálózat topológiáját, de a korábban azonosított génprogramok a kiegészített hálózatban is megmaradtak. Valamelyest elmosódott ugyan a határ a „Vezérlő” és ABA/L1L illetve a „Korai” és ABI3 szabályozókörök között, ugyanakkor a tartalékfehérjék kis szabályozókörei jobban szétváltak ezektől. A LMW-GS gének összesen három alhálózatba tömörültek. Legnagyobb számban a Glu1x alhálózatban találhatóak, majd ennél kevesebb található a Glu3-b nevű alhálózatban. A Glu3a hálózatban összesen egy LMW-GS gén található. A Glu3-a hálózat elemei, a hálózat topológiai alapján az ún. kontroll programok (Vezérlő, ABI3, ABA/L1L) és a tartalékfehérje programok hídját képezik. A Glu1x alhálózatba tömörült LMW-GS gének jellemzője, hogy B1-es promóter szakaszában jelen van egy MYB kötőhely. A Glu3-b alhálózatba tömörült LMW-GS esetén viszont vagy a CBF@11poz vagy a MYB@34 hiányzik, de minden esetben jelen van egy extra bZIP kötőhely.
65
20. ábra LMW-GS génekkel kibővített fókuszált hálózat. A hálózatban az LMW-GS gének (Glu-3-ként jelöltek) összesen négy csoportba tagolódtak. Meghagyva az eredeti kettő Glu1x és Glu1y programokat, még további két kisebb, Glu3-a és Glu3-b alhálózatokba tagozódtak. Az algoritmus most nem osztotta önálló „közösségre” az ABI3 és „Korai” génprogramot, de a topológián jól látszik, hogy megmaradtak. Hasonlót figyelhetünk meg a „Vezérlő” és ABA/L1L génprogramoknál. 66
4.3 A HMW-GS PROMÓTEREK EVOLÚCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA A HMW glutenin homeológ promóter szakaszok nagyfokú hasonlósága felveti azt a kérdést, hogy a paralóg gének mikor és hogyan váltak szét. Melyik gén volt hamarabb, és miben különbözött a promóterek evolúciója a duplikáció óta? A vizsgálat során annak a jeleit is kerestük, hogy mennyire érvényesült az a megfigyelt szabály, hogy a génduplikációt funkcióváltás vagy inaktiválódás követi? A vizsgálatunkhoz 139 HMW glutenin gén promóter szekvenciáját használtuk, melyek közel 40 Triticeae nemzettség családhoz tartozó fajt és az A, B, D, E, H, S, R, V genomokat reprezentálták.
A
szekvenciákat
először
illesztettük,
majd
az
illesztés
alapján
megszerkesztettük a filogenetikai fát (21. ábra). A feltüntetett fa alapvetően két fő ágra oszlik, ami jól megkülönbözteti az x- és y-típusú promótereket. Ezt a különbség az ágak eltérő színezésével emeltük ki. Az ábrán ugyancsak feltüntettük a szekvenciák kondenzált promóter mintázatát, ami az 3.1.2 fejezetben leírt módszernek megfelelően csak a kötőhelyeket és azok sorrendjét ábrázolja modulok szerint elválasztva. A köztes szekvencia szakaszok jelölését elhagytuk. Az ilyen módon egyszerűsített ábrázolás szemlélteti a modulok változásait, egy új kötőhely kialakulását illetve eltűnését. A szekvenciák egy-egy csoportja jól láthatóan hordozza az x- és y-ra is jellemző jegyeket. Ezeknél az x-re leginkább jellemző CEREAL boksz és a bazális elhelyezkedésű MYB kötőhelyek együtt fordultak elő az y-ra jellemző, a CRM4-ben feltűnő NAC kötőhelyekkel. Érdekes, hogy a Glu-1By gének két külön ágon szerepelnek és a Glu-1Bx esetén is megfigyelhető egy zártabb és egy divergensebb csoport. Ugyanez a jelenség határozottan megismétlődik a Glu-1Ay gének esetén. A Glu-1Dx és Glu-1Dy egyformán lazán összetartó ágon találhatóak. A szekvenciákat genomok szerint csoportosítottuk és kiszámítottuk a csoportok közötti divergenciát (22. ábra). Az S és D genom esetén az x-típusú promóter divergenciája, míg az A, B és R genomok esetén az y-típusú génekhez tartozó promóterek divergenciája a nagyobb. A csoportok közötti divergencia esetén a y-típusú promóterek nagyobb divergenciáról tanúskodtak, mint az x-típusúak.
67
68
21. ábra Az x és y promóterek filogenetikai fája (előző oldalon). A fa kékkel jelölt ágai az x-típusú promótereket jelöli, a rózsaszín az y-típusút. A színátmenetes rész a promóter mintázat alapján hibrid szekvenciákat jelöli. Jellemzően az E genomhoz tartozó fajok között nem válik szét a két típus. Érdekes, hogy a rozs esetében (R genom) is keverednek az x és y promóterekre jellemző motívumcsoportok. A kondenzált promóter ábrázolások bal oldalán, apró betűs résszel, jelöltük a szekvenciák azonosítóját (accession) és a fajt.
22. ábra A HMW glutenin promótereinek diverzitása. A diagram genom csoportonként mutatja az x- és y-típusú promóterek diverzitását. Az oszlopdiagram pedig az össz- illetve a csoportok közti diverzitást mutatja. Az Aegilops fajoknál megtalálható S genom esetén az x promóter diverzitása nagyobb, mint az y. Ugyanez látható a termesztésbe későn bevont D genom esetén is. Az A,B és R genomok esetén az y-típusú promóterek diverzitása minden esetben nagyobb az x-típusú promótereknél.
69
5 AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE Növényekben a transzkripciós szabályozást nagyszámú (>1500) TF irányítja. A több tízezer célgén expresszióját számos, gyakran egymással is összefüggő szabályozási kör biztosítja. A teljes folyamat komplexitása ma még nehezen modellezhető (Middleton és mtsai., 2012). Ugyanakkor a szabályozókörök, alacsonyabb, egymástól kevésbé függő kölcsönhatásai jól hozzáférhetőek és vizsgálhatóak. Ezen kis szabályozókörök felfoghatók a nagyobb egész moduljainak, vagy alprogramjainak (Middleton és mtsai., 2012). Az előző fejetekben leírt eredmények alapján sikerült alaposabban megismerni a HMW és LMW glutenin gének szabályozását, mely szerint kisebb génprogramok irányítják a búza HMW és LMW glutenin génjeinek expresszióját. Az alább közölt modellek a HMW glutenin gének esetében szemfejlődés alatti teljes szabályozásra, míg az LMW esetében az aktivitás finomhangolására terjednek ki. A modellek alulról építkeznek és a promóterekben, illetve expressziókban rejlő információk alapján a kódvisszafejtés logikáját (reverse engineering) követik. Nem terjednek ki a szabályozás teljes vertikumára, ám ahol tudtunk, tettünk erre vonatkozó indikációkat.
5.1 A
NAGY
MOLEKULATÖMEGŰ
GLUTENIN
ALEGYSÉGFEHÉRJÉK
SZABÁLYOZÁSA 5.1.1 ELTÉRŐ SZABÁLYOZÁS AZ X- ÉS Y-TÍPUSÚ HMW GLUTENIN GÉNEK KÖZÖTT A promóter profilok karakterisztikus különbsége már önmagában eltérő szabályozást feltételez az x- és y-típusú HMW glutenin gének között. A x- és y-típusú gének promóterei között tapasztalt legnagyobb eltérések a CRM4, CRM6 és a bazális promóter motívum összetételeiben voltak. További, kisebb különbségek is megfigyelhetők, mint pl. az y-típusú gének CRM4-es moduljában, ahol az x-típusúakból hiányzó NAC TF-t kötő helyek találhatóak. A NAC transzkripciós faktorokkal kapcsolatban korábban leírták, hogy rizsben az ENAC1 szerepet játszik a szemfejlődésben és az abiotikus stresszválasz kialakításában (Sun és mtsai., 2012). A x-típusú gének esetében a CRM4 és a bazális promóter szakaszok is egyaránt jól konzerválódott MYB kötőhelyeket tartalmaznak. Növényekben a MYB TF-ok nagyszámban 70
elterjedtek és fontos szerepük van a fejlődést, anyagcserét és stresszválaszokat meghatározó szabályozókörökben (Dubos és mtsai., 2010; Zhang és mtsai., 2012). E kiemelt szerep miatt feltételezzük, hogy a MYB és a NAC kötőhelyek jelenléte lehet az egyik kulcs az x- és az y-típusú gének között tapasztalt expressziós dinamika eltérésére. A fókuszált ko-expressziós hálózatban kizárólag a Glu1x alhálózatában volt jelen MYB TF, ami tovább erősítette azt a feltételezést, hogy a x- és y-típusú HMW glutenin géneket eltérő szabályozási körök kontrollálják.
5.1.2 GÉNPROGRAMOK ÉS SZEREPÜK A transzkripciós faktorok és célgének közötti ko-expresszió általánosan jó indikátora a lehetséges kölcsönhatásoknak, ugyanakkor génprogramok azonosítására nem elégséges. Ellenben a ko-expressziós hálózatok és a promóter motívum-kompozíciójának együttes elemzése bizonyítottan hatékony módszer génprogramok kimutatására (Vandepoele és mtsai., 2009). A fókuszált hálózat topológiája alapján különböző génprogramokat azonosítottunk, amelyek a szemfejlődés egyes specifikus fázisaival lehetnek összefüggésben, és a fejlődési státusz szerint modulálják a transzkripció szintjét. Az ABI3 transzkripciós faktorhoz kapcsolt génprogram többnyire korai fázisban, a prolaminok átíródását közvetlenül megelőzve játszhat fontos szerepet. Ezt erősít az a korábban elfogadott tény, hogy az ABI3-nak kulcsfontosságú szerep van a búzaszem raktározó tevékenységének inicializálásban és fenntartásában (Agarwal és mtsai., 2011; She és mtsai., 2011). Az ABA és L1L transzkripciós faktorral kapcsolt génprogramok többnyire a szemtelítődés kései fázisában játszanak szerepet, amikor a kiszáradás elindul, az abszcizinsav szintje emelkedik és a fehérjeszintézis lassulni kezd. Ugyanakkor nem mindegyik génprogram időzítése tűnik konzerváltnak a genotípusok között. A HMW glutenin szintézis szempontjából kulcsfontosságú géneket magába foglaló „Vezérlő” program genotípusonként akár 10 napnyi eltérést is mutattak. Ez Glenlea esetében azt jelentette, hogy a „Vezérlő” és ABI3 génprogramok időben nem váltak szét, és már 5 nappal a virágzást követően aktívak voltak. Ezt az eltérést kísérletesen megvizsgáltuk. A Glenlea és Chinese Spring PBF promótereit lókuszonként (5A, 5B, 5D) izoláltuk és megszekvenáltuk. A P-boksz motívumokhoz bekötődő DOF típusú, PBF nevű transzkripciós faktor génjének promóter szekvenciáit összehasonlítva azt kaptuk, hogy az 5A és 5B lókuszokon található szekvenciák között markáns különbségek 71
vannak. Korábbi tanulmányok erős LD-ot (linkage disequilibrium) állapítottak meg egy fehérje tartalom marker és a PBF-5B lókusz között (Plessis és mtsai., 2013). A promóterek különbsége már önmagában elégséges oka a Glenlea PBF TF-ának korai aktivitásának.
