2. A membrán-fehérjék térbeli szerveződése a plazmamembránban: Fehérje asszociáció, klaszterek, hálózatok
A membránfehérjék globális szerkezete és kapcsolódása a lipid kettősréteghez: osztályozási elvek, kategóriák 4
1 Ext.
membrán
8
2
3
9
- - + ++
5
Int. 1.) antigének, receptorok 2.) ‘multi-span’ fehérjék 3.) transzport fehérjék (multi-alegység komplexek) 4.) glikozil-foszfatidilinozitol (GPI) horgonyzott külső perifériás fehérje 5.) zsírsavval (mirisztoil-, palmitoil-, prenyl-) acilált belső perifériás fehérje 6.) sejtváz struktúrfehérje (pl. spektrin és analógjai, aktin filamentum) 7.) dinamikus kapcsoló fehérjék (pl. ERM fehérjecsalád) 8.) transzmembrán adaptor fehérjék (pl. LAT, NTAL) 9.) pányvázó (scaffolding) fehérjék
7 6
7
A membránfehérjék dinamikus , szupramolekuláris klaszterei (’mintázatai’ ) a sejtfelszínen:
molekuláris homo- és heteroasszociátumok; clusterek; membrán mikrodomének Ezeket kiváltó/stabilizáló tényezők:
► genetikailag determinált komplexek (pl. TcR/CD3, BcR komplex, FcεRI)
► ligand indukált aggregáció (pl. EGF-receptor TK család) ► fehérje-fehérje kcsh.: konformáció/affinitás hajtott asszociációk (pl. MHChomoasszociáció, MHC-I és MHC-II közötti hetero-asszociációk, „tetraspan web”)
► lipid mikrodomének általi kompartmentalizáció (diffúziós barrier, fehérjelipid kölcsönhatás): raftok, caveolák (pl. GPI-fehérjék /CD14,CD48/,acilált Src kinázok “összegyüjtése”, IL-2/IL-15 receptorkomplex alegység kompartmentalizáció) ►citoszkeletális kihorgonyzás/kapcsolás: adhéziós (vinculin/talin), accessory/kapcsoló/adapter fehérjék (pl. LAT, NTAL, Gab1, MAGUK-family, ERM-family)
A fehérje-asszociáció / ‘csoportosulás’ (clustering) különböző szintjei membránokban:
• Homo-asszociáció: (5-10 nm) molekuláris szint
pl. HLA-DR
•
pl. FasR (CD95)
Hetero-asszociáció: (5-10 nm) pl. HLA-I – Insulin Receptor
• Fehérje cluster: szupramolekuláris szint
(50 – 500 nm) pl. (TcR-CD3)n aktivált T sejteken
•
Membrán mikrodomén:
(20 nm – 2 μm) pl. raft (tutaj)
“burkolt csapda”
‘Dinamikus szupramolekuláris membrán struktúrák (mikrodomének)’
Chlatrin burok ligand
R
Kölcsönhatás a membrán szkeletonnal: kötődés, “kerítéshatás”
vezikuláris transzport, fúzió a sejtmembránnal
Fehérje asszociáció, aggregáció
asszociáció speciális lipid mikrodoménekkel (raft, caveola) (Golgi)
Jelátviteli kaszkádok (PTK, G-protein, PI, kalcium)
Többláncú Immunfelismerő Receptorok családja („Multichain Immune Recognition Receptor”, MIRR)
BCR
TCR
FcεR I
PM organization of the interleukin-2 receptor complex
Nanometer-scale organization of the alpha subunits of the receptors for IL2 and IL15 in human T lymphoma cells Bärbel I. de Bakker, Andrea Bodnár, Erik M. H. P. van Dijk, György Vámosi, Sándor Damjanovich, Thomas A. Waldmann, Niek F. van Hulst, Attila Jenei, María F. Garcia-Parajo. J Cell Sci 2008 121: 627-633; doi: 10.1242/jcs.019513
Az IL-2 és IL-15 citokinek immunszabályozó funkciói függenek az aktuális membrán receptor szerveződéstől/affinitástól
A plazmamembránok laterális doménszerkezete
☺ ☺
Laterális fehérje denzitás: 10-30.000/μm2 ; lipid fajlagos felület: 0.68 nm2; α-helix fajlagos felület: 1.1 nm2 ; fehérjék által elfoglalt terület: single-span: ~ 1 nm2, tetraspan: 4.5 nm2, sevenspan: ~ 8 nm2 Egy 30x30 nm2 területű membrándoménbe belefér pl. : vagy 32 lipid, vagy 15 single-span fehérje, vagy 12 tetraspan, vagy 8 sevenspan fehérje ill. ezek megfelelelő kombinációi
Plazma membrán mikrodomének: lipid raft
caveola
A „tetraspan web„: TM4-SF fehérjék ● 34 tetraspan fehérje ismert emlősökben, ebből 33 humán is ● Képesek „konformációs pányvázóként” (scaffolding) többféle fehérje szelektív horgonyzására a membrán egy területén. A kapcsolódó fehérjékkel nagyobb, több száz fehérjéből álló ‘hálózatot’ is tudnak képezni a membránban N-glikoziláció
TM4-SF specifikum: erősen konzervatív szekvencia/motívum
(LED)
(SED)
palmitoiláció
Sejtkommunikáció: Komplex fehérje hálózatok-jelátviteli és regulációs rendszerek
Sejtfelszínen: in situ biofizikai képalkotó technikákmobilitás és kölcsönhatás mérése (FRET, FRAP, SPT, stb....)
