1. TENYÉSZTÉSES VIZSGÁLATI MÓDSZEREK A tenyésztéses módszerek egyrészt lehetıséget teremtenek mikroorganizmusok különbözı célra történı fenntartására és elszaporítására, másrészt ezen eljárások segítségével megoldható egyes mikrobacsoportok vagy fajok jelenlétének kimutatása. Ugyancsak ezen módszerek képezik az élısejtszám-meghatározás alapját. Mielıtt részletesen megismerkednénk a mikrobiológiában használt tenyésztési módszerekkel elıtte érdemes közelebbrıl megismerkedni a prokarióta anyagcsere alapvonásaival.
1.1.
A baktériumok változatos anyagcsere-folyamatai
Mint minden élılény anyagcseréje esetén a prokarióták esetében is a felépítı folyamat (asszimiláció vagy bioszintézis) energiaigényes, amely során a kis energiájú, egyszerő szerkezető molekulákból nagy energiájú, bonyolult szerkezető molekulák (makromolekulák) képzıdnek. Az energiaszerzés módja, a hidrogén/elektron donor típusa és a szénforrás fajtája szerint a mikroorganizmusokat különbözı csoportokba soroljuk. Az energia szerzés módja szerint megkülönböztetünk: • Fototrófokat, amikor a fényenergia az energiaforrás • Kemotrófokat, amikor a kémiai energia az energiaforrás (redukált vegyületek oxidálása) A hidrogén/elektron donor típusa szerint: • Litotróf élılény: hidrogénforrásként szervetlen vegyületeket használ fel (pl. H2O, H2S) • Organotróf élılény: hidrogénforrásként szerves vegyületeket használ A szénforrás szerint: • Autotróf asszimilációról, amikor a mikroorganizmus szénforrásként szén-dioxidot használ fel. • Heterotróf asszimiláció: szénforrásként szerves vegyületet használ fel. Egy litotróf általában autotróf, míg egy organotróf általában heterotróf. Azt, hogy a különbözı mikroorganizmusok milyen tápanyagokat és milyen anyagcsereutakon tudnak hasznosítani, a mikrobafajok genetikai tulajdonságai szablyák meg, amelyek kifejezıdését a környezeti tényezık bizonyos mértékig képesek befolyásolni. Ezek alapján a mikroorganizmusok az anyagcseréjük szerint az alábbi 4 fıcsoportba sorolhatók: • Fotolitotróf autotrófok pl.: cianobaktériumok, amelyek autotróf fotoszintetizáló, litotróf (H2O) élılények • Fotoorganotróf heterotrófok pl halobaktériumok, amelyek heterotróf fotoszintetizáló, organotróf élılények • Kemolitotróf autotrófok: pl: nitrifikáló baktériumok, melyek autotróf kemoszintetizáló (NH4+→ NO2-,NO3-), litotróf (H2) élılények és a vasbaktériumok, melyek autotróf kemoszintetizáló (Fe2+ → Fe3+), litotróf (H2) élılények • Kemoorganotróf heterotróf pl. minden patogén Az elsı három csoport tagjai alapvetı szerepet játszanak a bioszféra anyagainak körforgásában, élelmiszerekben alig találkozunk velük. Élelmiszerhigiéniai és humánvalamint állategészségügyi jelentısége elsısorban a kemoorganotróf heterotróf baktériumoknak van. A mikroorganizmusok szaporodásának feltétele a megfelelı tápanyagellátás és környezeti tényezık (hımérséklet, pH, redoxpotenciál, vízaktivitás) biztosítása. Laboratóriumi
1
körülmények között ezt a célt szolgálják a különbözı összetételő tápközegek, amelyekkel a vizsgált mikrobák tápanyag-, pH-, vízaktivitás- és redoxpotenciál-igénye kielégíthetı. A szükséges hımérséklet termosztátokkal biztosítható. 1.2. TÁPKÖZEGEK A táptalajok a mikroorganizmusok szaporodásának és életképességének fenntartására szolgálnak. Fedezniük kell a mikrobák változatos tápanyag- és energiaforrás-igényét, valamint biztosítaniuk a kívánt fizikai-kémiai körülményeket. l. A táptalajok összetétele A táptalajoknak tartalmazniuk kell mindazokat az anyagokat, amelyekre a mikroorganizmusoknak szüksége van, és amelyeket maguk szintetizálni nem képesek. Feltétlenül szükséges táptalajkomponensek: Víz: A víz az élı szervezet alapvetı komponense, szerepet játszik minden élılény anyagcserefolyamataiban. Emellett a táptalajokban a mikroorganizmusok számára, mint környezeti tényezı is nélkülözhetetlen. A táptalajok készítéséhez általában egyszer desztillált vizet kell használni. Szén- és energiaforrás: a táptalajokban a redukált széntartalmú vegyületek kettıs célt szolgálnak: egyrészt energiát nyernek belıle, másrészt ezekbıl építik fel a mikroorganizmusok saját széntartalmú anyagaikat. Az autotróf mikroorganizmusok képesek a levegı szén-dioxid tartalmát is hasznosítani, a mikrobák döntı többsége azonban a kemoheterotróf csoportba tartozik. A számukra hasznosítható szerves szénforrások igen széles skálája mikrobafajonként eltér, s ez a tulajdonság vizsgálata a mikroorganizmusok azonosításának igen fontos lépése. A leggyakrabban használt szén- és energiaforrások az egyszerő cukrok (glükóz, laktóz stb.), a pepton és a húskivonat. (E két utóbbi egyben nitrogénforrás is.) Nitrogénforrás: az élı anyag bioszintéziséhez szükséges, igénytıl függıen szerves vagy szervetlen nitrogén-vegyületek. A levegı molekuláris nitrogéntartalmát csak néhány baktériumfaj képes hasznosítani (Rhizobium, Azotobacter fajok). A különbözı nitrogénforrások eltérı hasznosíthatósága - hasonlóan a szénforrásokhoz - diagnosztikai célokra kihasználható. A leggyakrabban használt szervetlen nitrogénforrások az ammónium-, nitrit- és nitrátsók, szervesek pedig a húskivonat, természetes fehérjék, peptonok, triptonok és az aminosavak. Ásványi anyagok: fontos szerepet játszanak egyrészt a sejt ozmotikus nyomásának kialakításában a sejthártya aktív transzportfolyamatai révén, valamint kofaktorként az enzimaktivitás szabályozásában. A mikroorganizmusok ásványianyag-igényét gyakran a csapvíz is kielégíti, de a szervetlen foszforvegyületeket - a makroerg foszfátkötések révén a sejt energiaforgalmában betöltött döntı szerepe miatt - megfelelı mennyiségben a táptalajhoz kell adni. Feltételesen szükséges táptalajkomponensek: Vitaminok, biosz anyagok: a különbözı anyagcsere-folyamatokban - igen kis mennyiségben szükséges anyagok, amelyeket a mikroorganizmus nem képes elıállítani. Ezek az anyagok elsısorban a koenzimként játszanak szerepet az anyagcserében. A baktériumoknak zsírban oldódó vitaminokra és C-vitaminra nincs szükségük. A legtöbbjük a B-vitaminokat is szintetizálni képes, azonban amelyek nem, azoknak ezeket készen kell kapniuk. A laboratóriumi gyakorlatban legáltalánosabban használt komplex vitaminforrás az élesztıkivonat. .