5.1.3 SZÖVETSPECIFITÁS A LA CISZ Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a Glu-1Dx5 gén promóterének -277 bp-ig tartó szakasza elegendő, hogy dohányban biztosítsa a szövetspecifitást (Anderson és mtsai., 1998; Halford és mtsai., 1989; Robert és mtsai., 1989). Hasonló, kiméra promótereket használó kísérletekben ennél rövidebb szakaszt használva, már a -252 bp-tól kialakult a riportergén szövetspecifitás (Oszvald és mtsai., 2008). Ezen eredmények lényegét az érintett szakasz motívum összetétele jól megvilágítja. Itt található ugyanis a HMW-Enhanszer motívum, amely tartalmaz egy CCAAT bokszot és egy hozzá közeli ABRE motívumot. A CCAAT boksz az NF-YA családhoz tartozó CBF TF-t köti, ami egy Hiszton-2A-hoz nagyban hasonlító komplexet épít fel a DNS-en. E három alegységből álló komplex a növények kombinatorikus szabályozásában kiemelten fontos szerepet játszik (Laloum és mtsai., 2013). Az ABRE@277s és a CBF@230s (ABRE|CBF) motívumcsoportosulás egy 100%-osan konzervált motívumcsoport, ezért feltételezésünk szerint fontos szerepe lehet a szövetspecifitás kialakításában. Kísérleteinket e hipotézis mentén terveztük. A tranziens génexpressziós vizsgálatok megmutatták, hogy e motívumcsoport és az ettől feljebb illetve lejjebb fekvő motívumok távolsága fontos szerepet játszanak a HMW-GS szabályozásban. Az eredményeink alapján az ABRE|CBF csoport kettős szerepet tölt be. Egyszerre fontos a feltételezhetően TATA@91s-en kialakuló átíró komplex felépülésében és gátlásban. A motívumcsoport kivágása esetén a gén aktivitása rendkívül legyengült, az átírás nem vagy csak nehezen tudott elindulni. Azonban amikor a csoportosulást semleges szekvenciával helyettesítettük, a riportergén levélben erősebb intenzitást mutatott a vad típusnál. Ez arra enged következtetni, hogy a komplex fel tudott épülni, és az átírást nem gátolta semmi a levélben. A pozitív kontrolltól, ami egy konstitutív promóter, ugyanakkor így is elmaradt. A mutáns konstrukció értelemszerűen nem vált konstitutívvá az ABRE|CBF cseréjével. Endospermiumban ez a konstrukció ugyanakkor kisebb aktivitást mutatott a vad típusnál. Ennek alapján feltételezhető, hogy az ABRE|CBF motívum direkt módon gátolja az átírást a levélben. A átírás fokozásában ugyanakkor direkt illetve (a távolságtartó funkción keresztül) indirekt módon is szerepe lehet az endospermiumban. Ennek pontosítására további vizsgálatok szükségesek. A 72
távolság fontossága miatt, feltételezzük, hogy egy térbeli átrendeződés (lásd később) lehetővé teszi a CRM4 és a bazális promóter „tükörszimmetrikus” MYB kötőhelyei között kialakuló kölcsönhatást. Mivel levélben az ABRE|CBF régióba bekötő faktorok egy gátlást okozó kombinációja alakul ki, ez az átrendeződés nem vagy másképpen tud csak tud kialakulni (23. ábra).Modellünk szerint a MYB-MYB komplex a PBF-SPA komplexszel az ABRE|CBF ellenében dolgozik fiatal levelekben. Az előző két komplex fokozná az átírást, az utóbbi gátolja. A szövetekre jellemző transzkripciós faktorok hatására hol a gátló, hol pedig a fokozó hatások érvényesülnek. Furtado és munkatársai beszámoltak arról, hogy transzgenikus rizsben a 425 bp hosszú búza
23. ábra A HMW glutenin gének szövetspecifitásának modellje. A teljes kék kör a MYB-MYB kölcsönhatást jelöli, ami az ABRE|CBF távollétében fokozza az átíródást levélben. A deléciós konstrukció esetén a MYB-MYB interakció nem tud létrejönni, mert a hurok végei nem megfelelően illeszkednek. A beékelődő rózsaszín trapéz jelöli az ABRE|CBF régió gátló hatását a vadtípusú promóterben. Az endospermiumban a gátló hatás nem alakul ki, a trapézt alkotó komplex megváltozott kombinációja miatt. HMW-GS gén promóter nem volt szigorúan specifikus, és sztomatában, levélerekben és gyökérben is tapasztaltak aktivitást (Furtado és mtsai., 2008). Ez egyrészről feltételezi, hogy rizsben és búzában másképp történik a szabályozás, ám másrészről a konstrukció nem képes a bazális és a 425bp-nél távolabb fekvő CRM4 szakaszok közötti interakció kialakítására, és ezzel gyengülhet a promóter szövetspecifitása. Későbbi vizsgálatok kimutatták, hogy a 425 bp hosszú promóter aleuronban is expresszált (Furtado és mtsai., 2009). Másik közleményben arról számoltak be, hogy a 700 bp hosszú Glu-1Bx7 HMW-GS promóter kisebb aktivitást 73
mutatott a teljes 2000 bp hosszú promóternél búza endospermiumban (Wang és mtsai., 2013). Ez az eredmény a CRM4 MYB kötőhelyei fontosságát hangsúlyozza, tekintettel arra, hogy ezek hiányoztak 700 bp hosszú konstrukcióból.
5.1.4 A HMW GLUTENIN GÉNEK SZABÁLYOZÁSÁNAK MODELLJE Eredményeink alapján a HMW glutenin gének szabályozását egy modellben foglaltuk össze (24. ábra). A modell alapján a szövetspecifitás feltételezhetően negatívan szabályozott és a 277-es pozícióig található motívumok játszanak benne kulcsszerepet, különös hangsúllyal az ABRE|CBF csoportra (lásd 5.1.3 fejezetet). A kezdeti átírás az endospermium korai fejlődési szakaszában (4-5 nappal a virágzás után) már elindul. A modell szerint a nem megfelelő kombinációban jelenlevő TF kombináció hiánya miatt az ábrán feltüntetett fekete színnel jelölt, gátlást okozó (fordított) lakat kiold. A lakatok kombinációs zárjával ezt kombinatorikus jelleget illusztráltuk. A kombinációs lakat számtárcsáinak színei (csíkok a lakaton) a megfelelő TF beépülését (zöld), illetve annak hiányát, vagy a nem megfelelő TF beépülését (magenta) jelzi. A modul gátló hatása (magenta) átvált az átírást megengedőre (zöld). A kis mértékű transzkripciót, kis mértékű kék színezéssel a CDS szakaszt ábrázoló részben jelöltük. Modellünk szerint a korai szakaszban (virágzás utáni 7. napig) a bazális modulon túl a többi modul még nem (sárga), vagy elhanyagolható módon (sárga-zöld átmenet) hat a transzkripcióra. A fejlődés szemtelítődési szakaszában, ami búza genotípusonként változik, a „Vezérlő” génprogram aktivizálódik, ahol egyszerre vannak jelen a DOF típusú PBF és bZIP típusú SPA TF-ok, amelyek a CRM1 és CRM3 szakaszokon található kötőhelyekkel lépnek kölcsönhatásba. Növények szemterméseinek szöveteiben különösen jellemző a DOF és bZIP TF-ok kölcsönhatások megléte (Agarwal és mtsai., 2011). Az LMW glutenin gének esetén az endospermium boksz tartalmaz egy DOF típusú PBF és egy bZIP kötőhelyet. A HMW glutenin gén promóterein e két motívumot a CEREAL boksz és a teljes CRM2-es régió választja el egymástól. A régiók térbeli közeledését valószínűleg a tökéletesen konzervált CRM2 régió moderálja az itt jelenlevő három transzkripciós faktor (bZIP, MYB és VP1) megfelelő kombinációja által. A dolgozatban bemutatott fókuszált hálózaton jól látható, hogy e TF-ok expressziója szorosan korrelál egymással az ABI3 génprogramban. Olyannyira, hogy az ABI3 program bemutatott TF összetétele csupán ebből a három TF-ból állt. Korábbi bioinformatikai
74
elemzések kimutatták, hogy bZIP, MYB és VP1‡ kötőhelyek együttes előfordulása evolúciósan konzervált és az auxin által indukált expresszióban van közvetítő szerepük (Berendzen és mtsai., 2012). ABI3 génprogram már a fejlődési fázis korai szakaszán aktív az összes vizsgált genotípusban. Ez jól összefér az auxin jelátvitelben betöltött szerepével, hiszen az auxin az egyetlen fitohormon mely a fejlődés kezdetétől jelen van. Tekintve, hogy rövid (>150 bp) DNS hurkok kialakulásáról a promóter szakaszokon már korábban is beszámoltak (Tahirov és mtsai., 2002), feltételezzük, hogy a CRM1 és a CRM3 egy ilyen hurok által közeledik egymáshoz. E térbeli átrendeződésben a CRM2 régiónak valószínűen kiemelt szerepe van. Modellünk szerint miután az ABI3 programban megjelenik a kedvező TF kombináció, a fehér, átírást támogató lakat kiold. Ezt követően a transzkripció intenzitását egyedül a „Vezérlő”, a Glu1x és a Glu1y génprogramok transzkripciós faktorainak kölcsönhatásai határozzák meg. A „Vezérlő” génprogram során a PBF elfoglalja a CRM1-en található kötőhelyét, és kölcsönhatásba lép CRM3-ra kötött bZIP típusú SPA-val. A tartalékfehérjék forrás-függése miatt elképzelhető, hogy a környezeti változások csupán úgy és annyiban hatnak a kódoló génjeik aktivitásukra, amennyiben azok a „forrásokat” apasztják. Azaz a rendelkezésre álló N, S és C szintjében illetve ezek arányában (bármilyen okból) beállt változások növelhetik vagy csökkenthetik az aktivitásukat. Ebben játszhatnak közvetítő szerepet a CRM-ekkel kölcsönható transzkripciós faktorok. Mindebből az is adódik, hogy a szemfejlődés korai szakaszában, a differenciálódás és a sejtosztódás során ezek folyamatai annyira „lekötik” a forrásokat, hogy a HMW-GS transzkripciója, még ha megengedett is (fekete és fehér lakat is nyitva), nem indul el. A környezeti hatásokra (avagy a források mértékének változásaira) való válaszban a kialakult komplexek játszanak kulcs szerepet. A PBF-SPA kölcsönhatás megléte, hiánya lehet egy ilyen visszacsatolásra alkalmas komplex. A CRM4 sok bZIP kötő GCN4 motívummal rendelkezik, ami alacsony N-szinthez kapcsolt negatív szabályozással hoztak összefüggésbe (Müller és Knudsen, 1993). Az x-típusú HMW-GS géneknél a környezeti változók szerinti finomszabályozás a feltételezett MYB-MYB komplexen keresztül is megvalósulhat. A Glu1x szabályozókörében jelenlévő JAMYB ennek valószínűségét támasztja alá, amit már rizs esetében összefüggésbe hoztak a jázminsavhoz köthető biotikus és abiotikus stresszre adott válasszal (Yokotani és
‡
ABI3 egy VP1(B3) típusú TF.
75
mtsai., 2012). Az y-típusnál a NAC kötőhely jelenléte egy az ABA-tól független lehetséges útvonalat feltételez (Nakashima és mtsai., 2014). Ez azért is érdekes, mert az y-típusú HMWGS-ek az érés végére megemelkedő ABA szinttől függetlenül képesek növelni az intenzitásukat. Az x-típusúaknál ekkor már a csúcs utáni csökkenő dinamika jellemző.
24. ábra A HMW glutenin gének szabályozásának modellje.
76
5.2 A KIS MOLEKULATÖMEGŰ GLUTENINEK SZABÁLYOZÁSA 5.2.1 AZ LMW GLUTENIN CISZ SZABÁLYOZÓ ELEMEINEK JELLEMZÉSE A megkétszereződött endospermium boksz (EB) és a hosszú endospermium boksz (LEB) leginkább a LMW glutenin génekre jellemző, de megtalálták már gamma gliadin promóterében is (Pistón és mtsai., 2009). A LEB Leginkább az IEN, MEN és MRC típusú génekben fordul elő teljes hosszában, míg a többi típusnál csak részlegesen volt azonosítható. Ezekben az esetekben vagy egy-két GCN4 motívum hiányzott, vagy csak részleges duplikáció volt megfigyelhető. Jellemzően ilyen esetekben a PBF kötő motívumát egy SKN1 motívum kísérte. A legtöbb esetben a -300-as pozíciótól eltérő helyeken is megtalálható volt a teljes endospermium boksz. A teljes EB-k száma, pozíciója és más TF kötőhelyekkel való szomszédsága (csoportosulása) összefüggésbe hozható a gének eltérő aktivitásával. Az MRC típusú LMW glutenin esetében a megkétszereződött LEB-nek fontos szerepe lehet a fokozott átíródásban. Ugyanakkor a legnagyabb aktivitással bíró MSV típusú gének esetében nem találtunk több EB-t. Éppen ellenkezőleg, a -300 bp-nál megtalálható EB nem teljes, a promóter itt csupán két DOF kötőhelyet tartalmaz a LEB régióban, és nincs bZIP (SKN1 vagy GCN4) kötőhely a közelben. Viszont tartalmaz egy teljes EB-t -550 bp-nál. Valószínűsíthető tehát, hogy ez a motívum az expresszió fokozásában tölt be szerepet. Összességében kijelenthető, hogy a MYB és bZIP kötőhelyeknek fontos moderáló szerep jut a tartalékfehérje
gének
átírásának
szabályozásában.