Modellezés (in silico): „Interactome” analízisfehérjeszerkezeti, kölcsönhatási (vektoriális) adatbázisok alapján DNS (sejtmag)
Betegségek sejtszintű jelátviteli, kommunikációs zavarainak felismerése a protein-interactome tanulmányozásával
Példa: a „szindrómás autism spectrum disorder” kulcsfehérjéinek interactome térképe
Hogyan vizsgálhatjuk a membránfehérjék molekuláris szerveződését, a fehérjék asszociációit/csoportosulásait? • klasszikus immun-biokémia: pl. immun-koprecipitáció • Fluoreszcens immuncitokémia/mikroszkópia: CLSM, SRM - cocapping (sapkásodás) - kolokalizáció (intenzitás kereszt-korreláció és cluster-analízis) • Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET): - mikroszkópiás “photobleaching” FRET (pbFRET) vagy - intenzitásmérésen alapuló FRET (RI-FRET)
• Nagyfeloldású (~nm- ~ x10 nm) optikai (STED,SIM, STORM, PALM), ill. pásztázó szonda- mikroszkópiák: atomi erőmikroszkópia (AFM) ill. ‘közeli mező mikroszkópia’ (SNOM) – sejtfelszíni topográfia
Molekuláris ko-lokalizáció detektálása immuno-koprecipitációval Protein G gyöngy
(A)-specifikus mAb
Overnight, 4 oC
Mosás, forralás SDS PAGE puff. centrifugálás
SDS PAGE
B A
A
blotting
Sejtlizátum, Ag + anti-B mAb + HRP-anti Ig + ECL reagens
Hogyan mutatható ki élő sejteken a membránfehérjék in situ molekuláris szintű szerveződése ? - homo- és hetero-asszociációik
- membrán lipid mikrodoménekhez való viszonyuk
Élő sejtek immunfluoreszcens jelzése Ellenanyag konjugálása fluoreszcens festékkel; sejt jelölése fluoreszcens ellenanyaggal vagy biotin-avidin reakcióval
NH2 (-SH)
a.
(R: isothiocianát, v. szukcinimid, ill. maleimid) kovalens
+
R-
(NaHCO3, pH:8.0)
(pl. FITC, Cy2,3,5,7; APC; RPE; Alexa 488,546,647)
Ig Fab
b.
Immunoglobulinok (mAb)
avidin
Kd: 10-6 – 10-8 M
biotin
(Fab’)2
M
M 20-30 perc, jégen
Konfokális fluoreszcens mikroszkópia (lézer-pásztázás: point scanning X-Y, optikai szeletelés: Z-scan, 200-500 nm, digitális fluoreszcens képalkotás, 3D-rekonstrukció)
Példa: Az IL-2 citokin-receptor lokalizációja és kompartmentalizációja a T sejtek plazmamembránjában. „Az IL2-R és a GPI-horgonyzott CD48 ‘raft-asszociált membránfehérje’ viszonya” • Immun-koprecipitáció (mindkét irányban) pozitív
• Jelentős mértékű co-capping figyelhető meg a két fehérjénél green channel: XSF-anti-CD48
A CD25 (IL-2Rα) és a CD48 kolokalizáltak T sejt-membránban (azonos mikrodoménben vannak)
red channel: Cy5-anti-CD25
MOLEKULA-KOLOKALIZÁCIÓ CLSM-el
j Pixel: pl. 0.1 x 0.1 μm ► Két, spektrálisan izolált optikai csatorna: (pl. zöld: x, vörös: y) -kettősen jelölt sejtminta - digitálisan rögzített képek -a ‘kolokalizációt’ a kereszt-korrelációs koefficiens (CC) értéke alapján kvantitatívan is megítélhetjük egy pl. 512x512 v. 1024x1024 pixeles image-ből.
i
► A Pearson’s koefficiens definíciója:
CC = Σi Σj (xi,j - <x>) (yi,j -
) / √ Σi Σj (xi,j - <x>)2 Σi Σj (yi,j - )2 , ahol xi,j ill. yi,j az i és j koordinátákkal jellemzett pixel fluoreszcencia értékei az x (zöld) ill. y (vörös) képen (optikai csatornában).