2
Szervetlen és szerves hidrogén-donorok és -akceptorok: baktériumok légzési láncában képzıdı hidrogén-ionokat felvevı terminális anyagok. Csak akkor szükséges a táptalajhoz adni, ha a táptalajban lévı többi komponens egyike sem képes ezt a funkciót ellátni.
1.3.
A TÁPTALAJOK CSOPORTOSÍTÁSA
1.3.1. A táptalajok csoportosítása összetétel szerint Összetétel szerint megkülönböztetünk természetes, félszintetikus és szintetikus táptalajokat. A természetes táptalajok természetes anyagok felhasználásával készülnek, ezért összetételük pontosan nem definiálható. Ebbe a csoportba tartozik a húsleves, a melasz vagy a maláta. Félszintetikus tápközegek összetevıinek egy része olyan természetes anyag, amelynek összetétele nem teljesen ismert, vagy alkotóinak aránya változó. Ebbe a csoportba tartozik minden olyan táptalaj, amely agart tartalmaz. A szintetikus táptalajok minden összetevıjét kvantitatíve és kvalitatíve is ismerjük. Hátrányuk, hogy igen drágák. 1.3.2. A táptalajok csoportosítása halmazállapot szerint Halmazállapot szerint beszélhetünk folyékony, félfolyékony és szilárd táptalajokról. A folyékony táptalajokra jellemzı, hogy a különbözı tápanyagokat szuszpenzióban, valódi vagy kolloid oldat formájában tartalmazzák. A folyékony halmazállapotú tápközegek közül a természetes vagy félszintetikus táptalajokat leveseknek nevezzük, a szintetikus táptalajokat pedig tápoldatnak. A szilárd táptalajok a folyékony táptalajokból származtathatók szilárdító anyagok (agar-agar, zselatin, szilikagél) hozzáadásával. Régebben a zselatin volt a legelterjedtebb szilárdító anyag, ma egyre inkább háttérbe szorul, ami egyrészt igen alacsony olvadáspontjával (35 °C) magyarázható, másrészt azzal a ténnyel, hogy a zselatint számos baktériumfaj elfolyósítja zselatináz enzime révén. Éppen ezért ma már inkább csak diagnosztikai céllal használjuk. Az agar kétkomponenső gélképzı poliszacharid-keverék, amelyet egyes tengeri vörösalgákból vontak ki. Az agar nagy elınye, hogy 38-40 °C-on megdermed, olvadáspontja azonban 98 °C. Mivel az agar természetes anyag, összetétele nem definiálható pontosan, csak természetes és félszintetikus táptalajokhoz használható. A szintetikus táptalajokban szilárdítóanyagként zömmel szilikagél (nátrium-szilikát, vízüveg, Na2SiO3) szerepel. A szilárd táptalaj megjelenési formája szerint lehet kémcsıben elkészítve magas- vagy ferdeagar, Petri-csészébe leöntve pedig agarlemez. A félfolyékony táptalajok is tartalmaznak szilárdítóanyagot, de lényegesen kevesebbet, mint a szilárd táptalajok. 1.3.3. A táptalajok csoportosítása a felhasználás célja szerint Alaptáptalajok: Az alaptáptalajok olyan médiumok, amelyek összetételüknél fogva általánosan (de nem univerzálisan) használhatók, a szaporodáshoz szükséges tápanyagokon kívül más speciális anyagot nem tartalmaznak. Dúsító táptalajok: többnyire olyan folyékony táptalaj, amely összetétele miatt különösen kedvezı körülményeket biztosít a mikroorganizmusok szaporodására. A szelektív dúsító táptalajok összetételüknél fogva különösen alkalmasak arra, hogy bizonyos mikrobacsoportokat a többi mikróbával szemben speciális tápanyag-hasznosítási képességük,
3
vagy más egyedi tulajdonságuk alapján (pl. antibiotikum-rezisztencia stb.) a tenyésztés során felszaporítsunk. Elektív táptalajok: olyan táptalajok, amelyekben összetételüknél fogva csak bizonyos mikrobacsoportok képesek szaporodni, hiszen csak ezen mikrobacsoportok minimális tápanyagigényét elégítik ki, így azok a környezetükben élı kísérı mikrobiótából kiemelhetık. Szelektív táptalajok: A szelektív táptalajok olyan kiegészítı komponenst tartalmaznak, amelyek egyes mikrobacsoportok szaporodását gátolják (pl. antibiotikumok, festékek, szulfonamidok stb.). Természetesen ezek a táptalajok gyakran tartalmaznak olyan alkotókat is, amelyek a keresett, mikrobacsoport szaporodását segítik. A szelektív táptalajok közé tartoznak a módosított pH-jú (erısen savas vagy lúgos) médiumok is. Differenciáló vagy indikátor táptalajok: a mikroorganizmusok differenciálására, azonosítására szolgáló táptalajok, amelyek kémiai indikátort, vagy egyéb jelzırendszert (pl. Durham-féle fermentációs csı) tartalmaznak, amely speciális reakciókat (pl. savtermelést) jelez. Jellemzıjük, hogy egyes komponenseik szabad szemmel is látható reakciót adnak a mikroorganizmusok bizonyos anyagcseretermékeivel vagy enzimeivel. Speciális táptalajok: különbözı vizsgálati céllal összeállított, különleges vizsgálatokat szolgáló tápközegek. 1. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: CC, BP, MYP agarlemezek, oltótő, alkoholos filc Mikroorganizmusok: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus 2 napos tenyészete TSA agaron és egy ezen mikrobák keverékébıl készített mikrobaszuszpenzió Az egyes táptalajokból 1-1 Petri-csészét öntünk ki. A táptalajok megdermedése után a táplemezeket le kell szárítani! Amennyiben steril fülke nem áll rendelkezésre, a csészéket óvatosan nyitjuk, a fedelet kézben lefelé tartva steril vattával páramentesítjük, majd a táplemezt tartalmazó csésze felet tetıcserépszerően rátesszük. (E mővelet elıtt célszerő az asztallapot fertıtlenítıszeres ruhával letörölni.) Steril fülkében a csészék normál helyzetben nyitott fedıvel száríthatók. A leoltani kívánt mikrobákból a steril fiziológiás sóoldatban szuszpenziót készítünk (úgy mintha kémcsıbıl folyadék tápoldatba oltanánk). (Fonalasgombák esetében célszerő a konidium szuszpenziót sterilvizes lemosással készíteni.) Az agar dermedése, majd a csészék szárítása után a lemezek alkoholos filccel alsó felére húzzunk 2 merıleges vonalat, amelyek 4 egyenlı részre osztják a Petri-csészét. Az egyes körcikkeket számozzuk meg. Vegyünk egy kevés inokulumot a Staphylococcus aureus-t tartalmazó szuszpenzióból az oltókacs segítségével, majd húzzunk vele egy vonalat az egyik Petri-csésze 1. negyedében. A 2. negyedet E. coli-val, a 3. negyedet Bacillus cereus-sal, a 4.-et az ismeretlen kevert tenyészettel oltjuk be. Hasonlóan járjunk el a másik 2 lemez esetében is. Ne felejtsük el lelángolni a kacsot minden egyes oltás után. Inkubáljuk a lemezeket 37 °C-on. Értékelés +++ erıs, ++ közepes,+ gyenge szaporulat, – nem szaporodik Tápközeg
Staph. aureus
E. coli
Bacillus cereus
Mix
4
A tápközeg típusa (szelektív vagy differenciáló)
CC BP MYP
1.3.4. A táptalajok osztályozása az elkészítési módszer szerint Kész táptalaj: olyan táptalaj, amely tárolóedényekben kész formában kapható (pl. Petricsészék vagy csövek, vagy egyéb tároló edények). Kereskedelmi vízmentes készítményekbıl elkészített táptalaj: táptalaj száraz formában, amely nem kész az azonnali felhasználásra(pl. porok, granulátumuk, liofilizált termékek). A víz hozzáadása a két táptalajféle egyikét eredményezi: • Teljesen kész táptalajt; • Nem teljesen kész táptalajt, amelyhez használat elıtt az instabil alkotórészeket hozzáadják. A laboratóriumban egyedi összetevıkbıl összemért táptalaj.