MYB
kötőhelyek
különböző
polimorfizmusait azonosítottuk többnyire DOF vagy bZIP TF kötőhelyek. MYB kötőhely gyakran előfordult -34 bp pozícióban. Ezt a motívumot először MYB1AT néven A. thaliana-ban azonosították egy dehidratáció-reszponzív gén promóterében, és gátló hatással bírhat az LMW glutenin gének expressziójában a szemfejlődés kései fázisában (Abe és mtsai., 2003). A CBF kötőhely (CCAAT) az egyik leggyakrabban előforduló motívum az eukarióta sejtek promótereiben. Korábban már leírták, hogy a tartalékfehérje promóterek közös jellemzője, hogy tartalmaznak egy CBF motívumot a promóter közeli (az ATG-hez közel eső) szakaszon (Thompson és Larkins, 1989). Azok a gének, amelyek szabályozását a CCAAT bokszot tartalmazó promóterek határozzák meg többnyire szövet vagy fejlődés specifikusak. A CCAAT boksz pozíciója, iránya és környezete meglehetősen jól konzervált az ortológ gének között 77
(Mantovani, 1999). jellemzően 60-100 bp távolságra helyezkednek el, és az átírás kezdetétől mindkét irányban operatívak (Bucher, 1990; Dorn és mtsai., 1987; Edwards és mtsai., 1998; Mantovani, 1998). Érdekes, hogy a legtöbb LMW glutenin esetében a kódoló régiótól mindösszesen 11 bp távolságra helyezkednek el. Vizsgálatunk során egyedül az MSP, IEN, MEN (s-típus) gének promóterei nem tartalmazták a CBF kötőhelyet. Jellemzően ezen gének transzkripciós aktivitása nem követi a tipikus csúcsosodó lefutást, hanem a szemfejlődési fázis kései szakaszában éri el maximális értékét.
5.2.2 KONZERVÁLT CISZ SZABÁLYOZÓ RÉGIÓK ÉS GÉNAKTIVITÁSOK ÖSSZEFÜGGÉSEI A promóterek szabályozó elem összetételének és eloszlásának összehasonlítása alapján megállapítottuk, hogy egyes motívumok pozíciója és egymáshoz viszonyított sorrendje erősebben konzerválódott. Néhány ezek közül általánosan jellemző a gabona tartalékfehérje génekre, mint például a EB régió, ugyanakkor más régiók inkább az LMW gluteninek alcsoportjaira jellemzőbbek. A B2 régió magas konzerváltságából fakadóan és a benne található TATA boksz miatt elengedhetetlen a transzkripcióhoz. Ugyanakkor az ezt megelőző B1 régió kötőhely összetétele meglehetős változékonyságról tanúskodott. A benne lévő konzervált pozíciójú MYB és CBF kötőhelyek jelenléte géntípus függő, habár határozott korrelációt nehéz lenne megállapítani a típusok nem egységes reprezentáltsága miatt. Érdekes ugyanakkor, hogy azok a LMW-GS gének, amely B1 szakasza egy bZIP kötőhelyet tartalmazott önálló alhálózatba tömörültek a ko-expressziók hálózatos elemzése során. Ez egy valamelyest külön utas szabályozás meglétét támasztja alá. Meglehet ugyanakkor, ez a külön út nem több egy gátlásnál, mert ezen LMW-GS gének aktivitása konzekvensen alacsony volt a vizsgált genotípusokban és aktivitásdinamikájuk nem csúcsosodó. A legtöbb gén csúccsal rendelkező expressziós dinamikát mutatott, amelynél a fejlődési szakasz felénél tapasztalható volt egy csúcs (a virágzás utáni 10. és 25. nap között). A másik csoport nem érte el a csúcsot a fejlődési fázis feléig, és láthatólag hosszabb ideig mutatott aktivitást, ám többnyire alacsony szinten. A fókuszált hálózati elemzés LMW-GS génekkel való kiegészítését követően a legtöbb LMW-GS gén a Glu1x génprogramba tömörült. Az leírt Glu3a és Glu3-b alhálózatok a Glu1x alhálózatról váltak le. Nem találtunk LMW-GS gént, amely a Glu1y alhálózatába tagozódott volna. 78
5.2.3 AZ LMW GLUTENIN GÉNEK TRANSZKRIPCIÓJÁNAK FINOMHANGOLÁSA A bemutatott eredmények szerint az LMW glutenin gének expressziója két eltérő dinamikát követ. A legtöbb s- illetve i-típusú gén folyamatosan növekvő intenzitást mutat, míg az mtípusú gének intenzitása a fejlődési szakasz közepén csúcsosodott. Eszerint az s- illetve i-típusú gének esetében a pozitív N-visszacsatolás képes végig fenntartani az átírást, sőt növelni is azt. Ahol ezek a bZIP kötő szekvencia motívumok jelen vannak, a negatív N visszacsatolás érvényesül, és az átírás lecsökken. További jelentős eltérés a SPA kötőhely jelenléte a folyamatosan növekedő intenzitást produkáló gének promóterének -600 és -500 közötti szakaszán. Egyéb típusoknál a SPA kötőhelye hiányzik. A CBF kötő (CCAAT boksz) motívum jelenlétében szintén eltér a két csoport. Azoknál a géneknél, melyeknek az intenzitása csúcsosodott a CBF@11poz jelen volt. A fenti eredmények alapján a következő modellben foglaltuk össze az LMW glutenin gének finomszabályozásának feltételezett módját. A gének alapszintű transzkripcióját a B1 és B2-n felépülő komplexek biztosítják miután a gének epigenetikailag aktívvá váltak. Ezen komplexek között van a TATA boksz körül felépülő átíró komplex, amelyet a MYB modulál. A koexpressziós hálózat és irodalmi adatok (Abe és mtsai., 1997) alapján okunk van feltételezni, hogy a MYB TF egy abszcinzinsavhoz kötött gátlás kialakulásában játszik szerepet az érés vége felé, amikor megindul a kiszáradás. Hasonlóan, azokban az esetekben, ahol megtalálható a CBF@11poz feltételezhető, hogy a virágzást követő 20. nap után kialakul egy transzkripciós gátlás. Az EB és LEB régiók PBF-DOF kölcsönhatásain keresztül a negatív és pozitív visszacsatoláson át a finomhangolást végzik. Alacsony N szint mellett, tehát a raktározó szövet kialakulása előtt a negatív visszacsatolás érvényesül. Majd amikor a szövet az endospermium a szemtelítődés fázisába lép az N szint megemelkedik, és ez a hatás lecsökken. Az érett szemben található LMW-GS nagy mennyiségéhez hozzájárul, hogy a három (Glu-3A, B, D) multigén lókuszon akár 10-12 aktív LMW-GS gén is előfordulhat lókuszonként.
79
5.3 AZ LMW ÉS HMW GLUTENIN GÉNEK PROMÓTEREINEK ÖSSZEVETÉSE A HMW-GS promóterek motívum kompozíciója hasonlít ugyan az LMW glutenin génekéhez abban, hogy ugyanazon típusú TF kötőhelyek fordulnak elő, de a kötőhelyek száma és eloszlása lényegesen eltért. A HMW gluteninek esetében ugyanis egy olyan moduláris motívum eloszlást észleltünk, ahol jellemzően a hasonló típusú TF kötőhelyek tömörültek kisebb régiókba. A kötőhelyek száma azonban géntípusonként változott. Az LMW-GS esetében a MYB, bZIP és PBF kötőhelyek jellemzően egymás közelében helyezkednek el. Több PBF kötőhely is megtalálható ugyan -400 és -300 bp pozíciók között abban a régióban, ahol a HMW-GS CRM1 régiója található, de az LMW-GS promóterek esetében ezek közvetlen szomszédságában legtöbbször 2-3 bZIP kötőhely is előfordul. Hasonlóan, a HMW-GS promóter bZIP kötőhelyekben gazdag CRM3-as régiójának pozíciójában a LMW-GS promóterek szintén tartalmaznak bZIP kötőhelyeket, de azokat PBF kötőhelyek övezik. A HMW-GS átírása alacsony N szint mellett a bZIP kötő GCN4 motívumon keresztül gátolódik. Az LMW-GS esetében a N szabályozás egy TF komplexen keresztül valósul meg, ami magában foglalja a PBF-et (Kawakatsu és Takaiwa, 2010a). Az irodalmi adatok és az azonosított promóterek szerkezetbeli különbségei alapján feltételezhető, hogy a N szabályozás másképpen valósul meg a két glutenin géncsalád esetében. További karakterisztikus eltérés a két prolamin család között, hogy az LMW gluteninek promóterei transzkripciós kezdőponttól visszafelé 5-600 bp távolságra elvesztik konzerváltságukat, míg a HMW promóterek 1600-2000 bp-ig nagymértékű hasonlóságot mutatnak. A HMW-GS esetén a szövetspecifitást cisz szabályozó elemek által biztosított. Az LMW-GS szabályozásában feltételezhetően nagy szerepet játszanak olyan epigenetikai faktorok is, amely nagyban befolyásolják a szövetspecifitás mechanizmusát. Az LMW-GS szabályozási modellje ezért inkább egy finomhangolási logikát mutat be, míg a HMW-GS esetén egy teljes modell kerül bemutatásra.
5.4 NÖVÉNYSZÍNTŰ ÖSSZEFÜGGÉSEK A 12. ábra illusztrálja a HMW glutenin géneknek a környezeti hatásoktól való függését. Ezen vizsgálat kimutatta, hogy az x és y-típusú gének másképpen reagálnak a hőmérsékletre, illetve a megnövelt N mennyiségre. Az alaphelyzetben is erősen expresszáló Glu-1Bx7 tovább 80
erősödött a hőmérséklet emelkedésére, ám ezenfelül extra nitrogén már nem növelte azt tovább. A hőség tehát látszólag növelte a fehérjeszintézis forrásait. Érdekes azonban, hogy extra N hatására a magas hőmérsékleten felül Glu-1Dx5 és Glu-1Ax2 esetében az intenzitás tovább emelkedett. Ilyen körülmények között Glu-1Bx7 már nem emelkedett tovább, látszólag elérte a kapacitásának határát. A HMW glutenin fehérjék szintézise a várakozásoknak (Feller és mtsai., 2008) megfelelően tehát forrás függő. Magas hőmérséklet hatására a növény gyorsabban kiszárad, a levelekben hamarabb beindul a fehérjebontás, és az aminosavak koncentrációja gyorsabban emelkedik a fejlődő búzaszem szöveteiben. A hatás kvázi azonnali. A hozzáadott nitrogén esetén először a vegetatív szövetekben elő kell állítani az aminosavat és csak azután kerülhetnek a szemtermésbe. A levelek degradációja és a szemtelítődés összehangolása koordinált szabályozást feltételez, ahol a jelátvivők maguk az aminosavak lehetnek (Slimane és mtsai., 2013). Bernard és kollégái már beszámoltak arról, hogy a vegetatív szövetek kiszáradása szabályozott módon történik annak érdekében, hogy a kloroplasztisz és egyéb sejtalkotók bomlástermékei folyamatosan szállítódjanak a nyelő szövetekbe (Bernard és mtsai., 2008). Kalcium kapcsolt fehérjekinázok és kazeinkinázok rizs endospermiumában feldúsultak, ami szintén több szövet összehangolt szabályozását feltételezi (Xue és mtsai., 2012). Árpa esetén a cukorszint emelkedése indította el a jelátviteli kaszkádot, ami végül a tartalékfehérjék expressziójához vezetett (Borisjuk és mtsai., 2004). A HOSUT10 búzában genetikai módosítással javították a búzaszemben lévő cukor transzportot, ami pozitívan hatott a prolaminok expressziójára (Weichert és mtsai., 2010). A növények teljes életciklusában szükséges az N és C megfelelő egyensúlya. Cukor és a glutaminsav fontos intermedierei a szén- és nitrogén metabolizmusnak és több, mint valószínűen jelátvivő molekulaként is fontos szerepet töltenek be (Zheng, 2009). Az endospermium mindkét molekulára nézve nyelő (sink) szövet. A keményítő és a fehérjeszintézis ezeket a molekulákat kvázi kivonja az aktív anyagcseréből, ezáltal növelve azok vegetatív szövetbeli mobilizálását, ami egy összehangolt, növényszintű szabályozást mutat. A vizsgált prolamin gének promóterein a N jelátvitel leginkább negatív visszacsatolásként, azaz fékként vannak jelen. Ez arra enged következtetni, hogy a szén- illetve energiaforrás a szemtelítődés szűk keresztmetszete. Elégtelen C transzport esetén, csökken az
81
aminosavak beépülése a tartalékfehérjékbe annak érdekében, hogy fennmaradjon az ideális N/C arány az érés során.
