Gyors-kinetika módszerek 2010. március 9. Nyitrai Miklós
A módszerek jelentősége
A biológiai mechanizmusok megértése;
Vándorló melanocita (Victor SMALL).
Biológiai folyamatok időskálája; A ms skálán való mérések.
Milyen módszerekről tanulunk? -„stopped-flow” vagy megállított áramlású reaktor -„surface plasmon resonance” vagy felületi plazmon rezonancia
A módszerek közös tulajdonsága Alkalmasak gyors, pl. a milliszekundumos időskálán lezajló folyamatok követésére.
-„flash photolysis” vagy villanófény fotolízis -…módszerek és alkalmazásaik.
A reakciókinetikai mérési módszerek jellemző időfelbontása 100 s
10-3 ms
10-6 μs
10-9 10-12 ns ps
„lombik-reakció” megállított áramlás (stopped flow) villanófény-fotolízis (flash photolysis)
Kulcsszavak
stopped flow vagy stopped-flow, gyorskinetikai mérés, abszorpció, fluoreszcencia, fecskendő, mixer (keverő), vizsgálati cella, reakció, reagens, oldat sebességi állandó
fotonszámlálás (photon counting) Forrás: Keszei Ernő előadásanyaga
1
1. lépés: a folyadékok áramoltatása
Megállított áramlású reaktor
Fényforrás
(„stopped-flow”) Mérőcella Miért ez a neve? Hogyan működik? Milyen alkalmazásai vannak?
Keverő
„STOP”
„A”
„B”
dugattyú
dugattyú
http://www.photophysics.com/sx20.php
dugattyú
Megállító érzékelő
A dugattyúk vezérlése Nagy nyomás vagy léptető motor
pl. fluoreszcencia vagy fény szórás
2. lépés: az áramlások megállítása Fényforrás
t = 0 időpont
3. lépés: a kinetikai mérés
Fényforrás pl. abszorbció
Mérőcella
Mérőcella
Keverő
Keverő
„STOP”
„A”
„B”
dugattyú
dugattyú
dugattyú
Megállító érzékelő
STOP jel
A dugattyúk vezérlése
„STOP”
„A”
„B”
dugattyú
dugattyú
dugattyú
A dugattyúk vezérlése
A folyamat egyben pl. fluoreszcencia vagy fény szórás
Fényforrás A reakció elkezdődik
pl. abszorbció
Mérőcella „STOP” Keverő
A holtidő fogalma és jelentősége
dugattyú
„A”
„B”
dugattyú
dugattyú
A folyadékok összekeverése és a hasznos mérés kezdete között eltelt idő. Tipikusan 0,5-1 ms.
AAdugattyúk dugattyúkmegállnak! vezérlése Nagy nyomás vagy léptető motor
Megállító STOP!!! érzékelő
2
A
A B
A megállított áramlású reaktor alkalmazásai
B
Mit mérünk?
A
A B
B
Egy alkalmas spektroszkópiai jelet. Kötődési és disszociációs kinetika vizsgálata fehérje-fehérje, vagy fehérje-ligandum kölcsönhatások esetében.
Feltétel: változzon a reakció során! A szokásos spektroszkópiai jelek: -Fluoreszcencia
intenzitás
-Abszorbció -Fényszórás
Vizsgálati tér
Fecskendők és keverés
Termosztált Abszorpció és Fluoreszcencia (anizotrópia) mérés
Villanófény fotolízis Hasonlóan az előbbiekhez, itt is a nulla időpont definiálása a kritikus.
A módszer alapelve Alapállapotban nem reagáló, passzív szubsztrát alkalmazása; A szubsztrát fénnyel aktiválható; Lézer villanással aktiváljuk; Mérjük a létrejövő folyamat kinetikáját.
3
Az alkalmazás alapelve
Felületi plazmon rezonancia
Nincs Létrejön reakció!! a reakció!! Lézer villanás!
A
A B Rezonancia jel
B
(kRU)
A
A B
B
kötődés
disszoc. regenerálás
konc.
A
Partner A, aktív
B
Partner B A,ispasszív aktív
0
2
4
6
8
1 0
Idő (perc)
A működés alapelve
E
Áramlási cella Partner B Partner A Fém (pl. arany vagy ezüst) réteg
Fém (pl. arany vagy ezüst) réteg
üveg üveg
la Po
t ál riz
n fé
y
Megvilágítás
Vi ss
za ve rt f
Vi ss én y
l izá lar Po
én tf
y
Detektálás
Milyen hatások befolyásolják a szöget?
za ve rt f
én y
Intenzitás csökkenés!
A szenzogram
Fém (pl. arany vagy ezüst) réteg
üveg
Az elhajlás szöge függ:
Vi ss
1) A hullámhossztól. y
za ve rt f
én y
I. II.
II.
intenzitás
3) A törésmutatótól.
l izá lar o P
rezonancia jel
2) A hőmérséklettől.
én tf
I. idő
I.
II.
A kötődés hatására módosul.
szög
4
Immobilizálás A módszer jellemzői, előnyei a) Közvetlenül a molekula felülethez kapcsolása (direkt);
A vizsgált fehérjék, peptidek, lipidek, hatóanyagok jellemzése jelölés nélkül.
b) Egy közvetítő kötődő molekula immobilizálása (indirekt).
Valós időben követhetőek a folyamatok. Kis mintaméretek, chip alapú alkalmazás.
a
Rezonancia jel
Összetett folyamatok vizsgálata
b
Alkalmazások -affinitások meghatározása (KA vagy KD);
kötődés
-kinetikai mérések (kassz vagy kdissz);
disszociáció
-hatóanyag specificitás vizsgálata; regenerálás
-fehérjék, peptidek, lipidek kötődésének vizsgálata.
konc.
0
2
4
6
-kötődő komponensek izolálása keverékből;
8
10
Idő (perc)
A mérés elrendezése
5