1.4.
A TÁPTALAJOK ÉS HÍGÍTÓFOLYADÉKOK KÉSZÍTÉSE ÉS TÁROLÁSA
Táptalajok és hígítófolyadékok készítéséhez csak kifogástalan minıségő és tisztaságú, bakteriológiai célokra alkalmas alapanyagok használhatók fel. A hıkezelés nélkül felhasználásra kerülı alapanyagokat aszeptikusan kell kezelni. Az alapanyagokat tisztán tartott, száraz, rovaroktól és rágcsálóktól mentes helyiségben kell raktározni. A higroszkópos anyagokat légmentesen zárható edényben kell tárolni. A beméréseket tiszta eszközökkel, analitikai körülmények között kell elvégezni. A táptalajokat és hígítófolyadékokat csak tiszta, hıálló üvegedényben, rozsdamentes acélból készült vagy hibátlan tőzzománcos edényben szabad elkészíteni. A készítés során az alábbi mőveleti sorrendet kell betartani: − az alapanyagok elıkészítése, - az alapanyagok bemérése, − az alapanyagok oldása a receptekben megadott sorrend szerint, állandó keverés közben, − melegítés a komponensek teljes oldódásáig − pH-ellenırzés, szükség szerint beállítás - kiegészítés végsı térfogatra, − kiszerelés, − sterilezés. A táptalaj ill. hígítófolyadék pH-mérése hımérsékletkompenzációs pH-mérıvel történjen, a pH-beállítását 1 n NaOH-, ill. HCI-oldattal kell végezni. A táptalajok és hígítófolyadékok többségét telített, túlnyomásos gızzel, 121 °C-on autoklávban kell sterilezni 15 percig. A behatási idıt attól az idıponttól kell számítani, amikor a munkatér hımérséklete az adott nyomásnak megfelelı értéket elérte. Csavaros kupakkal záródó palackok sterilezése elıtt a zárókupakot meg kell lazítani, majd az autoklávból történı kiszedés után szorosra meg kell húzni. A rakomány felmelegítése minél
5
gyorsabb legyen, a sterilezés után a túlnyomás megszüntetését viszont lassan kell végezni. Az autokláv ajtaját csak akkor szabad kinyitni, ha a táptalajok hımérséklete már 70-80 °C-ra lehőlt. Bizonyos táptalajokat frakcionált sterilezésnek kell alávetni, tehát három egymás után következı napon 80-85 °C-os hımérsékleten 1-2 óra hosszat hıkezelni. A hıkezelés közötti idı alatt a táptalajokat a spórák germinációjának elısegítése céljából szobahımérsékleten kell tartani. Olyan táptalajokat vagy táptalaj-alapanyagokat, amelyeket még 80-85 °C-on sem lehet hıkezelni, szőréssel (0,2 µm pórusnagyságú membránszőrı) kell sterilezni. A nagyobb mennyiségben elkészült táptalajokat általában literes térfogatú, papírvatta-dugóval vagy csavaros kupakkal lezárt üvegekben kell tárolni. Az üvegben tárolt táptalajokat áramló gızben kell felolvasztani, és a még szükséges összetevık hozzáadása után további hevítés nélkül mielıbb szétmérni. Csak annyi alaptáptalajt szabad felolvasztani, amennyire szükség van; az ismételt felolvasztás a táptalajt károsíthatja! 4 óránál hosszabb ideig ne tartsuk olvadt állapotban a táptalajt. Az agar táptalajok hımérséklete a lemezekbe történı kiöntés alatt a kondenzvíz képzıdés csökkentése érdekében 60 °C-nál nagyobb ne legyen. Az agar táptalajokból a szokványos Petri-csésze aljába kb. 15-20 cm3-t kell önteni. A steril, részben teljes táptalajokat – vagyis az olyan táptalajokat, amelyekhez az utolsó alkatrészeket közvetlenül a felhasználás elıtt kell hozzáadni - általában hőtıszekrényekben, 48 °C-on kell tárolni legfeljebb 3 hónapig. A Petri-csészébe fejtett szilárd táptalajokat fordított helyzetben, kell a hőtıszekrénybe helyezni. Kiszáradt, elszínezıdött, vagy baktériumos szennyezıdés jeleit mutató táptalajokat nem szabad felhasználni. A táptalaj nevét, készítésének napját a győjtıkosáron, ill. az egyedi táptalajedényen fel kell tüntetni. A hőtıszekrényben tárolt táptalajokat beoltás elıtt szobahımérsékletre kell felmelegíteni. Minden tápközeg használhatóságáról gyızıdjünk meg, próbáljuk ki ıket tesztmikroorganizmusokkal. 2. GYAKORLAT Tápközegek készítése Ezen a gyakorlaton végrehajtjuk egy alaptáptalaj készítését. Ennek a táptalajnak a gyakorlatban használt rövidített neve: PC (Plate Count agar) Szükséges anyagok és eszközök: PC por táptalaj, desztillált víz, 0,1 n NaOH-oldat, 0,1 n HCl-oldat, 1 literes edény, táramérleg, bemérıedény, bemérıkanál, pH-papír vagy pH mérı, villanyrezsó, mérıhenger, 200 cm3-es táptalaj üvegek vagy kémcsövek A gyakorlat menete: Mérjünk ki, majd szuszpendáljunk fel 22,5 g/liter anyagot 1000 cm3 desztillált vízben, melegítsük az oldatot a komponensek teljes oldódásáig. Melegítés közben az agaros közeg gyakran felhabzik és könnyen leéghet az edény aljára, így folymatosan keverni kell. Állítsuk be a közeg pH-ját 7.0 ± 0.2-ra 25 °C-on. 0,1 n NaOH vagy 0,1 n HCl-oldat hozzáadásával. Adagolás 100 cm3-ként 200 cm3-es táptalaj üvegekbe vagy 15 cm3-ként kémcsövekbe. Autoklávozzuk (15 percig 121 °C-on).
6
1.5.