5.5 NEMESÍTÉSI VONATKOZÁSOK Újszerű megközelítésünk és a célnak megfelelően fejlesztett számítástechnikai eszközeink lehetővé tették a HMW és LMW glutenin alegységfehérje gének promóter szerkezetének alapos tanulmányozását és moduláris szerkezetének leírását. (Juhász és mtsai., 2011; Makai és mtsai., 2013, 2014, 2015). A feltárt cisz szabályozó modulok motívum összetétele változott a glutenin gének típusa (x vagy y, illetve s, i vagy m) illetve kromoszómális elhelyezkedése szerint (A, B vagy D). A változások jól dokumentálható aktivitás különbségekkel jártak együtt. Az LMW-GS gének esetén a B1 régióban előforduló bZIP kötőhely lehetséges kapcsolata az alacsony aktivitással nem zárja ki, hogy az expresszió mértéke allélfüggő. Ezt támasztja alá a Glenlea és a Chinese Spring vonatkozásban említett MRC1 és MRC2 gének előfordulásában és expressziójában mutatkozó markáns különbségek is. A feltételezhetően homológ gének különböző alléljai eltérő mértékű aktivitást demonstráltak a két genotípusban. Ez eltér a HMW-GS esetében tapasztaltaktól, ahol ilyen jellegű allélfüggést nem mutattunk ki. A HMW-GS-ek esetén, a y-típusú gének alacsonyabb aktivitását jól tükrözi a promóter profilja, amely sok tekintetben eltér az x-típusú gének profiljától. Ez az eltérés végfelhasználói szempontból nem feltétlenül optimális, hiszen y-típusú HMW gluteninek magasabb aránya a lisztben javítja a tészta tulajdonságait (Anderson és Bekes, 2011; Blechl és mtsai., 2007; Butow és mtsai., 2003; León és mtsai., 2010; Oszvald és mtsai., 2011). Feltételezzük, hogy a különbséget a háziasítás okozta diverzitás csökkenés (domestication bottleneck) okozta (Dong és mtsai., 2013; Giles és Brown, 2006; Haudry és mtsai., 2007). Érdekes jelenség, hogy allélikus variancia alig jellemző a promóterekre, ami arra utal, hogy fontos szelekciós tényező lehet. Másrészről viszont továbbra is nyitva hagyja a kérdést, hogy mi befolyásolja a különböző genotípusok közti aktivitás eltérését. A kérdésre a jelenlegi adataink fényében egyetlen lehetséges választ találtunk. Eszerint a búza nemesítése során a vizsgált tartalékfehérje gének promótere nem vagy csak alig változtak. Ugyanakkor a velük kölcsönható transzkripciós faktorok aktivitása módosulhatott, és ily módon ronthatta vagy javíthatta a genotípusok fehérjetartalmát vagy összetételét. A PBF 82
promóternél általunk leírt és a SPA TF-ral korábban leírt (Ravel és mtsai., 2009) polimorfizmusok ebbe az irányba mutatnak. A Triticeae nemzettség csoporthoz tartozó HMW glutenin gének promóterei visszaigazolták feltevésünket. A szabályozó régiók nagyfokú konzerváltsága a búza rokonsági körén belül arra utal, hogy a promóter erőssége nehezen fokozható. Minden eltérés a tartalékfehérjék transzkripciós dinamikájában a kölcsönható TF aktivitásának illetve expresszió dinamikájának a függvénye. Ezt támasztják alá génexpressziós vizsgálataink eredményei is. A jellemzően eltérő sütőipari minőséggel bíró Glenlea és Chinese Spring genotípusok között a „Vezérlő” génprogram kinetikája markáns különbséget mutatott (15. ábra). Ezen eltérést részben magyarázza, hogy az 5A és 5B kromoszómákon található PBF gének promóterei, a bemutatott eredmények szerint jelentősen eltértek a vizsgált két genotípus között. Így a PBF gén promótere és további promóterek nemesítési programokba történő bevonása hozzájárulhat a nagyobb fehérjetartalommal és/vagy jobb minőséggel rendelkező genotípusok nemesítéséhez. Promóterre tervezett szelekciós markereket (Juhász és mtsai., 2003) már sikeresen használnak a nemesítésben. A filogenetikai elemzéssel sikerült betekintést nyernünk a HMW glutenin gének, és a vizsgált termesztett vagy vad rokon fajok evolúciós fejlődésébe (21. ábra). Az eredményeink alapján szerkesztett fa topológiája szerint az y-típusú promóterek kevésbé szerteágazóak, mint az xtípusúak. Több motívum is eltűnt az y-típusú promóterekből, melyek közül jó néhány a hibrid jellegű promóterekben még jelen volt. Ilyenek a CEREAL-boksz, NAC és a MYB TF kötőhelyek. Az intenzitás csökkenés és ezáltal a pszeudogénné válás felé vezető út egy jellemző példája a Glu-1Ay, amely promóter szakaszából a fentieken túl szinte a teljes CRM1-es szakasz hiányzik. A Glu-1Bx promóterén kevesebb számú bZIP kötőhely található, ami akár a N-jelátvitelhez való lazább kötődését is jelentheti. Ezt erősíti a tény, hogy N hozzáadására a Bx7 fehérjék mennyisége kisebb mértékben növekedett az Ax2 és Dx5 fehérjékhez mérten (12. ábra). Feltételezhető, hogy a kezdetben erős, intenzitásában az x-típusú génekhez közelítő, környezeti hatásoknak való kitettségében pedig az y-típushoz hasonlító promóterek a duplikációt követően szétváltak. Az x-típus megerősödött, valamelyest függetlenné vált a környezeti hatások jelátviteli csatornáitól, míg a y-típusú promóterek megőrizték környezeti hatásoknak való kitettségüket, és játsszák a „ballaszt” szerepét az N/C egyensúly kényes fenntartásában. Mindez összefügg azzal a nézettel, hogy a génduplikációt gyakran az 83
expressziós mintázatok eltérése és/vagy funkciók eltolódása követi (Li és mtsai., 2005). Az ytípusú gének kisebb expressziós intenzitása és eltérő válasza a környezeti hatásokra ilyen irányba mutat. A kalkulált diverzitás értékek alapján az alacsony intenzitású, y-típusú gének nagyobb változatosságot mutattak a régebb óta termelésbe vont genomok (A, B) között, míg a később termelésbe vont (D) vagy vad (S) genomok esetén ennek fordítottja igaz (22. ábra). Az A és B genom alkotta tetraploid fajokat jóval korábban termesztésbe vonták, hosszabban hatott a nemesítési szelekció az x promóter erősségére, így azok sokszínűsége korlátozva volt. Ugyanitt az y-típusú gén promótere gyengült, és ez a gyengülés értelemszerűen sokféle módon történhetett, növelve a sokszínűségét. A S genom viszont vad fajokban fordul elő, ahol az xtípusú promóterek diverzitása a nagyobb. Nemesítési szelekció hiányában ez csak úgy magyarázható, ha feltételezzük, hogy ez a régebbi kópia. A tetraploid fajok szemterméseiből készült liszt kevésbé alkalmas kelesztett kenyér készítésére. A D genommal kiegészült hexaploid búza ugyanakkor kiváló kenyérbúza. A D genom révén kialakuló HMW glutenin polimer a korábbi 2+1 aktív gén helyett már 3+2 aktív gént tartalmazott. Ezáltal a kialakuló glutenin polimer mérete, illetve a tészta erősséggel szoros korrelációt mutató extra nagy méretű oldhatatlan polimer frakció mennyisége szignifikánsan megemelkedett a tetraploid búzához képest. Ehhez azonban erősen hozzájárulhatott az a tény is, hogy a hexaploid búzában az y-típusú HMW glutenin gének közül a Glu-1Dy gén expressziós aktivitása a legnagyobb, ami javította az x/y típusok arányát fehérje szinten. Az egyszeri A+B ploidizáció elméletét valamelyest gyengíti az a tény, hogy az A és B lókuszok x és y génjeinek ágai szerteágazóak (21. ábra). A Glu-1By esetén teljesen szét is válnak, amely akár arra is visszavezethető, hogy az A+B ploidizáció két párhuzamos esetben megtörténhetett. Bár a jelenlegi felfogás szerint egy tetraploid őst feltételeznek, ennek ellenkezőjét eleddig nem tudták kizárni (Matsuoka, 2011). Mindezzel szintén összefüggésbe hozható a PBF TF promóternél kapott eredményünk, miszerint a Chinese Spring és Glenlea genotípusoknál a 5A és 5B lókuszon található PBF gén promótere jelentősen eltért, míg az 5D lókuszon azonosak voltak.
84
5.6 KONKLÚZIÓ Jelen dolgozat eredményei statisztikai elemzések alapján születtek. A rendelkezésre álló minták ugyan nagyszámúak voltak, de nem egyformán képviselték az azonosított típusokat, altípusokat. Ugyanakkor a feltárt modellek több egymástól független statisztikai, összehasonlító és kísérletes vizsgálat eredményei. Eredményeink először arra utaltak, hogy a LMW-GS gének szabályozása két utas. Ezzel tulajdonképpen megegyező eredményt kaptunk a HMW-GS esetében. Az LMW-GS génekkel kiegészített fókuszált hálózatelemzések eredményei azonban rámutattak arra, hogy ez a kétszer két út nem négy hanem csupán kettő. Azaz a két kimutatott kis szabályozókör az LMW és HMW gluteninek esetén átfed, melyet egyrészt igazol az LMW glutenin gének a Glu1x génprogrammal közös szabályozási programban expresszálódnak, másrészt pedig számításaink alapján feltételezhető, hogy a két géncsalád expressziós szabályozásában lényeges szerepet játszó MYB, bZIP és DOF transzkripciós faktorok ugyanazok. Mindkét géncsalád alapvetően két expressziós dinamikát követ: egy csúcsosodó jellegűt és egy lassan, de folyamatosan növekedő dinamikát követőt. Habár promóter motívum összetételük csak részben és nagyvonalakban hasonlít, a kulcsfontosságú, vezérlő motívumok (PBF, SPA, MYB, CBF) azonosak. A motívumok mintázata, eloszlása alapján azonban a TF-ok (ha azonosak is) meglehetősen eltérő mechanizmusok által fejtik ki hatásukat. LMW gluteninek esetén a kötőhelyek TF komplexek lineáris felépülésről tanúskodnak. HMW gluteninek esetén erős, indirekt bizonyítékok jelzik egy térbeni konformáció kialakulását mind a szövetspecifitás, mind a pozitív vezérlés megvalósuláshoz. A HMW-GS gének promótereinek nagyfokú konzerváltsága, ami a Triticeae nemzettség csoport más fajaira is kiterjed, azt sugallja, hogy a genotípusok közötti aktivitásbeli eltérést a transzkripciós faktorok eltérő dinamikája befolyásolja. Ezeken belül is a „Vezérlő” programban résztvevő TF-oknak van kiemelkedő szerepük. Ennek igazolásaként egy a vezérlő programban kiemelt szerepet játszó TF, a PBF promóterét vizsgáltuk meg két genotípusban. A PBF-5A és 5B gének promóterei jelentősen eltérnek egymástól. Az különbségek kellően megalapozzák a Chinese Spring és Glenlea genotípusok „Vezérlő” génprogramjának időzítési különbségét. Eredményeink alapján a búza fehérje tartalmának kialakulásában szignifikáns szerepet játszó HMW és LMW glutenin gének transzkripciós szabályozásában tapasztalt jellemzők alapján a 85
HMW glutenin génekre történő szelekció helyett az alábbi nemesítési stratégiát javasoljuk: (i) Vadfajok keresztezésénél célszerű lenne az y típusú HMW glutenin gének promótereit közelíteni az x-típusú promóterhez vagy legalább vadtípusokban talált a hibrid promóterekhez. (ii) Szelekciós marker tervezésnél javasolt a PBF TF promóterét illetve általánosságban véve a szabályozásban kulcsszerepet játszó TF-ok promótereit használni, mint hozammal összefüggő markert.