► Csak a detektálási küszöb (zaj/háttér) fölötti értékekkel rendelkező pixeleket vesszük figyelembe a summázás során. A CC szélső értékei: CC= 1, két teljesen azonos kép esetén, CC = -1 a kétféle festék (jelölt molekula) teljesen szeparált lokalizációja esetén CC: 0-1 – a random eloszlástól eltérő mértékű „valós molekuláris kolokalizáció”
Fehérje-fehérje, fehérje-lipid kolokalizáció: CLSM képalkotás
j
T sejten GM-1 gangliozidok, FITC-CTX B-vel jelölve (a raftok lipid markere) b T sejten IL-2 receptor α (CD25) Cy-3monoklonális antitesttel jelölve “Overlay” (pixel-helyes) A + B image.
c i
Pearson koefficiens: > 0.6 !
Probléma: nincs molekuláris szintű feloldás ! (LF: 200-250 nm)
„Ki kihez van közel vagy távol” a molekuláris,nanométeres skálán? Az optikai képalkotás feloldási határral rendelkezik (Abbe-korlát) és egy kompromisszum: „nem látjuk közvetlenül” a molekuláris kölcsönhatást, (d:<10-20 nm) de detektálhatjuk pl. a pixelenkénti Förster-Rezonancia Energia Transzfer (RET) hatásfokának meghatározása alapján
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) A
D*
A*
D*
Donor and acceptor far apart - No FRET
Donor and acceptor close together - FRET
• Nem-sugárzó (elektromágneses/rezonancia) energiaátadás egy fluoreszcens (donor) molekuláról egy energia-felvevő (acceptor) molekulának dipól-dipól csatolás útján (Förster, 1958) • A dinamikus Förster-típusú energiaátadás erősen távolság függő, a sebességi állandó (valószínűség) ~ 1/R6 • Hatékony módszer az intra-és intermolekuláris távolságok (molekuláris konformációváltozások, asszociációk) vizsgálatában
Példa: az „Akceptor photobleaching” mérése
Nagyfeloldású, nem diffrakció-korlátozott ‘pásztázó szonda-mikroszkópiák’: 1.) „Atomic Force Microscopy” /AFM/ - Transzmissziós Elektron mikroszkópiával és immunogold jelzéssel kombinálva 2.)„Scanning Near Field Microscopy” /SNOM/ *Feloldás: igen jó, elvben a szonda mérete határozza meg: ~ 5-50 nm z irányban, 50-100 nm x-y irányban **Hátrány: a mintaelőkészítés (beágyazás, fixálás, dehidratálás, stb.) erősen befolyásolhatja a natív struktúrát!
Atomi erő mikroszkópia (AFM) működési elve (G. Binnig 1996 Nobel díj) - pN/nN erőállandójú rugó (kar) - pásztázó hegy (tip:SiN3 kristály) mérete (alakja) határozza meg a feloldási határt (elvben néhány Angstrom z irányban). - piezo-vezérelt vonal-pásztázás - lézerfény visszaverődés kvadráns diódával történő detektálása: pozíciójelzés
Immuno-gold jelzés arany-gyöngy átmérő: 5-50 nm (5 nm-ként elérhető) gold
anti-Fc mAb-al fedett aranygyöngy primer antitest
R
sejt
MHC-I glikoproteinek sejtfelszíni eloszlása (clusterei) AFM: immunogold jelölést követően humán T limfóma sejteken
MHC-I és MHC-II molekulák hetero-asszociációja APC-n, szekvenciális immunogold jelölést (2 féle méretű gold bead) követően, TEM és AFM pásztázó mikroszkópiákkal detektálva
TEM image
AFM image
A TEM és AFM image fehérjeeloszlásának cluster-analízise random eloszlás: Poisson eloszlás (üres karika) immunogold szám (gyakoriság) mátrix elemenként a mintában (fekete karika) -függvényillesztés
A jelölt fehérje (MHC-II) Klaszteresedést mutat B limfómák felszínén (nobs > nelm)
Proc Nat Acad Sci USA,1997