OLTÁSI ÉS TENYÉSZTÉSI MÓDSZEREK
Az oltás a mikroorganizmusok tenyésztését megelızı, alapvetıen fontos mikrobiológiai mővelet. Lényege: steril oltóeszköz segítségével steril tápközegbe juttatjuk azokat a mikróbákat, amelyeket szaporítani kívánunk. Inokulásáról beszélünk, ha a vizsgálati anyag egy részével (inokulum) beoltjuk a szaporításra szolgáló táptalajt. Minden olyan esetben, amikor hígítófolyadékban vagy tápközegben elszaporított mikroorganizmusokat viszünk a szaporításra szolgáló táptalajra (törzsfenntartás, tiszta tenyészet készítése stb.) átoltásról beszélünk. Tenyésztés alatt értjük a baktériumok és gombák meghatározott táptalajokon történı mesterséges szaporítását. A mikroba-tenyésztés célja lehet egy már meglévı tenyészet fenntartása, tiszta tenyészet készítése, a szükséges mikroorganizmusok tömeges elszaporítása, illetve egy vizsgálati minta élısejt-számának meghatározása. Ügyelnünk kell arra, hogy oltás és tenyésztés közben tenyészeteink ne fertızıdjenek be idegen mikroorganizmusokkal, ezért mindig be kell tartanunk az aszeptikus (fertızésmentes) munka követelményeit. Néhány gyakorlati tanács az oltási munkák helyes kivitelezéséhez: Ha lehetıségünk van rá, csírátlanítsuk ultraibolya sugárzású lámpákkal annak a helyiségnek a levegıjét, amelyben dolgozni fogunk. Munkaasztalunk felületét mossuk le fertıtlenítıszerrel. Soha ne végezzünk oltási munkát nyitott ablak mellett, vagy huzatos helyiségben. Mindig gázláng mellett dolgozzunk. Tenyészetbıl inokulumot venni, oltást végezni csak steril oltoeszközzel szabad. Forró oltóeszközzel ne vegyünk inokulumot, mert a mikróbák elpusztulnak, s oltásra nem használhatók. Várjuk meg az oltóeszköz lehőlését, vagy hőtsük le azt oltás elıtt steril tápfolyadékba mártással, illetve steril tápközegbe való behúzással. Ha nagyobb mennyiségben, pipetta tartóban sterilezett pipettákat használunk, mindig gázláng közelében nyissuk és zárjuk a doboz fedelét egy-egy pipetta kivételekor. A kivett pipettát célszerő használat elıtt egyszer gázlángon áthúzni. Ha mikróba tenyészetet, vagy steril tápközeget tartalmazó üvegedényt inokulum kivételkor, oltáskor kinyitunk, majd lezárunk, az üvegedény száját lelángolással kell sterilizálnunk rögtön kinyitás után és bezárás elıtt is! A gázlángban történı lelángolás (flammálás) egyrészt csírátlanítja az üvegedény száját, másrészt melegítés hatására a kémcsıben lévı levegı kifele áramlik, így a külsı légtérbıl nem történhet levegıbeszívás. Ezzel kizárható az egyik legjelentısebb külsı fertızési forrás. Steril tápközeget vagy tenyészetet tartalmazó üvegedény kinyitásakor a vattadugót vagy kémcsı kupakot jobb kezünk kis és győrős ujjával a tenyerünkhöz szorítva vegyük ki, s tartsuk ott a kémcsı zárásáig. Vigyázzunk, hogy a dugó kémcsıbe kerülı részét ne fogjuk meg és ne érintsük semmihez. Petri-csészében való tenyésztéshez mindig szilárd tápközeget használunk. A légmentesen záró, steril Petri-csészét gázláng mellett és a tetı oldalra billentésével csak résnyire nyissuk fel, hogy a levegıbıl történı mikróba fertızést elkerüljük. 1.5.1. Oltási módok Az oltási módokat különféle szempontok alapján csoportosíthatjuk: • a használt oltóeszköz fajtája, • az oltásra használt tenyészet halmazállapota, • a beoltott tápközeg halmazállapota, • az oltás formája, típusa szerint.
7
A különbözı oltóeszközökkel végezhetı oltási típusok: Folyadék tenyészetbıl
táptalaj felületére oltókaccsal
Szilárd tenyészetbıl
Folyadék tenyészetbıl
táplevesbe
pipettával
táplevesbe
felolvasztott, 45 ºC-ra visszahőtött tápagarba
Szilárd tenyészetbıl
oltótővel
táptalajba szúrással
táplevesbe
Részletesebben a kémcsıbıl kémcsıbe történı (szilárd táptalajon) átoltást ismertetjük. A többi átoltási formára értelemszerően kell alkalmazni a leírtakat. 1. Az oltásra kerülı kémcsövet lássuk el megfelelı jelzéssel. 2. Vegyük balkezünkbe a két kémcsövet (amibe, illetve amelybıl átoltunk) úgy, hogy azok biztos távolságra legyenek egymástól és nyílásuk jobbfelé essen (amennyiben jobb kezesek vegyünk). A kémcsöveket hüvelykujjunkkal szorítsuk a tenyerünkhöz. (A kémcsövek dugóit még az átoltás megkezdése elıtt lazítsuk meg.) (13. ábra) 3. Vegyük jobb kezünkbe az oltókacsot ceruzaszerően. 4. Égessük le az oltókacsot alaposan (izzásig), azután hagyjuk kihőlni . 5. Lángoljuk le a tenyészetet és a táptalajt tartalmazó kémcsövek dugóit. 6. Jobb kezünk kisujjával és győrősujjával fogjuk meg egyszerre a két kémcsı vattadugóját a külsı kézfelület felıli oldalról és vegyük ki. 7. Égessük le a kémcsövek száját. 8. Az oltókacsot érintsük hozzá a tenyészet felsı széléhez (ha esetleg forró lenne, hőljön le). 9. Húzzuk végig a kacsot a tenyészet felszínén (az agar felszínét ne szántsuk fel), és vegyünk ki egy kacsnyi mennyiségő baktériumot. 10. A kacson lévı mikroorganizmusokat hullámos (kígyózó) vagy egyenes vonal mentén, alulról kiindulva kenjük szét a táptalaj felületén. 11. Lángoljuk le a két kémcsı száját és tegyük vissza a két vattadugót. 12. Az oltókacsot kiizzítjuk. 13. A frissen beoltott táptalajt rakjuk be a megfelelı hımérséklető termosztátba.