86
6 ÖSSZEFOGLALÁS A kutatás eredményei alapján feltételezzük, hogy a promóter szakaszok polimorfizmusai felelősek a homeológ (A, B és D genom) és paralóg (x és y típusú) HMW glutenin gének között megfigyelt aktivitás különbségekért. Ugyanakkor ugyanazon gén más-más alléljának expressziójának
különbsége
nem
magyarázható
a
promóterek
eltérő
motívum
kompozíciójával, mivel nincs kimutatható eltérés. Eredményeink tükrében az látszik, hogy a HMW-GS gének Chinese Spring és Glenlea genotípusok között előforduló transzkripciós aktivitásának
különbségei
visszavezethetők
azok
promóter
régióival
kölcsönható
transzkripciós faktorok aktivitására. A két glutenin alegységfehérje promótere hasonlít abban, hogy ugyanazon típusú TF kötőhelyek fordultak elő, de a kötőhelyek száma és eloszlása lényegesen eltért. A HMW gluteninek esetében ugyanis egy olyan moduláris motívum eloszlást észleltünk, ahol jellemzően a hasonló típusú TF kötőhelyek tömörültek kisebb régiókba. A kötőhelyek száma azonban génenként változott. További karakterisztikus eltérés a két glutenin között, hogy az LMW gluteninek promóterei transzkripciós kezdőponttól visszafelé 5-600 bp távolságra elvesztik konzerváltságukat, míg a HMW promóterek 1600-2000 bp-ig nagymértékű hasonlóságot mutatnak az egyes géntípusokban is. A promóter profilokhoz kapcsolt expressziós adatok alapján megszerkesztettük a fejlődő endospermium ko-expressziós hálózatát, amely alapján hat kis szabályozókört azonosítottunk. Kettő az x és az y-típusú HMWGS gének saját szabályozási körét jelölte, egy pedig genotípusonként eltérő dinamikát követő ún. „Vezérlő” kört. Az LMW glutenin gének esetében kimutattuk, hogy transzkripciójuk alapvetően két dinamikát követ. Az s- és az i-típusú egy folyamatosan növekvő expressziót mutatott, míg az m-típusú LMW gluteninek expressziós görbéje csúcsosodó jellegű volt. Nem kizárható, hogy a két-két szabályozói kör átfed vagy azonos. A teljes Triticeae nemzettség csoport HMW-GS gének promóter szakaszaink összevetése bemutatta, hogy a promóter szerkezet konzerváltsága nem elhanyagolható mértékig a vad búzafajokban is fennáll. Az elemzés rámutatott a promóterek egy lehetséges evolúciójára, mely szerint a duplikációt követően az x és y-típusú HMW-GS gének szabályozási kinetikája és a szerepvállalása sztöchiometriai egyensúly fenntartásában valamelyest eltolódtak. 87
SUMMARY Our analysis demonstrated that the polymorphisms of the promoter regions may be responsible for activity differences between the homeolog and paralog glutenin genes. However there is no significant difference between the promoters of different alleles of the same gene across genotypes. Therefore the varying expression dynamics of interacting TFs across genotypes is likely to be the primary contributor of the allelic variation of Glu-1 gene expressions. The promoters of two gluten subunits are comparable in terms of the quality of the TF binding sites, but their numbers and distribution are considerably different. Our analyses revealed that the promoters of Glu-1 genes are divided into cis-regulatory modules that are locally overrepresented by binding sites belonging to unique but distinct transcription factor (TF) families. This structure is in sharp contrast with the diverse composition of the conserved noncoding regions of Glu-3 genes. Further difference between the two glutenin genes that LMWGS lost the conservation of its promoters at 5-600 bp distance from the transcription start site while HMW-GS presented highly conserved patterns until 1600-2000 bp. Combining various expression data and the motif distribution data, a co-expressional network was built. The network helped to identify six transcriptional gene programs in the endosperm including two related to Glu-1x and Glu-1y genes. While most gene programs could be related to a developmental phase, the dynamics of the so called Enhancer program presented variance between the genotypes. In case of the LMW glutenin, we demonstrated that they follow two distinct transcription dynamics: the s and i-type genes follow a gradually increasing activity, while the m-type genes presented a peak during maturation. The two regulatory paths of LMW and the two regulatory paths of HMW-GS may well be overlapping. Comparing the promoters of HMW-GS across the Triticeae tribe, we found that the level of conservation is equally high in the wild relatives of the hexaploid wheat. The evolutionary changes in the promoter profiles suggest that after the duplication event of the x and y-type HMW-GS, their regulatory logic and their role in maintaining the stoichiometric equilibrium may have shifted apart.
88
IRODALOMJEGYZÉK Abe, H., Yamaguchi-Shinozaki, K., Urao, T., Iwasaki, T., Hosokawa, D., és Shinozaki, K. (1997). Role of arabidopsis MYC and MYB homologs in drought- and abscisic acid-regulated gene expression. Plant Cell 9, 1859–1868. Abe, H., Urao, T., Ito, T., Seki, M., Shinozaki, K., és Yamaguchi-Shinozaki, K. (2003). Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell 15, 63–78. Agarwal, P., Kapoor, S., és Tyagi, A.K. (2011). Transcription factors regulating the progression of monocot and dicot seed development. Bioessays 33, 189–202. Albani, D., és Robert, L.S. (1995). Cloning and characterization of a Brassica napus gene encoding a homologue of the B subunit of a heteromeric CCAAT-binding factor. Gene 167, 209–213. Albani, D., Hammond-Kosack, M.C., Smith, C., Conlan, S., Colot, V., Holdsworth, M., és Bevan, M.W. (1997). The wheat transcriptional activator SPA: a seed-specific bZIP protein that recognizes the GCN4-like motif in the bifactorial endosperm box of prolamin genes. Plant Cell 9, 171–184. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., és Lipman, D.J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389. Anderson, O.D., és Bekes, F. (2011). Incorporation of high-molecular-weight glutenin subunits into doughs using 2 gram mixograph and extensigraphs. J. Cereal Sci. 54, 288–295. Anderson, O.D., és Greene, F.C. (1989). The characterization and comparative analysis of high-molecular-weight glutenin genes from genomes A and B of a hexaploid bread wheat. Theor. Appl. Genet. 77. Anderson, O.D., Abraham-Pierce, F. a., és Tam, A. (1998). Conservation in wheat highmolecular-weight glutenin gene promoter sequences: comparisons among loci and among alleles of the GLU-B1-1 locus. TAG Theor. Appl. Genet. 96, 568–576. Anderson, O.D., Larka, L., Christoffers, M.J., Mccue, K.F., és Gustafson, J.P. (2002). Comparison of orthologous and paralogous DNA flanking the wheat high molecular weight glutenin genes : sequence conservation and divergence , transposon distribution , and matrix-attachment regions. Genome 380, 367–380. Anonim (2005). The story of wheat: Ears of plenty. Econ.
89
Barneix, A.J. (2007). Physiology and biochemistry of source-regulated protein accumulation in the wheat grain. J. Plant Physiol. 164, 581–590. Bartels, D., és Thompson, R.D. (1986). Synthesis of messenger-RNAs coding for abundant endosperm proteins during wheat grain development. Plant Sci. 46, 117–125. Bastian, M., Heymann, S., és Jacomy, M. (2009). Gephi: An Open Source Software for Exploring and Manipulating Networks. Békés, F., Kemény, S., és Morell, M. (2006). An integrated approach to predicting endproduct quality of wheat. Eur. J. Agron. 25, 155–162. Bennett, M.D., Smith, J.B., és Barclay, I. (1975). Early Seed Development in the Triticeae. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 272, 199–227. Berendzen, K.W., Weiste, C., Wanke, D., Kilian, J., Harter, K., és Dröge-Laser, W. (2012). Bioinformatic cis-element analyses performed in Arabidopsis and rice disclose bZIP- and MYB-related binding sites as potential AuxRE-coupling elements in auxin-mediated transcription. BMC Plant Biol. 12, 125. Bernard, S.M., Møller, A.L.B., Dionisio, G., Kichey, T., Jahn, T.P., Dubois, F., Baudo, M., Lopes, M.S., Tercé-Laforgue, T., Foyer, C.H., és mtsai. (2008). Gene expression, cellular localisation and function of glutamine synthetase isozymes in wheat (Triticum aestivum L.). Plant Mol. Biol. 67, 89–105. Birchler, J. a, és Veitia, R. a (2012). Gene balance hypothesis: connecting issues of dosage sensitivity across biological disciplines. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 14746–14753. Blackwell, T.K., Bowerman, B., Priess, J.R., és Weintraub, H. (1994). Formation of a monomeric DNA binding domain by Skn-1 bZIP and homeodomain elements. Science 266, 621–628. Blechl, A., Lin, J., Nguyen, S., Chan, R., Anderson, O.D., és Dupont, F.M. (2007). Transgenic wheats with elevated levels of Dx5 and/or Dy10 high-molecular-weight glutenin subunits yield doughs with increased mixing strength and tolerance. J. Cereal Sci. 45, 172–183. Blondel, V.D., Guillaume, J.-L., Lambiotte, R., és Lefebvre, E. (2008). Fast unfolding of communities in large networks. J. Stat. Mech. Theory Exp. 2008, P10008. Bolouri, H. (2014). Modeling genomic regulatory networks with big data. Trends Genet. 30, 182–191. Borisjuk, L., Rolletschek, H., Radchuk, R., Weschke, W., Wobus, U., és Weber, H. (2004). Seed development and differentiation: a role for metabolic regulation. Plant Biol. (Stuttg). 6, 375– 386. Brandes, U. (2001). A faster algorithm for betweenness centrality*. J. Math. Sociol. 25, 163– 177. 90
Bucher, P. (1990). Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter elements derived from 502 unrelated promoter sequences. J. Mol. Biol. 212, 563–578. Butow, B.., Tatham, A.., Savage, A.W.., Gilbert, S.., Shewry, P.., Solomon, R.., és Békés, F. (2003). Creating a balance—the incorporation of a HMW glutenin subunit into transgenic wheat lines. J. Cereal Sci. 38, 181–187. Charmet, G. (2011). Wheat domestication: lessons for the future. C. R. Biol. 334, 212–220. Chen, R., Ni, Z., Nie, X., Qin, Y., Dong, G., és Sun, Q. (2005). Isolation and characterization of genes encoding Myb transcription factor in wheat ( L.). Plant Sci. 169, 1146–1154. Ciaffi, M., Lafiandra, D., Porceddu, E., és Benedettelli, S. (1993). Storage-protein variation in wild emmer wheat (Triticum turgidum ssp.dicoccoides) from Jordan and Turkey. I. Electrophoretic characterization of genotypes. Theor. Appl. Genet. 86, 474–480. Ciaffi, M., Dominici, L., és Lafiandra, D. (1998). High molecular weight glutenin subunit variation in wild and cultivated einkorn wheats (Triticum spp., Poaceae). Plant Syst. Evol. 209, 123–137. Colot, V., Robert, L., és Kavanagh, T. (1987). Localization of sequences in wheat endosperm protein genes which confer tissue-specific expression in tobacco. EMBO J. 6, 3559–3564. Conlan, R., Hammond-Kosack, M., és Bevan, M. (1999). Transcription activation mediated by the bZIP factor SPA on the endosperm box is modulated by ESBF-1 in vitro. Plant J. 19, 173– 181. Dai, Z., Plessis, A., Vincent, J., Duchateau, N., Besson, A., Dardevet, M., Prodhomme, D., Gibon, Y., Hilbert, G., Pailloux, M., és mtsai. (2015). Transcriptional and metabolic alternations rebalance wheat grain storage protein accumulation under variable nitrogen and sulfur supply. Plant J. 83, 326–343. Dash, S., Van Hemert, J., Hong, L., Wise, R.P., és Dickerson, J.A. (2012). PLEXdb: gene expression resources for plants and plant pathogens. Nucleic Acids Res. 40, D1194–D1201. Davidson, E.H. (2006). The regulatory genome: gene regulatory networks in development and evolution. Davis, K.R., Cain, R.F., Peters, L.J., Le Tourneau, D., és McGinnis J (1981). Evaluation of the nutrient composition of wheat. II. proximate analysis, thiamin, riboflavin, niacin, and pyridoxine. Cereal Chem. 58, 116–120. Diaz, I., Vicente-Carbajosa, J., Abraham, Z., Martínez, M., Isabel-La Moneda, I., és Carbonero, P. (2002). The GAMYB protein from barley interacts with the DOF transcription factor BPBF and activates endosperm-specific genes during seed development. Plant J. 29, 453–464.