8
1. ábra: A kémcsövek és az oltókacs helyes tartása átoltáskor 1.5.2. Tenyésztési módok A tenyésztés a mikroorganizmus oxigénigényének megfelelıen aerob vagy anaerob körülmények között történik. Aerob módon tenyészthetı minden olyan mikroorganizmus, amely anyagcseréjéhez oxigént igényel, vagy amelyek szaporodását az oxigén nem gátolja jelentıs mértékben (aerotolerans). Anaerob módon kell tenyészteni minden olyan mikrobát, amelynek anyagcseréjét, szaporodását az oxigén gátolja. A mikroorganizmusoknak egy csoportja viszont csak csökkentett oxigénnyomáson, szén-dioxiddal dúsított légtérben képes szaporodni. Ezeket a mikrobákat mikroaerofileknek nevezzük. 1.5.2.1 Aerob tenyésztési eljárások Az aerob tenyésztési eljárásoknál biztosítani kell a szaporításra szolgáló közeg oxigénellátását. Ez a legtöbb esetben nem jelent problémát, mert a Petri-csészékbe öntött és megszilárdult, néhány mm vastag táptalajba a levegıbıl bediffundáló oxigén elegendı a szaporodáshoz. Hasonló módon, fémkupakkal, vagy laza papírvatta-dugóval lezárt kémcsövekben is elegendı az oxigén-ellátás ferde agaros tenyészetek vagy egyszerő levestenyészetek esetében. Nagyobb térfogatú folyadéktenyészeteknél a nyugvó folyadék felületén át történı oxigénátadás már nem elegendı, ezeket a tenyészeteket rázatással vagy steril levegıvel történı buborékoltatással kell "levegıztetni". Ezt a célt szolgálják a
9
laboratóriumi rázógépek, vagy rázóvízfürdık, illetve a fermentorok, amelyek segítségével az intenzív oxigén-bevitel biztosítható. 1.5.2.2 Anaerob tenyésztési eljárások Az obligát anaerob baktériumok -330 mV-nál magasabb redoxpotenciálú környezetben nem szaporodik. Az atmoszférikus levegıvel egyensúlyban lévı vízben a redoxpotenciál +800 mV. Anaerob tenyésztési körülmények eléréséhez tehát csökkenteni kell a redoxpotenciált. A redoxpotenciál csökkenthetı az oxigén kizárásával, vagy redukálóanyagok hozzáadásával. A levegı kiszorításának egyik legegyszerőbb módja a tápközeg fedése paraffindugóval, vagy paraffinolajjal. Ezt az eljárást kémcsıben készített tenyészetek esetén célszerő alkalmazni. Agarlemezek esetében célszerőbb az un. anaerob edények alkalmazása (14. ábra). Az anaerob edények olyan légmentesen zárható edények, amelyekbıl az oxigént kémiai úton (pl. pirogalluszsav és kálium-hidroxid összekeverésével) vonjuk el. Az edénybe az anaerob körülmények meglétének ellenırzése céljából redoxindikátorral átitatott szőrıpapírt, kell helyezni.
1. szorítócsavar 2. fedél
3. redox indikátor 4. anaerob só 5. tenyészetek Petri-csészében
2. ábra: Az anaerob edény részei Nagy mintaszámmal dolgozó laboratóriumok esetében a legcélszerőbb az anaerob termosztát használata. Az anaerob termosztát légmentesítése a levegı kiszivattyúzásával, vagy kémiai úton az oxigén vízzé alakításával hidrogén jelenlétében palládium katalizátor segítségével történik. A táptalajhoz adott redukáló hatású adalékanyagként leggyakrabban merkapto-, vagy szulfhidril csoportot (-SH) tartalmazó anyagot (marhamáj, darált hús, cisztein, nátriumtioglikolát) adunk.
1.6.
TISZTATENYÉSZETEK KÉSZÍTÉSE (szélesztéses eljárás)
Az elektív, szelektív és differenciáló táptalajok alkalmazásával csak a mikroorganizmusok egy-egy szőkebb csoportját tudjuk elkülöníteni, de ezek teljes körő azonosításra nem alkalmasak, ezt a célt a különbözı diagnosztikai vizsgálatok (biokémiai, szerológiai stb.) szolgálják. Az azonosíthatóságnak, a mikrobafaj meghatározásának minden esetben
10
elıfeltétele a tiszta tenyészet elıállítása. A tiszta tenyészet más mikroorganizmusoktól mentes, egyetlen sejtbıl vagy telepképzı egységbıl fejlıdı sejttömeg. A tiszta tenyészet készítésé során egyetlen sejt elszaporodásából származó telepbıl kell kiindulni. Az átoltás során a vizsgálandó mikroorganizmusokat tartalmazó tenyészetbıl egysejt eredető mikroorganizmusokat viszünk át friss, steril táptalajra. A tiszta tenyészet készítésének számos formája használatos a kiindulási és a készítendı táptalaj típusának függvényében. A legelterjedtebb forma az elektív, szelektív vagy, differenciáló, folyékony, vagy szilárd táptalajból alaptáptalajra történı átoltás ritkító szélesztéssel. A ritkító szélesztés célja olyan "vonáskultúra" készítése, melynek eredményeként az inkubálást követıen szoliter telepeket is kapunk. A ritkító szélesztés technikáját a 13. ás 14. ábra mutatja, amikor egy kacsnyi mennyiséget az agarlemez felületén egyenes vonalban vagy hullámosan kenünk ki.
kacs leégetése
nincs leégetése
kacs leégetése
nincs leégetése
kacs leégetése
nincs leégetése
kacs leégetése
kacs leégetése, inkubálás
3. ábra: Kaccsal végezhetı szélesztési forma I.
kacs leégetése
kacs leégetése
Az utolsó sáv végébıl a kacs hegyével
11
„cikkcakkot” húzunk a lemezen, majd a kacsot leégetjük 4. ábra: Kaccsal végezhetı szélesztési forma II. Tenyésztés után újra kiválasztunk egy jól elkülönült telepet. Az eljárást addig ismételjük egy nem szelektív táptalaj két lemezén, amíg csak egyféle teleptípus nı a lemezen. 3. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: oltókacs, krumpli-agarlemez (PDA: Potato-Dextrose Agar), YGC agarlemez Mikroorganizmusok: Saccharomyces cerevisiae és Penicillium expansum vegyes élesztıkivonat-glükóz-chloramphenicol-agarlemezen (YGC)
tenyészete
szelektív
A gyakorlat menete: A gyakorlat célja Saccharomyces cerevisiae tiszta tenyészet elıállítása PDA-lemezen. A szelektív YGC-lemezen telepmorfológia alapján kell elkülöníteni az élesztı- és a penésztelepeket. A penészgombák által képzett valódi micélium vattaszerő, spórásodás elıtt fehér, utána szürke. Az élesztıgomba pszeudomicéliumai a baktériumtelepekhez hasonló, a penésztelepeknél kisebb, kompakt állományú telepek. Az átoltáshoz ki kell választani egy különálló élesztıgomba telepet, majd a lelángolt és kihőlt oltókaccsal a táptalaj felszínérıl leemeljük, és vonalkultúraként a PDA-lemezre felvisszük, majd a 13. vagy a 14. ábra szerint elszélesztjük. A különbözı irányú szélesztések között az oltókacsot mindig le kell lángolni és kihőteni. A lemezeket szobahımérsékleten (24°C) 48 órán át kell inkubálni. Megfigyelések: Rajzoljuk le, milyen eloszlásban jelennek meg a telepek szélesztésnél.
1.7.
TÖRZSFENNTARTÁS (ferdeagaron)
A mikrobiológiai munka elengedhetetlen feltétele, hogy a laboratóriumban mindenkor fellelhetık legyenek olyan azonosított mikrobatörzsek, amelyek a fajra jellemzı tulajdonságokat mutatják, és ezáltal kontroll-kultúraként alkalmazhatók. Ezeket a törzseket permanensen fenn kell tartani. Ez meghatározott idıközönkénti átoltást követel meg a táptalaj beszáradása, a káros anyagcseretermékek felhalmozódása, az egyes táptalajkomponensekelfogyása következtében bekövetkezı "öregedés" kiküszöbölése érdekében. A törzseket általában kémcsövekben, folyékony táptalajban, vagy ferde agaron tenyésztik. A törzsfenntartáshoz használt táptalajok az alaptáptalajok közé tartoznak. Mind a tartósítási folyamat, mind a tárolás sokféle módon lehetséges, minden mikrobára közös, optimális módszer nincs, az adott esetben kell meghatározni a legmegfelelıbbet (vivıközeg, fagyasztási sebesség stb.) A törzsfenntartás elsı feltétele, hogy a módszer megfelelı legyen az adott törzs életképességének megtartására, megfelelı ideig (évekig). Az életképesség mind a tartósítási folyamat, mind a tárolás alatt csökkenhet, a cél, hogy ez
12
minimális mértékő legyen. A törzsfenntartás minıségének megítélésében fontos a törzs tisztaságának, genetikai tulajdonságainak stabil megırzése. Hagyományos módszerek: 1. szubkultúra-tenyészetek fenntartása folyamatos átoltással 2. olaj alatti tárolással 3. víz alatti tárolással 4. szárítással a. vízmentes steril szilikagélen, b. steril homokon, talajon, c. steril papírkorongon, vagy –csíkon, d. elıszárított keményítı-, dextrán-, peptonkorongon, e. zselatinkorongon Kórszerő módszerek 1. Liquid-drying: szárítás közvetlen folyadékfázisból, fagyasztás nélkül vákuum alatt. 2. Fagyasztás: a. Tárolás -70 … -80 °C-on, glicerin és/vagy DMSO (dimetil-szulfoxid) védıközegekben, folyékony nitogénben (-196 °C) vagy folyékony N2 felett való tárolás, glicerin és/vagy DMSO védıközegben. b. Fagyasztva szárítás (liofilezés), ahol a víz kifagyasztása után a jeget vákuum alatt szublimáltatják, védıközegként lóvérsavót, 10% sovány tejet, tej+inozitoldatot stb. használnak; menete elıfagyasztás, elsıdleges szárítás (szublimálás vákuumban), másodlagos szárítás (a maradék nedvesség deszorpciója). E módszerekkel lehet a genetikai tulajdonságokat legjobban megırizni és akár 25-30 évnél is tovább fenntartani életképes állapotban a legtöbb mikroorganizmust. 4. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: oltókacs, glükóz-élesztıkivonat-pepton (GYP) ferdeagar TSA (triptose-soya-agar) ferdeagar Mikroorganizmus: Saccharomyces cerevisiae GYP-ferdeagar tenyészete Bacillus subtilis TSA-ferdeagar tenyészete Serratia marcescens TSA-ferdeagar tenyészete A gyakorlat menete: A Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis és Serratia marcescens tenyészetet tartalmazó csı nyakát a dugó körül lelángoljuk, majd belıle lelángolt és kihőtött oltókaccsal egy kacsnyi mennyiséget kiveszünk, és ezt a steril GYP ill. TSA ferdeagar felszínére hullámos vonalban kikenjük. A kupak visszahelyezése elıtt a kémcsı száját lelángoljuk. A beoltott csövet 48 órán át szobahımérsékleten inkubáljuk, majd a tenyészet ellenırzése után 4-8 °C-on tároljuk. A régi tenyészetet addig nem szabad megsterilezni és kidobni, amíg meg nem bizonyosodtunk arról, hogy az átoltás sikerült. Megfigyelések: Ellenırizzük az átoltás eredményességét. Figyeljük meg az átoltott mikroorganizmusok színét, telepmorfológiai (fénye-matt felszín) tulajdonságait. Ábrázoljuk megjelenési formájukat.
13
1.8.
MOZGÁSVIZSGÁLAT FÉLFOLYÉKONY TÁPTALAJBAN
A baktériumok mozgásának vizsgálatára többféle módszer alkalmazható. Ezek közül a függıcsepp-készítmény már az elızı gyakorlatok során bemutatásra került. A mozgásképesség kimutatható félfolyékony magasagarba szúrásos technikával történı oltással is (15. áébra). Az atrich baktériumok ugyanis csak a szúrási csatorna mentén növekednek, míg a csillós baktériumok a szúrási csatornától radiális irányban, rajzanak.
4 cm
atrich
csillós baktériumok
5. ábra: Mozgásképesség vizsgálat a félfolyékony magasagarban 5. GYAKORLAT Szükséges anyagok és eszközök: oltótő, félfolyékony mozgásképesség agar (FF MOT) Mikroorganizmus: Proteus vulgaris, vagy Proteus mirabilis ferdeagaros tenyészete A gyakorlat menete: A Proteus vulgaris ferdeagaros tenyészetébıl lelángolt és kihőtött oltótővel kis mennyiséget kiveszünk, majd az oltótőt beleszúrjuk a félfolyékony mozgásvizsgálat agarba. 37 °C-on 48 órán át történı inkubálás után bíráljuk el a csöveket. Megfigyelések:
2. MIKROORGANIZMUSOK SZÁMÁNAK MEGHATÁROZÁSA Gyakorlati vagy tudományos célból gyakran szükséges, hogy ismerjük a tenyészetben, víz-, élelmiszer-, takarmány- vagy talajmintában a benne levı mikroorganizmusok számát. Ezt a célt hivatottak szolgálni a különbözı kvantitatív (mennyiségi) meghatározási módszerek, amelyeket 2 nagy csoportra osztunk a sejtszám meghatározás módja alapján: • Direkt sejtszám meghatározás Cél: összes csíraszám meghatározása Módszer: mikroszkópos
14
Hiba: sejtek aggregátumokba tömörülnek, nem tesz különbséget élı és elhalt sejtek között • Indirekt sejtszám meghatározás 1. Cél: összes csíraszám meghatározása Módszer: 1. Elektronikus sejtszámláló berendezés (fluoreszcens festés után) 2. Optikai módszerek (Turbidimetriás, Nefelometriás eljárás) 3. Tömegmérés (szőrés, centrifugálás, szárítás utáni mérlegelés) 4. Bio-kémiai módszerek (fehérjetartalom, különbözı enzimaktivitások, szervesanyag-tartalom, ATP-tartalom mérése) 2. Cél: összes élı csíraszám meghatározása Módszer: tenyésztéses Az összes csíraszám az élı és elhalt sejtek köbcentimérenkénti vagy grammonkénti mennyiségét jelenti. Az összes élı csíraszám viszont az élı, táptalajon kitenyésztett, szaporodásra képes sejtek számát mutatja.
2.1.