91
Diaz, I., Martinez, M., Isabel-LaMoneda, I., Rubio-Somoza, I., és Carbonero, P. (2005). The DOF protein, SAD, interacts with GAMYB in plant nuclei and activates transcription of endosperm-specific genes during barley seed development. Plant J. 42, 652–662. Doebley, J., Gaut, B., és Smith, B. (2006). The molecular genetics of crop domestication. Cell 1309–1321. Dong, G., Ni, Z., Yao, Y., Nie, X., és Sun, Q. (2007). Wheat Dof transcription factor WPBF interacts with TaQM and activates transcription of an alpha-gliadin gene during wheat seed development. Plant Mol. Biol. 63, 73–84. Dong, Z., Yang, Y., Li, Y., Zhang, K., Lou, H., An, X., Dong, L., Gu, Y.Q., Anderson, O.D., Liu, X., és mtsai. (2013). Haplotype variation of Glu-D1 locus and the origin of Glu-D1d allele conferring superior end-use qualities in common wheat. PLoS One 8, e74859. Dorn, A., Durand, B., Marfing, C., Le Meur, M., Benoist, C., és Mathis, D. (1987). Conserved major histocompatibility complex class II boxes--X and Y--are transcriptional control elements and specifically bind nuclear proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 6249–6253. Du, H., Zhang, L., Liu, L., Tang, X.-F., Yang, W.-J., Wu, Y.-M., Huang, Y.-B., és Tang, Y.-X. (2009). Biochemical and molecular characterization of plant MYB transcription factor family. Biochem. 74, 1–11. Dubcovsky, J., és Dvorak, J. (2007). Genome plasticity a key factor in the success of polyploid wheat under domestication. Science 316, 1862–1866. Dubos, C., Stracke, R., Grotewold, E., Weisshaar, B., Martin, C., és Lepiniec, L. (2010). MYB transcription factors in Arabidopsis. Trends Plant Sci. 15, 573–581. Duffus, C.M., és Cochrane, M.P. (1992). Grain structure and composition. In Barley: Genetics, Biochemistry, Molecular Biology and Biotechnology, P.R. Shewry, szerk. (CAB International, Wallingford, UK), o. 291–317. Dupont, F.M. (2008). Metabolic pathways of the wheat (Triticum aestivum) endosperm amyloplast revealed by proteomics. BMC Plant Biol. 8, 39. Dupont, F.M., és Altenbach, S.B. (2003). Molecular and biochemical impacts of environmental factors on wheat grain development and protein synthesis. Cell 38, 133–146. DuPont, F.M., Hurkman, W.J., Vensel, W.H., Chan, R., Lopez, R., Tanaka, C.K., és Altenbach, S.B. (2006). Differential accumulation of sulfur-rich and sulfur-poor wheat flour proteins is affected by temperature and mineral nutrition during grain development. J. Cereal Sci. 44, 101–112. Dupont, F.M., Vensel, W.H., Tanaka, C.K., Hurkman, W.J., és Altenbach, S.B. (2011). Deciphering the complexities of the wheat flour proteome using quantitative twodimensional electrophoresis, three proteases and tandem mass spectrometry. Proteome Sci. 9, 10. 92
Edwards, D., Murray, J. a, és Smith, a G. (1998). Multiple genes encoding the conserved CCAAT-box transcription factor complex are expressed in Arabidopsis. Plant Physiol. 117, 1015–1022. Fauteux, F., és Strömvik, M. V (2009). Seed storage protein gene promoters contain conserved DNA motifs in Brassicaceae, Fabaceae and Poaceae. BMC Plant Biol. 9, 126. Feller, U., Anders, I., és Mae, T. (2008). Rubiscolytics: fate of Rubisco after its enzymatic function in a cell is terminated. J. Exp. Bot. 59, 1615–1624. Forde, B.G., Heyworth, A., Pywell, J., Kreis, M., és B.G.Forde, A.Heyworth, J.P.A.M.K. (1985). Nucleotide sequence of a B1 hordein gene and the identification of possible upstream regulatory elements in endosperm storage protein genes from barley, wheat and maize. Nucleic Acids Res. 13, D1–D4. Furtado, A., Henry, R.J., és Takaiwa, F. (2008). Comparison of promoters in transgenic rice. Plant Biotechnol. J. 6, 679–693. Furtado, A., Henry, R.J., és Pellegrineschi, A. (2009). Analysis of promoters in transgenic barley and wheat. Plant Biotechnol. J. 7, 240–253. Gianibelli, M.C., Wrigley, C.W., és MacRitchie, F. (2002). Polymorphism of Low Mr Glutenin Subunits in Triticum tauschii. J. Cereal Sci. 35, 277–286. Giles, R.J., és Brown, T.A. (2006). GluDy allele variations in Aegilops tauschii and Triticum aestivum: implications for the origins of hexaploid wheats. Theor. Appl. Genet. 112, 1563– 1572. Gu, Y.Q., Coleman-derr, D., Kong, X., és Anderson, O.D. (2004). Rapid genome evolution revealed by comparative sequence analysis of orthologous regions from four triticeae genomes. Plant Physiol. 135, 459–470. Gu, Y.Q., Salse, J., Coleman-Derr, D., Dupin, A., Crossman, C., Lazo, G.R., Huo, N., Belcram, H., Ravel, C., Charmet, G., és mtsai. (2006). Types and rates of sequence evolution at the highmolecular-weight glutenin locus in hexaploid wheat and its ancestral genomes. Genetics 174, 1493–1504. Gu, Y.Q., Wanjugi, H., Coleman-Derr, D., Kong, X., és Anderson, O.D. (2010). Conserved globulin gene across eight grass genomes identify fundamental units of the loci encoding seed storage proteins. Funct. Integr. Genomics 10, 111–122. Guillaumie, S., Charmet, G., Linossier, L., Torney, V., Robert, N., és Ravel, C. (2004). Colocation between a gene encoding the bZip factor SPA and an eQTL for a high-molecularweight glutenin subunit in wheat (Triticum aestivum). Genome 47, 705–713. Gupta, R.B., és Shepherd, K.W. (1990a). Two-step one-dimensional SDS-PAGE analysis of LMW subunits of glutelin : 1. Variation and genetic control of the subunits in hexaploid wheats. Theor. Appl. Genet. 80, 65–74. 93
Gupta, R.B., és Shepherd, K.W. (1990b). Two-step one-dimensional SDS-PAGE analysis of LMW subunits of glutelin : 2. Genetic control of the subunits in species related to wheat. Theor. Appl. Genet. 80, 183–187. Gutiérrez, R., Quiroz-Figueroa, F., és Vázquez-Ramos, J.M. (2005). Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant Cell Physiol. 46, 166–173. Halford, N., Forde, J., Shewry, P., és Kreis, M. (1989). Functional analysis of the upstream regions of a silent and an expressed member of a family of wheat seed protein genes in transgenic tobacco. Plant Sci. 62, 207–216. Halford, N.G., Field, J.M., Blair, H., Urwin, P., Moore, K., Robert, L., Thompson, R., Flavell, R.B., Tatham, A.S., és Shewry, P.R. (1992). Analysis of HMW glutenin subunits encoded by chromosome 1A of bread wheat (Triticum aestivum L.) indicates quantitative effects on grain quality. Theor. Appl. Genet. 83. Hammond-Kosack, M. (1993). In vivo footprinting of a low molecular weight glutenin gene (LMWG-1D1) in wheat endosperm. EMBO … 12, 545–554. Harlan, J.R. (1992). Crops & man (American Society of Agronomy). Harlan, J., Wet, J. De, és Price, E. (1973). Comparative evolution of cereals. Evolution (N. Y). 27, 311–325. Hartings, H., Lazzaroni, N., Marsan, P., Aragay, A., Thompson, R., Salamini, F., Difonzo, N., Palau, J., és Motto, M. (1990). The b-32 protein from maize endosperm – characterization of genomic sequences encoding 2 alternative central domains. Plant Mol. Biol. 14, 1031–1040. Hatsugai, N., Kuroyanagi, M., Yamada, K., Meshi, T., Tsuda, S., Kondo, M., Nishimura, M., és Hara-Nishimura, I. (2004). A plant vacuolar protease, VPE, mediates virus-induced hypersensitive cell death. Science 305, 855–858. Haudry, A., Cenci, A., Ravel, C., Bataillon, T., Brunel, D., Poncet, C., Hochu, I., Poirier, S., Santoni, S., Glémin, S., és mtsai. (2007). Grinding up wheat: a massive loss of nucleotide diversity since domestication. Mol. Biol. Evol. 24, 1506–1517. Higo, K., Ugawa, Y., Iwamoto, M., és Korenaga, T. (1999). Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999. Nucleic Acids Res. 27, 297–300. De Hoon, M.J.L., Imoto, S., Nolan, J., és Miyano, S. (2004). Open source clustering software. Bioinformatics 20, 1453–1454. Hurkman, W.J., Tanaka, C.K., Vensel, W.H., Thilmony, R., és Altenbach, S.B. (2013). Comparative proteomic analysis of the effect of temperature and fertilizer on gliadin and glutenin accumulation in the developing endosperm and flour from Triticum aestivum L. cv. Butte 86. Proteome Sci. 11, 8. 94
Ikeda, T.M., Nagamine, T., Fukuoka, H., és Yano, H. (2002). Identification of new lowmolecular-weight glutenin subunit genes in wheat. Theor. Appl. Genet. 104, 680–687. Izawa, T., Foster, R., és Chua, N.H. (1993). Plant bZIP Protein DNA Binding Specificity. J. Mol. Biol. 230, 1131–1144. Jiang, Q.-T., Wei, Y.-M., Wang, F., Wang, J.-R., Yan, Z.-H., és Zheng, Y.-L. (2009). Characterization and comparative analysis of HMW glutenin 1Ay alleles with differential expressions. BMC Plant Biol. 9, 16. Jiang, Q.-T., Ma, J., Wei, Y.-M., Liu, Y.-X., Lan, X.-J., Dai, S.-F., Lu, Z.-X., Zhao, S., Zhao, Q.-Z., és Zheng, Y.-L. (2012). Novel variants of HMW glutenin subunits from Aegilops section Sitopsis species in relation to evolution and wheat breeding. BMC Plant Biol. 12, 73. Juhasz, A., Tamas, L., Karsai, I., Vida, G., Lang, L., és Bedo, Z. (2001). Identification, cloning and characterisation of a HMW-glutenin gene from an old Hungarian wheat variety, Bankuti 1201. Euphytica 119, 75–79. Juhász, A., és Gianibelli, M.C. (2004). Information, hidden in the low-molecular-weight glutenin gene sequences. In the 8th Gluten Workshop, o. 62–65. Juhász, A., Gárdonyi, M., Tamás, L., és Bedö, Z. (2003). Characterisation of the promoter region of Glu-1 Bx7 gene from overexpressing lines of an old Hungarian wheat variety. In Proceedings of the 10th International wheat genetics symposium, o. 1348–1350. Juhász, A., Makai, S., Sebestyén, E., Tamas, L., és Balazs, E. (2011). Role of conserved noncoding regulatory elements in LMW-glutenin gene expression. PLoS One 6. Kasarda, D.D., Tao, H.P., Evans, P.K., Adalsteins, A.E., és Yuen, S.W. (1988). Sequencing of Protein from a Single Spot of a 2-D Gel Pattern: N-Terminal Sequence of a Major Wheat LMW-Glutenin Subunit. J. Exp. Bot. 39, 899–906. Kawakatsu, T., és Takaiwa, F. (2010a). Cereal seed storage protein synthesis: fundamental processes for recombinant protein production in cereal grains. Plant Biotechnol. J. 2008, 1– 15. Kawakatsu, T., és Takaiwa, F. (2010b). Differences in transcriptional regulatory mechanisms functioning for free lysine content and seed storage protein accumulation in rice grain. Plant Cell Physiol. 51, 1964–1974. Kim, E.H., Kim, Y.S., Park, S.-H., Koo, Y.J., Choi, Y. Do, Chung, Y.-Y., Lee, I.-J., és Kim, J.-K. (2009). Methyl jasmonate reduces grain yield by mediating stress signals to alter spikelet development in rice. Plant Physiol. 149, 1751–1760. Kong, X.-Y., Gu, Y.Q., You, F.M., Dubcovsky, J., és Anderson, O.D. (2004). Dynamics of the evolution of orthologous and paralogous portions of a complex locus region in two genomes of allopolyploid wheat. Plant Mol. Biol. 54, 55–69. 95
Kornitzer, D., Raboy, B., Kulka, R.G., és Fink, G.R. (1994). Regulated degradation of the transcription factor Gcn4. EMBO J. 13, 6021–6030. Kowles, R. V, és Phillips, R.L. (1985). DNA amplification patterns in maize endosperm nuclei during kernel development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 7010–7014. Kreis, M., Forde, B.G.G., Rahman, S., Miflin, B.J.J., és Shewry, P.R.R. (1985). Molecular evolution of the seed storage proteins of barley, rye and wheat. J. Mol. Biol. 183, 499–502. Kridl, J., Vieira, J., Rubenstein, I., és Messing, J. (1984). Nucleotide-sequence analysis of a zein genomic clone with a short open reading frame. Gene 28, 113–118. Lafiandra, D., Masci, S., és D’Ovidio, R. (2004). The Gluten Proteins (Royal Society of Chemistry). Laloum, T., De Mita, S., Gamas, P., Baudin, M., és Niebel, A. (2013). CCAAT-box binding transcription factors in plants: Y so many? Trends Plant Sci. 18, 157–166. Lee, Y.-K., Bekes, F., Gupta, R., Appels, R., és Morell, M.K. (1999a). The low-molecular-weight glutenin subunit proteins of primitive wheats. I. Variation in A-genome species. TAG Theor. Appl. Genet. 98, 119–125. Lee, Y.-K., Ciaffi, M., Appels, R., és Morell, M.K. (1999b). The low-molecular-weight glutenin subunit proteins of primitive wheats. II. The genes from A-genome species. TAG Theor. Appl. Genet. 98, 126–134. León, E., Aouni, R., Piston, F., Rodríguez-Quijano, M., Shewry, P.R., Martín, A., és Barro, F. (2010). Stacking HMW-GS transgenes in bread wheat: Combining subunit 1Dy10 gives improved mixing properties and dough functionality. J. Cereal Sci. 51, 13–20. Lescot, M., Déhais, P., Thijs, G., Marchal, K., Moreau, Y., Van de Peer, Y., Rouzé, P., és Rombauts, S. (2002). PlantCARE, a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences. Nucleic Acids Res. 30, 325–327. Lew, E.J.-L., Kuzmizky, D.., és Kasarda, D.D. (1992). Characterization of Low Molecular Weight Glutenin Subunits by Reversed-Phase High- Performance Liquid Chromatography, Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, and N-Terminal Amino Acid Sequencing. Cereal Chem. 69, 508–515. Li, W.-H., Yang, J., és Gu, X. (2005). Expression divergence between duplicate genes. Trends Genet. 21, 602–607. Locascio, A., Roig-Villanova, I., Bernardi, J., és Varotto, S. (2014). Current perspectives on the hormonal control of seed development in Arabidopsis and maize: a focus on auxin. Front. Plant Sci. 5, 412.
96
Makai, S., Juhász, A., Balázs, E., és Tamás, L. (2011). A simple and efficient way to in silico study expression of highly similar genes highly. In 1st Congress of Cereal Biotechnology and Breeding,. Makai, S., He, G.Y., Tamas, L., és Juhász, A. (2012). Profiling Ta HMW-GS promoter regions. In Poster at Gluten Workshop, Beijing,. Makai, S., Tamás, L., és Juhász, A. (2013). The Music of HMW Glutenins. In 12th International Wheat Genetics Symposium,. Makai, S., Tamas, L., és Juhasz, A. (2014). Distinct regulatory modules identified in the promoters of wheat Glu-1 genes suggest different regulatory mechanisms (Cold Spring Harbor Labs Journals). Makai, S., Éva, C., Tamás, L., és Juhász, A. (2015). Multiple elements controlling the expression of wheat high molecular weight glutenin paralogs. Funct. Integr. Genomics. Mantovani, R. (1998). A survey of 178 NF-Y binding CCAAT boxes. Nucleic Acids Res. 26, 1135–1143. Mantovani, R. (1999). The molecular biology of the CCAAT-binding factor NF-Y. Gene 239, 15–27. Margiotta, B., Urbano, M., Colaprico, G., Johansson, E., Buonocore, F., D’Ovidio, R., és Lafiandra, D. (1996). Detection of y-type Subunit at theGlu-A1Locus in Some Swedish Bread Wheat Lines. J. Cereal Sci. 23, 203–211. Marzin, S., Mihaly, R., Pauk, J., és Schweizer, P. (2008). A transient assay system for the assessment of cell-autonomous gene function in dehydration-stressed barley. J. Exp. Bot. 59, 3359–3369. Masci, S., Lew, E.J.L., Lafiandra, D., Porceddu, E., és Kasarda, D.D. (1995). Characterization of low molecular weight glutenin subunits by reversed-phase high-performance liquid chromatography, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide. Cereal Chem. 72, 100–104. Matsuoka, Y. (2011). Evolution of polyploid triticum wheats under cultivation: the role of domestication, natural hybridization and allopolyploid speciation in their diversification. Plant Cell Physiol. 52, 750–764. Mena, M., Vicente-Carbajosa, J., Schmidt, R.J., és Carbonero, P. (1998). An endospermspecific DOF protein from barley, highly conserved in wheat, binds to and activates transcription from the prolamin-box of a native B-hordein promoter in barley endosperm. Plant J. 16, 53–62. Mészáros, K., Éva, C., Kiss, T., Bányai, J., Kiss, E., Téglás, F., Láng, L., Karsai, I., és Tamás, L. (2015). Generating Marker-Free Transgenic Wheat Using Minimal Gene Cassette and ColdInducible Cre/Lox System. Plant Mol. Biol. Report. 33, 1221–1231. 97
Middleton, A.M., Farcot, E., Owen, M.R., és Vernoux, T. (2012). Modeling Regulatory Networks to Understand Plant Development: Small Is Beautiful. Plant Cell 24, 3876–3891. Müller, M., és Knudsen, S. (1993). The nitrogen response of a barley C-hordein promoter is controlled by positive and negative regulation of the GCN4 and endosperm box. Plant J. 4, 343–355. Nakashima, K., Yamaguchi-Shinozaki, K., és Shinozaki, K. (2014). The transcriptional regulatory network in the drought response and its crosstalk in abiotic stress responses including drought, cold, and heat. Front. Plant Sci. 5, 170. Norre, F., Peyrot, C., Garcia, C., Rancé, I., Drevet, J., Theisen, M., és Gruber, V. (2002). Powerful effect of an atypical bifactorial endosperm box from wheat HMWG-Dx5 promoter in maize endosperm. Plant Mol. Biol. 50, 699–712. Olsen, K.M., és Wendel, J.F. (2013). Crop plants as models for understanding plant adaptation and diversification. Front. Plant Sci. 4, 290. Orth, R. a., és Bushuk, W. (1972). A Comparative Study of the Proteins of Wheats of Diverse Baking Qualities. Osborne, T.B. (1907). The proteins of the wheat kernel. Washington, D.C. Carnegie Inst. Washingt. 84. Oszvald, M., Gardonyi, M., Tamas, C., Takacs, I., Jenes, B., és Tamas, L. (2008). Development and characterization of a chimaeric tissue-specific promoter in wheat and rice endosperm. 1–7. Oszvald, M., Balázs, G., Tömösközi, S., Békés, F., és Tamás, L. (2011). Comparative Study of the Effect of Incorporated Individual Wheat Storage Proteins on Mixing Properties of Rice and Wheat Doughs. J. Agric. Food Chem. 59, 9664–9672. Peng, F.Y., és Weselake, R.J. (2011). Gene coexpression clusters and putative regulatory elements underlying seed storage reserve accumulation in Arabidopsis. BMC Genomics 12, 286. Petolino, J.F., és Davies, J.P. (2013). Designed transcriptional regulators for trait development. Plant Sci. 201-202, 128–136. Pistón, F., Marín, S., Hernando, A., és Barro, F. (2009). Analysis of the activity of a γ-gliadin promoter in transgenic wheat and characterization of gliadin synthesis in wheat by MALDITOF during grain development. Mol. Breed. 23, 655–667. Plessis, A., Ravel, C., Bordes, J., Balfourier, F., és Martre, P. (2013). Association study of wheat grain protein composition reveals that gliadin and glutenin composition are transregulated by different chromosome regions. J. Exp. Bot. 64, 3627–3644.