ÉLİ CSÍRASZÁM MEGHATÁROZÁSI MÓDSZEREK TENYÉSZTÉSES ELJÁRÁSSAL
Az élısejtszám meghatározási módszerek lehetıvé teszik, hogy egy vizsgált közegben (élelmiszer, takarmány, talaj stb.) a számunkra hasznos, vagy káros szaporodni képes mikroorganizmusok számát meghatározzuk. A gyakorlatban legelterjedtebben alkalmazott négy vizsgálati módszer: • Határhígítás • Telepszámlálásos módszer o Lemezöntés o Szélesztés • Membránszőrés A határhígításos módszernél a csíraszámot nem közvetlenül olvassuk le, hanem statisztikai alapon számítjuk ki: a tenyésztést folyékony tápközegben végezzük. A másik három módszernél a tenyésztés szilárdított táptalajon vagy táptalajban történik, a kifejlıdı mikroorganizmus telepek tehát közvetlenül számolhatók. E különbségektıl eltekintve valamennyi élıcsíraszám meghatározási módszer megegyezik abban, hogy a tulajdonképpeni tenyésztés elıtt a vizsgálandó anyagból szuszpenziót készítünk, amit fokozatosan addig hígítunk, amíg az élı sejtek száma, a tenyésztés után, értékelhetıvé válik. DECIMÁLIS HÍGÍTÁSI SOR KÉSZÍTÉSE A vizsgálati mintában (élelmiszer-, víz-, talajminta stb.) a keresett mikroorganizmusok számát mindig a minta 1g-jára, vagy 1 cm3-ére vonatkoztatva adjuk meg. A "Mintaelıkészítés" címő fejezetben már szó volt róla, hogy tekintettel a minták mikrobiotájának egyenlıtlen eloszlására a vizsgálati anyagot elıször homogenizálni kell, célszerően kilencszeres mennyiségő hígítóvízzel. Egy steril edénybe vagy steril mőanyag zacskóba mérjük ki a vizsgálati mintát reprezentáló m g tömeget vagy V cm3 térfogatot. Általában a vizsgálati anyag a minta 10 g-ja, illetve 10 cm3-re, egyes esetekben fıleg patogén mikroorganizmusok jelenlétének vizsgálatakor (Salmonella, Listeria monocytogenes) a vizsgálati anyag 25, esetleg 100 g, illetve cm3 is lehet. Adjunk hozzá 9Xm g-mal vagy 9XV
15
cm3 -rel egyenlı hígítófolyadék-mennyiséget. A hígítófolyadék steril élettani (fiziológiás) sóoldat (8,5 g NaCl 1000 cm3 ioncserélt vízben). A homogénezéssel elkészített un. alaphígítás (10-1) képezi az alapját az alábbiak szerint elkészítendı, un. decimális hígítási sornak (16. ábra): az alaposan összerázott alaphígításból steril pipettával 1 cm3-t kell 9 cm3 hígítófolyadékhoz mérni a következı (2-es hígítás, 10-2) elkészítéséhez, majd a folyamatot folytatni a szükséges hígítási fokig. Minden hígítás elkészüléséhez új pipettát kell használni. A hígítási fokokat úgy kell megválasztani, hogy telepszámlálásos módszer esetén a várható telepszám 10-300 legyen, míg MPN-módszer esetén az utolsó hígításban feltételezhetıen már ne legyen a vizsgálandó mikroorganizmus. 1 cm3
1 cm3
1 cm3
1 cm3
1 cm3
1 cm3
9-9 cm3 hígítófolyadék
Alaphígítás (10-1) 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Hígítási fok: 1 2 3 4 5 6 7 6. ábra: Decimális hígítási sor készítési módja szilárd mintából Ügyelni kell a pipettázás pontosságára, továbbá az aszeptikus munkára. Könnyen belátható, hogy a hígítás annál pontosabb, minél pontosabbak a pipetták ill. a hígítóoldatok térfogata. Minél nagyobb mérvő a hígítás, tehát minél kisebb a sejtszám, annál fontosabb a fertızıdés megakadályozása. 1000-es csíraszámnál még nem okoz bajt, azonban a cm3-ként 1-2 sejtet, vagy esetleg még annyit sem tartalmazó hígításoknál többszáz százalékos hibát eredményezhet. 2.1.1. Mikroorganizmusok számának meghatározása MPN-módszerrel Az MPN (Most Probable Number = legvalószínőbb élı sejtszám) módszer használatakor a mikroorganizmusokat folyékony táptalajban szaporítjuk el, és a mikrobaszaporodást mutató csövek száma alapján, statisztikai alapon következtetünk a keresett mikroorganizmusok számára. Az MPN-módszer alkalmazhatóságnak alapfeltétele, hogy • a sejtek eloszlása az alapszuszpenzióban véletlenszerő legyen, vagyis a sejtek a szuszpenzió bármely részében azonos valószínőséggel legyenek megtalálhatók, és • a folyékony táptalajban mikrobaszaporodás legyen tapasztalható már 1 élı sejtet tartalmazó inokulum beoltása esetén is.
16
A határhígításos módszer - a táptalajtól és a tenyésztési technikától függıen egyaránt alkalmazható az összes (aerob mezofil) élı csíraszám és valamely kiválasztott mikrobacsoport vagy mikroorganizmus számának meghatározására. A vizsgálandó anyagból alapszuszpenziót kell készíteni, majd ezt decimális alapon addig hígítani, míg az utolsó hígítás 1 cm3-ében már valószínőleg már nem található a keresendı mikroorganizmus egyetlen sejtje sem. Ezért azt a technikát határhígításos módszernek is nevezik. Azt, hogy melyik az a hígítás, amelybıl kioltva már feltehetıleg nem tapasztalunk mikrobaszaporodást a minta jellege, és a keresett mikroorganizmus határozza meg. A hígításokból steril pipettával 1-1 cm3-t kioltunk folyékony táptalajt tartalmazó csövekbe. Amennyiben a kioltást a hígabb szuszpenziótól kezdjük, a kioltás végrehajtható egy pipettával is. A sejtszám-meghatározás pontosságának megbízhatósága növelhetı • a hígítás léptékének csökkentésével (pl. 2-es alapú hígítás), • a hígítási fokokból történı leoltások (párhuzamosok) számának növelésével, és • az ismétlések, vagyis az alaphígítások számának növeléséve. A mindennapi gyakorlatban általában a párhuzamosok számának növelésével emelik a megbízhatóságot. A megkívánt pontosságtól függıen 2-5 párhuzamos leoltására van szükség. Leggyakrabban a 3-3 párhuzamos leoltással hajtják végre a legvalószínőbb élıcsíra-szám meghatározását. Az elbírálás elsı lépése az elıírt inkubálás után a kulcsszám meghatározása (17. ábra). A kulcsszám egy háromjegyő szám, amelyet három egymást követı hígítási szinten a mikrobaszaporodást mutató pozitív csövek számából határozunk meg. A kulcsszám elsı tagjának azt az utolsó hígítási szintet kell kijelölni, amelyen a pozitív csövek száma még maximális (ha pl. 3 párhuzamos leoltást végeztünk, akkor lehetıleg 3). A második számjegy az ezután következı hígítási lépcsıben talált pozitív csövek számát adja meg. A harmadik számjegy pedig a következı nagyobb hígítás pozitív csöveinek számára utal. Elıfordulhat az értékelés során, hogy olyan kulcsszámot kapunk, amelyben a magasabb hígításhoz több pozitív csı tartozik. Ez a mikroorganizmusok egyenlıtlen eloszlására vagy a hígítás hibájára utal! Hígítási szint
Pozitív csövek száma:
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
3
3
2
1
0
Jelmagyarázat: pozítív csı negatív csı aláhúzás: kulcsszám 7. ábra: A kulcsszám meghatározásának módja
17
Ezt követıen az un. Hoskins-féle táblázatból ki kell keresni a kapott kulcsszámhoz tatozó alapértéket, majd ezt meg kell szorozni a kulcsszám elsı tagjához tartozó hígítási fokkal. Az így kapott értéket normál alakba hozva adjuk meg a vizsgálat eredményét CFU/cm3-ben vagy CFU/g-ban. CFU=Colony Forming Unit, azaz Telepképzı egység (TKE). 1. táblázat Hoskins-féle táblázat a milliliterenkénti legvalószínőbb élısejtszám megállapításához (hígításonként 3-3 leoltás esetén) (részlet) Kulcsszám Alapérték Kulcsszám Alapérték 000 0 300 2,3 100 0,36 310 4,3 7,5 110 0,73 311 111 1,1 320 9,3 0,91 321 15 200 210 1,5 322 21 211 2,0 330 24 46 220 2,1 331 221 2,8 332 110 222 3,5 333 Tovább higítani! A kulcsszám a példánkban (17.ábra): 3 2 1 (aláhúzott számok). Az ennek megfelelı alapérték (a 4. táblázatból kikeresve): 15. A kulcsszám elsı tagjának hígítási szintje: 10-2. Ezekbıl az adatokból az alapszuszpenzió legvalószínőbb élıcsíraszáma: 15x102=1,5x103 CFU/cm3 6. GYAKORLAT Mezofil (szulfitredukáló) anaerob spórás baktériumok (vegetatív és spórás alak) számának meghatározása MPN-módszerrel. Mezofil (szulfitredukáló), spóraképzı anaerob baktériumok alatt azokat a Clostridium-ok nemzetségébe tartozó, 30 °C hımérsékleten anaerob körülmények között növekvı mikroorganizmusokat értjük, amelyek adott feltételek mellett a szulfitot szulfiddá redukálják. szulfit redukció →(vas ) − szulfid A vizsgálathoz D-glükóz - nátrium-diszulfit - ammónium- vas(II)-citrát - B-polimixin tartalmú folyékony szelektív és differenciáló táptalajt (DRCM) használunk. A táptalaj szelektivitását a Bacillus polimixa által termelt polimixin nevő antibiotikum biztosítja, amely gátolja a nem spórásodó mikrobióta szaporodását. A Bacillus nemzetség tagjainak fejlıdését az anaerob; viszonyok akadályozzák. A táptalaj alkalmas a szulfitredukció kimutatására, amelynek alapanyaga a nátrium-szulfit; a keletkezı szulfidionokat a vas-ammónium-citrát "jelzi" oly módon, hogy a vas-ion a szulfid-ionokkal kapcsolódva feketére színezi a tápközeget. Az anaerobiozis ellenırizhetısége érdekében a táptalaj rezazurin nevő redoxindikátort tartalmaz. Az oxigénmentes táptalaj világos vörösesbarna színő, oxigén hatására pedig rózsaszínő. A táptalajból felhasználás elıtt az oxigénnyomokat forralással el kell távolítani. Szükséges anyagok és eszközök: Vízfürdı, steril pipetták, steril hígítóvíz 9 cm3-ként csövekbe adagolva, DRCM-leves 10 cm3ként csövekbe adagolva, paraffinolaj 18
Mikroorganizmus: Clostridium butyricum vizes szuszpenziója A gyakorlat menete: A vizsgálathoz két alapszuszpenziót kell készíteni, és az egyiket vízfürdıben 75 °C-on 15 percen át kell hıkezelni a vegetatív alakok inaktiválása céljából. Ezt követıen mindkét alaphígításból decimális hígítási sort kell készíteni, majd a hígításokból 3-3 párhuzamos leoltást végezni DRCM-levest tartalmazó csövekbe. A beoltott csöveket az anaerob körülmények kialakítása érdekében 2-3 mm vastagságban parafinolajjal kell fedni, majd 30 °C-on 44 ± 4 órán át inkubálni. Pozitív esetben a beoltott tápközeg fekete elszínezıdést mutat. A hıkezeletlen mintából kapott eredmény adja meg az összes (vegetatív és spórás) mezofil szulfitredukáló klosztridiumok számát, a hıkezelt mintából pedig a spórás alakok számát kapjuk meg. Eredmények: 7. GYAKORLAT Kóliform baktériumok és feltételezetten Escherichia coli számának meghatározása MPN-módszerrel Kóliform baktériumok alatt értjük azokat az Enterobacteriaceae családba tartozó aerob és fakultatív anaerob, G(-), spórát nem képzı baktériumokat, amelyek a laktózt 30 °C hımérsékleten 24-48 óra alatt sav- és gáztermelés közben bontják. Ezek a baktériumok MPNmódszerrel szelektív, laktóztartalmú táptalajokban mutathatók ki. A kóliform baktériumok határhígításos módszerrel történı kimutatásához leggyakrabban a lauril-szulfát tartalmú szelektív levestáptalajt (LS) használják. A magas tápanyagtartalom és a foszfát puffer jelenléte gyors növekedést és fokozott gázképzıdést eredményez még a „lassú laktóz-fermentáló” kóliform baktériumoknál is. A laktózbontást kísérı gáztermelés a táptalajba szájával lefelé elhelyezett Durham-féle fermentációs csı segítségével vizsgálható. A lauril-szulfát gátolja a kísérıflóra szaporodását. A kóliform baktériumok csoportjába tartozik az egyik legjelentısebb ételmérgezı baktérium, az E. coli. Ennek kimutatása a kóliform baktériumokkal egyidejőleg a táptalajhoz adott "MUG" (4-metil-umbelliferil-ß-D-glükuronid) nevő adalékanyag segítségével történik. A MUG az E. coli baktériumok által termelt glükuronidáz enzim egyik lehetséges szubsztrátja. Az enzim a MUG-ról lehasítja a glükuronsavat, a visszamaradó 4-metil-umbelliferon nevő termék UV-fényben fluoreszkál. A fluoreszkálás mértéke néhány csepp 1 mólos nátriumhidroxid oldattal felerısíthetı. Szükséges anyagok és eszközök: Steril pipetták, steril hígítóvíz 9 cm3-ként csövekbe adagolva, MUG-ot tartalmazó LS-leves 10 cm3-ként csövekbe adagolva Mikroorganizmus: Kóliform baktériumok és E. coli vegyes vizes szuszpenziója A gyakorlat menete: A vizsgálathoz alaphígítást, majd abból decimális hígítási sort kell készíteni, és a hígításokból 3-3 párhuzamos leoltást végezni MUG-os BBL-levest tartalmazó, Durham-féle fermentációs
19
csıvel ellátott csövekbe. A beoltott csöveket 30 °C-on 24-48 órán át kell inkubálni. Az értékelést a Hoskins-táblázat alapján kell elvégezni. Kóliformokra nézve pozitívnak kell tekinteni minden olyan csövet, amelyben a Durham-csınek legalább 1/10 részét gázbuborék tölti ki. A kóliform pozitív csövek közül E. coli baktériumot tartalmaznak a fluoreszkáló csövek. Megjegyzés: A címben a feltételezetten E. coli-szám meghatározás arra utal, hogy ez a vizsgálat nem teljes körő, az E. coli jelenlétét a továbbiakban még meg kell erısíteni. (Biokémiai vizsgálatok)
20