98
Qiang, X., Zechmann, B., Reitz, M.U., Kogel, K.-H., és Schäfer, P. (2012). The mutualistic fungus Piriformospora indica colonizes Arabidopsis roots by inducing an endoplasmic reticulum stress-triggered caspase-dependent cell death. Plant Cell 24, 794–809. Qu, L.Q., Xing, Y.P., Liu, W.X., Xu, X.P., és Song, Y.R. (2008). Expression pattern and activity of six glutelin gene promoters in transgenic rice. J. Exp. Bot. 59, 2417–2424. Radchuk, V. V, Sreenivasulu, N., Radchuk, R.I., Wobus, U., és Weschke, W. (2005). The methylation cycle and its possible functions in barley endosperm development. Plant Mol. Biol. 59, 289–307. Ravel, C., Martre, P., Romeuf, I., Dardevet, M., El-Malki, R., Bordes, J., Duchateau, N., Brunel, D., Balfourier, F., és Charmet, G. (2009). Nucleotide polymorphism in the wheat transcriptional activator Spa influences its pattern of expression and has pleiotropic effects on grain protein composition, dough viscoelasticity, and grain hardness. Plant Physiol. 151, 2133–2144. Ravel, C., Fiquet, S., Boudet, J., Dardevet, M., Vincent, J., Merlino, M., Michard, R., és Martre, P. (2014). Conserved cis-regulatory modules in promoters of genes encoding wheat highmolecular-weight glutenin subunits. Front. Plant Sci. 5, 1–17. Robert, L.S., Thompson, R.D., és Flavell, R.B. (1989). Tissue-specific expression of a wheat high molecular weight glutenin gene in transgenic tobacco. Plant Cell 1, 569–578. Rodríguez-Quijano, M., Nieto-Taladriz, M.T., és Carrillo, J.M. (1997). Variation in B-LMW glutenin subunits in Einkorn wheats. Genet. Resour. Crop Evol. 44, 539–543. Rodríguez-Quijano, M., Nieto-Taladriz, M.T., és Carrillo, J.M. (2001). Polymorphism of high molecular weight glutenin subunits in three species of Aegilops. Genet. Resour. Crop Evol. 48, 599–607. Rolletschek, H., Koch, K., Wobus, U., és Borisjuk, L. (2005). Positional cues for the starch/lipid balance in maize kernels and resource partitioning to the embryo. Plant J. 42, 69–83. Sabelli, P. a, és Larkins, B. a (2008). The Endoreduplication Cell Cycle: Regulation and Function. In Cell Division Control in Plants, D.P.S. Verma, és Z. Hong, szerk. (Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg), o. 75–100. Sabelli, P. a, és Larkins, B. a (2009). The development of endosperm in grasses. Plant Physiol. 149, 14–26. Seilmeier, W., Belitz, H.-D., és Wieser, H. (1991). Separation and quantitative determination of high-molecular-weight subunits of glutenin from different wheat varieties and genetic variants of the variety Sicco. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 192, 124–129. Sharan, R., Ovcharenko, I., Ben-Hur, A., és Karp, R.M. (2003). CREME: a framework for identifying cis-regulatory modules in human-mouse conserved segments. Bioinformatics 19 Suppl 1, i283–i291. 99
She, M., Ye, X., Yan, Y., és Howit, C. (2011). Gene networks in the synthesis and deposition of protein polymers during grain development of wheat. Funct. Integr. … 23–35. Shewry, P.R., Parmar, S., és Miflin, B.J. (1983). Extraction, separation, and polymorphism of the prolamin storage proteins (secalins) of rye. Cereal Chem. 60, 1–6. Shewry, P.R., Gilbert, S.M., Savage, A.W.J., Tatham, A.S., Wan, Y.-F., Belton, P.S., Wellner, N., D’Ovidio, R., Békés, F., és Halford, N.G. (2003a). Sequence and properties of HMW subunit 1Bx20 from pasta wheat (Triticum durum) which is associated with poor end use properties. Theor. Appl. Genet. 106, 744–750. Shewry, P.R., Halford, N.G., és Lafiandra, D. (2003b). Genetics of wheat gluten proteins. Adv. Genet. 49, 111–184. Shewry, P.R., Halford, N.G., Tatham, A.S., Popineau, Y., Lafiandra, D., és Belton, P.S. (2003c). The high molecular weight subunits of wheat glutenin and their role in determining wheat processing properties. Adv. Food Nutr. Res. 45, 219–302. Shewry, P.R., D’Ovidio, R., Lafiandra, D., Jenkins, J.A., Mills, E.N.C., és Békés, F. (2009). CHAPTER 8: Wheat Grain Proteins. In WHEAT: Chemistry and Technology, (AACC International, Inc.), o. 223–298. Shirsat, A., Wilford, N., Croy, R., és Boulter, D. (1989). Sequences responsible for the tissue specific promoter activity of a pea legumin gene in tobacco. MGG Mol. Gen. Genet. 215, 326–331. Simons, K.J., Fellers, J.P., Trick, H.N., Zhang, Z., Tai, Y.-S., Gill, B.S., és Faris, J.D. (2006). Molecular characterization of the major wheat domestication gene Q. Genetics 172, 547– 555. Slimane, R. Ben, Bancal, P., Bancal, M.M.-O.M., és Ben Slimane, R. (2013). Down-regulation by stems and sheaths of grain filling with mobilized nitrogen in wheat. F. Crop. Res. 140, 59– 68. Sørensen, M.B. (1992). Methylation of B-hordein genes in barley endosperm is inversely correlated with gene activity and affected by the regulatory gene Lys3. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 4119–4123. Sørensen, M., Cameron-Mills, V., és Brandt, A. (1989). Transcriptional and postranscriptional regulation of gene expression in developing barley endosperm. Mol. Gen. Genet. 217, 195–201. Stoger, E., Williams, S., Keen, D., és Christou, P. (1999). Constitutive versus seed specific expression in transgenic wheat : temporal and spatial control. Mol. Biotechnol. 73–82. Sugiyama, T., Rafalski, A., Peterson, D., és Söll, D. (1985). A wheat HMW glutenin subunit gene reveals a highly repeated structure. Nucleic Acids Res. 13, 8729–8737. 100
Sun, H., Huang, X., Xu, X., Lan, H., Huang, J., és Zhang, H.-S. (2012). ENAC1, a NAC transcription factor, is an early and transient response regulator induced by abiotic stress in rice (Oryza sativa L.). Mol. Biotechnol. 52, 101–110. Suzuki, A., Wu, C.Y., Washida, H., és Takaiwa, F. (1998). Rice MYB protein OSMYB5 specifically binds to the AACA motif conserved among promoters of genes for storage protein glutelin. Plant Cell Physiol. 39, 555–559. Suzuki, M., Kao, C.Y., és McCarty, D.R. (1997). The conserved B3 domain of VIVIPAROUS1 has a cooperative DNA binding activity. Plant Cell 9, 799–807. Tahirov, T., Sato, K., és Ichikawa-Iwata, E. (2002). Mechanism of c-Myb–C/EBPβ cooperation from separated sites on a promoter. Cell 108, 57–70. Takaiwa, F., Yamanouchi, U., Yoshihara, T., Washida, H., Tanabe, F., Kato, A., és Yamada, K. (1996). Characterization of common cis-regulatory elements responsible for the endospermspecific expression of members of the rice glutelin multigene family. Plant Mol. Biol. 30, 1207–1221. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., és Kumar, S. (2013). MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30, 2725–2729. Terasawa, Y., Takata, K., Hirano, H., Kato, K., Kawahara, T., Sasakuma, T., és Sasanuma, T. (2010). Genetic variation of high-molecular-weight glutenin subunit composition in Asian wheat. Genet. Resour. Crop Evol. 58, 283–289. Thiel, J., Hollmann, J., Rutten, T., Weber, H., Scholz, U., és Weschke, W. (2012). 454 Transcriptome sequencing suggests a role for two-component signalling in cellularization and differentiation of barley endosperm transfer cells. PLoS One 7, e41867. Thomas, M.S., és Flavell, R.B. (1990). Identification of an enhancer element for the endosperm-specific expression of high molecular weight glutenin. Plant Cell 2, 1171–1180. Thompson, G.A., és Larkins, B.A. (1989). Structural elements regulating zein gene expression. Bioessays 10, 108–113. Tischner, T., és Koszegi, B. (1997). Climatic programms used in the Martonvasar phytotron most frequently in recent years. Acta Agron. Hungarica. Vandepoele, K., Quimbaya, M., Casneuf, T., De Veylder, L., és Van de Peer, Y. (2009). Unraveling transcriptional control in Arabidopsis using cis-regulatory elements and coexpression networks. Plant Physiol. 150, 535–546. Verdier, J., és Thompson, R.D. (2008). Transcriptional regulation of storage protein synthesis during dicotyledon seed filling. Plant Cell Physiol. 49, 1263–1271.
101
Vicente-Carbajosa, J., Moose, S.P., Parsons, R.L., és Schmidt, R.J. (1997). A maize zinc-finger protein binds the prolamin box in zein gene promoters and interacts with the basic leucine zipper transcriptional activator Opaque2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 7685–7690. Wan, Y., Poole, R.L., Huttly, A.K., Toscano-Underwood, C., Feeney, K., Welham, S., Gooding, M.J., Mills, C., Edwards, K.J., Shewry, P.R., és mtsai. (2008). Transcriptome analysis of grain development in hexaploid wheat. BMC Genomics 9, 121. Wang, J.-P.Z., Lindsay, B.G., Leebens-Mack, J., Cui, L., Wall, K., Miller, W.C., és dePamphilis, C.W. (2004). EST clustering error evaluation and correction. Bioinformatics 20, 2973–2984. Wang, K., Zhang, X., Zhao, Y., Chen, F., és Xia, G. (2013). Structure, variation and expression analysis of glutenin gene promoters from Triticum aestivum cultivar Chinese Spring shows the distal region of promoter 1Bx7 is key regulatory sequence. Gene null. Wang, R.L., Stec, A., Hey, J., Lukens, L., és Doebley, J. (1999). The limits of selection during maize domestication. Nature 398, 236–239. Wanous, M.K., Munkvold, J.D., Kruse, J.D., Brachman, E.E., Klawiter, M. a, és Fuehrer, K.J. (2003). Identification of chromosome arms influencing expression of the HMW glutenins in wheat. Theor. Appl. Genet. 106, 213–220. Washida, H., Wu, C.Y., Suzuki, a, Yamanouchi, U., Akihama, T., Harada, K., és Takaiwa, F. (1999). Identification of cis-regulatory elements required for endosperm expression of the rice storage protein glutelin gene GluB-1. Plant Mol. Biol. 40, 1–12. Weichert, N., Saalbach, I., Weichert, H., Kohl, S., Erban, A., Kopka, J., Hause, B., Varshney, A., Sreenivasulu, N., Strickert, M., és mtsai. (2010). Increasing sucrose uptake capacity of wheat grains stimulates storage protein synthesis. Plant Physiol. 152, 698–710. Wen, S., Wen, N., Pang, J., Langen, G., Brew-Appiah, R. a. T., Mejias, J.H., Osorio, C., Yang, M., Gemini, R., Moehs, C.P., és mtsai. (2012). Structural genes of wheat and barley 5methylcytosine DNA glycosylases and their potential applications for human health. Proc. Natl. Acad. Sci. 109. Werner, T., Fessele, S., Maier, H., és Nelson, P.J. (2003). Computer modeling of promoter organization as a tool to study transcriptional coregulation. FASEB J. 17, 1228–1237. Wicker, T., Yahiaoui, N., Guyot, R., Schlagenhauf, E., Liu, Z., és Dubcovsky, J. (2003). Rapid Genome Divergence at Orthologous Low Molecular Weight Glutenin Loci of the A and A m Genomes of Wheat. Society 15, 1186–1197. Wittkopp, P.J., és Kalay, G. (2011). Cis-regulatory elements: molecular mechanisms and evolutionary processes underlying divergence. Nat. Rev. Genet. 13, 59–69. Wrigley, C.W. (2009). Wheat: A Unique Grain for the World. In WHEAT: Chemistry and Technology, (AACC International, Inc.), o. 1–17. 102
Wu, C., Washida, H., Onodera, Y., Harada, K., és Takaiwa, F. (2000). Quantitative nature of the Prolamin-box, ACGT and AACA motifs in a rice glutelin gene promoter: minimal ciselement requirements for endosperm-specific gene expression. Plant J. 23, 415–421. Xue, L.-J., Zhang, J.-J., és Xue, H.-W. (2012). Genome-wide analysis of the complex transcriptional networks of rice developing seeds. PLoS One 7, e31081. Yamamoto, M., és Onodera, Y. (2006). Synergism between RPBF Dof and RISBZ1 bZIP activators in the regulation of rice seed expression genes. Plant … 141, 1694–1707. Yanagisawa, S. (2002). The Dof family of plant transcription factors. Trends Plant Sci. 2002, 712555-560. Yang, J., Zhang, J., Wang, Z., Liu, K., és Wang, P. (2006). Post-anthesis development of inferior and superior spikelets in rice in relation to abscisic acid and ethylene. J. Exp. Bot. 57, 149–160. Yokotani, N., Ichikawa, T., Kondou, Y., Iwabuchi, M., Matsui, M., Hirochika, H., és Oda, K. (2012). Role of the rice transcription factor JAmyb in abiotic stress response. J. Plant Res. 126, 131–139. Zhang, H., Jin, J., Tang, L., Zhao, Y., Gu, X., Gao, G., és Luo, J. (2011). PlantTFDB 2.0: update and improvement of the comprehensive plant transcription factor database. Nucleic Acids Res. 39, D1114–D1117. Zhang, L., Zhao, G., Jia, J., Liu, X., és Kong, X. (2012). Molecular characterization of 60 isolated wheat MYB genes and analysis of their expression during abiotic stress. J. Exp. Bot. 63, 203– 214. Zheng, Z.-L. (2009). Carbon and nitrogen nutrient balance signaling in plants. Plant Signal. Behav. 4, 584–591.
103
